<p class="jove_content"&gt; Yazarlar Akım Sitometri analiz ve sıralama ile yardım için Jennifer Strange ve Greg Bauman teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma FM NCRR gelen erişmiş Numarası 2P20 RR020171 tarafından ve Kentucky başlangıç ​​fon Üniversitesi tarafından desteklenen; GIE Cumhurbaşkanlığı Yüksek Lisans Burs ve Kentucky Fırsat Kardeşliği desteği kabul eder.</p

1. Buffy Coat gelen İnsan periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) İzolasyonu <ol><li> Hastane veya yakındaki kan merkezi yerden buffy coat bir birim edinin. Bizim kan merkezi normal kan vericilerden elde birim buffy coat, 40-60 mL bize sağlar. </li><li> Buffy coat sulandırmak için steril PBS içeren bir otoklav 500 ml cam şişe içine kan dökün. PBS + buffy kaplamanın son hacim 250 mL olmalıdır. </li><li> 20 mL Lymphoprep çözeltisi ile, her on 50 ml konik tüpler doldurun. </li><li> Yavaşça Lymphoprep çözüm rahatsız dikkat ederek, seyreltilmiş buffy coat 25 mL Lymphoprep çözüm bindiriyoruz. </li><li> 500 x g hızında, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca boru dönerler. Lenfosit fraksiyonu rahatsız etmeyecek şekilde, santrifüj fren kapalı olduğundan emin olun. </li><li> Bir pipetle Lymphoprep ve plazma orta katman arasındaki ara yüzeydeki PBMC&#39;ler Collect. Yaklaşık 1 mL kadar plazma-orta off aspirehala PBMC içeren buffy coat katmanı kapsar. Yeni bir 50 ml tüp PBMC&#39;leri transfer etmek için 10 ml pipet kullanın. </li><li> PBS ile iki kez yıkanır ve ardından hücreler bir hemasitometre ile ilgili sayım için soğuk RPMI 50 mL içerisinde yeniden süspanse hücreleri. 1 x 10 9 PBMC&#39;leri - Tipik kurtarma 8 x 10 8&#39;dir. </li></ol> Bu işlem kan küçük miktarlar için küçültülmüş olabilir. Tam kan numuneleri seyreltilmesi PBS ile 1:1 dir. 2. Toplam CD4 Manyetik Negatif Seçim + T hücreleri, CD4 + CD45RA + naif T hücreleri veya CD4 + CD45RO + EasySep Zenginleştirme Kitleri kullanarak PBMC&#39;leri gelen Bellek T Hücreleri (Kök Hücre Teknolojileri) 4.25 x 10 8 PBMC&#39;leri 1 x 10 8 izlenmesi için basamakları. <ol><li> % 2 FBS ve 1 mM EDTA içeren PBS ile mL başına 5 x 10 7 arasında bir nihai konsantrasyona Pastör pipetiyle PBMC&#39;ler. Taze bir 14 mL polipropilen yuvarlak dipli bir tüp hücreleri taşıyın. <ol class = &quot;lalpha&quot;&gt; <li> Toplam insan CD4 + T hücreleri negatif seleksiyon tarafından izole edilmesi: insan CD4 + T hücre Zenginleştirme antikorların kokteyli (PBMC mL&#39;si başına 50 ul) karışımı ile oda sıcaklığında 10 dakika inkübe ekleyebilir. </li><li> Negatif seleksiyon insan saf T hücrelerinin izolasyonu: PBMC hücre süspansiyonu, karışım mL&#39;si başına anti-CD45RO antikorun 50 uL ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika süreyle inkübe edilir. 10 dakika için oda sıcaklığında kiti (PBMC ve mL başına 50 ul) eklendi ve karışım inkübe ile sağlanan zenginleştirme kokteyli ekleyin. </li><li> Negatif seleksiyon insan bellek T hücrelerinin izolasyonu: insan Bellek CD4 + T hücre antikorların Zenginleştirme kokteyli (PBMC mL&#39;si başına 50 uL), karıştırılır ve oda sıcaklığında 10 dakika süreyle inkübe edilir. </li></ol></li><li> Eşit çözüm bunların dağıtımını yapmak için de manyetik parçacıklar karıştırın. Naif kiti girdap değil nanopartiküller yapın. </li><li> Manyetik parçacıkların (100 toplam CD4 PBMC&#39;ler mL&#39;si başına uL + ve saf T hücre seçimi, bellek T hücresi seçimi için PBMC&#39;ler mL&#39;si başına 50 uL) ilave edilir. Yavaşça saf T hücresi seçimi için 10 dakika veya bellek ya da total CD4 + T hücresi seçimi için 5 dakika için oda sıcaklığında 2-3 kez ve inkübe pipet ile karıştırılır. </li><li> PBS kadar tüp başına 10 ml hacim getirmek için% 2 FBS ve 1 mM EDTA ihtiva eden ekleyin. Yavaşça toplam CD4 + T hücreleri, naif ve bellek alt için sırasıyla 5, 10 veya 2.5 dakika için gümüş EasySep cazibe merkezi haline kapağını açıp tüpü yerleştirmeden önce 2-3 kez pipetleme ile karıştırın. </li><li> Hala EasySep mıknatıs tüpü ile ilgi hücrelerin izole yeni 50 ml tüp içine sıvı dökün. </li><li> Adımları 2.5 ve daha iyi kurtarma için 2.6 tekrarlayın. </li></ol> 3. Hücre Kültürü Koşullar Düzenleyici T Hücreleri tetikleyebilecek <ol><li> Tarafından adım 1 ve 2, katı doku kültür plakaları öncesi gün birinci (anti-CD3 antikoru seyreltilmesiSteril PBS içinde 1 mg / mL bir konsantrasyona OKT3 klonu). 6 sıra plaka 2 mL PBS + iyi başına anti-CD3 eklemek için, 12 de plaka 1 ml için veya 24 de plaka için her kuyuda 500 uL ekleyin. Kaplama plakası 4 ° C&#39;de, kullanılıncaya kadar devam edin. </li><li> RPMI-1640 2,06 mM ile ön-takviye Glutamax-I ve 25 mM kadar% 10 ısı-inaktive edilmiş fetal bovin serumu (FBS), 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin ve 50 uM β-merkaptoetanol ekleyerek polarizasyon orta hazırlamak HEPES tamponu. Ardından, 2 ng / ml TGF-β ve 5 ng / ml IL-2 ilave edin. Burada, bir ligandları ya da ortam ilgi inhibitörleri ekleyebilir. 2 x 10 6 hücre / polarizasyon orta mL &#39;lik bir konsantrasyonda adım 2&#39;de elde edilen hücreleri tekrar süspansiyon. </li><li> 37 öncesi sıcak plakaları ° C ve hücreleri eklemeden önce, anti-CD3 kaplı kuyuların PBS dışarı aspire. Bir 6 kuyulu plakanın bir 24 kuyulu plakanın bir 12 kuyulu plakanın veya hücre 1 mL için hücreler 2 mL için 4 mL başına de hücre süspansiyonu ilave edin. Buharlaşmasını azaltmak için PBS ile boş kuyu doldurunmedya. 37 ° C /% 5 CO2 de 3 gün süreyle inkübe edilir. </li><li> 3. gün sonrası kaplama üzerine, 500 x g&#39;de 5 dakika santrifüj plaka aşağı spin. Plakanın altındaki T hücreleri bozmadan, medya yarısı kaldırmak ve taze ortam ile değiştirin. Iyi hücrelerin (3 x 10 6 / ml &#39;nin üzerinde konsantrasyon) ile kalabalık olur Alternatif olarak, eğer eşit başka bir anti-CD3 kaplı plaka içine hacmi bölmek ve özgün birime geri taze medya ekleyebilirsiniz. 37 ° C /% 5 CO2 az 2-3 gün daha inkübe. </li></ol> 4. T Hücreler üç Populasyonlarının Floresans-Aktif Hücre Sıralama (FACS) <ol><li> Steril PBS ile% 0.5 (w / v) sığır serum albümini (BSA) ve 2 mM EDTA ilave edilerek tampon yıkama FACS hazırlayın. 4 yer tampon ° C soğuk olsun. </li><li> De hücre kültürü hücreleri çıkarın ve tam hücre iyileşme sağlamak için 2 mL PBS ile her iyice durulayın. 50 ml polipropilen tüpler tüm hücrelere yerleştirin ve 10 için 500 xg&#39;de santrifüjdakika 4 ° C. </li><li> Hücre yoğunluğu belirlemek için bir hemasitometre ile ilgili hücreleri hesaplama. </li><li> Yeri 3-5 tazminat kontrolleri için dört ayrı 5 mL&#39;lik yuvarlak dipli polistiren tüplerde tüp başına x 10 5 hücre. 50 ml polipropilen tüpler, tüp başına bir daha 35 x 10 6 hücre kalan hücreler yerleştirin. </li><li> 4 ° C ve aspirat medya az 5 dakika hücreleri aşağı Spin. 1 x 10 6 hücre başına soğuk yıkama tamponu 90 uL sıralanabilir hücreleri yeniden süspanse edin. Soğuk yıkama tampon kompanzasyon kontrolü tüplerin 100 uL içinde süspanse edin. </li><li> Sıralanması için hücreleri, anti-CD25-PE 2 uL, anti-CD45RA-PE-Cy5 3 uL ve 1 başına anti-CD127-APC 1 x 10 uL 6 hücreleri birleştirir. Dördüncü tüpüne anti-CD127-APC üçüncü tüp AND1 uL için PE-Cy5 - İlk dengeleme kontrol tüpü, ikinci bir tüpe anti-CD25-PE 2 uL, anti-CD45RA 3 uL için bir antikorla ekleyin. Karanlıkta 45 dakika süreyle buz üzerinde inkübe tüplerin her. </li><li&gt; sıralanmasını hücreleri ve kompanzasyon kontrolü tüplere 1 ml soğuk yıkama tamponu 10 ml ekleyin. 4 az 5 dakika boyunca 500 xg&#39;de tüm hücreleri santrifüjleyin ° C </li><li> Yıkama tamponu mL&#39;si başına 1 x 10 7 hücreleri arasında derişimde tampon ve Pastör pipetiyle hücreleri aspire. Bir 40 uM naylon hücre süzgecinden filtreleme önce hücreler mL&#39;si başına DNase II 1,5 uL ekleyin. Tüp başına en fazla 3.5 &#39;den ml ile birden 5 mL&#39;lik yuvarlak dipli polipropilen tüplere hücreleri taşıyın. Tampon yıkama 300 uL tazminat kontrol hücreleri süspansiyon hale getirin. </li><li> PE, APC ve PE-Cy5 filtreleri tarafından çapraz algılama en aza indirmek için MoFlo akış sitometresinde tazminat ayarlayın. 1 ml doğmuş buzağı serumu içeren 5 mL&#39;lik yuvarlak dipli polistiren tüpler içine T hücreleri, naif (CD25-CD45RA +) ve bellek (CD25 - - CD45RA) - iTregs (hücreler CD25 Merhaba CD127 -/LOW CD45RA) sıralamak için kapıları ayarlayın. </li></ol> 5.. Bastırma Assay <ol><li> Suppr olunession assay 100 U / ml penisilin, streptomisin 100 ug / mL, 5 ng / ml IL-2 ve TGF-β için AMACI-V 2 ng / ml ortamı eklenerek. </li><li> Tahlil günü, heterolog CD4 + gibi adım 1 ve 2 de gösterilen buffy tabaka den T hücrelerinin saflaştırmak. Bu deney için bastırma hedef hücreler olacak ve Şekil 2, gün 0 görülebileceği gibi, CD25 + Treg hücreleri içermez. </li><li> Hücreleri yerine 2 uL mL&#39;si başına 5 mM stok çözeltisi, sadece 1 uL kullanılması haricinde, üreticinin talimatlarına uygun olarak CellTrace kiti ile etiket hücreleri,. Doğrudan ışıktan uzak tutmak, 5 mM stok çözelti yapmak için KAKE bir şişeye CellTrace kit tarafından verilen DMSO 18 uL ekleyin. 1 x 10 6 hücre / mL &#39;lik nihai bir konsantrasyona önceden ısıtılmış PBS +% 0.1 (w / v) BSA hedef hücrelerin gerekli numarası (1 x 10 7 maksimum) tekrar süspansiyon. Hücreler mL&#39;si başına 5 mM KAKE 1 uL ekleyin ve 5 minut için bir 37 ° C&#39;de su banyosunda inkübees. Boyama gidermek ve 5 dakika buz üzerinde inkübe% 10 FBS ile komple, buz RPMI 5 hacim ekleyin. Soğuk tam RPMI ve Pastör pipetiyle 1 ile iki kat daha fazla hücre x 10 bastırma tahlil medya 100 uL başına 5 hücreleri. Yıkayın </li><li> Treg bastırma müfettişi boncuk 2 x 10 7 boncuk / mL stok konsantrasyonda bulunmaktadır. Boncuklar pelet bir sayı, bir Eppendorf tüpüne hızlı santrifüjleme ile deneyi başına hücre sayısına eşit toplam. RPMI ve yeniden pelet ile bir kez boncuk yıkayın. RPMI aspirasyonu sonra, Pastör pipetiyle boncuklar çok iyi başına boncuk uygun miktarda supresyon testi medya 8 uL olduğunu. </li><li> Bir 96 yuvarlak alt doku kültürü plakası için istenen hedefe KAKE lekeli hücreleri (1 x 10 5 hücre / ml), müfettiş boncuk ve taze bastırma tahlil medya kutuplaşmış ve sıralanmış hücreleri (1 x 10 5 hücre / ml) ekleyin (KAKE lekeli): 200 ul&#39;lik bir son hacim efektör (sıralanmış) oranı. Tüm koşullar tripli ayarlanırCates. </li><li> Çukur başına 92 uL bastırıcı deney ortamı içinde KAKE boyalı hücrelerin 100 uL, denetiminde boncuklar 8 uL ve taze, boyanmamış hücrelerin 1 x 10 5 ekleyerek iki kontrol koşullar birinci hazırlayın. Yukarıdaki aynı hücresel bileşenleri ile ancak müfettiş boncuk Treg olmadan ikinci denetim hazırlayın. </li><li> Beş gün boyunca 37 ° C /% 5 CO 2 alüminyum folyo ve inkübe levha örtün. </li><li> Karanlık, bir 5 mL&#39;lik yuvarlak dipli polistiren tüp pipetleme ve yerde her kuyudan hücreleri toplamak. 4 ° C, aspirat medya az 5 dakika boyunca 500 xg&#39;de hücreleri santrifüjleyin ve adım 4 tampon yıkama 300 uL soğuk FACS içinde yeniden süspanse. Ilk 3 x 10 4 KAKE + Hücre Görev yazılımı ile bir histogram hedef hücreleri temsil eden canlı lenfosit kapısından olayları analiz edin. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Akım sitometrik Pseudocolor Örneği beş günlük bir zaman cou içinde araziler noktarse izleme iTreg farklılaşma FoxP3 ile CD25 müşterek ifadesinden nispi göre, CTLA-4 ve CD45RA Şekil 2&#39;de görülebilir. Şekil 3 histogram iTregs (CD25 Hi CD45RA - CD127 -/LOW hücreleri) sıralanır hangi başarılı bir supresyon testi gösterir. Düzenleyici baskılayıcı / yeteneği kazanmış bir beş günlük kültürden sadece alt kümesidir Şekil 4 Tregs indüksiyonu gösterir naif bir T hücre havuzu (üst paneller) ve standart iTreg orta beş günlük kültür sonrası bir bellek T hücre havuzu (alt paneller), dan. İlk hücrelerin KAKE boyanması ya naif (sağ üst panel) veya bellek T hücreleri (sağ alt panel) sadece hücre bölünmesi birkaç tur sonra iTregs (en yüksek FoxP3-salgılayan hücre) için ayırt göstermektedir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3738/3738fig1.jpg" /> Şekil 1. Deneysel işlemin şematik. PBMC arT hücreleri - CD4 + CD25 negatif manyetik seçimi öncesinde gradient santrifüj yoluyla insan periferik kan dışarı ayrılmış e. Kültüründe 5-6 gün sonra, hücrelerin FACS geçmesi ve baskılayıcı aktiviteyi ölçmek için, heterolog KAKE etiketli hedef hücreler ile birlikte inkübe edilir. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3738/3738fig2.jpg" /> Şekil 2 saflaştırılmış insan primer CD4 + CD25 -. T hücreleri, orta iTreg kültürlenmiştir. Bir hücre porsiyonunun CD45RA, FoxP3, CTLA-4 ve CD25 belirteçlerin ilerlemeyi izlemek için sadece izolasyon (gün 0) sonra ve 1, 3 ve hücre kültürü 5 toplanır. ITreg profili CD45RA karşılık - FoxP3 Merhaba, CTLA-4 ve CD25 Merhaba Merhaba (in-grafik penceresinde vurgulanır). <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3738/3738fig3.jpg" /> Şekil 3. + KAKE la CD4 Safbeled hücreleri (1 x 10 5 / kuyu) sıralanır saf, belleğe ya da iTreg hücreleri varlığında bastırılması müfettişi boncuklar Treg ile kültüre edilir (3 x 10 4 / çukur). Beş gün sonra, hücreler hasat edilmiş ve lekeli hücrelerin KAKE profili akış sitometresi ile analiz edilir. ITreg hücrelerinin varlığında tamamen CD4 + T hücreleri çoğalması ortadan kaldırmaktadır. Sayılar bölünme geçirmiş KAKE etiketli hücrelerin yüzdesi göstergesidir. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3738/3738fig4.jpg" /> Şekil 4 insan birincil naif Arıtılmış. (CD4 + CD25 - CD45RA +) ve bellek (CD4 + CD25 - CD45RO +) T hücreleri KAKE ve orta iTreg kültürlerinde ile boyanmış. Beş gün sonra, hücrelerin phenotyped ve hücre bölünmesinin oranları tahmin edilmektedir. Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi, her iki alt kümesi ayırt iTreg alt tekabülCD45RA - CD25 Merhaba FoxP3 Hi ve CTLA-4 Merhaba (son iki gösterilmemiştir). Karşılaştırmalı KAKE boyama profilleri beş günlük kültür sırasında en proliferatif hücreler olarak iTregs (burada en yüksek ifade FoxP3 T hücreleri gibi) tespit etti.

<ol>
	<li>Powrie, F., Correa-Oliveira, R., Mauze, S., Coffman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+interactions+between+CD45RBhigh+and+CD45RBlow+CD4++T+cells+are+important+for+the+balance+between+protective+and+pathogenic+cell-mediated+immunity.">Regulatory interactions between CD45RBhigh and CD45RBlow CD4+ T cells are important for the balance between protective and pathogenic cell-mediated immunity.</a> The Journal of Experimental Medicine. 179, 589-600 (1994).</li><li>Tarbell, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell-expanded,+islet-specific+CD4++CD25++CD62L++regulatory+T+cells+restore+normoglycemia+in+diabetic+NOD+mice.">Dendritic cell-expanded, islet-specific CD4+ CD25+ CD62L+ regulatory T cells restore normoglycemia in diabetic NOD mice.</a> The Journal of Experimental Medicine. 204, 191-201 (2007).</li><li>Morgan, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+treatment+of+collagen-induced+arthritis+by+adoptive+transfer+of+CD25++regulatory+T+cells.">Effective treatment of collagen-induced arthritis by adoptive transfer of CD25+ regulatory T cells.</a> Arthritis and Rheumatism. 52, 2212-2221 (2005).</li><li>Taylor, P. A., Lees, C. J., Blazar, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+infusion+of+ex+vivo+activated+and+expanded+CD4(+)CD25(+)+immune+regulatory+cells+inhibits+graft-versus-host+disease+lethality.">The infusion of ex vivo activated and expanded CD4(+)CD25(+) immune regulatory cells inhibits graft-versus-host disease lethality.</a> Blood. 99, 3493-3493 (2002).</li><li>Ziegler, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXP3:+of+mice+and+men.">FOXP3: of mice and men.</a> Annual Review of Immunology. 24, 209-226 (2006).</li><li>Riley, J. L., June, C. H., Blazar, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+T+regulatory+cell+therapy:+take+a+billion+or+so+and+call+me+in+the+morning.">Human T regulatory cell therapy: take a billion or so and call me in the morning.</a> Immunity. 30, 656-6565 (2009).</li><li>Morgan, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+FOXP3+mRNA+is+not+confined+to+CD4+CD25++T+regulatory+cells+in+humans.">Expression of FOXP3 mRNA is not confined to CD4+CD25+ T regulatory cells in humans.</a> Human Immunology. 66, 13-20 (2005).</li><li>Wang, J., Huizinga, T. W. J., Toew, R. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+Novo+Generation+and+Enhanced+Suppression+of+Human+CD4+CD25++Regulatory+T+Cells+by+Retinoic+Acid.">De Novo Generation and Enhanced Suppression of Human CD4+CD25+ Regulatory T Cells by Retinoic Acid.</a> Journal of Immunology. 183, 4119-4126 (2009).</li><li>Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+regulatory+T+cell+development+by+the+transcription+factor+Foxp3.">Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3.</a> Science (New York, N.Y.). 299, 1057-1061 (2003).</li><li>McHugh, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4(+)CD25(+)+immunoregulatory+T+cells:+gene+expression+analysis+reveals+a+functional+role+for+the+glucocorticoid-induced+TNF+receptor.">CD4(+)CD25(+) immunoregulatory T cells: gene expression analysis reveals a functional role for the glucocorticoid-induced TNF receptor.</a> Immunity. 16, 311-323 (2002).</li><li>Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunologic+Self-Tolerance+Maintained+by+Cd25+Cd4+Regulatory+T+Cells+Constitutively+Expressing+Cytotoxic+T+Lymphocyte-Associated+Antigen+4.">Immunologic Self-Tolerance Maintained by Cd25+Cd4+Regulatory T Cells Constitutively Expressing Cytotoxic T Lymphocyte-Associated Antigen 4.</a> The Journal of Experimental Medicine. 192, 303-310 (2000).</li><li>Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD127+expression+inversely+correlates+with+FoxP3+and+suppressive+function+of+human+CD4++T+reg+cells.">CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ T reg cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 203, 1701-1711 (2006).</li><li>Schraven, B., Kalinke, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD28+superagonists:+what+makes+the+difference+in+humans.">CD28 superagonists: what makes the difference in humans.</a> Immunity. 28, 591-595 (2008).</li><li>Reneer, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripherally+induced+human+Regulatory+T+cells+uncouple+Kv1.3+activation+from+TCR-associated+signaling.">Peripherally induced human Regulatory T cells uncouple Kv1.3 activation from TCR-associated signaling.</a> European Journal of Immunology. , (2011).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Treg transferi, bunların verimli üretimi ve istikrarlı bakım yöntemleri otoimmünite rejeksiyon ve diğer immün veya inflamatuvar aracılı hastalıklar ile mücadelede çok büyük tedavi umut vaat ederken henüz geliştirilmiş değil. Insan T hücreleri dolaşımdaki sadece% 1-5 Tregs oldukları için kontrollü genişleme ve farklılaşma kliniğe Tregs uygulanması önemli bir caydırıcı olarak bu yetersizlik üstesinden gelir. Bu deneme TGN1412 13 öğrenilebilir gibi, diğer yandan, bu derece m...

<table border="1"><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Lymphoprep </td><td> Eksen-Shield </td><td> 1114547 </td><td> Oda sıcaklığında tutmak </td></tr><tr><td> Soğutmalı Tezgah Üstü Santrifüj </td><td> Eppendorf </td><td> 5810R </td><td></td></tr><tr><td> Parlak-Line hemositometre </td><td> Hausser Bilimsel </td><td> 3110 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep İnsan CD4 + T hücre Zenginleştirme Seti </td><td> Kök Hücre Teknolojileri </td><td> 19052 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep İnsan Belleği CD4 + T hücre Zenginleştirme Seti </td><td> Kök Hücre Teknolojileri </td><td> 19157 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep İnsan naif CD4 + T hücre Zenginleştirme Seti </td><td> Kök Hücre Teknolojileri </td><td> 19155 </td><td></td></tr><tr><td> Big Easy EasySep Magnet </td><td> Kök Hücre Teknolojileri </td><td> 18001 </td><td> Gümüş </td></tr><tr><td> 5 ml&#39;lik tabanı yuvarlak bir polistiren Tüpler </td><td> BD Falcon </td><td> 352008 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml polipropilen santrifüj tüpünde </td><td> VWR </td><td> 89004-368 </td><td></td></tr><tr><td> 14 mL Polipropilen Yuvarlak Alt Tüpler </td><td> BD Falcon </td><td> 352059 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml polipropilen santrifüj tüpünde </td><td> VWR </td><td> 89004-364 </td><td></td></tr><tr><td> İnsan anti-CD3 antikoru </td><td> Bio X Hücre </td><td> BE0001-2 </td><td> Klonlama: OKT3 </td></tr><tr><td> 24 Well Polistiren Kültür Plakalı </td><td> BD Falcon </td><td> 353047 </td><td></td></tr><tr><td> 96 Şey Yuvarlak Alt Doku Kültürü Plakalı </td><td> Grenier Bio-One </td><td> 650180 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax-I ve HEPES tamponu ile RPMI 1640 </td><td> Gibco </td><td> 72400 </td><td></td></tr> &lt;tr&gt; <td> Fetal bovin serumu (FBS) </td><td> Gibco </td><td> 16000 </td><td></td></tr><tr><td> β-merkaptoetanol </td><td> Sigma </td><td> M7522 </td><td></td></tr><tr><td> TGF-β1 Rekombinant İnsan </td><td> eBioscience </td><td> 14-8348-62 </td><td></td></tr><tr><td> Rekombinant İnsan IL-2 </td><td> eBioscience </td><td> 14-8029-63 </td><td></td></tr><tr><td> Bovine Serum Albumin (BSA) </td><td> MP Biomedicals Inc </td><td> 810531 </td><td></td></tr><tr><td> 0.5 M EDTA </td><td> Amresco </td><td> E177 </td><td></td></tr><tr><td> Fare anti-insan CD25-PE </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-091-024 </td><td> Klonlama: 4E3 </td></tr><tr><td> Fare anti-insan CD45RA-PE-Cy5 </td><td> eBioscience </td><td> 15-0458-42 </td><td> Klonlama: HI100 </td></tr><tr><td> Fare anti-insan CD127-APC </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-094-890 </td><td> Klonlama: MB15-18C9 </td></tr><tr><td> DNaz II </td><td> MP Biomedicals Inc </td><td> 190370 </td><td></td></tr><tr><td> MoFlo Akış Sitometresi </td><td> Beckman Coulter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> FlowJo Yazılım </td><td> Ağaç Yıldız, Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hücre Görev Pro Yazılımı </td><td> BD Biosciences </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Yenidoğan Buzağı Serumu </td><td> Gibco </td><td> 16010 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutamin </td><td> Gibco </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> AIM-V </td><td> Gibco </td><td> 0870112 </td><td></td></tr><tr><td> CellTrace KAKE Hücre Çoğalması Kiti </td><td> Invitrogen </td><td> C34554 </td><td></td></tr><tr><td> Bastırma Müfettiş Boncuk Treg </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-092-909 </td><td></td></tr><tr><td> Penisilin-Streptomisin </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td><td></td></tr><tr><td> 40 uM Naylon Hücre Gerginliker </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td><td></td></tr></table>

generation of induced regulatory t cells from primary human na&iuml;ve and memory t cells

Immünsupresif CD4 + düzenleyici T hücreleri (Tregs) geliştirilmesi ve bakım ve insan bedeni üzerinde kendini ve ortakçı antijenlerin büyük miktarda immünolojik homeostazisde kalmak için ihtiyaç duyulan periferik tolerans katkıda bulunur. Tregs ve inflamatuvar konvansiyonel T hücrelerinin arasındaki dengeye Pertürbasyonu İmmünopatolojiye veya kansere neden olabilir. Tregs terapötik enjeksiyon kolit, 1, tip I diyabet 2, romatoid artrit ve graft versus host hastalığı, insan karşı fare Treg biyolojisi 5 in 4 birkaç temel farklılıklar murin modellerinde etkili olduğu gösterilmiştir olmakla birlikte şimdiye kadar klinik kullanımı engellemiştir sahiptir. Yeterli sayıda, saflık, stabilite ve terapötik Tregs yuvalandırma özgüllük eksikliği kendi ex vivo genişlemesi 6 koşulları optimize etmek için hangi insan Treg gelişimi dinamik bir platformu gerektirmiştir. Burada beğendimdört aşamadan ayrılabilir tek bir insan periferik kan donörden bağlı Tregs (iTregs) farklılaşması için bir yöntem escribe: periferik kan mononükleer hücreleri, CD4 manyetik seçimi + T hücre izolasyonu, in vitro hücre kültürü ve floresan aktive T hücre alt gruplarının hücre sıralama (FACS). Treg imza transkripsiyon faktörü forkhead kutusu P3 (FoxP3) insanlarda 7 aktivasyon bağlı transkripsiyon faktörü ve hiçbir diğer benzersiz belirteç var, damgalı bir kombinatoryal paneli baskılayıcı aktivite ile T hücrelerini tanımlamak için kullanılması gerekir beri. Kültüründe altı gün sonra, sistemindeki hücrelerin saf T hücreleri, CD25 ve CD45RA bunların bağıl ifade göre bellek T hücreleri veya iTregs içine olarak belirli edilebilir. Bellek ve naif T hücrelerinin farklı rapor kutuplaşma gereksinimleri ve plasticities 8 sahip olduğu gibi, CD45RA + ve CD45RO içine ilk T hücre popülasyonunun öncesi sıralama + alt kümeleri olabilir be bu farklılıklar incelemek için kullanılır. Diğerleri ile uyumlu olarak, bizim CD25 Hi CD45RA - FoxP3 9 iTregs ekspres yüksek düzeyde, GITR ve CTLA-4 11 ve CD127 12 düşük seviyelerde. Her nüfusun FACS ardından, elde edilen hücreler carboxyfluorescein süksinimidil ester (KAKE)-etiketli T hücrelerinin proliferasyonu otolog geciktirmek üzere göreli yeteneği hesaplayan bir bastırma deneyde kullanılabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃ¯ve and Memory T Cells at JoVE.com

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&amp;#239;ve and Memory T Cells

Biz tek bir insan kan bağışında düzenleyici, bellek ve naif T hücreleri oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Polarize Tregs sonra da burada ayrıntılı bir bastırma testi dahil olmak üzere genetik homojenlik ile genetik ve fonksiyonel uygulamalar çeşitli diğer komutlara göre olabilir.

İlköğretim İnsan naif ve Bellek T Hücreleri gelen İsteyerek Düzenleyici T Hücreleri Üretimi

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

generation-induced-regulatory-t-cells-from-primary-human-nave-memory

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

23.9K Görüntüleme.  University of Kentucky. Biz tek bir insan kan bağışında düzenleyici, bellek ve naif T hücreleri oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Polarize Tregs sonra da burada ayrıntılı bir bastırma testi dahil olmak üzere genetik homojenlik ile genetik ve fonksiyonel uygulamalar çeşitli diğer komutlara göre olabilir.

Video: Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&#239;ve and Memory T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

Primer insan T hücrelerinin piggyBac Transposon Sistem Modifikasyon

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to measurable increases in antigen-specific T cell responses in vaccine settings for cancer and infectious pathogens. However, their role in HIV-1 immuno-pathogenesis remains controversial, as they could either serve to suppress deleterious HIV-1-associated immune activation and thus slow HIV-1 disease progression or alternatively suppress HIV-1-specific immunity and thereby promote virus spread. Understanding and modulating Treg function in the context of HIV-1 could lead to potential new strategies for immunotherapy or HIV vaccines. However, important open questions remain on their role in the context of HIV-1 infection, which needs to be carefully studied.
Representing roughly 5% of human CD4+ T cells in the peripheral blood, studying the Treg population has proven to be difficult, especially in HIV-1 infected individuals where HIV-1-associated CD4 T cell and with that Treg depletion occurs. The characterization of regulatory T cells in individuals with advanced HIV-1 disease or tissue samples, for which only very small biological samples can be obtained, is therefore extremely challenging. We propose a technical solution to overcome these limitations using isolation and expansion of Tregs from HIV-1-positive individuals.
Here we describe an easy and robust method to successfully expand Tregs isolated from HIV-1-infected individuals in vitro. Flow-sorted CD3+CD4+CD25+CD127low Tregs were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 coated beads and cultured in the presence of IL-2. The expanded Tregs expressed high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS compared to conventional T cells and were shown to be highly suppressive. Easier access to large numbers of Tregs will allow researchers to address important questions concerning their role in HIV-1 immunopathogenesis. We believe answering these questions may provide useful insight for the development of an effective HIV-1 vaccine.

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

Yeni Araçlar HIV-1 ile enfekte bireyler gelen Düzenleyici T hücreleri büyütmek için

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic progenitors of both mouse and human origin. It is now used to address a growing variety of complex genetic, cellular and molecular questions related to hematopoiesis, and is at the cutting edge of efforts to translate these basic findings to therapeutic applications. The procedures are straightforward and routinely yield robust results. However, achieving successful hematopoietic differentiation in vitro requires special attention to the details of reagent and cell culture maintenance. Furthermore, the protocol features technique sensitive steps that, while not difficult, take care and practice to master. Here we focus on the procedures for differentiation of T lymphocytes from mouse embryonic stem cells (mESC). We provide a detailed protocol with discussions of the critical steps and parameters that enable reproducibly robust cellular differentiation in vitro. It is in the interest of the field to consider wider adoption of this technology, as it has the potential to reduce animal use, lower the cost and shorten the timelines of both basic and translational experimentation.

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Mouse embryonic stem cells can be differentiated to T cells in vitro using the OP9-DL1 co-culture system. Success in this procedure requires careful attention to reagent/cell maintenance, and key technique sensitive steps. Here we discuss these critical parameters and provide a detailed protocol to encourage adoption of this technology.

T hücrelerinin türetilmesi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Fare Embriyonik Kök Hücreleri

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

Periferik Kan İnsan alloantijen-özgü T hücrelerinin üretilmesi

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Here a protocol is presented to measure bacterial capture by CD4+ T cells which occurs during antigen presentation via transinfection from pre-infected dendritic cells (DC). We show how to perform the necessary steps: isolation of primary cells, infection of DC, DC/T cell conjugate formation, and measurement of bacterial T cell transfection.

T hücreleri dendritik hücreler gelen Transinfection tarafından Bakteriler Yakalama

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance and homeostasis maintenance by regulating the immune response. The primary role of Treg cells is to suppress the proliferation of effector T (Teff) cells and the production of cytokines such as IFN-&#947;, TNF-&#945;, and IL-2. It has been demonstrated that Treg cells&#39; ability to inhibit the function of Teff cells is enhanced during persistent pathogen infection and cancer development. To clarify the function of Treg cells under resting or inflamed conditions, a variety of in vitro suppression assays using mouse or human Treg cells have been devised. The main aim of this study is to develop a method to compare the differences in phenotype and suppressive function between resting and activated Treg cells. To isolate activated Treg cells, mice were infected with lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) clone 13 (CL13), a chronic strain of LCMV. Treg cells isolated from the spleen of LCMV CL13-infected mice exhibited both the activated phenotype and enhanced suppressive activity compared with resting Treg cells isolated from na&#239;ve mice. Here, we describe the basic protocol for ex vivo phenotype analysis to distinguish activated Treg cells from resting Treg cells. Furthermore, we describe a protocol for the measurement of the suppressive activity of fully activated Treg cells.

Here, we describe a protocol to analyze the phenotype of regulatory T (Treg) cells isolated from na&#239;ve and chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice. In addition, we provide a process to evaluate the suppressive activity of the Treg cells.

Fenotipik ve Kronik Lenfositik koryomenenjit Virüs ile enfekte Fare İzole Aktif Düzenleyici T hücrelerinin Fonksiyonel Analiz

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic self-tolerance. Tregs represent about 5 - 10% of the mature CD4+ T cell subpopulation in mice and humans, with about 1 - 2% of those Tregs circulating in the peripheral blood. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be differentiated into functional Tregs, which have a potential to be used for cell-based therapies of autoimmune diseases. Here, we present a method to develop antigen (Ag)-specific Tregs from iPSCs (i.e., iPSC-Tregs). The method is based on incorporating the transcription factor FoxP3 and an Ag-specific T cell receptor (TCR) into iPSCs and then differentiating on OP9 stromal cells expressing Notch ligands delta-like (DL) 1 and DL4. Following in vitro differentiation, the iPSC-Tregs express CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, and Ag-specific TCR and are able to respond to Ag stimulation. This method has been successfully applied to cell-based therapy of autoimmune arthritis in a murine model. Adoptive transfer of these Ag-specific iPSC-Tregs into Ag-induced arthritis (AIA)-bearing mice has the ability to reduce joint inflammation and swelling and to prevent bone loss.

We present here a method to develop functional antigen (Ag)-specific regulatory T cells (Tregs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) for immunotherapy of autoimmune arthritis in a murine model.

Otoimmünite karşı Kök Hücre türetilmiş antijen-özgü düzenleyici T hücrelerinin gelişimini

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes. 
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human na&#239;ve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-&#946; plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR. 
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained. 
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-&#946; plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.

&lt;em&gt;In Vitro&lt;/em&gt; Differentiation of Human CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;FOXP3&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&amp;#239;ve CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T Cells Using a TGF-&amp;#946;-containing Protocol

This protocol describes the reproducible generation and phenotyping of human induced regulatory T cells (iTregs) from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro. Different protocols for FOXP3 induction allow for the study of specific iTreg phenotypes obtained with respective protocols.

Bir TGF-β-içeren Protokolü kullanılarak naif CD4 + T hücrelerinden insan CD4 + FoxP3 + Bağlı regülatör T hücreleri (iTregs) in vitro ayrımında

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of glass-supported planar bilayers and in vitro-derived T-cell clones or lines1,2,3,4. How these findings apply to the primary human T cells isolated from blood or lymphoid tissues is not known, partly due to significant difficulties in obtaining a sufficient number of cells for analysis5. Here we address this through the development of a technique exploiting multichannel flow slides to build planar lipid bilayers containing activating and adhesion molecules. The low height of the flow slides promotes rapid cell sedimentation in order to synchronize cell:bilayer attachment, thereby allowing researchers to study the dynamic of the synaptic interface formation and the kinetics of the granules release. We apply this approach to analyze the synaptic interface of as few as 104 to 105 primary cryopreserved T cells isolated from lymph nodes (LN) and peripheral blood (PB). The results reveal that the novel planar lipid bilayer technique enables the study of the biophysical properties of primary human T cells derived from blood and tissues in the context of health and disease.

The protocol describes a technique to study the ability of primary polyclonal human T cells to form synaptic interfaces using planar lipid bilayers. We use this technique to show the differential synapse formation capability of human primary T cells derived from lymph nodes and peripheral blood.

Periferik kan ve lenf dokusu birincil insan T hücre sinaptik arabirimi değerlendirilmesi

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

Production of Human CRISPR-Engineered CAR-T Cells

Adoptive cell therapies using chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells) have demonstrated remarkable clinical efficacy in patients with hematological malignancies and are currently being investigated for various solid tumors. CAR-T cells are generated by removing T cells from a patient's blood and engineering them to express a synthetic immune receptor that redirects the T-cells to recognize and eliminate target tumor cells. Gene editing of CAR-T cells has the potential to improve safety of current CAR-T cell therapies and further increase the efficacy of CAR-T cells. Here, we describe methods for the activation, expansion, and characterization of human CRISPR-engineered CD19 directed CAR-T cells. This comprises transduction of the CAR lentiviral vector and use of single guide RNA (sgRNA) and Cas9 endonuclease to target genes of interest in T cells. The methods described in this protocol can be universally applied to other CAR constructs and target genes beyond the ones used for this study. Furthermore, this protocol discusses strategies for gRNA design, lead gRNA selection and target gene knockout validation to reproducibly achieve high-efficiency, multiplex CRISPR-Cas9 engineering of clinical grade human T cells.

Here, we present a protocol for gene editing in primary human T cells using CRISPR Cas Technology to modify CAR-T cells.