EPSRC, HFSP, Kore Ulusal Araştırma Vakfı (Hibe Numarası R11-2009-044-1002-0K20904000004-09A050000410): Yazarlar, aşağıdaki araştırma konseyleri ve hibe desteği kabul etmek istiyorum.

1. Mikroçip üretim <ol><li> SU8 ana imalat. 30 sn için 3000 rpm&#39;de Si gofret 40 mikron yükseklik, spin kat SU8-50 (MicroChem Corp) mikroakışkan kanalları elde etmek için Yumuşak fırında sıcak bir plaka üzerinde 65 ° C 5 dakika ve 95 ° C, çözücü buharlaşması ve film sıkıştıracağını 30 dakika. Soğuduktan sonra, uygun bir maske altında SU8 300 mJ / 2 360-440 nm radyasyon ile karşı maruz kalmaktadır. Maruz kalındıktan sonra, gofret fırında 65 ° C için 2 dakika 4 dakika ve 95 ° C Soğuduktan sonra, karıştırarak, 5 dakika boyunca maruz kalmamış alanlarda (Micrpoposit EC solvent Chestech) gelişir. Kullanın 5 taze gofret yıkayın ve temiz bir yüzey oluşturmak için gaz altında kuru çözücü EC. Hekzan ve metanol yıkar ile gofret davranın. Yüzeyine silan trikloro buharlaşan bir son adım (1,1,2,2-perfluoocytl) (40 dakika desikatöre), SU8 ana üretim süreci tamamlayın. </li><li> PDMS curing dicing ve delik delme. Yapılandırılmış mikroakışkan substratlar formu için master üzerine dökün ardından çapraz bağlayıcı reçine 10:1 (w / w) oranı Sylgard 184 (Dow Corning) karışımı ve. Bir saat sonra bir desikatöre Degas ve 65 tedavi cihazı (üst tabaka) ° C Ana kapalı tedavi PDMS ve kabuğu kesin. Akışkan borular için biyopsi yumruk kullanarak erişim delikleri oluşturun. Kür, 65 yaşında, 20 dakika boyunca PDMS başka bir katman (10x10 cm Petri kabındaki eşit olarak yayılan reçine 8 g) ° C Alt tabakasına hazırlanan üst tabaka yerleştirin ve daha sonra 65 yaşında bir gecede tedavi ° C Kullanmak için Petri kabı ve zar yongaları Peel. </li></ol> 2. Deney düzeneği <ol><li> Mikroakışkan kurulum <ol><li> Hortumun herhangi bir yerinde herhangi bir hava kabarcığı kalır sağlamak, gerekli çözümleri ile şırınga (plastik veya cam Beckton, Dickinson and Company veya SGE Analitik Bilim) doldurun. Damlacık üretimi için iki aşamadan kullanılır. Sulu (dağınık) phase ilgi reaktifler (örneğin büyüme ortamında bir hücre süspansiyon, ya da moleküler fluorophores bir çözüm) içerir. Bu durumda sürekli faz gibi davranır yağ fazında, genellikle petrol ve sürfaktan bir karışım, florlu yağı örneğin% 2 Raindance sürfaktan (Raindance Teknolojileri) (3M Fluorinert Elektronik Sıvı FC-40) oluşur ya da% 2 Açıklığı 80 Mineral yağ (Croda). </li><li> Fit bir ucunda iğneler şırınga iğne uçları aynı iç çapı boru (Polietilen borular, Harvard Apparatus). Boru, titreşim tedirginlikler nedeniyle akış kararsızlıkları en aza indirmek için mümkün olan en kısa uzunlukta kesilmiş olmalıdır. </li><li> Hortumun diğer ucu doğrudan PDMS substrat delikli deliklere takın. Silika kapiller liman veya bağlayıcılar (örneğin Upchurch Nanoports) kullanımı gibi daha karmaşık çözümler mikroakışkan cihazı ve tüp arasında daha sağlam bir arabirimi için de uygulanabilir. Prize bağlayınçipin bir koleksiyoncu (çöp toplama ya da daha fazla analit işleme) tüp ve doğrudan bağlantı noktası. </li><li> Mount bir şırınga pompası (örneğin PHD 4400 Hpsi programlanabilir şırınga pompaları, Harvard Apparatus) şırınga ve her aşaması için (genellikle dakikada mikrolitre sırasını) istenilen beslerken akış hızı tanımlamak. Yağ 1 / sulu akış oranları bir asgari oran, kararsız damlacığı oluşumundan (cihaz geometri bağlı olarak) yol açacak sulu faz, PDMS ıslatma önlemek için tavsiye edilir. Aynı nedenden ötürü, aynı zamanda sulu faz giriş ilk önce, herhangi bir mikroakışkan kanallar aracılığıyla, yağ fazı tek başına temizlemek için tavsiye edilir. Deneyler Burada kullanılan son kurulum Şekil 2a gösterilmiştir. </li></ol></li><li> Optik sistem kurulumu <ol><li> Konfokal mikroskobu (otomat ile küçük hacimlerde yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip mikroakışkan kanalları içinde (birkaç pikolitre) probed Mikronaltı konumlandırma kapasite). </li><li> Yüksek kuantum verimi ile ideal bir floresan moleküller suda çözünebilen kullanın. Excite ilgili fluorofor emme eşleşen bir dalga boyunda bir lazer işletim kullanarak moleküller. Örneğin, floresein 5-izotiyosiyanat (FITC) ve Alexa Fluor 488 gibi sık kullanılan floresan moleküller verimli bir 488 nm diyot lazer (örneğin PicoQuant Gmbh, LDH-PC-485) kullanılarak heyecan olabilir. Floresan moleküller, Texas Kırmızı veya Allophycocyanin (APC) gibi verimli bir şekilde kullanarak 633 nm çıkılabilir He / Ne lazer (örneğin Newport R-31.425). </li><li> Tekrarlama oranları birkaç MHz (çeşitli ns darbe ayırımlar) ve Floresan Ömür Boyu Görüntüleme (Flim) deneyleri için yeterince farklılaşmış bir ömür boyu özellikleri ile fluorophores çalışan darbeli lazerler kullanın. </li><li> Kiriş direksiyon aynalar ve optik kiriş yüksekliğinin yanı sıra ışın yönünü kontrol etmek için kullanın. </li><li> Nesnel l içine lazer ışınını bir dikroik ayna kullanınEns. Aynı anda iki lazer kullanılırsa, bir dual-band dikroik ayna yansıması iki lazer ışınları (z488/633rdc Chroma Technology Corporation bir ayna ideal örneğin 488 ve 633 nm kirişler için) izin için monte edilebilir. </li><li> Mikroakışkan bir kanal içinde sıkı bir odak lazer ışığı getirmek için sonsuz düzeltilmiş, yüksek sayısal açıklık (NA) mikroskop objektif (yani Olympus 60 x / 1.2 NA, suya daldırma) kullanın. Uzun boylu mikro (&gt; 100 mikron) ile çalışırken kullanılan nesnel uygun çalışma mesafe Mikrokanallı tam yükseklikte etkili kapsar olmasını sağlamak için seçilmiş olması gerekir. </li><li> Aynı yüksek NA, aynı dikroik ayna aracılığıyla iletilen amaç ve (mikroakışkan kanal içinde) kullanarak örnek tarafından yayılan floresan toplayın. </li><li> Tek veya çift-bant emisyon filtresi (örneğin Chroma Technology Corporation bir z488/633 filtre) kullanarak herhangi bir kalıntı uyarma ışık çıkarın. </li><li> Focus floresan emission bir yüzü düz diğeri dışbükey mercek (örneğin 50,2 F Newport Ltd) ile 75 mikron bir iğne deliği üzerine. Konfokal mikroskop objektif düzlemde iğne deliği yerleştirin. </li><li> Iki dedektör üzerine floresan sinyal bölmek için başka bir dikroik ayna (örn. 630dcxr, Chroma Technology Corporation) kullanın. </li><li> Bir emisyon filtresi (örneğin hq540/80 m Chroma Technology Corporation bir filtre) ile dikroik ayna tarafından yansıtılır floresan Filtre ve yüzü düz diğeri dışbükey lens ile odak (örneğin f = 30.0 id 25,4 mm, Thorlabs) ilk üzerine ( &#39;Yeşil&#39;) dedektörü. Ikincil bir kırmızı fluorofor ilgili deneyler başka bir emisyon filtresi (örneğin Chroma Technology Corporation bir hq640lp filtresi) ile dikroik ayna tarafından gönderilen floresan filtre ve daha sonra ikinci dedektörü (&#39;kırmızı&#39;) üzerine başka bir yüzü düz diğeri dışbükey lens odak. </li><li> Floresans fotonu tespiti için çığ fotodiyotlar (örneğin AQR-141, EG &amp; G, Perkin-Elmer) kullanın. Son kurulum gösterilmiştir. <strong&gt; Şekil 2b. </li></ol></li></ol> 3. Damlacık üretimi ve veri toplama <ol><li> Damlacık nesil yöntemleri <ol><li> Bu damlacıkları oluşturmak için iki ana yapılandırmaları mikro kullanabilirsiniz: oluşan damlacıklar Mikrokanallı kendisi kadar geniş olduğu sürece Her iki yöntem de eşdeğer bir akış biçimi (Şekil 3a ve 3b) 6,7 odaklanma ya da T-kavşak. Sonuç olarak, iki karışmayan sıvılar bir araya getirmek ve arayüzü geliştirmek sonraki kılcal kararsızlıkları, monodisperse damlacıkları (birkaç Femtolitreden gibi küçük) kendiliğinden oluşturulur bu geometriler kullanarak ortaya çıkan kesme kuvvetlerinin. </li><li> Farklı şekillerde reaktifleri sarabiliriz: reaktifler hazırlanan ve karışık çip kapalı istenilen karışımı / konsantrasyon, ya da damlacık formasyonu (Şekil 3c) önce araya gelerek ayrı ayrı çip haline getirdi ve olabilir olabilir . Bukarışımları / konsantrasyonları sadece göreceli akış oranlarını ayarlama değiştirilebilir yılından bu yana son yöntem daha yüksek esneklik sağlar. Bu hücre kapsülleme, şırınga içinde hücre süspansiyonu, zaman ölçeği üzerinde deney hücrelerinin yoğunlaşmayı önlemek için karıştırılır gerektiğini kaydetti. </li></ol></li><li> Floresan veri toplama. <ol><li> Veri çığ fotodiyot dedektörü, (2.2.12 açıklanan), çok işlevli bir DAQ cihaza çift elektronik sinyal günlüğü (örneğin, bir PCI 6602, National Instruments), kişisel bilgisayar üzerinde çalışan. </li><li> Flim deneyler Zaman İlişkili Tek Foton Sayma dedektörleri bağlamak için (TCSPC) kartı (örneğin TimeHarp 100, PicoQuant GmbH) ayrı bir PC üzerinde çalışıyor. Algılanan her floresan foton bir olay lazer darbe ilişkili olduğu ve bu nedenle her yayılan floresan foton bir gecikme süresi atanır: Bu kart bir TCSPC metodoloji kullanılarak elde edilecek floresans ömrü veri sağlar. Bu verilerfluorofor / s ışınımsal oranı katsayısı / s bir kestirim elde etmek için bir tek veya çok-üstel bozulma eğrisinin takılabilir Dedektörün cihaz tepki fonksiyonu (IRF) ham verileri Deconvolute: Bu düşük bir konsantrasyon Auramine-O çözüm (birkaç piko bir floresan ömür boyu sergiler) kullanılarak elde edilmiştir 8. </li></ol></li></ol> 4. Damlacıklar içinde karıştırma hücre tanıma ve haritalama <ol><li> Damlacıklar içinde karıştırma hücre tanıma ve haritalama <ol><li> Escherichia coli En canlılığı testi deney için 10 suşu kullanın. Kültür gecede Luria Bertani suyu hücreleri ve deneylere önce 0.5 optik yoğunluk maç. </li><li> 0.4 mcM SYTO9 ve 1 mcM propidium iyodür hücrelerin canlılığı saptamak için kullanın. Her ikisi de DNA intercalating boyalar ve onların floresan DNA&#39;ya bağlanarak üzerine 20 yılı aşkın bir kat artar. SYTO9 beni bir yeşil floresan boyambrane geçirgen ve propidium iyodür membran geçirimsiz bir kırmızı floresan boya. Canlı hücrelerin ölü hücreleri, hem de &#39;yeşil&#39; ve &#39;kırmızı&#39; emisyon sergi Böylece &#39;yeşil&#39; floresan. </li><li> Kırmızı / yeşil floresan tespiti için 2.2 tanıtıldı setup) kullanın. </li><li> Taşınabilir bir mini-manyetik karıştırıcı (Utah Biyodizel Kaynağı, Utah), hücre sedimantasyon önlemek için bir 7mm manyetik karıştırıcı ile donatılmış bir 3ml BD plastipak şırınga içinde hücre süspansiyonları karıştırmak için kullanın. </li></ol></li><li> Flim kullanarak karıştırma olayları haritalama <ol><li> Damlacıkları akan boyunca hangi bir Mikrokanallı yarım yükseklikte optik prob hacmi odaklanın. </li><li> Iki sulu çözeltileri (Şekil 3c olarak), her biri farklı karakteristik floresan yaşamlarda (etkileşimli) fluorofor içeren formu damlacıkları . </li><li> Kanalın bir tarafında başlayarak, 1 mikron aralıklarla kanal tüm genişliği boyunca her deney yürütmek. Kanal edsonra floresan yoğunluğu büyük ölçüde lazer ışını yakınlığı odaklı düştükçe ges kolayca tespit edilebilir. </li><li> Yağ fazında gürültü arka sinyal patlamaları (damlacıkları ile ilişkili) ayırt etmek ve her patlama süresi kurmak için bir algoritma uygulanması. </li><li> Deney yapılmıştır belirli bir genişlikte her damla uzunluğu boyunca gecikme süresi ve yoğunluğu değerleri çıkarmak için ikinci bir algoritmanın uygulanması. 9 </li><li> Sonra deneyde her damla için floresans ömrü değerlendirmek için Maksimum Olabilirlik Tahmincisi (MLE) algoritmasını kullanır. 8 deneyde tüm damlacıkları için ömür boyu değerleri ortalama MLE hesaplama son hata (daha damlacıkları probed azaltır hata daha küçük). </li><li> Bir ömür boyu yörüngesini her genişliği elde edildikten sonra, 2B harita tüm yörüngeleri birleştirir. Her bir özellikle yaşam boyu değeri ile ilişkili olduğundanlar iki fluorophores karışımı bir konsantrasyon (veya karıştırma) harita böylece elde edilebilir. </li><li> İsteğe bağlı olarak, damlacık karıştırma 3D harita mikroakışkan kanal yüksekliği boyunca farklı pozisyonlarda bu protokol tekrarlayarak kolaylıkla elde edilebilir. </li></ol></li></ol> 5. Veri analizi <ol><li> Ham deneysel veri dosyaları uygun bilgisayar diline yeniden yorumluyoruz böylece daha da analiz edilebilir (foton sayıları zamanla değişim içeren örneğin, metin dosyaları, veri işleme ve analiz için kolayca Matlab içine ekstrakte edilebilir). MLE algoritmaları çalıştırmak veya ömür boyu yörüngeleri karıştırma patters 2B haritalar oluşturmak için daha karmaşık denemeler dosyaları (Flim için olanlar gibi) veya sipariş yer alan verilere erişmek için özel bir kod yazmak zorunda kalabilirsiniz. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Hücre tanıma Tipik örnekler variation hücre tabanlı deneyler için zamanın bir fonksiyonu olarak foton sayısı iki yüz milisaniyelik bir süre içinde, Şekil 4a ve c gösterilmiştir. Önemlisi Luria-Bertani suyu (LB orta) sulu damlacık sınırlarını tanımlayan zayıf floresanlama bir arka plan olarak görür, tek tek hücrelerin varlığı ile ilgili ayrı bir foton patlamalarının ise bu arka plan üstüne ayırt edilebilir. LB floresan arka plan, yaklaşık dikdörtgen bir kesit (kırmızı ve yeşil noktalı çizgi ile işaretlenmiş) ile karakterize edilir. E. kaynaklanan floresan patlamaları tam genişlikte yarı maksimum (FWHM) coli hücrelerinde göre damlacıklarının uzunluğu (40 mikron, 30 picolitres bir birime karşılık gelen) ve E. ile uyumlu arka plan damlacık olaylar, daha 30 kat daha kısa . coli hücreleri (1.5-2.0 mikron) 10 Çift kanallı tespit ileiyon sistemi, canlı hücreleri veya ölü hücrelerin varlığı, yeşil ve kırmızı kanalları analizi ayırt edilebilir. Şekil 4 b ve d damlacık başına hücre sayısını açıklayan olasılık dağılımı gösterir . Flim kullanarak karıştırma olayları haritalama Moleküler floresans ömrü sadece kimyasal çevre tarafından etkilenen bir birey fluorofor, kendine özgü bir özelliğidir. Buna göre ölçümler, konsantrasyon, uyarım yoğunluğu ve optik toplama gibi deneysel faktörler (bağımlı zaman entegre floresans ölçümleri, daha üstün çözünürlük ve hassasiyet ile çevre bilgileri (pH, sıcaklık, polarite ve viskozite gibi) elde etmek için kullanılır. verimlilik). 9,11 Yerde olduğu gibi sunulan, 8 di iki fluorophores kullanarak damlacıkları içindeki karıştırma desen haritası mümkündürfferent ömrü değerleri. 1 no&#39;lu denklemde görüldüğü gibi iki (etkileşimli) floresan türleri içeren bir karışımı çürüme biexponential formu alacaktır: <img src="/files/ftp_upload/3437/3437eq1.jpg" alt="Denklem 1" /> Bireysel yaşamlar τ1 ve τ2 olarak tanımlanan ve her bir bileşenin genlik sırasıyla α1 ve α2 tarafından verilmektedir. Ortalama ömrü, daha sonra şu şekilde tanımlanabilir: <img src="/files/ftp_upload/3437/3437eq2.jpg" alt="Denklem 2" /> Β1 ve β2 her bir bileşenin fraksiyonu ve aşağıdaki gibi tanımlanır: <img src="/files/ftp_upload/3437/3437eq3.jpg" alt="Denklem 3" /> Prob hacmi sabittir ve damlacıkları o konumda boyunca akan bu yana, ömür boyu bir yörünge uzunluğu boyunca bu özel genişlik damlacıklarının değerleri bu şekilde elde edilebilir. Averag belirli bir genişlik için karakteristik bir yörüngeŞekil 5a ed, 6000 damlacıkları arasında görülebilir. Kanalın tüm genişliği boyunca yörüngeleri birleştiren bir 2D konsantrasyonu (karıştırma) harita oluşmasına yol açar. Tipik bir sonuç Şekil 5b sunulmuştur. Damlacıkları çok sayıda arasında ortalama, standart hata, elde edilen sonuçların büyük ölçüde azalır (Şekil 5a% 95 güven aralığı, standart hata% 1) olabilir . Ömrü yörünge belirleme yöntemini tüm damlacıkları hemen hemen aynı olduğunu varsayar. Damlacıkları önemli ölçüde farklı olsaydı, elde edilen ortalama ömrü yörüngeleri (ve ortalama damlacıklarının uzunluğu boyunca ömür boyu sürekli keskin farklılıklar tespit edilir), daha az uzaklaşan profilleri düz olurdu: Bu iki ana nedenden dolayı, büyük ölçüde doğru olduğu kanıtlanmıştır. Ayrıca, sonuçlar ne olursa olsun bireysel olarak tekrarlanabilir.damlacıkları analiz veya damlacıklar miktarı hesaplamalarında kullanılacak. 8 <img src="/files/ftp_upload/3437/3437fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 mikroakışkan çip imalat süreci akış. <img src="/files/ftp_upload/3437/3437fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2, damlacık oluşumu için mikroakışkan yongası bağlı şırınga pompaları ve şırıngalar, temsil eden) Diyagramı, iki lazer için tipik bir optik kurulum b) şematik iki fluorofor (yeşil ve kırmızı) uyarma ve algılama . DC = Dikroik ayna, EM = Emisyon filtresi, L = Lens, PH = deliği, APD = Çığ fotodiyot dedektörü. <img src="/files/ftp_upload/3437/3437fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. On-chip damlacığı oluşumundan stratejileri: a) akış odaklama yapılandırma; b) T-kavşak yapılandırma. c) dr çip kapsüllemebaşlangıçta ayrı iki sulu reaktifler oplets. <img src="/files/ftp_upload/3437/3437fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4 (a) ölüler için 0.2 s izleri Optik okuma ve (c), canlı hücreleri (hücre süspansiyonu için akış oranları: 1 ul dk -1, yağ: 2 ul min -1) . Her kemer şeklindeki sinyal kesik çizgiler ile işaretlenmiş damlacık sınırları, sulu damlacık formları zayıf floresan LB orta karşılık gelir. Yeşil sinyaller, 633 nm dalga boyları üzerinde 633nm ve kırmızı sinyaller altında okuma temsil eder. Hücreler DNA intercalating boyalardan kaynaklanan dikey başak tarafından ayırt edilir. (B) ölü hücreler ve (d) canlı hücreler için tek damlacıkları içinde hücre doluluk için olasılık dağılımı. <img src="/files/ftp_upload/3437/3437fig5.jpg" alt="Şekil 5" /> Şekil 5 uzunluğu boyunca belirli bir genişlikte bir damlacık a) Tipik ortalama ömrü yörünge; b)(% FITC /% Str-AF488 olarak ifade ya da konsantrasyon), 2D bir ömür boyu harita içine damlacıkları tam genişliği boyunca bütün ortalama yörüngeleri kombinasyonu tipik gösterimi araştırdı.

<ol>
	<li>Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origins+and+the+future+of+microfluidics.">The origins and the future of microfluidics.</a> Nature. 442, 368-368 (2006).</li><li>Zheng, B., Angew, I. s. m. a. g. i. l. o. v., F, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Microfluidic+Approach+for+Screening+Submicroliter+Volumes+against+Multiple+Reagents+by+Using+Preformed+Arrays+of+Nanoliter+Plugs+in+a+Three-Phase+Liquid/Liquid/Gas+Flow.">A Microfluidic Approach for Screening Submicroliter Volumes against Multiple Reagents by Using Preformed Arrays of Nanoliter Plugs in a Three-Phase Liquid/Liquid/Gas Flow.</a> Chem. Int. Ed. 44, 2520-2520 (2005).</li><li>Huebner, A., Sharma, S., Srisa-Art, M., Hollfelder, F., Edel, J. B., Demello, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdroplets:+A+sea+of+applications.">Microdroplets: A sea of applications.</a> Lab on a Chip. 8, 1244-1244 (2008).</li><li>deMello, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+and+detection+of+chemical+reactions+in+microfluidic+systems.">Control and detection of chemical reactions in microfluidic systems.</a> Nature. 442, 394-394 (2006).</li><li>Thorsen, T., Roberts, R. W., Arnold, F. H., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+pattern+formation+in+a+vesicle-generating+microfluidic+device.">Dynamic pattern formation in a vesicle-generating microfluidic device.</a> Phys. Rev. Lett. 86, 4163-4163 (2001).</li><li>Anna, S. L., Bontoux, N., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+dispersions+using+"flow+focusing"+in+microchannels.">Formation of dispersions using "flow focusing" in microchannels.</a> Appl. Phys. Lett. 82, 364-364 (2003).</li><li>Casadevall i Solvas, X., Srisa-Art, M., deMello, A. J., Edel, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+Fluidic+Mixing+in+Microdroplets+with+1+&#x03BC;s+Time+Resolution+Using+Fluorescence+Lifetime+Imaging.">Mapping of Fluidic Mixing in Microdroplets with 1 &#x03BC;s Time Resolution Using Fluorescence Lifetime Imaging.</a> Anal. Chem. 82, 3950-3950 (2010).</li><li>Robinson, T. A., Schaerli, Y., Wootton, R., Hollfelder, F., Dunsby, C., Baldwin, G., Neil, M., French, P., deMello, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+background+signals+from+fluorescence+thermometry+measurements+in+PDMS+microchannels+using+fluorescence+lifetime+imaging.">Removal of background signals from fluorescence thermometry measurements in PDMS microchannels using fluorescence lifetime imaging.</a> Lab. Chip. 9, 3437-3441 (2009).</li><li>Huebner, A., Srisa-Art, M., Holt, D., Abell, C., Hollfelder, F., deMello, A. J., Edel, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+detection+of+protein+expression+in+single+cells+using+droplet+microfluidics.">Quantitative detection of protein expression in single cells using droplet microfluidics.</a> Chem. Commun. 1218, (2007).</li><li>Edel, J. B., Eid, J. S., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+single+molecule+FRET+efficiency+determination+for+surface+immobilized+DNA+using+maximum+likelihood+calculated+lifetimes.">Accurate single molecule FRET efficiency determination for surface immobilized DNA using maximum likelihood calculated lifetimes.</a> J. Phys. Chem. B. 73, 2986-2990 (2007).</li></ol>

Biz mikroakışkan bir cihazın fabrikasyon, deneysel bir kurulum ve Mikrodamlacık oluşumu ve reaktif kapsülleme ve işlenmiş damlacıklarının optik algılama için ilgili protokoller tanımlanmıştır. (Damlacıkları tek hücrelerin saptanması ve akan damlacıklar içinde karışım süreçleri haritalama) seçilen iki örnek, şu anda damlacık Mikroakiskan araştırılmaktadır yaygın uygulamalar temsil eder. Sunulan deneylerin de gösterdiği gibi, damlacık mikroakışkan platformlarının kullanımı olsa da, yüksek kapasiteli, yarı mükemmel hapsi, yüksek tekrarlanabilirlik ... büyük miktarda üretilen bilgilerin ve bu bilgilerin üretilen olduğu yüksek hız gibi bazı çekici özellikleri, mevcut ise tam olarak yararlanmak, bu minyatür platformlardan elde edilecek yüksek uzaysal çözünürlüğü ile hızlı algılama yöntemlerinin kullanılmasını gerektirir. Bu durumda biz bu olduğunu göstermektedirson derece hassas floresan spektroskopik teknikleri kullanarak. Özellikle, Flim algılama tekniği (bir kaç ns olarak tekrarlama dönemleri ile kısa darbeli lazer kullanımı kılan), hızla akan damlacıklar (saniyede yaklaşık 200), çok hızlı bilgi almak için kapasitesini ortaya koymaktadır. Bu durumda, tespit edilen olayların zaman çözünürlüğü 1 μs gibi düşük oldu. Damlacık boyutu ve konsantrasyon sınırları açısından büyük sayısal diyafram lensler ve daha büyük güç lazerlerin kullanımı kolay, 5 mikron (damlacık boyutu sınırlamaları fotolitografik kararları tarafından dayatıldığı gibi küçük damlacıklar içinde nM konsantrasyonları tespit izin verecek Mikronaltı konumlandırma aşamasında üretim süreci). Mikroakışkan damlacıkları tek bir hedef / olay, küçük miktarlarda reaktifleri içeren büyük ölçekli deneyler yürütmek için ideal adaylardır. Bu teknolojinin mevcut sınırlamalar dr oluşturmak için zorluk içerirYüksek verimli bir şekilde farklı kaynaklardan geniş bir yelpazede (onlarca veya yüzlerce) oplets. Ayrıca, üretilen, tek tek her damla hedef ve işlemek için zorluk, bu tekniklerin pratik uygulanabilirliği ciddi sınırlamalar getirmektedir. Bu nedenle, bu konularda araştırma ve analiz, yüksek hacimli uygulamalar standart bir referans yöntem haline mikroakışkan damlacık platformları sağlayacak gerekli teknolojik çözümler geliştirmeye yönelik önemli araştırma çabalarının merkezinde yer almaktadır.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Tip </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Floresein 5-izotiyosiyanat (FITC) </td><td> Reaktif </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F3651 </td></tr><tr><td> Streptavidin-Alexa Fluor 488 </td><td> Reaktif </td><td> Moleküler Probları </td><td> S11223 </td></tr><tr><td> Perfluorodecalin </td><td> Reaktif </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9900 </td></tr><tr><td> 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctanol </td><td> Reaktif </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 370533 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 silikon elastomer kiti </td><td> Reaktif </td><td> Premier Farnell UK LTD </td><td> 1673921 </td></tr><tr><td> auramine-O </td><td> Reaktif </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 861030 </td></tr><tr><td> 485 nm diode lazer darbeli </td><td> Ekipman </td><td> PicoQuant </td><td> LDH-PC-485 </td></tr><tr><td> TCSPC Kart </td><td> Ekipman </td><td> PicoQuant </td><td> TimeHarp 100 </td></tr><tr><td> dikroik ayna </td><td> Ekipman </td><td> Chroma Technology Corp. </td><td> z488rdc, </td></tr><tr><td> Mikroskop hedefi </td><td> Ekipman </td><td> Olympus </td><td> UPLSAPO 60XW </td></tr><tr><td> Çığ fotodiyot </td><td> Ekipman </td><td> AQR-141, EG &amp; G, Perkin-Elmer). </td><td> AQR-141 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Reaktif </td><td> Invitrogen </td><td> ABCD1234 </td></tr><tr><td> SYTO9 </td><td> Reaktif </td><td> Invitrogen </td><td> S34854 </td></tr><tr><td> Propidium İyodür </td><td> Reaktif </td><td> Invitrogen </td><td> P3566 </td></tr><tr><td> Escherichia coli top 10 suşu </td><td> Hücreler </td><td> Invitrogen </td><td> C4040-10 </td></tr></tbody></table>

fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

Kimya ve biyoloji gerçekleştirmek için mikroakışkan platformların geliştirilmesi, büyük bir kısmı sistem minyatürleştirme eşlik potansiyel yararları bir dizi tarafından tahrik edilmiştir. Avantajları verimli bir örnek, işlevsel bileşenleri facile entegrasyon, büyük ölçekli çoklama, gelişmiş analitik verim, gelişmiş kontrol ve azaltılmış enstrümantal ayak izleri doğru içsel bir yatkınlık femoto-litre hacimli nano işleme yeteneği dahil 1 Son yıllarda çok fazla ilgi damlacık tabanlı (ya da bölümlenmiş akışı) mikroakışkan sistemleri ve yüksek verimli bir deney platform olarak potansiyel gelişimi üzerine odaklanmış bulunmaktadır. 2-4 su-yağ emülsiyonu kendiliğinden mikroakışkan kanal oluşturmak için yapılır bir sonucu olarak iki farklı fazın arasında kılcal kararsızlıkları. Önemlisi, kesin olarak tanımlanmış hacimler ve kompozisyonlar microdroplets frekanslarda oluşturulabilirbirkaç kHz. Ayrıca, sürekli bir karışmayan faz, örnek çapraz konuşma ve dağılım (difüzyon ve Taylor tabanlı) ile ayrılmış izole bölmeleri içinde ilgi reaktifler encapsulating tarafından bertaraf edilebilir, minimum çapraz kontaminasyon ve analitik süreçlerin zaman yeteneği yol açar büyük doğruluk ile. Ayrıca, damlacıklar içeriğini ve kanal duvarları (sürekli faz ile ıslatılmış) arasında herhangi bir temas olmadığı için emilimi ve kanal duvarlarına reaktiflerin kaybı önlenir. Bu tür damlacıkları oluşturulur ve işlendikten sonra, gerekli analitik bilgileri ayıklamak için gereklidir. Bu bağlamda seçim algılama yöntemi, hızlı, yüksek duyarlılık ve algılama düşük limitler sağlamak, moleküler türlerin bir dizi için geçerli olmalıdır, tahribatsız ve uyduruk bir şekilde mikroakışkan cihazlara entegre edilmek üzere mümkün. Olarak geliştirilen bu ihtiyacı karşılamak içindeney araçları ve büyük miktarda küçük hacimli ortamlarda photophysical bilgi çıkarma sağlamak, fiziksel, kimyasal ve biyolojik parametreler geniş bir analizi için geçerli protokolleri uite. Burada bu yöntemlerin iki örnek sunuldu ve tek hücreleri ve pikolitre hacmi damlacıkları içinde karıştırma işlemleri haritalama tespiti için uygulanır. Biz mikroakışkan çip imalatı, optik kurulum ve damlacık oluşturma ve algılama süreci de dahil olmak üzere tüm deneysel süreci raporu.

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms at JoVE.com

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

Damlacık tabanlı mikroakışkan platformları kHz oranları ucuza pikolitrelik, kendi kendine bölümlere damarları oluşturmak mümkün olduğundan yüksek kapasiteli deney için umut vaat eden adaylardır. Hızlı, hassas ve yüksek çözünürlüklü floresans spektroskopik yöntemleri ile entegrasyon sayesinde, bu sistemler içinde üretilen bilgilerin büyük miktarda verimli, ayıklanır, harnessed ve kullanılan olabilir.

Mikroakışkan damlacık platformları için Floresan algılama yöntemleri

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

fluorescence-detection-methods-for-microfluidic-droplet-platforms

Research

JoVE Journal

Bioengineering

21.9K Görüntüleme.  Imperial College London. Damlacık tabanlı mikroakışkan platformları kHz oranları ucuza pikolitrelik, kendi kendine bölümlere damarları oluşturmak mümkün olduğundan yüksek kapasiteli deney için umut vaat eden adaylardır. Hızlı, hassas ve yüksek çözünürlüklü floresans spektroskopik yöntemleri ile entegrasyon sayesinde, bu sistemler içinde üretilen bilgilerin büyük miktarda verimli, ayıklanır, harnessed ve kullanılan olabilir.

Video: Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

Mekanik Dinamik Hücre Kültürü için Microfabricated platformlar

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Biyomühendislik

High Throughput Microfluidic Rapid and Low Cost Prototyping Packaging Methods

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging techniques.
The one-time use packaging technique employs UV-based and temperature curing epoxies to connect microtubes to access holes, wire-bonding for integrated circuit connections, and silver epoxy for electrical connections. This method is based on a robust assembly technique that can support relatively high pressure close to 1 psi and does not need any support to strengthen the microfluidic architecture.
Reusable packaging techniques consist of PDMS-based microtube interconnectors and anisotropic adhesive films for electrical connections. These devices are more sensitive and fragile. Consequently, Plexiglas support is added to the microfluidic structure to improve the electrical contact when anisotropic adhesive films are used, and also to strengthen the microfluidic architecture. In addition, a micromanipulator is needed to maintain tubes while using a thin PDMS layer to connect them to the access holes. Different PDMS layer thicknesses, ranging from 0.45-3 mm, are tested to compare the best adherence versus injection rates. Applied injection rates are varied from 50-300 &#956;l/hr for 0.45-3 mm PDMS layers, respectively. These techniques are mainly applicable for low-pressure applications. However, they can be extended for high-pressure ones through plasma-oxygen process to permanently seal the PDMS to glass substrates. The main advantage of this technique, besides the fact that it is reusable, consists of keeping the device observable when the microchannel length is very short (in the range of 3 mm or lower).

In this article we describe different techniques for microfluidic rapid prototyping platforms. The proposed techniques are based on ultraviolet (UV) sensitive and temperature curing epoxies, polydimethylsiloxane (PDMS) based tubing, wire-bonding, and anisotropic adhesive films. The assembling procedures presented are developed for both one-time use devices as well as reusable microfluidic systems.

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

Modifiye İki foton mikroskop 3D Orbital Takip: Hücre içi veziküllerin İzlemeye Bir Uygulama

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

Ticari Mikroskop Canlı Hücre Zarları Moleküler Difüzyon Kanunu Hızlı Floresans Görüntüleme Gönderen

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after merging (FRAM). FRAM adopts the same principles as the fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) technique, especially for measuring fluorescence recovery after bleaching a specific area, but FRAM uses a drop coalescence instead of photobleaching dye molecules to induce a chemical potential gradient of dye molecules. Our technique has several advantages over FRAP: it only requires a fluorescence microscope rather than a confocal microscope equipped with high power lasers; it is essentially free from the selection of fluorescence dyes; and it has far more freedom to define the measured diffusion area. Furthermore, FRAM potentially provides a route for studying the mixing or inter-diffusion of two different surfactants, when the monolayers at a surface of droplet and at a flat air/water interface are prepared with different species, independently.

We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.

Bir Damlacık birleştirme sonra Floresan Kurtarma Fosfolipid Monolayer İki boyutlu Difüzyon Tedbir

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

Damlacık Mikroakiskan için renkli Floresan Algılama Optik Elyaf kullanma

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform for reduced sample volume and assay time as well as full automation are required for potential use in point-of-care-diagnostics. Recently, we have demonstrated ultrasensitive detection of serum proteins, C-reactive protein (CRP) and cardiac troponin I (cTnI), utilizing a lab-on-a-disc composed of TiO2 nanofibrous (NF) mats. It showed a large dynamic range with femto molar (fM) detection sensitivity, from a small volume of whole blood in 30 min. The device consists of several components for blood separation, metering, mixing, and washing that are automated for improved sensitivity from low sample volumes. Here, in the video demonstration, we show the experimental protocols and know-how for the fabrication of NFs as well as the disc, their integration and the operation in the following order: processes for preparing TiO2 NF mat; transfer-printing of TiO2 NF mat onto the disc; surface modification for immune-reactions, disc assembly and operation; on-disc detection and representative results for immunoassay. Use of this device enables multiplexed analysis with minimal consumption of samples and reagents. Given the advantages, the device should find use in a wide variety of applications, and prove beneficial in facilitating the analysis of low abundant proteins.

This protocol demonstrates how to achieve femto molar detection sensitivity of proteins in 10 &#181;L of whole blood within 30 min. This can be achieved by using electrospun nanofibrous mats integrated in a lab-on-a-disc, which offers high surface area as well as effective mixing and washing for enhanced signal-to-noise ratio.

Tüm Blood adlı ultrasensitive Protein Algılama için Tam Otomatik Santrifüj mikroakışkan Cihazı

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to entry for non-specialists who would benefit greatly from the ability to develop their own microfluidic devices to address research questions. Particularly lacking has been the open dissemination of protocols related to photolithography, a key step in the development of a replica mold for the manufacture of polydimethylsiloxane (PDMS) devices. While the fabrication of single height silicon masters has been explored extensively in literature, fabrication steps for more complicated photolithography features necessary for many interesting device functionalities (such as feature rounding to make valve structures, multi-height single-mold patterning, or high aspect ratio definition) are often not explicitly outlined. 
Here, we provide a complete protocol for making multilayer microfluidic devices with valves and complex multi-height geometries, tunable for any application. These fabrication procedures are presented in the context of a microfluidic hydrogel bead synthesizer and demonstrate the production of droplets containing polyethylene glycol (PEG diacrylate) and a photoinitiator that can be polymerized into solid beads. This protocol and accompanying discussion provide a foundation of design principles and fabrication methods that enables development of a wide variety of microfluidic devices. The details included here should allow non-specialists to design and fabricate novel devices, thereby bringing a host of recently developed technologies to their most exciting applications in biological laboratories.

Multilayer microfluidic devices often involve the fabrication of master molds with complex geometries for functionality. This article presents a complete protocol for multi-step photolithography with valves and variable height features tunable to any application. As a demonstration, we fabricate a microfluidic droplet generator capable of producing hydrogel beads.

Ventilli Katmanlı mikroakışkan Cihazlar için çok adımlı Değişken Yükseklik Fotolitografi

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to spatially fractionate the sample based on a biological property of interest. For the resultant spatial distribution to be used as the assay readout, microfluidic devices are often subjected to microscopic analysis requiring complex instrumentation with higher cost and reduced portability. To address this limitation, we have developed an integrated electronic sensing technology for multiplexed detection of particles at different locations on a microfluidic chip. Our technology, called Microfluidic CODES, combines Resistive Pulse Sensing with Code Division Multiple Access to compress 2D spatial information into a 1D electrical signal. In this paper, we present a practical demonstration of the Microfluidic CODES technology to detect and size cultured cancer cells distributed over multiple microfluidic channels. As validated by the high-speed microscopy, our technology can accurately analyze dense cell populations all electronically without the need for an external instrument. As such, the Microfluidic CODES can potentially enable low-cost integrated lab-on-a-chip devices that are well suited for the point-of-care testing of biological samples.

We demonstrate a microfluidic platform with an integrated surface electrode network that combines resistive pulse sensing (RPS) with code division multiple access (CDMA), to multiplex detection and sizing of particles in multiple microfluidic channels.

Parçacıkların Mekansal Takip için Çoklanmış Elektronik Algılama ile mikroakışkan Platformu

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

A Droplet-Based Microfluidic Approach and Microsphere-PCR Amplification for Single-Stranded DNA Amplicons

Droplet-based microfluidics enable the reliable production of homogeneous microspheres in the microfluidic channel, providing controlled size and morphology of the obtained microsphere. A microsphere copolymerized with an acrydite-DNA probe was successfully fabricated. Different methods such as asymmetric PCR, exonuclease digestion, and isolation on streptavidin-coated magnetic beads can be used to synthesize single-stranded DNA (ssDNA). However, these methods cannot efficiently use large amounts of highly purified ssDNA. Here, we describe a microsphere-PCR protocol detailing how ssDNA can be efficiently amplified and separated from dsDNA simply by pipetting from a PCR reaction tube. The amplification of ssDNA can be applied as potential reagents for the DNA microarray and DNA-SELEX (Systematic evolution of ligands by exponential enrichment) processes.

This work provides a method for the fabrication of droplet-based microfluidic platforms and the application of polyacrylamide microspheres for microsphere-PCR amplification. The microsphere-PCR method makes it possible to obtain single-stranded DNA amplicons without separating double-stranded DNA.