Yazarlar tespit protokolünün sağlanması için pCAGAdDU vektör ve Oliver Gorka oluşturmak için Lirui Du teşekkür etmek istiyorum.

1. Girdi Vektör içine İlgi Çekici Gen Klonlanması <ol><li> Bir giriş vektörü, ilgi konusu gen klonlama. Bir topoizomeraz çiftli vektör (örneğin pentr / D-TOPO) veya kısıtlama enzim aracılı klonlama bu işlem için kullanılabilir içine kör uç ligasyonu ile takip geninin PCR amplifikasyonu. </li></ol> 2. PCAGAdDu hedef vektörü içine, ilgi konusu gen aktarma <ol><li> LR rekombinasyon (örneğin Ağ Geçidi LR Clonase II enzim Mix) tarafından hedef vektör girmesinden vektör ilgi gen aktarın. Bu adenovirüs ekspresyon vektörü (Şekil 1) oluşturur. </li><li> , Bir Paci restriksiyon sindirimi içinde adenoviral sentezleme vektörü 10 ug linearize DNA hızlandırabilir ve 100 ul başına 3 ug &#39;lik bir konsantrasyonda su içinde süspansiyon haline getirin. Doğrusallaştırma v çoğaltma ve encapsidation için gerekli olan viral ters tekrarlar (Re), açığaVirüs partiküllerinin içine Iral DNA yapısı. </li></ol> 3. Birincil Virüs Lizat üretimi <ol><li> Tohum 1 x 6-plaka de bir 2 ml hücre kültür ortamı içinde 10 5 HEK293A hücreleri (DMEM,% 10 FBS,% 5 PenStrep) ve 6 için hücre inkübe - 37 ° 14 saat, bir% 10 ° C CO 2 inkübatör onlara uymak için izin vermek. Daha sonra hücreler konfluense yaklaşık olarak en az% 50 olmalıdır. </li><li> Lipofeksiyon: Transferi NaCl 50 mcM, vorteks kısaca 94 ul içine jetPEI reaktif 6 ul. Vorteks 100 ul doğrusallaştırılmış adenovirüs vektörüne karışık çözelti eklenir ve 15 için transfeksiyon karışımı inkübe - oda sıcaklığında 30 dak. </li></ol> Adenovirüs enfeksiyonu için uygun biyogüvenlik koşulları altında aşağıdaki adımları uygulayın! <ol start="3"><li> HEK293A hücre içeren iyi üzerinde damla damla çözüm koyun ve 37 hücreleri inkübe ° C ve% 10 CO 2. Flöresanlı bir işaretleyici kullanırken, transfe değerlendirmekgörsel 12&#39;den sonra ction verimliliği - ters bir floresan mikroskop kullanılarak 36 saat. Taze ortam içinde 0.5 ml 3 günde ekleyin. </li><li> Ayırmak başlar genişlemiş ve yuvarlak hücreler ile alanlardır sitopatik etkileri (CPE), bir ışık veya floresan mikroskop ile 3 gün - her 2 kontrol edin. Bu, etkili bir virüs üretimi göstergesidir. CPE daha geniş bölgeleri (Şekil 3) ortaya çıkması üzerine, bu 24 alacak - 72 saat tüm hücreleri enfekte önce. </li><li> Tüm hücreleri CPE belirtileri gösteriyor, ancak hücrelerin genel bir dekolmanı meydana gelmeden önce, süpernatant ile Nazik pipetleme ve transfer hücreleri (SN, 3 - 5 ml) ile hücreleri ayırmak zaman 15 ml polistiren tüp. </li><li> 15 kuru buz üzerinde SN hücreleri Freeze - 20 dakika ve kopma hücrelere ° C daha sonra 37 hızlı bir şekilde çözülme. Bu donma-ve-çözülme döngüsü (F / TC) iki kez daha tekrarlayın. Bir gün içinde kullanım için buz üzerinde birincil virüs lizat tutun veya -80 ° C uzun süreli depolama için dondurma. Her türlü ilave F/ TC 30, virüsün titresi azaltacaktır - 50%. </li></ol> 4. Virüs Amplifikasyon <ol><li> Tohum ve 14 cm doku kültürü çanak% 90 izdiham HEK293A hücreleri büyür. </li><li> Birincil virüs lizatı (1,5-2,5 mL) yarısı ile hücreleri enfekte edebilir ve en az 36 saat boyunca hücrelerin inkübe. Hemen hemen bütün hücrelerin floresans mikroskobu ile tespit edilebilir, daha sonra enfekte edilmelidir. Zaten (daha konsantre yani) amplifiye virüs stokunun yeniden güçlendirme için, 50 enfeksiyon çokluğu (İçişleri Bakanlığı) (6.3) de HEK293A enfekte. </li><li> Hepsi CPE gösterir ama dekolmanı önce zaman Hücreler hasat edilmelidir. Verimli virüs üretimi ile bu durum enfeksiyondan sonra 48 saat içinde ulaşılır. (Bu bir hafta kadar sürerse, 4.2 açıklanan enfeksiyon için kullanılan adenovirüs stok miktarını artırarak amplifikasyon bir tur düşünün.) </li><li> 50 ml&#39;lik bir tüp polistiren için nazik pipetleme ve transfer hücreleri ve SN hücreleri ayırmak. 4 10 dakika ° C için 300 xg&#39;de hücreleri aşağı Spin </li><li> SN çıkarın ve orta veya Sn (yaklaşık 1 mi) arasında uygun bir hacimde pelletini. </li><li> 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 800 x g&#39;de santrifüj hücreleri ve bozmaya 3 K / TC gerçekleştirme (Konsantre virüs lizat yani) virüs partikülleri içeren SN çıkarmak ve kısım virüs lizat -80 saklayın ° C </li></ol> 5. Virüs titresi Belirlenmesi <ol><li> Tohum 10 5 A549 hücre başına kuyuya 1 ml orta ve hücreler 6 saat uymak izin bir 12 plaka 5 kuyu. </li><li> Ortam içinde bir seri dilüsyon (1:5,000, 1:10,000, 1:50,000, 1:100,000) yapmak ve oyuk başına 10 ul kadar konsantre edildi adenovirüs (buz üzerinde çözündürüldü) 1 ul kullanımı. Akım sitometri olarak yolluk ayarlamak için bir de bulaşmamış bırakın. </li><li> 36 saat sonra, PBS ve ayırmak hücreleri (örneğin trypsinization tarafından) ile yıkayın, SN çıkarmak. Biohazard önlemler için, bu c düzeltmek için tavsiye edilir10 dakika oda sıcaklığında ve bir kez PBS ile yıkama için 100 ul PBS içinde% 4 paraformaldehid arşın. </li><li> Enfeksiyon işaretleyici ifade FACS analizi yapın. Arsa enfekte hücrelerin mutlak sayısı (Şekil 4) karşı &#39;ul viral lizat Seç&#39;. Enfeksiyon doğrusal aralığı belirlemek ve x = 1.000 ul kullanarak lineer aralığında standart eğriden sulandırılmamış virüs ml&#39;si başına titreyi hesaplamak. </li></ol> 6. T Hücre Enfeksiyon <ol><li> Den dinlenme / naif CD4 T hücreleri izole DO11.10 tg; MACS (Naif CD4 + T hücre izolasyonu Seti II) veya FACS sıralama kullanarak CARΔ1 tg fareler (CD4 + CD25-CD62L + CD44-). </li><li> Küçük ölçekli deneyler için, bir 96-gözenekli yuvarlak tabanlı bir plaka içine iyi bir MOI 50 elde etmek için viral lizat uygun bir hacmi pipetle. </li><li> T hücre ortamı içinde 50 ul son hacim enfeksiyonu (RPMI1640,% 10 FBS,% 5 PenStrep,% 5 NaPyruvate, 1x NEAA, 1x gerekli MEM içinde 4 x 10 5 T hücre ile toplayınvitamini, 1x L-glutamin, 1:250,000 merkaptoetanol, 10 mM HEPES). Örnek: Bir İçişleri Bakanlığı 50 3 x 10 5 T hücreleri enfekte için kullanılır; viral titresi, 3 x 10 ml 9 -1 Virüs hacmi = İçişleri Bakanlığı x T / hücre sayısı / viral titresi = 50 x (3 x 10 5) (3 x 10 9 ml -1) = 0.005 ml </li></ol> Not: gevşek fincan (tüp başına tp 3 ml kadar) bir polistiren tüp içinde 10 6 naif T hücreleri başına 165 ul bir enfeksiyon hacminde bir İçişleri Bakanlığı 50 kullanılarak daha büyük hücre sayıları, ölçek enfeksiyon için. <ol start="4"><li> % 5 CO2 kuluçka makinesinde 37 ° C &#39;de 90 dakika boyunca inkübe hücreleri. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de hücreleri aşağı Spin, 200 ul PBS içinde tekrar süspansiyon SN, çıkarmak. Tekrar santrifüj ve SN çıkarmak. </li></ol> (İsteğe bağlı: hücreleri daha etkin virüs kaldırmak için tekrar yıkanabilir) <ol start="6"><li> Tekrar süspansiyon hücreleri200 ul T hücresi uyarıcı antikor olmayan ve IL-2 veya başka bir sitokin olmadan, orta ve 37 ° C&#39;de 40 saat boyunca dinlenmeye bir% 5 CO2 inkübatöründe ° C aktivasyonundan önce, ilgi konusu gen ekspresyonunu sağlamak için. </li></ol> 7. T Hücre Aktivasyon ve Polarizasyon <ol><li> Bir hacim, anti-CD3-ve küçük bir kap içine reaktif hücre sayısı (örneğin, 4 x 10 5) karşılık gelen bir anti-CD28 çiftli boncuk Pipet, PBS 10 kat hacim ekleyin ve 2 dakika için bir mıknatıs üzerine koyun . Süpernatantı alın ve 200 ul ortam içinde polarize boncuklar (Treg: T hücre ortamı + 1 ng / ml &#39;TGFβ, 100 U / ml IL-2) tekrar süspansiyon haline getirin. </li></ol> Not: Hücreler aynı zamanda, anti-CD28 ve anti-CD3 antikorları ile kaplı doku kültür kaplarında kullanılarak aktive edilebilir, ya da ovalbumin 323-339 peptit antijen ile doldurulan ışınlanmış BALB / c splenositleri kullanılarak DO11.10 T hücre reseptör-özgül. <ol start="2"><li> Centrifuge daha önce olduğu gibi hücreleri dinlenmiş, 200 içeren ul polarize orta anti-CD3-ve anti-CD28-antikor birleştiğinde boncuk SN ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarmak. Orta değiştirmeden% 5 CO 2 inkübatör 37 ° C de 72 saat inkübe edin. </li></ol> 8. T Hücre Sabitleme ve Sitometrisi için Boyama <ol><li> Hücreleri yıkayın: Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de hücreleri aşağı Spin, 200 ul PBS içinde tekrar süspansiyon SN, çıkarmak. Tekrar santrifüj ve SN çıkarmak. Buna göre tüm aşağıdaki yıkama adımları uygulayın. </li><li> 100 ul tamir edilebilir ölü hücre boyama çözeltisi içinde hücrelerin yeniden süspanse edin ve 4 de 30 dakika boyunca inkübe ° C. </li><li> Hücre yıkayın, 100 ul PBS içinde tekrar süspansiyon, PBS, oda sıcaklığında inkübe edin, 15 dakika içinde 100 ul% 4 paraformaldehid ekleyin. </li><li> Yıkama hücreleri, PBS içinde 200 ul buz gibi soğuk bir% 70 metanol içinde onları tekrar süspansiyon ve buz üzerinde 30 dakika süreyle inkübe edin. </li></ol> Not: Hücreler biyolojik tehlike önlem olmadan şu andan itibaren tedavi edilebilir!<ol start="5"><li> 60 ul ana-karışımı 60 ul PBS + 10 ug / ml Fc bloğu (spesifik olmayan bağlanma bloke etmek için anti-FCR3). Hazırlanması Yıkama hücreleri, PBS + anti-FCR3 40 ul bunları tekrar süspansiyon ve 15 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> 20 ul ekleyin PBS + anti-FCR3 1 mg PE-birleştiğinde anti-Foxp3 antikoru içeren, ° C gece boyunca 4 de iyice karıştırın ve kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> PBS içinde iki kez hücreleri yıkayın ve bir akış sitometresinde hücreleri analiz. </li></ol>

<ol>
	<li>Lahl, K., Loddenkemper, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+depletion+of+Foxp3++regulatory+T+cells+induces+a+scurfy-like+disease.">Selective depletion of Foxp3+ regulatory T cells induces a scurfy-like disease.</a> The Journal of Experimental Medicine. 204 (1), 57-63 (2007).</li><li>Kretschmer, K., Apostolou, I., Hawiger, D., Khazaie, K., Nussenzweig, M. C., von Boehmer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducing+and+expanding+regulatory+T+cell+populations+by+foreign+antigen.">Inducing and expanding regulatory T cell populations by foreign antigen.</a> Nature Immunology. 6 (12), 1219-1227 (2005).</li><li>Zhang, X., Izikson, L., Liu, L., Weiner, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+CD25(+)CD4(+)+regulatory+T+cells+by+oral+antigen+administration.">Activation of CD25(+)CD4(+) regulatory T cells by oral antigen administration.</a> Journal of Immunology (Baltimore, Md). 167 (8), 4245-4253 (2001).</li><li>Josefowicz, S. Z., Niec, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrathymically+generated+regulatory+T+cells+control+mucosal+TH2+inflammation.">Extrathymically generated regulatory T cells control mucosal TH2 inflammation.</a> Nature. 482 (7385), 395-399 (2012).</li><li>Samstein, R. M., Josefowicz, S. Z., Arvey, A., Treuting, P. M., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrathymic+generation+of+regulatory+T+cells+in+placental+mammals+mitigates+maternal-fetal+conflict.">Extrathymic generation of regulatory T cells in placental mammals mitigates maternal-fetal conflict.</a> Cell. 150 (1), 29-38 (2012).</li><li>Laurence, A., Amarnath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3+Transcription+Factor+Promotes+Instability+of+nTreg+Cells+and+Limits+Generation+of+iTreg+Cells+during+Acute+Murine+Graft-versus-Host+Disease.">STAT3 Transcription Factor Promotes Instability of nTreg Cells and Limits Generation of iTreg Cells during Acute Murine Graft-versus-Host Disease.</a> Immunity. 37 (2), 209-222 (2012).</li><li>Terabe, M., Berzofsky, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoregulatory+T+cells+in+tumor+immunity.">Immunoregulatory T cells in tumor immunity.</a> Current Opinion in Immunology. 16 (2), 157-162 (2004).</li><li>Li, X., Kostareli, E., Suffner, J., Garbi, N., H&#228;mmerling, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Treg+depletion+induces+T-cell+infiltration+and+rejection+of+large+tumors.">Efficient Treg depletion induces T-cell infiltration and rejection of large tumors.</a> European Journal of Immunology. 40 (12), 3325-3335 (2010).</li><li>Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxp3+programs+the+development+and+function+of+CD4+CD25++regulatory+T+cells.">Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells.</a> Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).</li><li>Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+regulatory+T+cell+development+by+the+transcription+factor+Foxp3.">Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3.</a> Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).</li><li>Chen, W., Jin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+Peripheral+CD4+CD25-+Naive+T+Cells+to+CD4+CD25++Regulatory+T+Cells+by+TGF-&#946;+Induction+of+Transcription+Factor+Foxp3.">Conversion of Peripheral CD4+CD25- Naive T Cells to CD4+CD25+ Regulatory T Cells by TGF-&#946; Induction of Transcription Factor Foxp3.</a> The Journal of Experimental Medicine. 198 (12), 1875-1886 (2003).</li><li>Xu, W., Lan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+induced-treg+cells+effectively+attenuates+murine+airway+allergic+inflammation.">Adoptive transfer of induced-treg cells effectively attenuates murine airway allergic inflammation.</a> PloS ONE. 7 (7), e40314 (2012).</li><li>Circosta, P., Granziero, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+receptor+(TCR)+gene+transfer+with+lentiviral+vectors+allows+efficient+redirection+of+tumor+specificity+in+naive+and+memory+T+cells+without+prior+stimulation+of+endogenous+TCR.">T cell receptor (TCR) gene transfer with lentiviral vectors allows efficient redirection of tumor specificity in naive and memory T cells without prior stimulation of endogenous TCR.</a> Human Gene Therapy. 20 (12), 1576-1588 (2009).</li><li>Patel, C., Muthuswamy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency,+Site-specific+Transfection+of+Adherent+Cells+with+siRNA+Using+Microelectrode+Arrays+(MEA).">High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA).</a> J. Vis. Exp. (67), e4415 (2012).</li><li>Zhong, S., Malecek, K., Perez-Garcia, A., Krogsgaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+transduction+of+T-cell+receptors+in+mouse+T-cells.">Retroviral transduction of T-cell receptors in mouse T-cells.</a> J. Vis. Exp. (44), e2307 (2010).</li><li>Leon, R. P., Hedlund, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral-mediated+gene+transfer+in+lymphocytes.">Adenoviral-mediated gene transfer in lymphocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (22), 13159-13164 (1998).</li><li>Wan, Y. Y., Leon, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+expression+of+the+coxsackie/adenovirus+receptor+enables+adenoviral-mediated+gene+delivery+in+naive+T+cells.">Transgenic expression of the coxsackie/adenovirus receptor enables adenoviral-mediated gene delivery in naive T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13784-13789 (2000).</li><li>Hurez, V., Dzialo-Hatton, R., Oliver, J., Matthews, R. J., Weaver, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+adenovirus-mediated+gene+transfer+into+primary+T+cells+and+thymocytes+in+a+new+coxsackie/adenovirus+receptor+transgenic+model.">Efficient adenovirus-mediated gene transfer into primary T cells and thymocytes in a new coxsackie/adenovirus receptor transgenic model.</a> BMC Immunology. 3, 4 (2002).</li><li>Eitelhuber, A. C., Warth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dephosphorylation+of+Carma1+by+PP2A+negatively+regulates+T-cell+activation.">Dephosphorylation of Carma1 by PP2A negatively regulates T-cell activation.</a> The EMBO Journal. 30 (3), 594-605 (2011).</li><li>Glasmacher, E., Hoefig, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roquin+binds+inducible+costimulator+mRNA+and+effectors+of+mRNA+decay+to+induce+microRNA-independent+post-transcriptional+repression.">Roquin binds inducible costimulator mRNA and effectors of mRNA decay to induce microRNA-independent post-transcriptional repression.</a> Nature Immunology. 11 (8), 725-733 (2010).</li><li>Russell, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+adenovirus+and+its+vectors.">Update on adenovirus and its vectors.</a> The Journal of General Virology. 81 (Pt. 11), 2573-2604 (2000).</li><li>Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C., Nairn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+a+Human+Cell+Line+Transformed+by+DNA+from+Human+Adenovirus+Type+5.">Characteristics of a Human Cell Line Transformed by DNA from Human Adenovirus Type 5.</a> Journal of General Virology. 36 (1), 59-72 (1977).</li><li>Landy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic,+structural,+and+regulatory+aspects+of+lambda+site-specific+recombination.">Dynamic, structural, and regulatory aspects of lambda site-specific recombination.</a> Annual Review of Biochemistry. 58, 913-949 (1989).</li><li>Bernard, P., Couturier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+killing+by+the+F+plasmid+CcdB+protein+involves+poisoning+of+DNA-topoisomerase+II+complexes.">Cell killing by the F plasmid CcdB protein involves poisoning of DNA-topoisomerase II complexes.</a> Journal of Molecular Biology. 226 (3), 735-745 (1992).</li><li>Thai, T. -. H., Calado, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Germinal+Center+Response+by+MicroRNA-155.">Regulation of the Germinal Center Response by MicroRNA-155.</a> Science. 316 (5824), 604-608 (2007).</li><li>Rodriguez, A., Vigorito, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+bic/microRNA-155+for+Normal+Immune+Function.">Requirement of bic/microRNA-155 for Normal Immune Function.</a> Science. 316 (5824), 608-611 (2007).</li><li>Cobb, B. S., Hertweck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+Dicer+in+immune+regulation.">A role for Dicer in immune regulation.</a> The Journal of Experimental Medicine. 203 (11), 2519-2527 (2006).</li><li>Steiner, D. F., Thomas, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-29+Regulates+T-Box+Transcription+Factors+and+Interferon-&#947;+Production+in+Helper+T+Cells.">MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-&#947; Production in Helper T Cells.</a> Immunity. , (2011).</li></ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan ederim.

Virüs Üretimi ve Titrasyon En iyi sonuçları elde etmek için transfeksiyon, Doğrusallaştırılmış vektör kalitesi ve miktarı en önemli görünmektedir. Enfeksiyon hızla bir kez verimli virüs üretimi oluşur devam edecek beri kültürün bir başlangıç ​​büyüme primer lizat üretim üzerinde olumsuz etkileri gözlenmedi. Ancak, HEK293A hücreler tarafından virüs üretimi verimliliği azaltmak uzun ekler etkilenebilir. Bazı açık okuma çerçeveleri aslında virüs üret...

Tregs immün tolerans korumak ve aşılmaz bağışıklık yanıtları kırmak için çok önemlidir. Tregs seyirci T hücre aktivasyonu bastırmak. Sonuç olarak, Tregs ablasyon aktive T hücreleri 1 ile tahrik ölümcül otoimmünite ve kendi kendini yok yol açar. Tregs CD4 tek pozitif öncüleri olumsuz seçimi sırasında timus gelişebilir, ama onlar da optimal ortak stimülasyon 1,2 ile düşük doz antijen stimülasyonu üzerine naif CD4 T hücreleri çevre içinde ayırt edebilirsiniz. Periferik Tregs bağırsak ve akciğer hoşgörü sağlayan suçlanmıştır ise timik Tregs, kendini antijenlere karşı doku otoimmünite bastırmak gibi görünüyor. Bu bağlı Tregs kuvvetli gıda ve hava, ortakçı bakteri ve alerjenleri 3,4 çevresel antijenleri dahil olmak üzere mukozada yabancı antijenleri, tanınması sonra T hücre aktivasyonu engeller. Buna ek olarak, Tregs fetal peptidler için anne toleransı 5 kurmak ve önceden için çok önemlihavalandırma graft-versus-host hastalığı 6. Aynı zamanda, aynı zamanda 7,8 Tregs tümör hücrelerinin immün gözetim alçaltarak istenmeyen etkilere aracılık eder. Tregs damgasını özelliği alt-belirterek transkripsiyon faktörü Foxp3, gerekli ve fonksiyon 9,10 Treg görüşmek için yeterli bir çatal başlı etki alanı içeren transkripsiyon faktörü ifadesidir. Foxp3 ifade neden bazı sinyal yolları bilinmektedir. Bununla birlikte, kontrol, düzenler ya da tetikleyici T hücresi reseptörüne tepki olarak farklılaşma Treg modüle ettiğini moleküler süreçlerin daha iyi anlaşılmıştır. Tregs çok etkili TGFβ ve IL-2, 11 varlığında, anti-CD3 ve anti-CD28 antikorları ile naif CD4 + T hücrelerinin uyarılması ile in vitro olarak uyarılabilir. Gelişmekte olan Tregs in vivo, Treg farklılaşma teşvik moleküllerin manipülasyon fonksiyonel olduğu gibi gelecekte therapi için büyük bir potansiyel taşımaktadıres, örneğin, astım, Crohn hastalığı, transplantasyon ve 11,12. Tersine, Treg farklılaşma engellemek için moleküllerin tedavi modülasyonu tümör hastaların kombine tedavi gelecekteki yaklaşımlar fayda sağlayabilir. In vitro farklılaşma tayinlerde T hücre alt farklılaşma ile ilişkili moleküler değişikliklerin açıklaması için vesile olmuştur. Şu anda, ara ya da kontrol T hücre farklılaşmasını ektopik gen ifadesinin en yaygın yöntemler naif T-hücrelerinde başarısız olması nedeniyle engellenmektedir bu gen ürünlerinin taranması için deneysel çalışır. Örneğin, elektroporasyon ve retroviral transdüksiyon aktive edilmiş T-hücrelerinde etkilidir. Ilk beklentileri, dinlenme hücreler tipik olarak etkilidir lentiviral transdüksiyon, aksine, sitokinler 13 tarafından naif T hücrelerinin ön aktivasyon gerektirir. Ayrıca, elektroporasyon sırasında cDNA veya mRNA &#39;devrikendisi T hücre aktivasyonunun özellikleri kazandırır ve hatta Ca2 + sinyali harekete geçirebilir plazma zar, depolarizasyon içerir ve NFAT proteinler (yayınlanmamış gözlem ve ref. 14) etkinleştirin. 40 saat - Benzer şekilde, retroviral transdüksiyon için, naif T hücreleri 18 için aktif olmak zorunda. Bu süre boyunca, hücre bölünmesi sırasında nükleer membran arıza meydana ve retroviral vektör 15&#39;in sonraki genomik entegrasyon için izin verir. Bu yöntemler bu nedenle yardımcı T hücre farklılaşmasının belirleyici aşamasıdır antijen ile ilk T hücre karşılaşma erken moleküler düzenleme ele mümkün değildir. Adenoviral transdüksiyon, insan adenovirüs Coxsackie reseptörü (CAR) ifade, insan hücre tipleri arasında bir dizi geçici ektopik gen ekspresyonunu vermek bilinmektedir. Bu hücre aktivasyonu ya da hücre döngüsü ilerlemesi için gerek kalmadan devam eder. C yüzey ekspresyonuAR etkili bir virüs bağlanma ve içselleştirilmesi için gerekli olan ve bir T hücre-spesifik promotör altında kesilmiş versiyonunu CARΔ1 transgenik ekspresyonu adenoviral enfeksiyon 16 ile duyarlı bir fare timositleri ve T hücre oluşturmak bulunmuştur. Önemli olarak, transgen timosit gelişimi değiştirmeyen veya naif CD4 in vitro farklılaşma, farklı alt-grup halinde hücreleri (veriler gösterilmemiştir; ref 17.) T. T hücrelerinin Adenovirüs aracılı transdüksiyon önce yaklaşımlar 19,20 aşırı 17,18 için kullanılan ve knock-down oldu. Transgenik T hücreleri ticari olarak temin DO11.10 TG arıtılabilir; CARΔ1 TG (Taconic, Inc ref 17).. Önemli olarak, Adeno transdüksiyon aktivasyon belirgin belirtileri neden olmadan naif T-hücrelerinde, bir ilgi geninin yüksek sağlar. T hücreleri naif kalır (CD44 düşük, CD62L yüksek) ve dinlenme (CD25 -, CD69 -) sonra enfeksiyonuve enfekte olmayan hücrelere benzer Treg içine aktif ve ayırt edilebilir. Rekombinant adenovirüsleri üretimi adenoviral plazmidi (Şekil 1) ile HEK293A hücre sırasında transfeksiyonundan sonra elde edilebilir. Bu plazmid genellikle çoğaltma-beceriksiz rekombinant adenovirüs 21 işlemek için silinir E1 ve E3 genleri ile insan tipi 5 adenovirüs genomu içerir. Onlar makaslanmış adenovirüs 22 istikrarlı entegrasyonu ile ölümsüzleştirdi edilmiş olarak HEK293A hücre çoğaltma eksikliği tamamlıyor. Adenoviral vektörlerin büyük (~ 40 kb) ve dolayısıyla iyi geleneksel kısıtlama enzim aracılı klonlama için uygun olmadığı için, biz Ağ Geçidi sistemi istihdam. İlgi konusu genin başlangıçta kolaylıkla lambda Rekombinasyon reaksiyonu (LR) 23 yoluyla hedef adenoviral vektörü içine transfer edilebilir daha küçük bir giriş vektörü içine klonlanır. Biz pCAGAdDu vektör inşaprokaryotik ccdb seçim işaretleyici 24 yan LR siteleri içeren bir ekspresyon kaseti ile CAG promoteri (tavuk aktin promotörü ve CMV artırıcı) birleştirerek. Bu ifade kaseti, büyükbaş hayvan büyüme hormonu poli (A) sinyal içeren bir diziye kaynaşmış olan ökaryotik enfeksiyon marker gelişmiş yeşil floresan protein (EGFP) arasında ekspresyonuna izin veren bir dahili ribozom giriş bölgesi (IRES) öğesi için eritilerek birleştirilir. Prototipik CMV promoteri yüksek aktivasyon bağımlı ve naif T hücrelerinde gen ekspresyonu için bu nedenle elverişsiz olduğu bulunmuştur beri, CAG cis-düzenleyici sekanslar seçtik. Burada, in vitro Treg farklılaşmasında etkili bir protokol ve etkinleştirme (Şekil 2) olmadan naif CD4 + T hücrelerinin transdüksiyonu için bir yöntem sağlar. Yöntemi ektopik gen ekspresyonu sağlayan ya da naif devlet önceki CD4 T hücre farklılaşması yıkmak. Bir overexpresse etkisini test edilmesine olanak sağlarT hücre alt bağlılık kadar ilk TCR uyarılması üzerine erken sinyal olaylar sırasında ilgi d gen. Bizim doğrulama deneyleri de Th2 gibi Th1 gibi diğer T hücre alt grupları, TH9, Th17, Th22 veya TFH hücrelerin farklılaşması benzer adenovirüs uygulama kurmak için temel sağlar.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR/D-TOPO Cloning Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K240020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway LR Clonase II Enzyme mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11791020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PacI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R057S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>jetPEI</td>
			<td>Polyplus-transfection</td>
			<td>101-10N</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293A Cell Line</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R705-07</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-185</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353046</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 cm tissue culture dish</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>168381</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CAR&Delta;1)1Jdgr</td>
			<td>Taconic Farms</td>
			<td>Model Nr. 4285</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-094-131</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41966-052</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>1502-P110704</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PenStrep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-167F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaPyruvate</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE13-115E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA 100x</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE13-114E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution (1 M)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630-056</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&beta;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-7522</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Essential vitamin mixture (100x)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>13-607C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 for Cell Expansion and Activation</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>114-56D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TGF-beta 1</td>
			<td>R&amp;D Systems</td>
			<td>240B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proleukin S (18 x 106IE)</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L-23105</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse BD Fc BlockT</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553141</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-5773-82</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay</td>
			<td>Roche Applied Biosystems</td>
			<td>4427975</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 Probes Master</td>
			<td>Roche Applied Biosystems</td>
			<td>04902343001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Roche Applied Biosystems</td>
			<td>4366596</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adenoviral transduction of naive cd4 t cells to study treg differentiation

Düzenleyici T hücreleri (Tregs) kendini hem de bazı yabancı antijenlere karşı bağışıklık dayanıklılık sağlamak için gereklidir. Tregs TGFβ ve IL-2 varlığında TCR-ve ko-stimülasyonu ile in vitro olarak naif CD4 + T hücrelerinden elde edilebilir. Bu, gelecekteki tedaviler için büyük bir potansiyel taşıyan, ancak, moleküller ve sinyal yolları kontrol farklılaşma büyük ölçüde bilinmemektedir olduğunu. Primer T hücrelerinde ektopik gen ifadesi yoluyla manipüle, ancak yaygın yöntemler primer antijen tanıma önce, T hücresinin en önemli naif durumuna hedef başarısız olabilir. Burada, Treg farklılaşma oluşturulmadan önce in vitro naif CD4 T hücrelerinde ektopik genleri ifade etmek için bir protokol sağlar. Bu çoğaltma eksikliği adenovirüs ile iletim yapar ve onun üretim ve üretim açıklar. Adenovirüs büyük ekler (en fazla 7 kb) kadar sürebilir ve yüksek ve geçici Hsplm ulaşmak için rehberleri ile donatılmış olabilirT hücrelerinde yansıması. Bir transgenik Coxsackie adenovirüs reseptör (SYR) ifade ise etkili naif fare T hücreleri transduces. Önemlisi, enfeksiyon sonrası T hücreleri naif kalır (CD44 düşük, CD62L yüksek) ve dinlenme (CD25 -, CD69 -) ve Tregs içine enfekte olmayan hücrelere benzer aktif ve ayırt edilebilir. Bu yüzden, bu yöntem, en başından beri CD4 T hücre farklılaşmasının manipülasyon sağlar. Bu ilk TCR stimülasyon erken sinyal olaylar sonunda farklılaşma Treg içine kurşun hücresel değişiklikler neden zaman bu ektopik gen ifadesinin yer zaten olmasını sağlar.

Virüs Üretim Yüksek virüs titreleri üretimi için, birincil virüs üretimi veya virüs amplifikasyon HEK293A hücre hasat zamanlaması çok önemlidir. Virüs üretim görsel işaretleri ile Örnek fluoresan ve faz kontrast görüntüleri Şekil 3 &#39;de gösterilmiştir. CPE 10 gün parçası olmayan bir kontrol pCAGAdDu vektörü ile HEK293A hücre sırasında transfeksiyonundan sonra gözlenmiştir. CPE enfeksiyon işaretleyici GFP yüksek ifade ayırmak ve sergilemey...

Watch this Scientific Journal Video about Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation at JoVE.com

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Naif CD4 Coxsackie adenovirüs reseptör transgenik ekspresyonu ile T-hücreleri içine adenoviral gen transferi düzenleyici T hücre farklılaşmasının moleküler analiz sağlar<em&gt; In vitro</em&gt;.

Naif CD4 adenoviral İletimi Treg Farklılaşma Eğitim Hücreler T

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

adenoviral-transduction-naive-cd4-t-cells-to-study-treg

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.7K Görüntüleme.  Helmholtz Zentrum München. Naif CD4 Coxsackie adenovirüs reseptör transgenik ekspresyonu ile T-hücreleri içine adenoviral gen transferi düzenleyici T hücre farklılaşmasının moleküler analiz sağlar In vitro.

Video: Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Fare T-hücrelerinin, T-hücre reseptörleri retroviral İletimi

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&amp;#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

İzolasyon ve naif CD4 T Lenfositler Th17 Farklılaşma

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and host T cells, to easily monitor the graft, and to adapt the system in order to answer different immunological questions. Medawar and colleagues established allogeneic tail-skin transplantation in mice in 1955. Since then, the skin transplantation model has been continuously modified and adapted to answer specific questions. The use of tail-skin renders this model easy to score for graft rejection, requires neither extensive preparation nor deep anesthesia, is applicable to animals of all genetic background, discourages ischemic necrosis, and permits chemical and biological intervention. 
In general, both CD4+ and CD8+ allogeneic T cells are responsible for the rejection of allografts since they recognize mismatched major histocompatibility antigens from different mouse strains. Several models have been described for activating allogeneic T cells in skin-transplanted mice. The identification of major histocompatibility complex (MHC) class I and II molecules in different mouse strains including C57BL/6 mice was an important step toward understanding and studying T cell-mediated alloresponses. In the tail-skin transplantation model described here, a three-point mutation (I-Abm12) in the antigen-presenting groove of the MHC-class II (I-Ab) molecule is sufficient to induce strong allogeneic CD4+ T cell activation in C57BL/6 mice. Skin grafts from I-Abm12 mice on C57BL/6 mice are rejected within 12-15 days, while syngeneic grafts are accepted for up to 100 days. The absence of T cells (CD3-/- and Rag2-/- mice) allows skin graft acceptance up to 100 days, which can be overcome by transferring 2 x 104 wild type or transgenic T cells. Adoptively transferred T cells proliferate and produce IFN-&#947; in I-Abm12-transplanted Rag2-/- mice.

Tail-skin transplantation is a powerful model for studying T cell-dependent rejection and tolerance induction during allogeneic immune responses in mice. The advantages of this protocol are minor invasive surgery, and ease of monitoring with no need to sacrifice the recipient mouse.

Farelerde allojenik CD4 + T hücre Cevapları Eğitim için Kuyruk Cilt Nakli

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&amp;#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Fare Naif CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Hücre İzolasyonu ve<em&gt; In vitro</em&gt; T hücre alt içine Farklılaşma

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCR&#945; and TCR&#946; chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.

We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

Kemik iliği projenitör hücrelerinin retroviral İletimi T-hücre reseptör Retrogenic fareler üretmek için

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Many experimental systems have been utilized to understand the mechanisms regulating T cell development and function in an immune response. Here a genetic approach using retroviral transduction is described, which is economic, time efficient, and most importantly, highly informative in identifying regulatory pathways.

Eğitim için bir genetik Yaklaşım olarak yardımcı T hücrelerinin retroviral İletimi Mekanizmaları kendi Farklılaşma ve Kontrol Fonksiyonunun

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes. 
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human na&#239;ve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-&#946; plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR. 
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained. 
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-&#946; plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.

&lt;em&gt;In Vitro&lt;/em&gt; Differentiation of Human CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;FOXP3&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&amp;#239;ve CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T Cells Using a TGF-&amp;#946;-containing Protocol

This protocol describes the reproducible generation and phenotyping of human induced regulatory T cells (iTregs) from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro. Different protocols for FOXP3 induction allow for the study of specific iTreg phenotypes obtained with respective protocols.

Bir TGF-β-içeren Protokolü kullanılarak naif CD4 + T hücrelerinden insan CD4 + FoxP3 + Bağlı regülatör T hücreleri (iTregs) in vitro ayrımında

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played by T cells in an immune response. This protocol describes the in vitro differentiation of bone marrow (BM) progenitors to obtain granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) derived-dendritic cells (DCs). The protocol also describes the adoptive transfer of ovalbumin peptide (OVAp)-loaded GM-CSF-derived DCs and na&#239;ve CD4 T cells from OTII transgenic mice in order to analyze the in vivo activation, proliferation, and Th1 differentiation of the transferred CD4 T cells. This protocol circumvents the limitation of purely in vivo methods imposed by the inability to specifically manipulate or select the studied cell population. Moreover, this protocol allows studies in an in vivo environment, thus avoiding alterations to functional factors that may occur in vitro and including the influence of cell types and other factors only found in intact organs. The protocol is a useful tool for generating changes in DCs and T cells that modify adaptive immune responses, potentially providing important results to understand the origin or development of numerous immune associated diseases.

An &lt;em&gt;In Vivo&lt;/em&gt; Mouse Model to Measure Na&amp;#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Here, we present a protocol for the in vivo determination of na&#239;ve CD4 T cell (T cell) activation, proliferation, and Th1 differentiation induced by GM-CSF bone marrow (BM)-derived dendritic cells (DCs). In addition, this protocol describes BM and T-cell isolation, DC generation, and DC and T-cell adoptive transfer.

Vivo fare modeli ölçü saf CD4 T Hücre aktivasyonu, yayılması ve kemik iliği türevi dendritik hücreler tarafından indüklenen Th1 farklılaşma

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...

Akut LCMV Enfeksiyonunda Erken Foliküler Yardımcı T-Hücre Taahhüdünün Deşifre Edilmesi

Accessing Early Differentiation of Virus-Specific Follicular Helper CD4+ T Cell in Acute LCMV-Infected Mice

Follicular Helper T (TFH) cells are perceived as an independent CD4+ T cell lineage that assists cognate B cells in producing high-affinity antibodies, thus establishing long-term humoral immunity. During acute viral infection, the fate commitment of virus-specific TFH cells is determined in the early infection phase, and investigations of the early-differentiated TFH cells are crucial in understanding T cell-dependent humoral immunity and optimizing vaccine design. In the study, using a mouse model of acute lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) infection and the TCR-transgenic SMARTA (SM) mouse with CD4+ T cells specifically recognizing LCMV glycoprotein epitope I-AbGP66-77, we described procedures to access the early fate commitment of virus-specific TFH cells based on flow cytometry stainings. Furthermore, by exploiting retroviral transduction of SM CD4+ T cells, methods to manipulate gene expression in early-differentiated virus-specific TFH cells are also provided. Hence, these methods will help in studies exploring the mechanism(s) underlying the early commitment of virus-specific TFH cells.

Yazar Gündemi: Akut LCMV Zorluklarında TFH Hücre Farklılaşmasının Yollarının Aydınlatılması

The current study showcases protocols for assessing the early fate commitment of virus-specific TFH cells and manipulating gene expression in these cells.

Akut LCMV ile Enfekte Farelerde Virüse Özgü Foliküler Yardımcı CD4+ T Hücresinin Erken Farklılaşmasına Erişim

Follicular Helper T (TFH) cells are perceived as an independent CD4+ T cell lineage that assists cognate B cells in producing high-affinity antibodies, ...