Ulusal Alkol İstismarı ve Alkolizm Enstitüsü (AA-016.967 ve AA016967-01S1; NIAAA TAM) tarafından sağlanan finansman, Wayne State Üniversitesi fonları başlatmak ve Wayne State Üniversitesi Araştırma Hibe Programı. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve NIAAA veya Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

1. Deneysel şartları Elektrot Fabrikasyon <ul type="circle"><li> Çoğu in-house yapılır bu yana çok sayıda karbon fiber Mikroelektronlar imalat yöntemleri vardır. Tipik olarak elektrot imalat detayları dikte elektrot (örneğin amperometri vs FSCV) uygulanır elektrokimyasal bir tekniktir. Mikroelektronlar FSCV için, aşağıdaki üç adım yordamı kullanarak in-house olabilir. Karbon fiber elektrod fabrikasyon daha eksiksiz bir açıklaması için, yeni bir Jüpiter 1. maddesinde bakın. Ancak, aşağıda açıklanan elektrotlar karşı yukarıda belirtilen protokol amperometrik karbon fiber Mikroelektronlar imal etmek için daha az adımları gerektiren silindirik karbon fiber Mikroelektronlar unutmayın. Bu basitleştirilmiş bir protokol, aseton içinde karbon fiber kaynar gerektirmez, cam kapilerleri yangın, parlatma veya cam-fiber kavşak mühür kullanılarak epoksi. </li><li> Vakum emme aspirkapiller microfilament (PM sistemleri, Carlsborg, WA uzunluğu 10 cm, od 1.2 mm id 0,68 mm) ile borosilikat cam, karbon fiber (Goodfellow Oakdale, PA çapı 7 mm) yedik. </li><li> Dişli, kılcal yarım çekti elektrot çektirmesi (Narishige, Tokyo, Japonya) içine kılcal yerleştirin. Elektrot çektirmesi için çıktı ayarları laboratuvardan laboratuvara değişir. Referans için, çektirmesi için çıkış ayarları ana mıknatıs 90.7, 23.2 sub-mıknatıs, ve ısıtıcı için 53.4. Çıkış ayarları ampirik olarak karbon fiber etrafında sıkı bir mühür ile yaklaşık 4.4 mm uzunluğunda bir cam konik oluşturmak için rafine edilmesi gerekir. </li><li> Mikroskop altında (Olympus, Tokyo, Japonya), karbon fiber, karbon fiber yaklaşık 50-200 mikron ağzı sıkıca kapatılmış bir arayüz çıkıntı izin cam ucu uzanan bir neşter bıçak kullanarak kırpın. </li></ul> Solüsyon hazırlama Üç tür yapay Cereninbrospinal sıvısı (aCSF) çözümleri tüm ultra saf su (18 M cm), önceden hazırlıklı olmak gerekir. <ul type="circle"><li> Sakkaroz-aCSF dilimleme en az bir gün önce hazırlanabilir. Sakaroz aCSF tampon (mM) oluşur: 180 sakaroz, 30 NaCl, 4.5 KCl, 1.0 MgCl 2, 26 NaHCO 3, 1.2 NaH 2 PO 4, ve 10 D-glukoz (pH 7.4) ve 95 kullanıyorsanız oksijenli olmalıdır 15 dakika 2 için% O 2 /% 5 CO 2. Vaktinden önce hazırlanmış ise, çözüm 4 buzdolabında tutulmalıdır ° C 1 hafta kadar. </li><li> Deney gün ACSF çözüm voltametrik kayıtları için hazırlıklı olmalısınız. 126 NaCl, 2.5 KCl, 2.4 CaCl 2, 1.2 MgCl 2, 25 NaHCO 3, 1.2 NaH 2 PO 4, 11 D-glukoz, 0.4 askorbik asit (pH, 7.4 &#39;): aCSF çözümü (mM) oluşur. Kurs süresince, oda sıcaklığında O2 /% 5 CO 2 ile% 95 köpürme oksijen deney . </li><li> Modified-elektrot kalibrasyonlar içerir aCSF çözeltisi (mM): 2.5 KCl, 126 NaCl, 1.2 NaH 2 PO 4, 2.4 CaCl 2, 1.2 MgCl 2, ve 25 NaHCO 3 (pH 7.4) ve bir hafta olmadan tutulabilir soğutma veya oksijenasyon. </li></ul> Elektrot Kalibrasyonu <ul type="circle"><li> Elektrot canlılığı ve duyarlılığı mühürlü bir referans elektrot (Ag / AgCl) ile 3 bağlantı noktası içeren bir akış &quot;t-hücre&quot; kullanarak, öncesi ve sonrası kalibrasyon, sırasıyla tarafından belirlenir. Fabrikasyon mikroelektrot akışı &quot;t-hücre&quot; içine indirdi. Giriş deliği modifiye aCSF 2 ml / dk akış hızında sürekli bir akış için izin veren bir şırınga pompası bağlıdır. &quot;T-hücre&quot; üçüncü bir bağlantı noktası, modifiye aCSF yapılan 3 mcM dopamin, ile dolu bir şırınga bağlı. </li><li> Önceden kalibre, modifiye aCSF çözüm yaklaşık 3 dakika boyunca akmasına izin - 7 saniye ve daha sonra elle 3 mcM dopamin standart 1-2 ml enjekte. Her bir elektrot içinönceden kalibre edilmesi için en az 3 kez ve ortalama her birinden elde edilen maksimal akımlar kalibrasyon tekrarlayın. </li><li> Dilim voltametri deneyi hemen sonra (bkz. Bölüm 3), elektrot, yukarıda açıklandığı gibi aynı şekilde yazılan kalibre. </li><li> Kalibrasyon faktörü (daha sonra, veri analizi sırasında kullanılan) dopamin standart konsantrasyonu ortalama dopamin oksidasyon (nA) akım bölünmesi ile tespit edilir. Örneğin, 3 mcM dopamin standardını kullanarak geçerli yanıt 3 ile bölünmüştür. </li></ul> 2. Dilim hazırlık <ol><li> Küçük bir beher, bir buz kovası ve yerine sakaroz aCSF 10 ml dökün. Ayrıca, ulaşmak içinde buz kovası anında yapıştırıcı (Loctite 404). </li><li> Alkol ped ile temiz silerek, bir tıraş bıçağı ve forseps, spatula, ve makas gibi, diseksiyon için gerekli gerekli araçları, hazırlayın. </li><li> Küçük bir gaz cha CO 2 boğulma fare Kurbanmber, keskin bir makas kullanarak hemen dekapitasyon takip. Tüm beyni hızla kaldırmak. Yaklaşık 10 dakika boyunca buz sakaroz aCSF beher beyin yerleştirin. </li><li> Bu arada, dilimleme Vibratome hazırlar. İlk olarak, numune banyosu bazı kırılmış buz koyun. Numune odasına yerleştirin ve sıkıca tutun sıkın. Hiç buz odasına alır emin yapmak, boşlukları doldurmak için numune odasının etrafında daha fazla buz ekleyin. Temizlenmiş jilet, Vibratome bıçak tutucu ve numune haznesi, buz sakaroz aCSF ile doldurun. </li><li> Beyin hazırlanması için bir çalışma yüzeyi kurmak için, bazı soğuk sakaroz aCSF kalkık bir Petri kabı üzerine yerleştirilmiş olan bir parça kağıt havlu üzerine dökün. Forseps kullanarak hazırlanan Petri kabı üzerine beyin transferi. Koronal dilimler için bir jilet ve atın medial-lateral ekseni boyunca beyincik kesti. Bu, Vibratome aşamada yapıştırılmış olabilir düz bir taban oluşturur. </li><li> Yernumune aşamasında Loctite yapıştırıcı bir damla (Adım 1 sırasında buz kovası yerleştirilir). Hemen yapıştırmayın sahnede hazırlanan beyin düz ucunu mümkün olduğunca dik tutarak. Numune odasında sahneye yerleştirin ve beyin odasında sakaroz aCSF tamamen dalmış olduğu sağlanması, vidayı sıkın. </li><li> Vibratome ön denetimleri kullanarak sahne ayarlamak böylece beynin üst jilet hatları. Vibratome için optimum parametreler düşük frekans ve hız ayarı ile elde edilir. Düşük hızlarda, yüksek hızlarda gözlenen beyin, Ezici bıçak gücü en aza indirmek için tercih edilmektedir. Dilim kalınlığı 400 mikron ayarlanır. </li><li> İlk birkaç dilim striatum içermeyecektir. Dilimleme striatum içeren dilimleri elde edinceye kadar tekrarlayın. Striatal bölgeye ulaşıldığında (anatomik simge tarafından teyit), bir beherdeki dilim ve yer kaldırmak için bir boya fırça kullanınoksijenli, oda sıcaklığı aCSF. Tipik olarak, kaudat putamen ve nukleus accumbens böylece striatal kompleksi içeren 3 - 4 dilim elde edebilirsiniz. </li><li> Dilimleri deneyler için kullanmadan önce en az 1 saat oda sıcaklığında oksijenli aCSF gelmesini sağlayın. </li></ol> 3. Kesitlerden Voltametrik kayıtları Dilimleri kuluçka edilirken, dilim kayıt odası hazırlanabilir. <ol><li> Bağlı tüp batırma kayıt odası (Özel Scientific, Denver, CO), oda sıcaklığında aCSF Oksijenleyici yer alın. Bir akış hızı 1 ml / dak perfüzyon pompası (Watson Marlow Limited, Falmouth, İngiltere) ayarlayın. 32 ° C&#39;ye kadar sıcaklık kontrolörü ayarlayın ACSF özel dahili bir dilim tutucu (hasır disk sahne değiştirilmiş) doldurur sonra, bir iğne şırınga (BD spinal iğne) kullanarak herhangi bir hava kabarcığı çıkarmadan dilim için hazırlamak. </li><li> Vakum çizerek Başbakan dilim banyoakışını başlatmak için bir şırınga kullanarak çıkış boru (cam sıvı atık şişe açan). Arabellek taşması kontrol dilim sahibinin kenarında bir fitil gibi davranmaya kimwipe yerleştirin. </li><li> 1 saat inkübasyondan sonra, sürekli% 95 O 2 /% 5 CO 2 oda sıcaklığı aCSF ile perfüze kayıt odasında tutucu, dilim dilim. </li><li> Ag / AgCl referans dilim tutucu elektrot (dilim haznesinin kapağı bantlanmış) ve başkanı aşamasında bir timsah klibi kullanarak elektrot bağlamak Batmak. <ul type="circle"><li> Ag / AgCl referans elektrot AgCl yüzeyinde ince bir tabaka yatırmak için 5 dakika için 1 M HCl (1 V) 250 mikron gümüş tel (AM Sistemleri, Carlsborg, WA) Eloksal ev yapılabilir gümüş tel. </li></ul></li><li> Striatal beyin kesit yüzeyi tungsten uyarıcı elektrot (Plastik, Roanoke, VA) indirin. Üst dayanmaktadır gibi uyarıcı elektrot dilim temas edinceye, ancak ponksiyon dilim olmamalıdır. Bizim deneysel, set-up stimülasyon nörolojik stimülatörü tarafından oluşturulur. </li><li> Karbon fiber çalışma mikroelektrot BD spinal iğne kullanılarak, 150 mM KCl çözeltisi ile tekrar doldurulur. Bir kurşun tel ChemClamp potansiyostat bir timsah klibi (Dagan Şirketler, Minneapolis, MN) kullanarak düşük gürültü kafa aşamasına bağlı (Squires Elektronik, Cornelius, OR), eklenir. Çalışma elektrot yerleştirilir yaklaşık 100 - 200 mikron uzaklıkta Bipolar uyarıcı elektrotlar, dilim derinliklerine yaklaşık 75 mikron. </li><li> Ya tek (monofazik, 350 uA, 60 Hz ve 4 ms darbe genişliği) veya birden fazla (örneğin 5 bakliyat, 350 uA, 20 Hz ve 4 ms geniş) bakliyat ile elektrik uyarılarının, nörotransmitter uyandırmak için uyarıcı elektrot tarafından verilmektedir sürüm 3. </li><li> Elektriksel olarak uyarılmış dopamin FSCV kullanarak ölçmek için, bir üçgen dalga formu elektrot uygulanır. Dop için tipik parametreleriamin algılama: karbon fiber mikroelektrot potansiyeli sonra 400 tarama hızı -0.4 V geri getirdi, 1,2 V olumlu bir sınır için rampalı bir Ag / AgCl referans elektrot, karşı -0.4 V düzenlenen V / s . </li><li> Dilim, elektriksel olarak 15 saniye boyunca her 5 dakikada çıkan dopamin efflux ve voltametrik ölçümleri yapılır uyarılmış. </li><li> En az üç kararlı elektriksel olarak uyarılan dopamin salınımını kayıtları (pik yüksekliği arasındaki fark &lt;% 10) sonra, ilgi farmakolojik ajan içeren aCSF dilim üzerinde maksimum etkiyi elde etmek için 30 dakika için 1 ml / dak akış hızında perfüze. Elektrikle uyarılan dopamin kayıtları farmakolojik perfüzyon sırasında her 5 dakikada bir yapılır. </li></ol> 4. Veri analizi Dilim elde sonuçlanan akım zamana izleri Wightman tarafından açıklandığı gibi, Michaelis-Menten tabanlı denklemlerin bir dizi doğrusal olmayan regresyon tarafından uygun olabilirve meslektaşları LabVIEW (National Instruments, Austin, Teksas) 4-6 yazılmış yazılım. Ve puls başına dopamin konsantrasyonunu (nM, bu yazılım, şimdiki zamana izlerini değişen iki parametre, V max (iz inen faz gösterdiği gibi dopamin taşıyıcı alımı oranına karşılık gelen nM / s) takılabilir. tepe yüksekliği maksimum karşılık gelen). Dopamin taşıyıcı dopamin yakınlığı yansıtan K m değeri, 160 nM ve değişmez. Elektrot kalibrasyon faktörü deney sonucunda belirlenir uydurma önce gereklidir. LabView yazılım determinasyon katsayısı (R 2) (R 2 değerleri&gt; 0.8) uyum iyiliği belirlemek için parametre içerir. 5. Temsilcisi Sonuçlar FSCV tek nabız, kaudat-koymak elektrikle uyarılan dopamin salınımı ve alımı incelemek için kullanılanamin (CPU), nükleus akumbens (NAC) çekirdek, ve farelerde NAC kabuk. Şekil 1A gösterilen Temsilcisi sonuçları geçerli (veya konsantrasyon) zamana araziler göstermektedir. Kırmızı ok karbon fiber mikroelektrot dopamin konsantrasyonunda değişikliklere ait akım miktarı karşılık gelen bir artış izledi dilim elektriksel stimülasyon uygulandığı zaman gösterir. Elektriksel stimülasyon sırasında baskın bir süreç dopamin salınımını, ancak böyle alımı ve difüzyon gibi diğer işlemler ve genel olarak gözlenen pik yüksekliği katkıda bulunur. Tepe azalan faz özellikle nöronal stimülasyon 7 durdu beri onun taşıyıcı nörotransmitter geri alım atfedilir. Ancak, difüzyon ve metabolizma akım azalması da katkıda tepe çürüme, geri alım sınırlı değildir. Elektrokimyasal ölçümler zaman ölçeğinde birkaç saniye içinde olduğundan, FSCV contributio ölçmek için çok hızlı olduğunu öne olmuşturmetabolizma 7 ns. Bu akım zamana izleri, y-ekseni sonrası deneme kalibrasyon faktörü konsantrasyonu (mcM) dönüştürülür. Şekil 1A içerlek ilgili arka plan şimdiki zamana izlerini siklik voltamogramları çıkarılır. Uygulanan potansiyeline karşı elektrot (x-ekseni) (y-ekseni) ölçülen akım çizim, dopamin kimyasal gözlenen oksidasyon pik ve dopamin-orto-kinon karşılık gelen bir azalma zirvesinde görülmektedir 0,6 V ile tanımlanır Ag / AgCl referans elektrot karşı 0,2 V. Verilerin üçüncü temsilini tek bir komplo oluşturmak için zamana izleri ve döngüsel voltammogram bilgileri birleştirerek üç boyutlu bir pseudo-color arsa (Şekil 1B) kullanır. Temsilcisi pseudo-color arsa, zaman, x-ekseni boyunca saniyede çizilir, karbon fiber çalışma mikroelektrot uygulanan gerilim y ekseni boyunca görülebilir ve mevcut fal olarak temsilz-ekseni boyunca se renk. Karbon fiber Mikroelektronlar (~ 7 mm çapında), küçük boyutu sayesinde, elektriksel olarak uyarılmış dopamin dinamikleri striatum (Şekil 2 CPU karşı NAC çekirdekli karşı NAC kabuk) ayrı anatomik bölgelerde tespit edilebilir. Striatal koronal dilimleri kullanarak bir avantajı dopamin hücre gövdeleri katkıları ortadan kaldırır ve presinaptik dopamin dinamiklerinin bir soruşturma sağlar. Diğerleri 16, 17 gösterildiği gibi presinaptik dopamin salınımı ve alımı kontrolü kesinlikle dopamin autoreceptor veya taşıyıcı fonksiyonları ile sınırlı değildir. Diğer nörotransmiter sistemlerinde Heteroreceptors da dopamin dinamikleri 18, 19 modüle. Şekil 3A gösterilen Temsilcisi akım zamana izleri dilimleri 30 dakika 1 mcM quinpirole (D2/D3 reseptör agonisti), elektrikle uyarılmış dopamin salınımını bir azalma ile tedavi edildiklerinde görülmektedir olduğunu göstermek. Diğer taraftan, ne zaman bir substratmetamfetamin olarak dopamin taşıyıcı, 30 dakika boyunca dilim üzerinde perfüze için, dopamin salınımını hiçbir fark görülmektedir (Şekil 3B). Pik çürüme, genellikle dopamin taşıyıcı kinetiği değişiklikler (K m) 3 ile ilişkili sağ, kaydırılır . Son olarak, dilim dopamin salınımını dinamikleri 20, 21 etkilemek için öne sürülmüştür 100 ng / mL beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF) çözümü, yıkanmış edildikten sonra Şekil 3C akım zamana eser temsil eden bir eser. Bu temsili eser, BDNF, elektrikle uyarılmış dopamin salınımını arttırmak için yeteneğinde olduğu görülebilir. Birlikte ele alındığında, bu farmakolojik tedaviler striatum içinde dopamin dinamikleri prob FSCV yararını vurgulamak. FSCV presinaptik dopamin dinamiğini incelemek için beyin dilimleri kullanarak birincil sınırlama sağlam bir beyin neurocircuitry kaybetmiş olmasıdır.Dilim FSCV ile zor katkıları bu sistemlerin araştırılmaktadır bölge işlevselliğini anlamak için (örneğin striatum) ya da olmayan uyarılan dopamin seviyelerini değerlendirmek için, diğer beyin bölgeleri nörotransmitterlerin etkilerini incelemek mümkün değildir. 24 - Bununla beraber, son teknik gelişmeler FSCV serbestçe farmakolojik manipülasyon, öz-yönetim, ya da yenilik 22 yanıt fareler hareketli dopamin geçici ölçümleri (ve elektriksel stimülasyon olmadan) için izin verdi . Genel olarak, dilim FSCV presinaptik dopamin dinamikleri hakkında değerli bilgiler sağlar ve mikrodiyaliz, elektrofizyoloji ve / veya serbestçe FSCV hareket gibi tamamlayıcı nörokimyasal teknikleri dilim FSCV sonuçları kaplin beyindeki nörotransmiter işleyişinin daha kapsamlı bir görünümünü sunmaktadır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3464/3464fig1.jpg" /> Şekil 1 dopamin elektrikle uyarılmışe sürüm C57Bl/6J fareler dorsal CPU dilim FSCV aşağıdaki tek-darbe stimülasyon kullanılarak ölçüldü. Dopamin salınımını tek bir darbe (kırmızı ok) tarafından uyarılmış olduğu (A) konsantrasyonu zamana iz. Tek yıldızla konsantrasyon, ağırlıklı olarak dopamin salınımını yükselişine katkıda bulunan faktörleri temsil eder, ama alımı ve difüzyon da katkıda bulunur. Nedeniyle alımı için değil, aynı zamanda difüzyon katkıda bulunur, başlangıca dönen çift yıldız tepe sinyal temsil eder. Ankastre ilgili döngüsel voltamogramları görüntüler. (B) dorsal CPU ekran zamanı (x-ekseni) Temsilcisi renkli çizimleri, sözde-renk karbon fiber mikroelektrot Ag / AgCl referans elektrot (y-ekseni) karşı potansiyel ve akım uygulanır. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3464/3464fig2.jpg" /> Şekil 2 NAC çekirdekli tek bir elektriksel stimülasyon darbe (kırmızı ok ile gösterilen) tarafından uyarılmış. Dopamin serbestC57Bl/6J fareler ve kabuk. (A ve C) NAC çekirdek ve kabuğunda zaman izleri ve bunlara karşılık gelen döngüsel voltamogramları (inset) karşı konsantrasyon. (B ve D) Daha önce NAC çekirdek ve kabuğunda, temsili renk araziler tarif. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3464/3464fig3.jpg" /> Şekil 3 dilim sonra Temsilcisi izleri, 30 dakika boyunca bir farmakolojik ajan ile tedavi edildi; her durumda, tek bir darbe CPU dopamin salınımını uyandırmak için kullanılır . (A) Uygulama, dopamin D2 reseptör agonisti quinpirole (kırmızı iz) tedavi öncesi (siyah iz) göre. (B) Metamfetamin perfüzyon (mor eser), tedavi öncesi (siyah iz). (C) beyin kaynaklı nörotrofik faktör yeteneği tedavi öncesi (siyah iz) göre (mavi iz) dopamin dinamiklerini etkilemek için.

<ol>
	<li>Pike, C. M., Grabner, C. P., Harkins, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+Amperometric+Electrodes.">Fabrication of Amperometric Electrodes.</a> J. Vis. Exp. (27), e1040-e1040 (2009).</li><li>Lack, A. K., Diaz, M. R., Chappell, A., DuBois, D. W., McCool, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+ethanol+and+withdrawal+differentially+modulate+pre-+and+postsynaptic+function+at+glutamatergic+synapses+in+rat+basolateral+amygdala.">Chronic ethanol and withdrawal differentially modulate pre- and postsynaptic function at glutamatergic synapses in rat basolateral amygdala.</a> J. Neuropyhysiol. 98, 3185-3196 (2007).</li><li>John, C. E., Jones, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltammetric+characterization+of+the+effect+of+monoamine+uptake+inhibitors+and+release+on+dopamine+and+serotonin+uptake+in+mouse+caudate-putamen+and+substantia+nigra+slices.">Voltammetric characterization of the effect of monoamine uptake inhibitors and release on dopamine and serotonin uptake in mouse caudate-putamen and substantia nigra slices.</a> Neuropharmacology. 52, 1596-1605 (2007).</li><li>Wightman, R. M., Amatore, C., Engstrom, R. C., Hale, P. D., Kistensen, E. W., Kuhr, W. G., May, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+characterization+of+dopamine+overflow+and+uptake+in+the+rat+striatum.">Real-time characterization of dopamine overflow and uptake in the rat striatum.</a> Neuroscience. 25, 513-523 (1988).</li><li>Wightman, R. M., Zimmerman, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+dopamine+extracellular+concentration+in+rat+striatum+by+impulse+flow+and+uptake.">Control of dopamine extracellular concentration in rat striatum by impulse flow and uptake.</a> Brain. Res. Brain. Res. Rev. 15, 135-144 (1990).</li><li>Jones, S. R., Garris, P. A., Kilts, C. D., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+dopamine+uptake+in+the+basolateral+amygdaloid+nucleus,+caudate-putamen,+and+nucleus+accumbens+of+the+rat.">Comparison of dopamine uptake in the basolateral amygdaloid nucleus, caudate-putamen, and nucleus accumbens of the rat.</a> J. Neurochem. 64, 2581-2589 (1995).</li><li>Michael, D. J., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrochemical+monitoring+of+biogenic+amine+neurotransmission+in+real+time.">Electrochemical monitoring of biogenic amine neurotransmission in real time.</a> J. Pharm. Biomed. Anal. 19, 33-46 (1999).</li><li>Pajski, M. L., Venton, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+release+evoked+by+short+electrical+stimulations+in+striatal+brain+slices+is+primarily+activity+dependent.">Adenosine release evoked by short electrical stimulations in striatal brain slices is primarily activity dependent.</a> A.C.S. Chem. Neurosci. 1, 775-787 (2010).</li><li>Sanford, A. L., Morton, S. W., Whitehouse, K. L., Oara, H. M., Lugo-Morales, L. Z., Roberts, J. G., Sombers, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltammetric+detection+of+hydrogen+peroxide+at+carbon+fiber+microelectrodes.">Voltammetric detection of hydrogen peroxide at carbon fiber microelectrodes.</a> Anal. Chem. 82, 5205-5210 (2010).</li><li>Park, J., Kile, B. M., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+voltammetric+monitoring+of+norepinephrine+release+in+the+rat+ventral+bed+nucleus+of+the+stria+terminalis+and+anteroventral+thalamic+nucleus.">In vivo voltammetric monitoring of norepinephrine release in the rat ventral bed nucleus of the stria terminalis and anteroventral thalamic nucleus.</a> Eur. J. Neurosci. 30, 2121-2133 (2009).</li><li>Hashemi, P., Dankoski, E. C., Petrovic, J., Keithley, R. B., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltammetric+detection+of+5-hydroxytryptamine+release+in+the+rat+brain.">Voltammetric detection of 5-hydroxytryptamine release in the rat brain.</a> Anal. Chem. 81, 9462-9471 (2009).</li><li>Borue, X., Cooper, S., Hirsh, J., Condron, B., Venton, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evaluation+of+serotonin+release+and+clearnece+in+drosophila.">Quantitative evaluation of serotonin release and clearnece in drosophila.</a> J. Neuroscience. Methods. 179, 300-308 (2009).</li><li>Vickrey, T. L., Condron, B., Venton, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+endogenous+dopamine+changes+in+drosophila+melanogaster+using+fast-scan+cyclic+voltammetry.">Detection of endogenous dopamine changes in drosophila melanogaster using fast-scan cyclic voltammetry.</a> Anal. Chem. 81, 9306-9313 (2009).</li><li>Makos, M. A., Han, K. A., Heien, M. L., Ewing, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+in+vivo+electrochemistry+to+study+the+physiological+effects+of+cocaine+and+other+stimulants+on+the+drosophila+melanogaster+dopamine+transporter.">Using in vivo electrochemistry to study the physiological effects of cocaine and other stimulants on the drosophila melanogaster dopamine transporter.</a> A.C.S. Chem Neurosci. 1, 74-83 (2009).</li><li>Budygin, E. A., John, C. E., Mateo, Y., Daunais, J. B., Friedman, D. P., Grant, K. A., Jones, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+ethanol+exposure+alters+presynaptic+dopamine+function+in+striatum+of+monkeys:+a+preliminary+study.">Chronic ethanol exposure alters presynaptic dopamine function in striatum of monkeys: a preliminary study.</a> Synapse. 50, 266-268 (2003).</li><li>Jones, S. R., Gainetdinov, R. R., Jaber, M., Giros, B., Wightman, R. M., Caron, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profound+neuronal+plasticity+in+response+to+inactivation+of+the+dopamine+transporter.">Profound neuronal plasticity in response to inactivation of the dopamine transporter.</a> PNAS. 95, 4029-4034 (1998).</li><li>Kennedy, R. T., Jones, S. R., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+observation+of+dopamine+autoreceptor+effects+in+rat+striatal+slices.">Dynamic observation of dopamine autoreceptor effects in rat striatal slices.</a> J. Neurochem. 59, 449-445 (1992).</li><li>Rice, M. E., Cragg, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+amplifies+reward-related+dopamine+signals+in+striatum.">Nicotine amplifies reward-related dopamine signals in striatum.</a> Nat. Neurosci. 7, 583-584 (2004).</li><li>Zhang, L., Doyon, W. M., Clark, J. J., Phillips, P. E., Dani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controls+of+tonic+and+phasic+dopamine+transmission+in+the+dorsal+and+ventral.">Controls of tonic and phasic dopamine transmission in the dorsal and ventral.</a> 76, 396-404 (2009).</li><li>Paredes, D., Grnaholm, A. C., Bickford, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+NGF+and+BDNF+on+baseline+glutamate+and+dopamine+release+in+the+hippocampal+formation+of+the+adult+rat.">Effects of NGF and BDNF on baseline glutamate and dopamine release in the hippocampal formation of the adult rat.</a> Brain. Res. 11141, 56-64 (2007).</li><li>Goggi, J., Puller, I. A., Carney, S. L., Bradford, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+pathways+involved+in+the+short-term+potentiation+of+dopamine+release+by+BDNF.">Signalling pathways involved in the short-term potentiation of dopamine release by BDNF.</a> Brain. Res. 968, 156-161 (2003).</li><li>Cheer, J. F., Wassum, K. M., Heien, M. L., Phillips, P. E., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoids+enhance+subsecond+doapmine+relese+in+the+nucleus+accumbens+of+awake+rats.">Cannabinoids enhance subsecond doapmine relese in the nucleus accumbens of awake rats.</a> J. Neurosci. 24, 4393-4400 (2004).</li><li>Phillips, P. E., Stuber, G. D., Heien, M. L., Wightman, R. M., Carelli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsecond+dopamine+release+promotes+cocaine+seeking.">Subsecond dopamine release promotes cocaine seeking.</a> Nature. 422, 614-618 (2003).</li><li>Robinson, D. L., Heien, M. L., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+of+dopamine+concentration+transients+increases+in+dorsal+and+ventral+striatum+of+male+rats+duing+introduction+of+conspecifics.">Frequency of dopamine concentration transients increases in dorsal and ventral striatum of male rats duing introduction of conspecifics.</a> J. Neurosci. 22, 10477-10486 (2002).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada sunulan protokol FSCV deneyler fare koronal beyin dilimleri hazırlamak ve nasıl kullanılacağını gösteriyor. 11 - Bu yöntem dopamin dinamiklerini elde etmek ve ölçmek için özel olmasına rağmen, diğer nörotransmitterlerin gibi adenozin, hidrojen peroksit, noradrenalin ve serotonin FSCV 3, 8 ile in vivo ve in vitro olarak takip edilmiştir. FSCV bazı çalışma elektrot 3, 11 uygulanan dalga basit değişiklikler ile bu diğer nörokimyasalların iz...

<table border="1"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Şirket </td><td> CAS numarası </td></tr><tr><td width="274"> Reaktif </td><td></td><td></td></tr><tr><td width="274"> Potasyum klorid </td><td> Balıkçı </td><td width="142" valign="top"> 7447407 </td></tr><tr><td width="274"> Sodyum klorür </td><td> Merck Kimyasallar </td><td width="142" valign="top"> 7647145 </td></tr><tr><td width="274"> Magnezyum klorür </td><td width="194" valign="top"> Balıkçı </td><td width="142" valign="top"> 7791186 </td></tr><tr><td width="274"> Kalsiyum klorür </td><td width="194" valign="top"> Balıkçı </td><td width="142" valign="top"> 10035048 </td></tr><tr><td width="274"> Sodyum bikarbonat </td><td width="194" valign="top"> Merck Kimyasallar </td><td width="142" valign="top"> 144558 </td></tr><tr><td width="274"> Sodyum fosfat, Dibazik </td><td width="194" valign="top"> Merck Kimyasals </td><td width="142" valign="top"> 7558794 </td></tr><tr><td width="274"> D-glukoz </td><td width="194" valign="top"> Balıkçı </td><td width="142" valign="top"> 50997 </td></tr><tr><td width="274"> Askorbik asit </td><td width="194" valign="top"> Balıkçı </td><td width="142" valign="top"> 50817 </td></tr><tr><td width="274"> Sakaroz </td><td width="194" valign="top"> Balıkçı </td><td> 57501 </td></tr><tr><td width="274">&nbsp;</td><td width="194" valign="top">&nbsp;</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td width="274"> Malzemeler </td><td width="194" valign="top"> Satıcı </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td width="274"> Karbon fiber </td><td> Goodfellow Oakdale, PA </td><td></td></tr><tr><td width="274"> Cam kapiller </td><td> AM Sistemleri Carlsborg WA. </td><td> 602000 </td></tr><tr><td width="274"> Gümüş tel </td><td> A-M Sistemleri Carlsborg WA. </td><td> 787000 </td></tr><tr><td width="274"> Tungsten uyarıcı elektrot </td><td> Plastik biri, Roanoke, VA </td><td></td></tr><tr><td width="274"> Platin tel </td><td></td><td></td></tr><tr><td width="274"> Kurşun tel </td><td> Squires Elektronik, Cornelius, OR </td><td></td></tr><tr><td width="274"> Loctite 404 anında yapıştırıcı </td><td> Hankal Corp Rocky Hill CT. </td><td></td></tr><tr><td width="274"> Jilet </td><td> Dünya hassas Instruments Inc FL. </td><td></td></tr><tr><td width="274"> BD Spinal iğne </td><td> BD Tıp sistemleri, Franlin Gölü, NJ </td><td> REF 405.234 </td></tr><tr><td width="274"> Cerrahi Bıçak </td><td> Tüy Güvenlik jilet LTD. Japonya </td><td></td></tr><tr><td width="274"></td><td></td><td></td></tr><tr><td width="274"> Yazılım </td><td width="194" valign = &quot;top&quot;&gt; Satıcı </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td width="274"> TH yazılım </td><td> ESA A.Ş., Chelmsford, MA </td><td></td></tr><tr><td width="274"> Enstrüman </td><td width="194" valign="top"> Satıcı </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td width="274"> Daldırma kayıt odası </td><td> Özel Scientific, Denver, CO </td><td></td></tr><tr><td width="274"> Neorolog uyaran izolatör </td><td> Digitmeter, Hertfordshire, İngiltere </td><td></td></tr><tr><td width="274"> Otomatik sıcaklık kontrolörü </td><td> Warner Instrument Corporation </td><td></td></tr><tr><td width="274"> Mikroskobu (SZX7) </td><td> Olympus </td><td></td></tr><tr><td width="274"> Mikroskop </td><td> Balıkçı </td><td></td></tr><tr><td width="274"> Vibratome 3000 kesit sistemi </td><td> St. Lou, MO. </td><td></td></tr><tr><td width="274"> Perfüzyon pompası </td><td> Watson Marlow Limited, Falmouth Cornwall - İngiltere </td><td> H110708 </td></tr><tr><td width="274"> Mikropipet çektirmesi </td><td> Narishige, Tokyo, Japonya </td><td></td></tr><tr><td width="274"> ChemClamp potansiyostat </td><td> Dagan Şirketler, Minneapolis, MN. </td><td></td></tr></tbody></table>

presynaptic dopamine dynamics in striatal brain slices with fast-scan cyclic voltammetry

Kapsamlı araştırma kötüye ilaçlar (örneğin kokain ve amfetamin), oynadığı rol psikiyatrik hastalıklar (örneğin şizofreni ve Dikkat Eksikliği Hiperaktivite Bozukluğu) ve dejeneratif katılımının eylem mekanizması önemi nedeniyle nörotransmiter dopamin odaklandı Parkinson ve Huntington hastalığı gibi bozukluklar. Normal fizyolojik koşullar altında, dopamin lokomotor aktivite, biliş, öğrenme, duygusal etkiler, ve nöroendokrin hormonu salgılamasını düzenleyen bilinmektedir. Dopamin nöronları en büyük yoğunluklarının biri, striatum, nukleus accumbens ve kaudat-putamen olarak bilinen iki ayrı nöroanatomik bölgelerdeki ayrılabilir içinde. Amaç fare striatum içinde dilim hızlı tarama döngüsel voltametri (FSCV) için genel bir protokol göstermek için. FSCV d gerçek zamanlı olarak, dopamin salınımı ve alımı ölçmek için fırsat sağlayan iyi tanımlanmış bir elektrokimyasal tekniğiiscrete beyin bölgeleri. FSCV Karbon fiber Mikroelektronlar dopamin oksidasyon (~ 7 mm çapında) tespit etmek için kullanılır. Dopamin algılamak için FSCV kullanarak analitik avantajı in vivo mikrodiyaliz tamamlayıcı bilgiler sağlayarak, en az on mikron 100 milisaniye ve uzaysal çözünürlüğü, gelişmiş temporal çözünürlük .

Watch this Scientific Journal Video about Presynaptic Dopamine Dynamics in Striatal Brain Slices with Fast-scan Cyclic Voltammetry at JoVE.com

Presynaptic Dopamine Dynamics in Striatal Brain Slices with Fast-scan Cyclic Voltammetry

Striatal beyin dilimleri elektriksel olarak uyarılmış presinaptik dopamin dinamiklerini ölçmek için hızlı tarama döngüsel voltametri kullanma.

Hızlı tarama Cyclic Voltametri striatal Beyin Slices presinaptik dopamin Dinamiği

Extensive research has focused on the neurotransmitter dopamine because of its importance in the mechanism of action of drugs of abuse (e.g. cocaine and ...

presynaptic-dopamine-dynamics-striatal-brain-slices-with-fast-scan

Research

JoVE Journal

Neuroscience

21.7K Görüntüleme.  Wayne State University. Striatal beyin dilimleri elektriksel olarak uyarılmış presinaptik dopamin dinamiklerini ölçmek için hızlı tarama döngüsel voltametri kullanma.

Video: Presynaptic Dopamine Dynamics in Striatal Brain Slices with Fast-scan Cyclic Voltammetry

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Kemirgen Beyin Dilimleri Nöronlar Vibrodissociation Sinaptik İletim ve Görüntü Presinaptik Terminalleri Eğitim

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Nörobilim

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output. During development, this activity is important for the migration and differentiation of cortex cell types and the formation of neuronal connections1. In the mature animal, ongoing activity reflects the past and the present state of an animal into which sensory stimuli are seamlessly integrated to compute future actions. Thus, a clear understanding of the organization of ongoing i.e. spontaneous activity is a prerequisite to understand cortex function. 
Numerous recording techniques revealed that ongoing activity in cortex is comprised of many neurons whose individual activities transiently sum to larger events that can be detected in the local field potential (LFP) with extracellular microelectrodes, or in the electroencephalogram (EEG), the magnetoencephalogram (MEG), and the BOLD signal from functional magnetic resonance imaging (fMRI). The LFP is currently the method of choice when studying neuronal population activity with high temporal and spatial resolution at the mesoscopic scale (several thousands of neurons). At the extracellular microelectrode, locally synchronized activities of spatially neighbored neurons result in rapid deflections in the LFP up to several hundreds of microvolts. When using an array of microelectrodes, the organizations of such deflections can be conveniently monitored in space and time. 
Neuronal avalanches describe the scale-invariant spatiotemporal organization of ongoing neuronal activity in the brain2,3. They are specific to the superficial layers of cortex as established in vitro4,5, in vivo in the anesthetized rat 6, and in the awake monkey7. Importantly, both theoretical and empirical studies2,8-10 suggest that neuronal avalanches indicate an exquisitely balanced critical state dynamics of cortex that optimizes information transfer and information processing.
In order to study the mechanisms of neuronal avalanche development, maintenance, and regulation, in vitro preparations are highly beneficial, as they allow for stable recordings of avalanche activity under precisely controlled conditions. The current protocol describes how to study neuronal avalanches in vitro by taking advantage of superficial layer development in organotypic cortex cultures, i.e. slice cultures, grown on planar, integrated microelectrode arrays (MEA; see also 11-14).

A robust way to study neuronal avalanches, i.e. scale-invariant spatio-temporal activity bursts, indicative of critical state dynamics in cortex. Avalanches emerge spontaneously in developing superficial layers of cultured cortex which allows for long-term measurements of the activity with planar integrated multi-electrode arrays (MEA) under precisely controlled conditions.

Organotipik Kültürleri nöronal Çığ Çok elektrot Dizi Kayıtlar

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Voltage Biasing, Cyclic Voltammetry, &amp; Electrical Impedance Spectroscopy for Neural Interfaces

Electrical impedance spectroscopy (EIS) and cyclic voltammetry (CV) measure properties of the electrode-tissue interface without additional invasive procedures, and can be used to monitor electrode performance over the long term. EIS measures electrical impedance at multiple frequencies, and increases in impedance indicate increased glial scar formation around the device, while cyclic voltammetry measures the charge carrying capacity of the electrode, and indicates how charge is transferred at different voltage levels. As implanted electrodes age, EIS and CV data change, and electrode sites that previously recorded spiking neurons often exhibit significantly lower efficacy for neural recording. The application of a brief voltage pulse to implanted electrode arrays, known as rejuvenation, can bring back spiking activity on otherwise silent electrode sites for a period of time. Rejuvenation alters EIS and CV, and can be monitored by these complementary methods. Typically, EIS is measured daily as an indication of the tissue response at the electrode site. If spikes are absent in a channel that previously had spikes, then CV is used to determine the charge carrying capacity of the electrode site, and rejuvenation can be applied to improve the interface efficacy. CV and EIS are then repeated to check the changes at the electrode-tissue interface, and neural recordings are collected. The overall goal of rejuvenation is to extend the functional lifetime of implanted arrays.

The electrode-tissue interface of neural recording electrodes can be characterized with electrical impedance spectroscopy (EIS) and cyclic voltammetry (CV). Application of voltage biasing changes the electrochemical properties of the electrode-tissue interface and can improve recording capability. Voltage biasing, EIS, CV, and neural recordings are complementary.

Sinir Arayüzler için voltaj kutuplanması, Voltametri, ve Elektrik Empedans Spektroskopisi

Electrical impedance spectroscopy (EIS) and cyclic voltammetry (CV) measure properties of the electrode-tissue interface without additional invasive ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Organotipik Hipokampal Dilimleri eşleştirilmiş Tüm Hücre Kayıtlar

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Beyin Dilimleri tüm hücre Patch-kelepçe Kayıtlar

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Modeling Fast-scan Cyclic Voltammetry Data from Electrically Stimulated Dopamine Neurotransmission Data Using QNsim1.0

Central dopaminergic (DAergic) pathways have an important role in a wide range of functions, such as attention, motivation, and movement. Dopamine (DA) is implicated in diseases and disorders including attention deficit hyperactivity disorder, Parkinson's disease, and traumatic brain injury. Thus, DA neurotransmission and the methods to study it are of intense scientific interest. In vivo fast-scan cyclic voltammetry (FSCV) is a method that allows for selectively monitoring DA concentration changes with fine temporal and spatial resolution. This technique is commonly used in conjunction with electrical stimulations of ascending DAergic pathways to control the impulse flow of dopamine neurotransmission. Although the stimulated DA neurotransmission paradigm can produce robust DA responses with clear morphologies, making them amenable for kinetic analysis, there is still much debate on how to interpret the responses in terms of their DA release and clearance components. To address this concern, a quantitative neurobiological (QN) framework of stimulated DA neurotransmission was recently developed to realistically model the dynamics of DA release and reuptake over the course of a stimulated DA response. The foundations of this model are based on experimental data from stimulated DA neurotransmission and on principles of neurotransmission adopted from various lines of research. The QN model implements 12 parameters related to stimulated DA release and reuptake dynamics to model DA responses. This work describes how to simulate DA responses using QNsim1.0 and also details principles that have been implemented to systematically discern alterations in the stimulated dopamine release and reuptake dynamics.

Fast-scan cyclic voltammetry can monitor in vivo dopamine neurotransmission in the context of drugs, disease, and other experimental manipulations. This work describes the implementation of QNsim1.0, a software to model electrically stimulated dopamine responses according to the quantitative neurobiological model to quantify estimates of dopamine release and reuptake dynamics.

QNsim 1.0&#39;u Kullanarak Elektromanyetik Uyarılmış Dopamin Nörotransmisyon Verisinden Hızlı Tarama Çevrimsel Voltametri Veri Modellenmesi

Central dopaminergic (DAergic) pathways have an important role in a wide range of functions, such as attention, motivation, and movement. Dopamine (DA) is ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Nöronal Dendrites beyin dilimleri içinde iki fotonlu kalsiyum görüntüleme

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. Single-molecule imaging is gaining momentum as it provides exceptional access to the visualization of individual molecules in living cells. Here, we describe a technique that we developed to perform single-particle tracking photo-activated localization microscopy (sptPALM) in Drosophila larvae. Synaptic communication relies on key presynaptic proteins that act by docking, priming, and promoting the fusion of neurotransmitter-containing vesicles with the plasma membrane. A range of protein-protein and protein-lipid interactions tightly regulates these processes and the presynaptic proteins therefore exhibit changes in mobility associated with each of these key events. Investigating how mobility of these proteins correlates with their physiological function in an intact live animal is essential to understanding their precise mechanism of action. Extracting protein mobility with high resolution in vivo requires overcoming limitations such as optical transparency, accessibility, and penetration depth. We describe how photoconvertible fluorescent proteins tagged to the presynaptic protein Syntaxin-1A can be visualized via slight oblique illumination and tracked at the motor nerve terminal or along the motor neuron axon of the third instar Drosophila larva.

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Here we illustrate how single molecule photo-activated localization microscopy can be carried out on the motor nerve terminal of a live Drosophila melanogaster third instar larva.

Vivo Tek molekül Drosophila Presynaptic Motor sinir Terminal izleme

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, they may function to regulate the developmental process and/or physiological function in neonatal brains. To investigate neurobiological functions of specific genes in the brain, it is essential to inactivate genes in the brain. Here, we describe a simple stereotaxic method to inactivate gene expression in the striatum of transgenic mice at neonatal time windows. AAV-eGFP-Cre viruses were microinjected into the striatum of Ai14 reporter gene mice at postnatal day (P) 2 by stereotaxic brain surgery. The tdTomato reporter gene expression was detected in P14 striatum, suggesting a successful Cre-loxP mediated DNA recombination in AAV-transduced striatal cells. We further validated this technique by microinjecting AAV-eGFP-Cre viruses into P2Foxp2fl/fl mice. Double labeling of GFP and Foxp2 showed that GFP-positive cells lacked Foxp2 immunoreactivity in P9 striatum, suggesting the loss of Foxp2 protein in AAV-eGFP-Cre transduced striatal cells. Taken together, these results demonstrate an effective genetic deletion by stereotaxically microinjected AAV-eGFP-Cre viruses in specific neuronal populations in the neonatal brains of floxed transgenic mice. In conclusion, our stereotaxic technique provides an easy and simple platform for genetic manipulation in neonatal mouse brains. The technique can not only be used to delete genes in specific regions of neonatal brains, but it also can be used to inject pharmacological drugs, neuronal tracers, genetically modified optogenetics and chemogenetics proteins, neuronal activity indicators and other reagents into the striatum of neonatal mouse brains.

We describe a protocol of stereotaxic surgery with a homemade head-fixed device for microinjecting reagents into the striatum of neonatal mouse brains. This technique allows genetic manipulation in neuronal cells of specific regions of neonatal mouse brains.

Yenidoğan fare beyin Striatal hücrelerdeki genetik manipülasyon için stereotaksik cerrahi

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from parallel fibers (PF) to Purkinje cells (PC) is considered the basis for motor learning, and deficiencies of both LTD and motor learning are observed in various gene-manipulated animals. Common motor learning sets, such as adaptation of the optokinetic reflex (OKR), the vestibular-ocular reflex (VOR), and rotarod test were used for evaluation of motor learning ability. However, results obtained from the GluA2-carboxy terminus modified knock-in mice demonstrated normal adaptation of the VOR and the OKR, despite lacking PF-LTD. In that report, induction of LTD was only attempted using one type of stimulation protocol at room temperature. Thus, conditions to induce cerebellar LTD were explored in the same knock-in mutants using various protocols at near physiological temperature. Finally, we found stimulation protocols, by which LTD could be induced in these gene-manipulated mice. In this study, a set of protocols are proposed to evaluate LTD-induction, which will more accurately allow examination of the causal relationship between LTD and motor learning. In conclusion, experimental conditions are crucial when evaluating LTD in gene-manipulated mice.

In some gene-manipulated animals, using a single protocol may fail to induce LTD in cerebellar Purkinje cells, and there may be a discrepancy between LTD and motor learning. Multiple protocols are necessary to assess LTD-induction in gene-manipulated animals. Standard protocols are shown.

Erişkin Serebellar Dilimlerde Uzun Süreli Depresyon İndüksiyonunun Değerlendirilmesi

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...