This work is supported in part by NIH-P41 P41-RRO3155 and NIH P50-GM076516 (grant to EG), and Fondazione Monte dei Paschi di Siena (grant to FB).

1. Sistem Kalibrasyon <ol><li> Nokta yayılma fonksiyonu (PSF) kalibrasyon <ol><li> Damıtılmış su içinde 90 ul, 30 ile floresan boncuk çözeltisi (yaklaşık 5 uM), 10 ul seyreltilir ve daha sonra 20 dakika boyunca ultrasonik titremeye maruz bırakılır çözeltisi. Bir kare (1 cm x 1 cm) agaroz jeli (% 3) ve depozit jel üstündeki çözeltisinin 10 ul parça kesin. 2 cm Petri kabı alt camına jel parçası devirmek ve camına damla sıkın. </li><li> , Satın alma kurulum açın tutucuya örnek koymak, kamera pozlama ve EMgain set (100 msn ve 1000 sistemine göre iyi parametrelerdir ama optimize) ve kamera soğumasını bekleyin. </li><li> 100 milisaniye, 1,000 kamera EMgain, edinim moduna ayarlayın kamera pozlama ayarı kaydetmek Transferi, 100 tekrarı ve otomatik Frame. </li><li> Jelin sınırında mercek ve iletilen ışık odaklama kullanılarak ve daha sonra, jel merkezine amacı hareket odaklanma ve sta ayarlamaklazer hizalama prosedürü rt (LAS AF, &#39;TIRF kurulum&#39; seçin ve otomatik hizalama prosedürünü izleyin). </li><li> Bir referans olarak (ki genellikle boncuk bütünü temsil) parlak noktaya odaklanmak doğru, izole tek noktalar ile bir görüş alanı bulun 100 kare kazanmak ve birkaç tek noktalar kazanmak için adımı 5-6 kez tekrarlayın. </li><li> Bir veri işleme programına edinilen serisi İthalat ve zaman içinde (Şekil 1A) yığını ortalama ve tek bir izole boncuk seçin. Parçacık agrega önlemek için küçük olanları seçmek için özen gösterin. </li><li> (Matlab Malzemelerinde ICS-Matlab araçları) komutu &quot;gaussfit&quot; kullanarak bir Gauss fonksiyonu ile seçilen yoğunluk dağılımı (tek boncuk profilinin bir örneğini Şekil 1B sunulmuştur) takınız. Elde edilen artıklar inceleyerek uyum iyiliğini doğrulayın (gelen artıklar ile donatılmış Gauss profilinin bir örneği i sunulmuşturn Şekil 1B). </li></ol></li><li> Kamera kalibrasyonu <ol><li> Kamerayı açın ve kamera soğumasını bekleyin. Set kamera alma ayarı, (yani, kullanılan kamera için biz 0.5 msn, 1.000 kamera EMgain, Kesilmiş Modu, 32 x 128, 10.000 tekrarlar için ROI boyutu edinim moduna pozu ayarlamak) ve kamera arka alımı başlatabilirsiniz sinyali. </li><li> İthalat bir veri işleme programı çerçeve serisi satın aldı. Hesaplayın ve kamera arka çipin seçilen bölgede yaklaşık düz olduğunu doğrulamak için her pikselin ortalama yoğunluğunu kontrol edin. Kamera plan genellikle sınır hatlarında önyargılı çünkü kırpılmış modunda, her çerçeve için ilk ve (ROI boyutuna bağlı olarak 3-10) son birkaç yatay satırları kaldırın. </li><li> Değerlerinin histogramı oluşturun (Matlab komut &#39;hist&#39; kullanarak) yığını elde edilen görüntü (aynı zamanda Dijital Seviye DL tanımlanan) ve logaritmasını arsafrekansını sonuçtaki (Matlab semiloloji komutunu kullanarak). Kamera arka DL dağılımının bir örneği, Şekil 2&#39;de gösterilmiştir. NOT: kamera iyi çalışıyorsa, komplo üslü (log ölçekli negatif eğimli bir çizgi izledi sıfır foton ilişkili değerlerin dağılımını temsil eden yaklaşık Gauss tepe (log-ölçekte bir parabolik profili) gösterecektir ) foton 1 (Şekil 2) ile ilişkili değerlerinin dağılımını temsil eder. Üstel kısmının çürümesi sürekli tek tek her foton kamera tarafından atanan DL bir tahmin temsil ederken, özellikle merkezi ve Gauss fonksiyonunun varyans, sırasıyla, ofset kamera ve hata temsil eder. Matlab malzemeleri destekleyen Script bölümünde &quot;CalibrateCamera&quot; kullanın. </li><li> Tüm seçilen Kamera EMGain ve Kazancı için işlemi tekrarlayın. </li></ol></li></ol> 2. EtiketliHücre Hazırlanması <ol><li> (1,2-dioleoyl- SN -glisero-3-fosfoetanolamin), lipid dahil 36 için gerekli olan lipozomları hazırlamak DOPE ayrı ayrı olarak 1 mg giderilmesi, DOTAP (1,2-dioleoil-3-trimetilamonyum propan-), 1 mg, ve kloroform, 1 ml PPE ATTO488 1 mg. 24 saat boyunca vakum altında bir araya 0,5 DOPE solüsyonu, DOTAP çözeltiden 0.5 ml ve PPE ATTO488 çözeltisi 25 ul kuru karıştırılır. 40 ° C&#39;de 15 dakika boyunca ultrasonik titremeye maruz bırakılır ve 15 dakika boyunca 20 mM HEPES tamponu, 0.5 ml, vorteksleyin. </li><li> , Hücre hazırlanması PBS ile birleşik CHO-K1 (Çin Hamsteri Yumurtalığı) bir p 100 tabak 3 kez yıkama, 5 dakika boyunca inkübatör içinde tripsin ve mağaza 1 ml ekleyin. % 10 FBS ile desteklenmiş DMEM / F12 ortamında 9 ml ilave müstakil hücrelerin süspansiyonu ve aynı ortamın 800 ul ihtiva eden bir Petri kabındaki hücre çözeltisinin 150 ul tohum. </li><li> 37 ° C&#39;de 24 saat boyunca kuluçka makinesi içinde depolayın ve% 5 CO2. Lipid eklenmesi için, 500 hücre orta yerineserumsuz ortam ul; 30 dakika sonra, lipozomlar çözeltisi 2 ul; ve PSB 15 dakika yıkamadan sonra görüntüleme için yeni DMEM / F12 orta ekleyin. </li><li> Transfaksiyon için, transfect hücreler görüntüleme önce inkübatör TfR-GFP plazmid ve mağaza 24 saat kullanarak Lipofektamin protokolü (Üretici talimatları) göre. </li></ol> 3. Veri Toplama <ol><li> Kurulum hazırlığı <ol><li> Mikroskop termostat amacıyla, deneyden önce 24 saat kuluçka açın. </li><li> Hızlı ulaşılabilir edinimi süresi uygulamak amacıyla, Kesilmiş Sensör Modu iş (giriş) ve hücre (kamera 2) seçmek için görüntüleme (kamera 1) ve ikinci kamera için bir ilk kamera kullanmak. Kurulum yapılandırmasına bir şeması Ek Şekil S1 sunulmuştur. Ardından, mikroskop iki kamera dönüşü uyum ve kameralar soğumasını bekleyin. </li><li> Iki kamera iletilen ışık görüntüleme parametreleri ayarlamak (yani </em&gt;, Pozlama süresi, EM Kazancı için 1) ve Aydınlık Alan modunda mikroskop koymak için 20 msn. </li><li> Sadece (burada 32 x 32 piksel ROI) hücre görüntüleme için kullanılan ROI ışık sağlayan yarıklar hafifçe itin tutucu örnekleri koyun ve mercek kullanarak odak, fotoğraf makinesi 1 ışık göndermek ve. </li><li> Seçilen bölgedeki bir hücreyi taşımak ve kamera 2 ışık göndermek, sonra bir başvuru olması için kamerayı 2. kontrol yazılımı bir ROI çizin. </li></ol></li><li> Görüntüleme (Şekil 3A) <ol><li> Öncelikle, sizin kurulum prosedürüne göre TIRF lazer hizalama. Bizim kurulumunda, &#39;TIRF kurulum&#39; seçin ve otomatik hizalama işlemini başlatmak. Lazer hizalandığında (yaklaşık 70 °) penetrasyon derinliği 70 nm ayarlayın. </li><li> Hem kamera 1 ve kamera 2 100 EMGain 70 msn ve pozlama süresi ayarlayın; Daha sonra, kamera 1 kullanarak bir hücreyi seçin, ardından kamera 2 ışık göndermek ve doğru hücre zarı odaklanın. Ca üzerinde asgari pozu ayarlamakmera 2, 1000 EMGain, Kesilmiş Sensör Modu, 10 5 tekrar ve set kaydetme dosyaları (Esnek Görüntü Nakil Sistemi, kolayca yönetilen bir biçimi) uygun olarak. </li><li> Görüntü serilerini kaydetmek için satın alma başlayın. Kazanç ve sonra, yeni bir hücre almadan önce sıcaklık stabilizasyonu sağlamak 8-10 hücrelerini elde etmek için son iki adımları tekrarlayın kırpılmış Modu bırakın. </li></ol></li></ol> Imaging&#39;e Mean Square Yerinden 4. Hesaplama (i MSD) Not: Aşağıdaki protokol, doğrudan ham verilere uygulanabilir. Aynı zamanda, tüm protokol Matlab ve SimFCS hem de simüle edilmiş veri satın alma için de geçerlidir. Gelen öğreticiler için bağlantı &#39;Malzeme&#39; bölümünde bulunabilir. <ol><li> Matlab ile Hesaplama <ol><li> ImportImageSeries script kullanarak Matlab&#39;a edinilen serisi aktarın. Co kullanarak zaman içinde her görüntünün ortalama yoğunluğunu hesaplamakmmand ilk 2 boyutlarına ortalama ve elde edilen vektör görmek için arsa kullanın. </li><li> Photobleaching% 10&#39;dan fazla varsa, dizi atmak veya onların ilk kısmını kaldırın. Daha düşük ise, 37 önce gösterildiği gibi, her bir görüntü için ortalama yoğunluğunu çıkarılarak korelasyon fonksiyonu üzerinde etkisini düzeltmek için çalışın. </li><li> Üçüncü boyut ortalamasını kullanarak her pikselin ortalama yoğunluğunu hesaplamak ve çıkan görüntü görüyorum. NOT: Özellikle dikkat artifaktüel korelasyon önlemek için gereklidir. Aslında, daha önce benzer teknikler 38, hücre sınırları yanı sıra odaklama veziküllerin üzerinden gösterildiği gibi bir güçlü bir korelasyon getirebilir. Ortalama görüntünün muayene hücre sınırları veya odak kesecikler dışında ortaya çıkarsa, aksi takdirde satın atmak dahil bölgeyi dışlamaya çalışıyorlar. Bu hareketsiz yapıların etkisini düzeltmek için her piksele 39 dan ortalama zamansal yoğunluğunu çıkarmak. </li><li> T hesaplayınişlevini CalculateSTICScorrfunc kullanarak o zamanmekansal korelasyon (G (ξ, χ, τ)). G (ξ, χ, 0) nedeniyle, düşük ışık rejimi atış gürültü korelasyon G hakim çünkü (0,0,0) sökün; nedeniyle detektöre korelasyon ölçülen bel artırarak τ = 0 g (ξ, χ, τ) deforme olabilir, bu süre boyunca G (± 1,0,0), ve parçacık hareketi hakimdir (bu etki, τ kaybolur &gt; 0) 34. </li><li> Daha sonra Malzeme desteklenmesinde &quot;LogBinStack&quot; fonksiyonunu kullanarak gürültüyü azaltmak ve bir logaritmik zaman-bin kullanılarak Ortalama G (ξ, χ, τ&gt; 0) (ξ, χ, τ) fonksiyonu kullanılarak &quot;gaussfit doğan&quot; G sığdırmak Malzemelerinde ICS-Matlab araçları i MSD (çıkan dizinin ikinci sütun) kurtarmak için. </li><li> Zamanın bir fonksiyonu olarak elde edilen bel σ (τ) 2, (i MSD) çizilir. Veri çok gürültülü ise, Edinim sayısını artırmak için çalışınIRED çerçeveler, birlikte lazer gücünü, ortalama daha fazla G (ξ, χ, τ) artırmak. </li></ol></li><li> SimFCS tarafından Hesaplama <ol><li> ImageJ BioFormat ithalatçı eklentisi kullanarak edinilen dosyalarını açın ve TIFF dizisi olarak iktisap dizi kaydedebilirsiniz. </li><li> Aç SimFCS seçin RICS aracı seçin ve Dosya&gt; İçe Çoklu Görüntüler (Ek Şekil S2). </li><li> Uygun pencereyi (Ek Şekil S3), Fit seçin doğru toplama parametreleri yerleştirin ve kapatın. </li><li> Ekran&gt; Ortalama Yoğunluk&gt; CH1 seçin ve photobleaching varlığını (Ek Şekil S4) doğrulayın. </li><li> Photobleaching% 10&#39;dan fazla mevcut ATIN serisi ise veya mümkün tekrar yük serisinin ilk bölümünü kaldırarak görüntü dizisi ise. </li><li> Ağartılması daha düşük% 10 Araçlar&gt; Eğer i MSD&gt; Set Parametreleri, sol bir on ROI panelinde set, &#39;kullan hareketli ortalama&#39; kontrolmuhabir zaman karakteristik difüzyon zaman daha yüksek olduğunu hareketli ortalama ödeme İlginiz için çerçeve koyu kahverengi (1 mikron 2 sn hareketli parçacık için -1 10 saniyelik bir zaman iyi bir hareketli ortalama) </li><li> Araçlar&gt; iMSD&gt; i MSD (Ek Şekil S5) ve zinde hesaplayın ve bloknot gelen i MSD ihracat (Ek Şekil S6). </li></ol></li></ol> I MSD gelen Difüzyon Kanunu 5. Hesaplama <ol><li> Kesişim (σ 0 2) hesaplamak için ilk birkaç puan Fit (5 puan genelde yeterli olur ama daha fazla puan onlar doğrusal bir davranış gösterir eğer takılabilir) ve daha önce ölçülen PSF 2 ile bu değeri karşılaştırın. Onlar karşılaştırılabilir iseniz, izole Flüoroforlann dinamikleri takip edilmektedir. Buna karşılık, σ 0 2 &gt;&gt; PSF 2 denemek sağlamak için daha hızlı elde etmek için isehiçbir gizli dinamikleri 34 mevcuttur. </li><li> Belirgin yayılımını (D app) denklem ve 3 ve 4 (bkz) kullanılarak, ortalama yer değiştirme (R) hesaplayın. </li><li> 12 FCS (Şekil 3D) göre yer değişimi ölçülür ile karşılaştırılabilir bir difüzyon kanunu elde etmek üzere Rl bir fonksiyonu olarak Arsa M app. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Tek parçacık izleme (SPT) moleküler dinamiklerini incelemek için en yaygın stratejilerden birini temsil ve parçacık yörüngeleri ölçüm büyük bir avantaja sahiptir. Bu da karmaşık bir sistemde bile birkaç etiketli parçacıkların davranışlarını sondalama sağlar. Bununla birlikte, tipik haliyle SPT sistemi ve çok parlak bir etiket düşük yoğunluklu ihtiyacı bu avantajı ulaşmak için. Sisteme, üretim, etiketleme ve yerleştirme karmaşık bir prosedür gerekli bu durumda: Özellikle, yüksek t...

Singer ve Nicolson tarafından orijinal &quot;sıvı mozaik&quot; modeli başlayarak, hücre plazma zarı resim sürekli iskeleti ve lipit etki 1,2 yükselen rolünü kapsayacak şekilde son yıllarda güncellendi. İlk gözlemler membran proteinlerinin önemli bir kısmı 3-5 hareketsiz olduğunu (sıkı bağlamak) açıklanması photobleaching sonra floresan iyileşme elde edilmiştir. Bu öncü çalışmalar, çok bilgilendirici olmasına rağmen, sıkı bağlamak kurulumları nispeten zayıf alan (mikron) olarak çözünürlük ve zaman (saniye) muzdarip. Ayrıca, bir topluluk ortalama ölçümü olmak, sıkı bağlamak tek molekül davranışı hakkında bilgi veren yoksun. Bu bağlamda, spesifik olarak bir olasılık (aynı anda bir difüzyon işlemi bir molekülün çalışma sağlayan) çok parlak etiketleri ile tek bir molekül etiketlemek için oldukça başarılı olmuştur. Özellikle, iterekve mikrosaniye zaman çizelgesi, Kusumi, büyük ölçüde membran fizyolojisi 6 aktin esaslı membran iskeletinin rolünün tanınması katkıda lipid ve protein dinamikleri bilinmeyen özellikleri ark. kazandı erişim için Tek Parçacık Takibi (SPT) yaklaşımı zaman çözünürlüğü , 7. Bu bulgular, lipid ve protein difüzyon aktin bazlı bir iskelet tarafından ayarlandığı, &quot;kazık ve çit&quot; modeli olarak adlandırılan oluşturulur. Ancak, SPT birçok deneysel konularda sağlanan bilgilerin büyük miktarda erişimi için ele alınması gerekir. Özellikle, etiketleme prosedürü genellikle sisteme etiketli türlerin üretimi, saflaştırılması ve tanıtım gibi birçok adımlarla oluşur. Ayrıca, büyük bir etiket, kuantum noktaları veya metal nanopartiküller gibi, çoğu zaman alt-milisaniye süreler ve bir çok durumda önlenebilir edilemeyen etiket ile hedef moleküllerinin çapraz bağlanmasını ulaşmak için gereklidir. Son olarak, birçok yörüngelerİstatistiksel kriterlerine uygun kaydedilecek olan ve eş zamanlı olarak etiketin bir düşük yoğunluklu izleme izin vermek için gereklidir. SPT ile karşılaştırıldığında, bu sakıncaları birçok üstesinden flüoresan korelasyon spektroskopisi (FCS), moleküler dinamiklerini incelemek için çok umut verici bir yaklaşımı temsil etmektedir. Aslında, FCS geçici transfekte hücrelerinde floresan protein etiketli moleküllerinin dinamiklerini incelemek sağlayan, loş ve yoğun etiketleri ile iyi de çalışıyor. Ayrıca, zaman sınırlı bir miktarda yüksek istatistikleri ulaşan verir. Son olarak, etiket &quot;yüksek&quot; yoğunluğuna rağmen FCS tek molekülleri bilgi sağlar. Tüm teşekkürler, bu özelliklere FCS çok düz bir yaklaşımı temsil etmektedir ve yoğun bir model membranlar ve canlı hücreler 8-10 hem lipid ve protein dinamikleri üzerinde çalışmak için uygulanmıştır. Birçok farklı yaklaşımlar moleküler difüzyon ayrıntılarını ortaya çıkarmak için FCS yeteneğini artırmak için önerilmiştir. Örneğin, sh wasKendi farklı büyüklükteki gözlem alanları FCS gerçekleştirerek bir molekül hareketlerinin 11,12 bir &quot;FCS difüzyon yasası&quot; aydınlatıcı gizli özellikleri tanımlayabilirsiniz. Boyutu değişmiştir olmanın yanı sıra, odak alanı da, 13 yinelenmiş oldu hızlı kameralarla 21,22 hatlarda 14-20 veya konjuge boyunca uzayda taşındı. Bu &#39;uzay-zamansal&#39; korelasyon yaklaşımlar kullanılarak, çeşitli membran bileşenlerinin ilgili biyolojik parametreler nicel modeli membranlar ve gerçek biyolojik olanlar, membran mekansal organizasyon haline tutulmakta ve böylece içgörü hem tarif edildi. Ancak, tüm FRAP ve FCS uygulamalarda şimdiye kadar tarif edilen fokal alanının boyutu aşılamayan uzamsal çözünürlüklü bir sınırı temsil eder. Çeşitli süper çözünürlüklü görüntüleme yöntemleri son zamanlarda bu sınırı aşmak için geliştirilmiştir. Bazıları böyle Stokastik optik yeniden mikroskobu (STORM) gibi, yerelleştirme hassas dayanmaktadır &lt;sup&gt; 23,24, foto-aktifleştirme lokalizasyon mikroskobu (PALM) 25, flöresanlı PALM (FPALM) 26 ve tek parçacık izleme PALM (sptPALM) 27: her anlık gerekli foton nispeten büyük miktarda bununla birlikte, zaman çözünürlüğü sınırlar En az birkaç milisaniye için bu yöntemler, bu nedenle in vivo olarak uygulanabilirliğini engellemektedir. Buna karşılık, süper çözünürlük görüntüleme için umut verici bir alternatif mekansal uyarılmış emisyon tükenmesi yöntemleri (STED&#39;in veya geri dönüşümlü doyabilen optik floresan geçişler (RESOLFT)) 28,29 ile floresan emisyonu modüle tarafından açılmıştır. Bu yaklaşımlar hızlı tarama mikroskopları ve algılama sistemleri kullanmaya imkanı ile gözlem hacminin şekillenmesini çok altında kırılma sınırını birleştirir. Flüoresan iniş-çıkışlarını analizi ile birlikte, doğrudan mikroskopi STED&#39;in lipidler ve p nano uzaysal dinamikleri prob bırakıldıcanlı hücre membranları içinde 30,31 roteinler. STED&#39;in bazlı mikroskopi aynı fiziksel miktarlar Canlı hücrelerdeki floresan etiketli zar proteinleri ve / veya lipidler dinamiklerinin çalışma için uygun modifiye edilmiş bir uzay-zaman görüntü korelasyon spektroskopisi (H TATİSTİKLERİ 32,33) yöntemi ile elde edilebilir ve ticari bir mikroskop ile. Burada sunulan deneysel protokol birkaç adımda oluşur. Birincisi, zar üzerinde ilgili bölgenin hızlı bir görüntüleme gerektirir. Daha sonra, elde edilen görüntülerin yığın ortalama uzaysal ve zamansal ilişki işlevleri hesaplamak için kullanılır. Bağıntı fonksiyonlarının bir dizi montaj olarak, molekül &quot;difüzyon kanunu &#39;belirgin bir difüzyon (D uygulaması) şeklinde görüntüleme şirketinden elde edilebilir - -Ortalama değiştirme grafiğinin. Bu komplo eleştirel molekülleri tarafından keşfedilmeyi ortama bağlıdır ve doğrudan gerçek difüzyon modları tanıma sağlarilgilenilen lipit / protein elde edilir. Daha önce 34 görüldüğü gibi ayrıntılı olarak, elde edilen görüntü serisi uzay-zamansal otomatik korelasyon fonksiyonu eleştirel toplanan resim serisi hareketli moleküllerin dinamiklerine bağlıdır (Aynı mantık bir hat satın uygulanabilir lütfen unutmayın Uzayda sadece tek boyut) olarak kabul edilir burada. Özellikle, korelasyon fonksiyonu olarak tanımlar: <img fo:content-width="2.3in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq1.jpg" width="230" /> (1) nerede <img fo:content-width=".5in" src="/files/ftp_upload/51994/xyt.jpg" width="50" /> , x konumuna, ölçülen floresans yoğunluğu temsil etmektedir, y-ve t de, <img fo:content-width=".08in" src="/files/ftp_upload/51994/e.jpg" width="8" /> ve <img fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/51994/x.jpg" width="10" /> temsil x mesafe vesırasıyla y yönlerinde, <img fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/51994/t.jpg" width="10" /> zaman aralığını temsil eder ve <img fo:content-width=".2in" src="/files/ftp_upload/51994/brackets.jpg" width="20" /> ortalamasını temsil eder. Bu fonksiyon, şu şekilde ifade edilebilir: <img fo:content-width="2.3in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq2.jpg" width="230" /> (2) &#39;N&#39;, gözlem alanında moleküllerin ortalama sayısı temsil ettiği, <img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/circlex.jpg" width="10" /> Uzayda büklüm operasyon temsil eder ve <img fo:content-width=".5in" src="/files/ftp_upload/51994/ex.jpg" width="50" /> enstrümantal bel otokorelasyonu temsil eder. Bu ikinci durum optik / kayıt kurulum için tek bir emitörün fotonlar uzayda yayılır nasıl bir önlem olarak yorumlanabilir (sözde Noktası Yayılması Fonksiyonu, PSF, geniyi) bir Gauss fonksiyonu tarafından yaklaşık ralli. Son olarak, <img fo:content-width=".5in" src="/files/ftp_upload/51994/ext.jpg" width="50" /> bir mesafede bir parçacık bulmak için olasılığını temsil eder <img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/e.jpg" width="10" /> ve <img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/x.jpg" width="10" /> bir süre geçtikten sonra <img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/t.jpg" width="10" /> . Biz parçacıkların her yöne rastgele hareket ve net tozları mevcut olmayan hangi bir uzadıya dinamikleri, düşünürsek, bu fonksiyon da iyi varyans hareketli parçacığın ortalama Meydanı Tehcirine (MSD) olarak tespit edilebilir bir Gauss fonksiyonu ile yaklaşılır . Bu durumda, korelasyon fonksiyonunun bel (ayrıca şu şekilde de ifade <img fo:content-width=".3in" src="/files/ftp_upload/51994/2t.jpg" width="30" /> ), Partikül İskelet toplamı ve enstrümantal bel olarak tanımlanabilir ve bir Gauss uyum ile ölçülebilirHer bir zaman gecikmesi için bağıntı fonksiyonunun anyonlar olabilecektir. Ölçülen ı MSD hareket eden moleküllerin belirgin bir yayılma hesaplamak için kullanılabilir <img fo:content-width=".4in" src="/files/ftp_upload/51994/dappt.jpg" width="40" /> ve bir ortalama yer değiştirme <img fo:content-width=".4in" src="/files/ftp_upload/51994/rt.jpg" width="40" /> gibi: <img fo:content-width="1.7in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq3.jpg" width="170" /> (3) <img fo:content-width="1.7in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq4.jpg" width="170" /> (4) Aşağıdaki bölümlerde boyunca okuyucuya rehberlik Kullanılan deney düzeneği üzerinde birkaç hususlar. Seçici ticari bir TIR floresan kullanarak, bir toplam iç yansıma (TIR) ​​aydınlatma kullanacak yaşayan hücrelerin bazal membran üzerinde florosforlar heyecanlandırmak için (TIRF) mikroskop (detaylar malzeme bölümünde bulunabilir). Ayrıca, sırayla th toplamakE floresan bir yüksek büyütmeli objektif kullanın ve (çip 16 mikron üzerinde piksel fiziksel boyutu) bir EMCCD kamera (100X NA 1.47, yüksek sayısal açıklık TIRF aydınlatma için gereklidir). 100 nm piksel boyutu ulaşmak için biz 1.6x ek bir büyütme merceği geçerlidir. Aşağıda tartışıldığı gibi, 1 ms altında bir zaman çözünürlüğü doğru 100 nm altında hızlı bir membran lipidlerinin dinamiklerini tanımlamak için gerekli olacaktır. Bu zamansal çözünürlüğe ulaşmak için biz kamera (512 x 512) bütün çip daha küçük faiz (ROI) bir bölgeyi seçmeniz gerekir. Bu şekilde, kamera zaman çözünürlüğü artırmak satır, daha az sayıda okuyacaktır. Ancak, bu okuma rejimde çerçeve zaman kamera üzerinde okuma çip maruz ücretleri değişiklikleri için gerekli ve 512 x 512 piksel EMCCD için milisaniye sırayla genellikle zaman ile sınırlı olacaktır. Bu sınırı yenmek için, gelişmekte olan bir teknoloji w, ROI-hatları, sadece yerine tüm çerçeveyi edilebiliyor(bizim EMCCD kırpılmış Sensör Modu denir) maruz çip boyutu bir pratik ve etkili azalma ITH. Bu yapılandırma, etkili olması için, dış ROI çip, optik bir yoldaki monte edilmiş delikli bir çift ile örtülmesi gerekir. Bir zaman çözünürlüğü aşağı 10 -4 saniye bu kurulum sayesinde elde edilebilir. &#39;Tartışma&#39; bölümünde açıklandığı gibi bu yaklaşım, birçok farklı deney düzeneklerinin ile birleştiğinde olabilir, ancak unutmayın. Yöntemin Gösterme GFP- bir ATTO488 etiketli hem 1-palmitoil-2-hidroksi-SN -glisero-3-fosfoetanolamin (ATTO488-PPE) ve transferrin alıcı bir GFP-etiketli varyantı kullanarak (canlı hücrelerde sağlanacaktır TfR). Daha önce 30,35 bildirildiği gibi ATTO488-KKD&#39;nin durumunda bu yaklaşım başarılı bir çoğunlukla ücretsiz difüzyon gösteren ortalama değiştirmesinin bir fonksiyonu olarak neredeyse sabit bir D uygulaması kurtarabilirsiniz. Buna karşılık, TfR-GFP azalan D göstermektedir <sukısmen sınırlı difüzyon 6 düşündüren ortalama değiştirmesinin bir fonksiyonu olarak b&gt; app. Ayrıca, ikinci durumda yerel difüzyon katsayısına ve membran düzlem üzerindeki pek çok mikrona kadar ortalama bir sınırlama alanını ölçmek mümkündür.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1142">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:183px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:480px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">iXon Ultra 897</td>
			<td style="width:183px;">Andor</td>
			<td>DU-897U-CS0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Solis</td>
			<td style="width:183px;">Andor</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">CHO-K1</td>
			<td style="width:183px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CCL-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ATTO 488 labeled PPE</td>
			<td style="width:183px;">ATTO-TEC GmbH</td>
			<td>AD 488-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">DOPE</td>
			<td style="width:183px;">Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">850725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">DOTAP</td>
			<td style="width:183px;">Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">890890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">100X Penicillin-Streptomycin-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">HEPES</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15630-106&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">PBS</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">SimFCS 3.0</td>
			<td style="width:183px;">Globals Software</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>the software can be downloaded here: http://www.lfd.uci.edu/globals/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMI6000 with TIRF modulus</td>
			<td style="width:183px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">LAS AF</td>
			<td style="width:183px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:183px;">Lipofectamine</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Matlab</td>
			<td style="width:183px;">MathWork</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Imagej</td>
			<td style="width:183px;">NIH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C-terminal GFP tagged Tranferrin Receptor</td>
			<td style="width:183px;">OriGene</td>
			<td>RG200980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Agar</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>A5306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Chloroform</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">528730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Latex beads, fluorescent yellow-green, 30 nm</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>L5155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">SONICA Ultrasonic Cleaners</td>
			<td>SOLTEC</td>
			<td style="width:119px;">ETH S3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Petri Dishes</td>
			<td style="width:183px;">Willco</td>
			<td>GWSt-3522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Bio-Format importer for Matlab</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.openmicroscopy.org/site/support/bio-formats5/users/matlab/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">ICS-MatLab Tools</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td><a href="https://www.cellmigration.org/resource/imaging/software/ICSMATLAB_28-02-06.zip">https://www.cellmigration.org/resource/imaging/software/ICSMATLAB_28-02-06.zip</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Simulation by Matlab Tutorial</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>https://www.cellmigration.org/resource/imaging/icsmatlab/ICSTutorial.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Simulation by SimFCS Tutorial</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>https://www.cellmigration.org/resource/imaging/ppt-pdf/RICS%20Simulations.ppt</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

from fast fluorescence imaging to molecular diffusion law on live cell membranes in a commercial microscope

Bu uzaysal dağılımı ve lipit ve protein gibi zar bileşenlerinin hareketi pek çok hücresel fonksiyonlarının düzenlenmesinde önemli bir etken olduğu giderek daha belirgin hale gelmiştir. Bununla birlikte, hızlı dinamikleri ve ilgili küçük yapılar için, çok yüksek uzay-zaman çözünürlüklü moleküllerin gerçek davranışlarını yakalamak için gereklidir. Burada yüksek uzaysal çözünürlüklü Canlı hücrelerdeki floresan etiketli plazma zar proteinleri ve lipidler dinamiğini çalışmak için deneysel protokol mevcut. Özellikle, bu yaklaşım, her bir molekülün izlendiği gerek yoktur, fakat zarın belirli bir bölgedeki tüm molekülleri kullanılarak nüfus davranışı hesaplar. Başlangıç ​​noktası, zar üzerinde belirli bir bölgenin hızlı görüntülenmesidir. Daha sonra, tam bir uzay-zaman otomatik bağıntı kurma fonksiyonu, örneğin, her biri 2, 3, n, tekrarları zaman gecikmeleri arttırmayı alınan görüntüleri ilişkilendirilmesi hesaplanır. Bu genişlik göstermek mümkündürdifüzyona bağlı parçacık hareketinin bir fonksiyonu olarak zaman gecikmesini arttırmayı mekansal otokorelasyon fonksiyonu artar pik. Bu nedenle, otokorelasyon fonksiyonların dizi montaj gerçek protein burada ortalama yer değiştirme karşı belirgin yayılma biçiminde, görüntüleme (iMSD) için ortalama kare deplasman elde etmek için olanak sağlar. Bu nanometre hassasiyetle tek moleküllerin ortalama dinamiklerinin kantitatif bir görünüm verir. Etiketli Transferin Reseptör (TfR) ve ATTO488 bir GFP etiketli varyantı kullanarak 1 Palmitoyl- 2-hidroksi sn -glisero-3-fosfoetanolamin (KKE) o üzerinde protein ve lipit difüzyon Spatiotemporal düzenlenmesini gözlemlemek mümkündür mikro kadar mili saniyelik bir zaman aralığında um boyutlu zar bölgeleri.

Protokol aşama 1.1 &#39;de tarif edildiği gibi etkili bel kalibre etmek için, tek bir floresan nano boncuk görüntü ölçü olabilir. Bu tür boncukların tipik floresan görüntü, Şekil 1 &#39;de sunulmuştur. 2B Gauss fonksiyonuyla yoğunluğu dağılımının uygun olarak geri artıkları verir ve 270 nm&#39;de ölçülmesi etkili bel verir. Bu değer Rayleigh denklemi tahmin beklenen kırılma sınırı ile iyi bir anlaşma olduğunu. Bu kalibrasyon parçacık dinamiği ölçümü için gerek...

Watch this Scientific Journal Video about From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope at JoVE.com

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

Ticari Mikroskop Canlı Hücre Zarları Moleküler Difüzyon Kanunu Hızlı Floresans Görüntüleme Gönderen

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

from-fast-fluorescence-imaging-to-molecular-diffusion-law-on-live

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.3K Görüntüleme.  Scuola Normale Superiore. Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

Video: From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular events. Viscosity is one of the key parameters affecting the diffusion of molecules and proteins, and changes in viscosity have been linked to disease and malfunction at the cellular level.1-3 While methods to measure the bulk viscosity are well developed, imaging microviscosity remains a challenge. Viscosity maps of microscopic objects, such as single cells, have until recently been hard to obtain. Mapping viscosity with fluorescence techniques is advantageous because, similar to other optical techniques, it is minimally invasive, non-destructive and can be applied to living cells and tissues.
Fluorescent molecular rotors exhibit fluorescence lifetimes and quantum yields which are a function of the viscosity of their microenvironment.4,5 Intramolecular twisting or rotation leads to non-radiative decay from the excited state back to the ground state. A viscous environment slows this rotation or twisting, restricting access to this non-radiative decay pathway. This leads to an increase in the fluorescence quantum yield and the fluorescence lifetime. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) of modified hydrophobic BODIPY dyes that act as fluorescent molecular rotors show that the fluorescence lifetime of these probes is a function of the microviscosity of their environment.6-8 A logarithmic plot of the fluorescence lifetime versus the solvent viscosity yields a straight line that obeys the F&ouml;rster Hoffman equation.9 This plot also serves as a calibration graph to convert fluorescence lifetime into viscosity.
Following incubation of living cells with the modified BODIPY fluorescent molecular rotor, a punctate dye distribution is observed in the fluorescence images. The viscosity value obtained in the puncta in live cells is around 100 times higher than that of water and of cellular cytoplasm.6,7 Time-resolved fluorescence anisotropy measurements yield rotational correlation times in agreement with these large microviscosity values. Mapping the fluorescence lifetime is independent of the fluorescence intensity, and thus allows the separation of probe concentration and viscosity effects. 
In summary, we have developed a practical and versatile approach to map the microviscosity in cells based on FLIM of fluorescent molecular rotors.

Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) has emerged as a key technique to image the environment and interaction of specific proteins and dyes in living cells. FLIM of fluorescent molecular rotors allows mapping of viscosity in living cells.

Yaşayan Hücreler Moleküler Rotorlar arasında Flüoresans Ömrü Görüntüleme

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

Biyomühendislik

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound healing, tissue regeneration, and cancer metastasis, cells must navigate through complex, three-dimensional extracellular tissue. To better understand the mechanisms behind these biological processes, it is important to examine the roles of the proteins responsible for driving cell migration. Here, we outline a protocol to study the mechanisms of cell migration using the epithelial cell line (MDCK), and a three-dimensional, fibrous, self-polymerizing matrix as a model system. This optically clear extracellular matrix is easily amenable to live-cell imaging studies and better mimics the physiological, soft tissue environment. This report demonstrates a technique for directly visualizing protein localization and dynamics, and deformation of the surrounding three-dimensional matrix. 
Examination of protein localization and dynamics during cellular processes provides key insight into protein functions. Genetically encoded fluorescent tags provide a unique method for observing protein localization and dynamics. Using this technique, we can analyze the subcellular accumulation of key, force-generating cytoskeletal components in real-time as the cell maneuvers through the matrix. In addition, using multiple fluorescent tags with different wavelengths, we can examine the localization of multiple proteins simultaneously, thus allowing us to test, for example, whether different proteins have similar or divergent roles. Furthermore, the dynamics of fluorescently tagged proteins can be quantified using Fluorescent Recovery After Photobleaching (FRAP) analysis. This measurement assays the protein mobility and how stably bound the proteins are to the cytoskeletal network.
By combining live-cell imaging with the treatment of protein function inhibitors, we can examine in real-time the changes in the distribution of proteins and morphology of migrating cells. Furthermore, we also combine live-cell imaging with the use of fluorescent tracer particles embedded within the matrix to visualize the matrix deformation during cell migration. Thus, we can visualize how a migrating cell distributes force-generating proteins, and where the traction forces are exerted to the surrounding matrix. Through these techniques, we can gain valuable insight into the roles of specific proteins and their contributions to the mechanisms of cell migration.

Cellular processes such as cell migration have traditionally been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. This report describes a technique for directly visualizing protein localization and analyzing protein dynamics in cells migrating in a more physiologically relevant, three-dimensional matrix.

Üç boyutlu Matrix floresan etiketli Proteinler ifade Geçiş Hücreler Canlı hücre Görüntüleme

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

Canlı Görüntüleme ve Yaralanma Yanıtları Çalışması için Mikroakiskan Chips kullanma<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an efficient manner. Typically, data for ~102 cells can be acquired within a 1 hr experiment. An automated image analysis program enables efficient post-experiment analysis of image data, enabling processing to be complete within a few hours. Our device geometry is unique in that cells must deform through a series of micron-scale constrictions, thereby enabling the initial deformation and time-dependent relaxation of individual cells to be assayed. The applicability of this method to human promyelocytic leukemia (HL-60) cells is demonstrated. Driving cells to deform through micron-scale constrictions using pressure-driven flow, we observe that human promyelocytic (HL-60) cells momentarily occlude the first constriction for a median time of 9.3 msec before passaging more quickly through the subsequent constrictions with a median transit time of 4.0 msec per constriction. By contrast, all-trans retinoic acid-treated (neutrophil-type) HL-60 cells occlude the first constriction for only 4.3 msec before passaging through the subsequent constrictions with a median transit time of 3.3 msec. This method can provide insight into the viscoelastic nature of cells, and ultimately reveal the molecular origins of this behavior.

We demonstrate a microfluidics-based assay to measure the timescale for cells to transit through a sequence of micron-scale constrictions.

Mikroakışkan Tekniği Hücre deformabilitesi Probe

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

Modifiye İki foton mikroskop 3D Orbital Takip: Hücre içi veziküllerin İzlemeye Bir Uygulama

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in their capability for measuring responses in real time in live cells or viable tissue. A protocol was developed with the use of a cell actuator to distend live cells grown on or tissues attached to an elastic substrate while imaging with confocal and atomic force microscopy (AFM). Preliminary studies show that tonic stretching of human bronchial epithelial cells caused a significant increase in the production of mitochondrial superoxide. Moreover, using this protocol, alveolar epithelial cells were stretched and imaged, which showed direct damage to the epithelial cells by overdistention simulating one form of lung injury in vitro. A protocol to conduct AFM nano-indentation on stretched cells is also provided.

A novel imaging protocol was developed using a custom motor-driven mechanical actuator to allow the measurement of real time responses to mechanical strain in live cells. Relevant to mechanobiology, the system can apply strains up to 20% while allowing near real-time imaging with confocal or atomic force microscopy.

Mekanik Stretch sırasında Canlı Hücre Görüntüleme

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after merging (FRAM). FRAM adopts the same principles as the fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) technique, especially for measuring fluorescence recovery after bleaching a specific area, but FRAM uses a drop coalescence instead of photobleaching dye molecules to induce a chemical potential gradient of dye molecules. Our technique has several advantages over FRAP: it only requires a fluorescence microscope rather than a confocal microscope equipped with high power lasers; it is essentially free from the selection of fluorescence dyes; and it has far more freedom to define the measured diffusion area. Furthermore, FRAM potentially provides a route for studying the mixing or inter-diffusion of two different surfactants, when the monolayers at a surface of droplet and at a flat air/water interface are prepared with different species, independently.

We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.

Bir Damlacık birleştirme sonra Floresan Kurtarma Fosfolipid Monolayer İki boyutlu Difüzyon Tedbir

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem cell (iPS) emerged as a new method in regenerative medicine. Although this tissue regeneration is promising, contamination with unwanted cells during tissue cultures is a major concern. Moreover, there is a safety concern regarding tumorigenicity after transplantation. Therefore, there is an urgent need for eliminating specific cells without damaging other cells that need to be protected, especially in established tissue. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture in vitro with near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT) without damaging non-targeted cells. This technique enables the elimination of specific cells from mixed cell cultures or tissues.

Eliminating specific cells without damaging other cells is extremely difficult, especially in established tissue, yet there is an urgent need for a cell elimination method in the tissue engineering field. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture using near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT).

Bir Yakın Kızılötesi Photoimmunotherapy Tekniği Karışık 3D Kültür seçici hücre Eliminasyon

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

Çoklu görüntüleme modları bir floresan mikroskop ile iletken

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Growth of Human and Sheep Corneal Endothelial Cell Layers on Biomaterial Membranes

Corneal endothelial cell cultures have a tendency to undergo epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) after loss of cell-to-cell contact. EMT is deleterious for the cells as it reduces their ability to form a mature and functional layer. Here, we present a method for establishing and subculturing human and sheep corneal endothelial cell cultures that minimizes the loss of cell-to-cell contact. Explants of corneal endothelium/Descemet&#39;s membrane are taken from donor corneas and placed into tissue culture under conditions that allow the cells to collectively migrate onto the culture surface. Once a culture has been established, the explants are transferred to fresh plates to initiate new cultures. Dispase II is used to gently lift clumps of cells off tissue culture plates for subculturing. Corneal endothelial cell cultures that have been established using this protocol are suitable for transferring to biomaterial membranes to produce tissue-engineered cell layers for transplantation in animal trials. A custom-made device for supporting biomaterial membranes during tissue culture is described and an example of a tissue-engineered graft composed of a layer of corneal endothelial cells and a layer of corneal stromal cells on either side of a collagen type I membrane is presented.

This protocol describes the critical steps required to establish and grow corneal endothelial cell cultures from explants of human or sheep tissue. A method for subculturing corneal endothelial cells on membranous biomaterials is also presented.