我々は、アッセイの開発とこの原稿について批判的なコメントのヘルプはアルベルトセヴェリーニとヴァネッサGoleskiに感謝。この作品は、カナダの公衆衛生局と産業研究支援プログラム（カナダ国立研究評議会）によって賄われていた。追加のサポートは、サスカチュワン州の出版基金の大学から得た。

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	<li>Hale, L. P., Swidsinski, A., Mendling, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+associated+with+bacterial+vaginosis.">Bacteria associated with bacterial vaginosis.</a> N. Engl. J. Med. 354, 202-203 (2006).</li><li>Hay, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+in+the+littoral+zone:+lactobacilli+losing+the+plot.">Life in the littoral zone: lactobacilli losing the plot.</a> Sex. Transm. Infect. 81, 100-102 (2005).</li><li>Morris, M., Nicoll, A., Simms, I., Wilson, J., Catchpole, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+vaginosis:+a+public+health+review.">Bacterial vaginosis: a public health review.</a> Brit. J. Obstet. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identification+of+bacteria+associated+with+bacterial+vaginosis.">Molecular identification of bacteria associated with bacterial vaginosis.</a> N. Engl. J. Med. 353, 1899-1911 (2005).</li><li>Dumonceaux, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+bacteria+associated+with+normal+microbiota+and+with+bacterial+vaginosis+in+vaginal+swabs+by+use+of+oligonucleotide-coupled+fluorescent+microspheres.">Multiplex detection of bacteria associated with normal microbiota and with bacterial vaginosis in vaginal swabs by use of oligonucleotide-coupled fluorescent microspheres.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 4067-4077 (2009).</li><li>Molenkamp, R., van der Ham, A., Schinkel, J., Beld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+five+different+DNA+targets+by+real-time+Taqman+PCR+using+the+Roche+LightCycler480:+Application+in+viral+molecular+diagnostics.">Simultaneous detection of five different DNA targets by real-time Taqman PCR using the Roche LightCycler480: Application in viral molecular diagnostics.</a> J. Virol. Meth. 141, 205-211 (2007).</li><li>Nikiforov, T. T., Rendle, R. B., Kotewicz, M. L., Rogers, Y. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+association+of+Atopobium+vaginae+and+Gardnerella+vaginalis+with+bacterial+vaginosis+and+recurrence+after+oral+metronidazole+therapy.">The association of Atopobium vaginae and Gardnerella vaginalis with bacterial vaginosis and recurrence after oral metronidazole therapy.</a> J. Infect. Dis. 194, 828-836 (2006).</li><li>Dumonceaux, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+of+specific+bacterial+populations+in+complex+intestinal+communities+using+quantitative+PCR+based+on+the+chaperonin-60+target.">Enumeration of specific bacterial populations in complex intestinal communities using quantitative PCR based on the chaperonin-60 target.</a> J. Microbiol. Meth. 64, 46-62 (2006).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

信号発生の特異性は非常に重要であり、あなたが本当に観測される信号は、その生物から生成されたアンプリコンの検出を反映していることを確信している必要があります。このようなPrimerPlex（プレミアBiosoft）などのソフトウェアは、効率的にハイブリダイズするプローブを設計するために役立ちますが、非対象種にクロスハイブリダイズしない場合があります。このプロトコルで説明さ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> オリゴヌクレオチド名 </td><td> 会社 </td><td> シーケンス1 </td></tr><tr><td> H279BP </td><td rowspan="3"> Invitrogen社、IDT、または他の</td><td> ビオチン- OEFO GAIIIIGCIGGIGAYGGIACIACIAC </td></tr><tr><td> H280 </td><td> YKIYKITCICCRAAICCIGGIGCYTT </td></tr><tr><td> H1612BP </td><td> ビオチン- OEFO GAIIIIGCIGGYGACGGYACSACSAC </td></tr><tr><td> H1613 </td><td></td><td> CGRCGRTCRCCGAAGCCSGGIGCCTT </td></tr><tr><td colspan="3"> 1O、ホスホロチオエート- C、E、ホスホロチオエート- G、F、ホスホロチオエート- A、I、イノシン、Y、CまたはT、R、またはG、K、TまたはG、S、CまたはG </td></tr></tbody></table>ユニバーサルcpn60 PCRのための修飾オリゴヌクレオチドの表1。シーケンス。 <table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前</td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> 1 - エチル-3 - （3 - dimethylamiopropyl）カルボジイミド塩酸（EDC） </td><td>ピアース</td><td> 22980 </td><td></td></tr><tr><td>蛍光ポリスチレンビーズ：MicroPlexミクロスフェア（ルミネックス）、またはバイオプレックスCOOHビーズ（Bio - Rad社） </td><td>ルミネックスまたはBio - Rad社</td><td> Bio - Rad社：xxxはビーズ識別子に対応する171 - 506xxx </td><td>磁気ビーズは、オリゴヌクレオチド結合のために利用可能になりつつあると特定の利点を提供することがあります。これらの著者が試行されていません。 </td></tr><tr><td>キャプチャーオリゴヌクレオチド（5&#39;アミノC12改） </td><td> Invitrogen社、IDT、または他の</td><td>様々な</td><td>脱塩の純度レベルは許容範囲です。膣スワブを特徴付けるために使用される捕獲プローブの配列は、このプロトコルは13基となる原稿に記載されています。 </td></tr><tr><td> T7エクソヌクレアーゼ</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td> M0263S </td><td></td></tr><tr><td>ストレプトアビジン- R -フィコエリスリン（SA - PE） </td><td>インビトロジェン</td><td> S - 866 </td><td>高純度SA - PEを取得するために注意が必要なのは、このカタログの数は推奨されます</td></tr><tr><td>サーモウェル、96ウェルPCRプレート</td><td>フィッシャー</td><td> CS006509 </td><td> 96ウェルサーモサイクラーとBioPlexマシンの両方に適合</td></tr><tr><td>サーモシールマット</td><td>フィッシャー</td><td> CS006555 </td><td>再使用することができます。石けん水で洗浄は、よくすすぎ、および乾燥</td></tr><tr><td> 5M TMAC </td><td>シグマ</td><td> T3411 </td><td></td></tr><tr><td>バイオプレックスまたはルミネックス楽器</td><td> Bio - Rad社またはルミネックス</td><td> Bio - Rad社：171-000201 </td><td></td></tr><tr><td>プローブ設計のためのPrimerPlexソフトウェア</td><td>プレミアBiosoft </td><td> www.premierbiosoft.com </td><td>ルミネックスプローブドのために提案他のソフトウェアプラットフォームを使用することができますが、署名</td></tr></tbody></table> 表2。特異的な試薬と装置。 <table border="1"><tbody><tr><td> コンポーネントは </td><td> μL/アッセイ </td><td> μl/100アッセイ </td><td> 最終濃度 </td></tr><tr><td> 10 × PCR緩衝液（Invitrogen） </td><td> 5 </td><td> 500 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> 50mMのMgCl 2の （Invitrogen社） </td><td> 2.5 </td><td> 250 </td><td> 2.5mMの</td></tr><tr><td>の10mMのdNTP </td><td> 1 </td><td> 100 </td><td> 0.2mMの各</td></tr><tr><td> H279BP、25μM </td><td> 0.25 </td><td> 25 </td><td> 375 nMの</td></tr><tr><td> H1612BP、25μM </td><td> 0.75 </td><td> 75 </td><td> 125 nMの</td></tr><tr><td> H280、25μM </td><td> 0.25 </td><td> 25 </td><td> 375 nMの</td></tr><tr><td> H1613、25μM </td><td> 0.75 </td><td> 75 </td><td> 125 nMの</td></tr><tr><td>水</td><td> 34 </td><td> 3400 </td><td> --- </td></tr><tr><td>合計</td><td> 44.5 </td><td> 4450 </td><td></td></tr></tbody></table> 表3。改良cpn60 UTプライマー（表1）を持つPCR用混合物を推奨。アッセイは、鋳型DNAとTaq DNAポリメラーゼ（インビトロジェン社）0.5μlの（2.5U）を5μl用に設定されています。通常、大容量を準備（100アッセイ用などに十分な）と-20℃で保存されています

multiplex detection of bacteria in complex clinical and environmental samples using oligonucleotide-coupled fluorescent microspheres

細菌性膣炎（BV）はガルドネレラの膣、Atopobium鞘を含む細菌種の数、支配細菌に乳酸菌 -支配、および他の1〜3の&quot;通常の&quot;微生物の変化によって特徴付けられる、定期的な複数菌症 ​​候群です。この条件は、HIV買収4を含む負の健康アウトカム、の範囲に関連付けられており、それが臨床的に5管理が困難になる可能性があります。また、BVの診断は、様々な数値基準6,7に得点されている膣スワブのスメアのグラム染色の使用に依存してきました。この診断は、シンプルで安価な、とよく資源が限られた設定に適していることが、それは主観的な解釈に関連する問題に苦しむことができますし、それが膣細菌8の組成の詳細なプロファイルを与えるものではありません。最近のディープシーケンシングの取り組みが持つ豊かな、多様な膣細菌叢を明らかにしたBV 11,12の分子診断のための潜在的なターゲットの数の同定の結果になっています9,10、通常考えられているそれらの個人、と比較してBVと診断された患者から採取したサンプルの間に明確な違い。これらの研究は、有用な情報を豊富に提供していますが、深いシーケンシングは、まだ臨床の現場での診断法として実用的ではない。我々は最近、急速にルミネックスプラットフォーム13上の検出とオリゴヌクレオチド結合蛍光ビーズを用いたマルチプレックス形式で膣細菌叢をプロファイリングするための方法を記載している。このメソッドは、現在のグラム染色ベースのメ​​ソッドと同様に、迅速かつ簡単ですが、プローブの設計の研究をシーケンシングに起因する分子の知識を悪用するというさらなる利点を追加します。このメソッドは、したがって、高い特異性と感度のカンプでBVを診断するために使用することができます膣スワブに存在する主要な微生物をプロファイルする方法を提供します半定量的かつ迅速な方法で、種の存在感と豊富で追加情報を提供しながら、グラム染色にared。この多重方式では、よく現在のところ、単一の試料14の5または6つの異なるアッセイに限定されている特定の生物の、現在の定量PCRアッセイの範囲を超えて拡張可能です。重要なのは、メソッドが膣スワブの細菌の検出に限定されるものではなく、容易に迅速に関心のほぼすべての微生物群集をプロファイルに適合させることができます。例えば、我々は最近、廃水処理プラントで使用する診断ツールの開発にこの手法を適用し始めている。

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Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres

我々は、オリゴヌクレオチド結合蛍光ビーズを用いて試料内の微生物の検出のための多重方法を説明します。サンプル内のすべての生物からのアンプリコンは、プローブ結合ビーズのパネルにハイブリダイズさせる。ルミネックスまたはバイオプレックス機器は、ビーズタイプとハイブリダイゼーションシグナルのための各ビーズを照会するために使用されます。

オリゴヌクレオチド結合蛍光マイクロスフェアを使用して複雑な臨床及び環境試料中の細菌の多重検出

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated ...

multiplex-detection-bacteria-complex-clinical-environmental-samples

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.1K ビュー.  Agriculture and Agri-Food Canada. 我々は、オリゴヌクレオチド結合蛍光ビーズを用いて試料内の微生物の検出のための多重方法を説明します。サンプル内のすべての生物からのアンプリコンは、プローブ結合ビーズのパネルにハイブリダイズさせる。ルミネックスまたはバイオプレックス機器は、ビーズタイプとハイブリダイゼーションシグナルのための各ビーズを照会するために使用?...