Name: generation of human alloantigen-specific t cells from peripheral blood
Uploaded: 2014-11-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood at JoVE.com

The author would like to thank the NIH Tetramer Core Facility for tetramer production. The author would also like to thank E.D. O&#8217;Connor and K.E. Marquez at the UCSD Human Embryonic Stem Cell Core Facility flow cytometry laboratory for assistance in cell sorting. This work was funded by National Institutes of Health grant K08AI085039 (G.P.M.).

NOT: Bu protokol, insan gönüllülerden periferal kan örneklerinin kullanılmasını gerektirir. Insan denekler ile tüm araştırma gözden ve Helsinki Bildirgesi (2013) ve Sağlık Sigortası Taşınabilirliği ve 1996 Sorumluluk Yasası ile uyumu sağlamak üzere bir İnsan Araştırmaları Kurumsal Değerlendirme Kurulu tarafından onaylanmış olması gerekir. Tüm kan T-hücrelerinin 1. izolasyonu <ol><li> Başlamadan önce, oda sıcaklığına kadar yoğunluk gradyan orta ısıtın. Kısım 2-4 steril 15 ml konik santrifüj tüplerine yoğunluk gradyan ortamının 4 ml (1 tüp her biri, 10 ml seyreltilmiş kan hacmi için kullanılacaktır). </li><li> 1-2 sodyum heparin sprey kan 10-20 ml kaplı (yeşil-üst) venöz kan alma tüpleri edinin. Eğitimli bireylerin gözetiminde insan numuneleri toplamak ve Kurumsal Değerlendirme Kuruluna göre protokolünü onayladı. </li><li> % 70 etanol ile, tüplerin dış silin. Dikkatle fi üstleri kaldırmaktoplama tüpleri doldurulmayan, steril bir 50 ml santrifüj tüpüne kan süzün. </li><li> Her bir kan toplama tüpüne 10 ml steril fosfat tamponlu tuz (PBS) ekleyin. , PBS toplamak decanted tam kan eklemek ve hafifçe karıştırın. </li><li> 25 ul insan T hücresi zenginleştirme Kokteyl / 2 mL toplam hacim. 20 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Yavaşça yoğunluk gradyan ortamının üstte 1 seyreltilmiş kan: 10 ml&#39;lik bir pipet kullanılarak, 1, 10 ml kadar katman. Yoğunluk gradyan ortamın yüzeyini bozmak için dikkatli olun. </li><li> 20 o C&#39;de santrifüj katmanlı kan ve yoğunluk gradyan orta 20 dakika boyunca 1200 x g&#39;de </li><li> Yoğunluk gradyan orta ve yoğunluk gradyan orta ve seyreltilmiş plazma arasındaki ara yüzde lökosit tabakası arasındaki ara yüzü bozmayacak dikkat ederek, santrifüj tüpleri çıkarın. 5 ml&#39;lik bir pipet kullanarak dikkatli bir şekilde lökosit faz toplanır ve yeni bir steril 50 ml konik küvet transferör. </li><li> 50 ml toplanan PBL hacmini getirmek ve hafifçe karıştırmak için PBS ekleyin. </li><li> 20 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 600 x g&#39;de santrifüj Durusu. </li><li> Süspanse tamponu (steril filtre edilmiş PBS% 1 BSA ihtiva eden) ayırma sitometrisi 10 ml&#39;lik steril bir akış hücreleri topak. Örnek hücre süspansiyonu, 10 ul, 1:10 seyreltilmiş bir hemositometre kullanılarak hücre sayısı tripan mavisi (90 ul ekle) (beklenen verim 1-4 x 10 6 hücre tam kan / tüp). <ol><li> 5 ml&#39;lik bir tüpe transfer 1 ml lik bir çıkarın ve tetramer etiketli olmayan T hücrelerinin analizi için buz üzerinde tutulur. Buz üzerinde hücre süspansiyonu tutun. </li></ol></li></ol> Alloantijen-spesifik T hücrelerinin 2. Manyetik zenginleştirilmesi <ol><li> 1 Alloantijen pMHC tetramerini sulandırmak: 100 steril sıralama tamponunda. </li><li> Santrifüj Hücre süspansiyonu, 20 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 600 x g&#39;de (adım 1.11 9 mi) Durusu. </li><li> Peletlendi için pMHC tetramer Alloantijen seyreltilmiş 50 ul ekleyinHücreler (10 7 hücreleri kadar). Nazik pipetleme karıştırın. Steril bir 5 ml tüp aktarın. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Sıralama tampon 2 ml ekleyin. 20 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 600 x g&#39;de santrifüj Durusu. </li><li> 100 ul sıralama tamponunda süspanse hücreler. 10 ul Biotin seçimi kokteyl ilave edilir ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir. </li><li> 5 ul manyetik nanopartikülleri ilave edilir ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edilir. </li><li> 2.5 ml sıralama tampon ve pipetleme hafifçe karıştırın ekleyin. 5 ml tüp aktarmak, 100 ul kısım çıkarın ve ön zenginleştirme hücrelerin analizi için buz üzerinde tutmak. </li><li> Hücre ayrılma mıknatıs hücre süspansiyonu ihtiva eden 5 ml&#39;lik tüp yerleştirin. Bu kapak, tüpün üstüne gevşek olması gerekmektedir. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Yavaşça tüpten kapağı çıkarın. Birlikte tüp ve mıknatıs tutma, taze 5 ml tüp içine tüp içeriğini süzün. Dokunun veya tüp içeriğini sallamayınsıvının son damla çıkarın. </li><li> Mıknatıstan tüpü çıkarın. 2 ml soğuk sıralama tampon ekleyin ve pipetle hafifçe karıştırın. 2, bir hemositometre kullanılarak hücrelerin sayısı tripan mavisi (10 ul ekle): Örnek hücre süspansiyonu, 10 ul, 1 seyreltin. </li></ol> Tek hücreli Sitometrisi hücre sıralama için T hücrelerinin 3. hazırlanması <ol><li> Hücrelerin tüm tüplere soğuk sıralama tampon ekleme (tetramer etiketlenmemiş, tetramer etiketli zenginleştirilmiş un, tetramer ve etiketli zenginleştirilmiş) 3 ml hacim getirmek. </li><li> 4 o C&#39;de 5 dakika boyunca 600 xg&#39;de Santrifüj ve decant tampon hücreleri kurtarmak için. </li><li> 25 ul soğuk tür tampon pelet hücreleri tekrar süspansiyon. 5 ul insan Fc blok ekleyin. 20 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. </li><li> Akış sitometri sıralama için antikorlar hazırlayın. 15 ul sıralama tampon, 15 ul anti-CD5, 15 ul anti-CD14, ve 15 ul anti-CD19 karıştırın. </li><li> Hücrelerin her biri tüp antikor karışımı 20 ul ekle. 20 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. </li><li> Her tüpe soğuk çeşit tampon 2 ml ekleyin. </li><li> 4 o C&#39;de 5 dakika boyunca 600 xg&#39;de Santrifüj ve decant tampon hücreleri kurtarmak için. </li><li> Sıralama tampon maddesi içinde 1 -2 x 10 6 hücre / ml&#39;lik bir konsantrasyonda tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> Insan T hücre kültür ortamının kısım 100 ul (Iscove DMEM, 2 mM Glutamax, 10 mM HEPES, 50 ug / ml gentamisin, 50 uM 2-merkaptoetanol,% 10 ısı ile inaktive edilmiş insan AB serumu, ve 2.5 ng / ml rekombinant insan ile desteklenmiş IL-2), 96 oyuklu tabanı yuvarlak hücre kültürü plakasının her oyuğuna. Buz üzerinde tutun. </li></ol> Tek hücreli Sitometrisi Sorting tarafından Tetramer-etiketli T hücrelerinin 4. İzolasyonu <ol><li> Alloantijen pMHC tetrameri etiketli T hücreleri (Şekil 2.a) tanımlamak için yolluk parametrelerin akım sitometri kurmak. B hücreleri ve CD14 ifade CD19 hariç, lenfositlerin ikilileri, kapıyı ortadan kaldırmak için stratejiler yolluk kurmak için ön zenginleştirme tetrameri etiketli kısmını kullanınmonositler ifade ve CD5 ifadesi ile, T hücreleri tanımlar. (Tetramer etiketli olmayan örnekten hücreler bu kapıdan giren ve - - CD19, CD5 + CD14 0%) ile tetramer bağlanması T hücrelerin belirlenmesine yolluk kurmak için bir floresan gibi tetrameri eksi bir kumanda ile işaretli olmayan örnek kullanın . Not: aşırı kısıtlayıcı yolluk stratejileri izole edilen T hücrelerinin sayısını azaltırken, antijene özel niteliği olmayan, T hücreleri veya T hücrelerinin izolasyonu ile sonuçlanır yeterince sıkı değildir stratejileri yolluk. </li><li> Tek hücre sıralama için plaka parametreleri programlamak. CD19 - - Her kuyuda tetramerini + hücreyi 1 CD5 + CD14 yerleştirmek için sıralayıcı yönlendirin. Her satırda (Şekil 2.S iyi (hücreler - CD19 - - tetrameri 100 CD5 + CD14) de 1 negatif kontrol (hücreleri kuyunun içine sıralanır) ve 1 pozitif kontrol içerecek şekilde ayarlanan plakayı yönlendirin </strong&gt;). </li><li> Ayırıcı stratejisi ve plaka kurulumu sitometrisi düzenlenen akım kullanarak, doğrudan bir akış sitometrik hücre ayırıcıyla 96 oyuklu bir plakaya bireysel tetramer bağlanması T hücreleri izole etmek. </li></ol> 5. Kültür ve alloantijen-özgü T hücresi klonlarının Genişleme <ol><li> 20 ° C&#39;de, hücre sınıflandırılması; 5 dakika boyunca 600 x g&#39;de santrifüj plaka tamamlanmasından sonra, % 6 CO 2 inkübatör 37 o C yerleştirin kültür plakası. </li><li> 30 saniye vorteksleyin uyarıcı, anti-CD3 / anti-CD28 mikro boncuklar boncuklar tekrar süspansiyon. </li><li> Toplanan T hücrelerinin uyarılması için gerekli olan aktivatör boncuk hacmi (aktivatörünün mikro-/ oyuk 0.5 ul) hesaplayın. Steril bir 5 ml tüp uyarıcısı boncuk hesaplanan hacim aktarın. 1 ml insan T hücre kültür ortamı ve vorteks ekleyin. </li><li> Mıknatıs microbead süspansiyonu ile tüp yerleştirin. Bu kapak, tüpün üstüne gevşek olması gerekmektedir. Oda sıcaklığında 2 dakika süreyle inkübe edin. </li><li> Yavaşça çıkarıntüpten kabı. Taze 5 ml tüp içine, birlikte decant tüp içeriği tüp ve mıknatıs tutma. Dokunun veya tüp içeriğini sallamayın. </li><li> Mıknatıstan tüpü çıkarın. Insan T hücre kültür ortamı ilave edin (mikrotaneciklerin, 100 ul ortam / 0.5 ul, başlangıçta ilave edildi). </li><li> Kısım 96 oyuklu plakanın her oyuğuna aktivatör boncuk süspansiyonu 100 ul. % 6 CO 2 inkübatör 37 o C kültür plaka inkübe. </li><li> Mikroskobik inceleme ile günlük hücre büyümesini izleyin. 7 günlük bir kültürden (Şekil 3a) - çoğalan hücrelerin küçük kümeler 5 sonra mikroskopla gözlenebilir. Not: bu noktada T hücresi kültürlerinin Görselleştirme zor olabilir, ve bu aşamada gözlemlenebilir hücre kümelerinin olmaması artan bir T hücresi eksikliği olmayabilir. </li><li> Hücre izolasyonu 14 gün sonra, dikkatli bir şekilde kültür üst kapalı ve ortam 100 ul çıkararak besleme kültürleri 100 μ ile değiştirinL, taze insan T hücre kültürü ortamı. % 6 CO 2 inkübatör 37 o C kültür plaka kuluçkaya devam edin. </li><li> Mikroskopik inceleme ve kültür ortamının rengi değerlendirilmesi günlük hücre büyümesini izlemek. 3 gün orta değişiklikten sonra - Büyük hücre kümeleri mikroskobik 2 görünür olmalıdır. Makroskobik olarak, hücre topakları ortam değişikliği takiben 14 gün boyunca görünür hale gelmelidir. </li><li> Hücre izolasyonunu takiben 28 gün, mikroskobik inceleme ile büyüyen klonları tanımlamak. 200 ul insan T hücre kültür ortamı içeren 48-çukurlu bir doku kültür plakasının her bir gözeneğine büyüme pozitif 96 oyuklu plaka kültürlerin 200 ul hacim aktarın. </li><li> Uyarıcı, anti-CD3 / anti-CD28 mikro boncuklar 12.5 ul içeren 100 ul ekle (- 5.6 bölümlerde 5.2 &#39;de tarif edildiği gibi hazırlanmıştır). % 6 CO 2 inkübatör 37 o C kültür plaka inkübe. </li><li> Mikroskobik eski tarafından günlük kültür büyümesini izlemekaminasyon ve kültür ortamının rengi değerlendirilmesi. T hücresi kültürü&gt; 2x10 6 / ml&#39;ye ulaştığı zaman (tipik olarak 3-5 gün tekrar uyarma işleminden sonra, ortam başladığı gün ile tahmin edilebilir saman-sarı renk), 24 oyuklu doku kültürü plakası, bir oyuğuna transfer kültürü ve 500 ul, insan T hücre ortamı ilave edin. </li><li> 10-14 gün pMHC tetramerinin analizi bağlama (bölüm 3 ve 4.1 açıklanan etiketleme ve yolluk stratejisini kullanarak) flow sitometri ile Alloantijen özelliğinin değerlendirilmesi T hücre kültürünün 200 ul toplamak, yeniden uyarma izleyin. </li></ol> 6. Uzun süreli yeniden uyarma ve Kültür T hücresi klonlarının <ol><li> Sürekli her 14 günde bir olabilir, arzu edilen özellikteki klonal T hücresi kültürlerini yeniden canlandırmak ve genişletmek. Son anti-CD3 / CD28 mikroboncuk uyarımını takiben 14. günde, steril bir 5 ml&#39;lik bir tüp içine T hücresi kültürlerini toplayın. 2,5 ml&#39;lik bir hacme, tek tüp içinde, aynı T hücresi klonunun birden fazla kuyu birleştirin. </li&gt; <li> 2.5 ml nihai hacme getirmek ve pipetleme hafifçe karıştırmak için orta ekleyin. </li><li> Kültürden eski, mikro çıkarmak için bir hücre ayırma mıknatıs T hücresi kültürü içeren 5 ml&#39;lik tüp yerleştirin. Bu kapak, tüpün üstüne gevşek olması gerekmektedir. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Yavaşça tüpten kapağı çıkarın. Birlikte tüp ve mıknatıs tutma, taze 5 ml&#39;lik bir tüp içine hücre süspansiyonu süzün. Dokunun ya da sıvının son damla kaldırmak için tüp içeriği sallamayın. </li><li> 4 ml nihai hacmi getirmek için orta ekleyin. Örnek 10 ul Hemasitometre kullanarak hücreleri saymak için. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 600 x g&#39;de santrifüj ile T hücrelerinin yeniden elde etmek. </li><li> Durusu süpernatant. 10 6 hücre / ml insan T hücre kültürü ortamında yeniden süspanse T hücreleri. Aktarım 1, 24 oyuklu doku kültür plakasının her bir oyuğuna ml&#39;lik eş payları. </li><li> Uyarıcı, anti-CD3 / a 12.5 ul ihtiva eden 100 ul ortam eklenerek T hücrelerini uyarmak YenidenYüzgeç CD28 microbeads (- 5.6 gibi bölümlere 5.2 açıklanmıştır). % 6 CO 2 inkübatör 37 o C&#39;de inkübe edilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Smith-Garvin, J. E., Koretzky, G. A., Jordan, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+activation.">T cell activation.</a> Annu. Rev. Immunol. 27 (1), 591-619 (2009).</li><li>Morris, G. P., Allen, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+TCR+balances+sensitivity+and+specificity+for+the+recognition+of+self+and+pathogens.">How the TCR balances sensitivity and specificity for the recognition of self and pathogens.</a> Nat. Immunol. 13 (2), 121-128 (2012).</li><li>Arstilla, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+direct+estimation+of+the+human+&#945;&#946;+T+cell+receptor+diversity.">A direct estimation of the human &#945;&#946; T cell receptor diversity.</a> Science. 286 (5441), 958-961 (1999).</li><li>Robbins, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+assessment+of+T-cell+receptor+&#946;-chain+diversity+in+&#945;&#946;+T+cells.">Comprehensive assessment of T-cell receptor &#946;-chain diversity in &#945;&#946; T cells.</a> Blood. 114 (19), 4099-4107 (2009).</li><li>Alanio, C., Lemaitre, F., Law, H. K. W., Hasan, M., Albert, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+of+human+antigen-specific+naive+CD8++T+cells+reveals+conserved+precursor+frequencies.">Enumeration of human antigen-specific naive CD8+ T cells reveals conserved precursor frequencies.</a> Blood. 115 (18), 3718-3725 (2010).</li><li>Suchin, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+frequency+of+alloreactive+T+cells+in+vivo:+new+answers+to+an+old+question.">Quantifying the frequency of alloreactive T cells in vivo: new answers to an old question.</a> J. Immunol. 166 (2), 973-981 (2001).</li><li>Felix, N. J., Allen, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+of+T-cell+alloreactivity.">Specificity of T-cell alloreactivity.</a> Nat. Rev. Immunol. 7 (12), 942-953 (2007).</li><li>Morris, G. P., Ni, P. P., Allen, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alloreactivity+is+limited+by+the+endogenous+peptide+repertoire.">Alloreactivity is limited by the endogenous peptide repertoire.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (9), 3695-3700 (2011).</li><li>Suri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+APCs,+the+autologous+peptides+selected+by+the+diabetogenic+I-Ag7+molecule+are+unique+and+determined+by+the+amino+acid+changes+in+the+P9+pocket.">In APCs, the autologous peptides selected by the diabetogenic I-Ag7 molecule are unique and determined by the amino acid changes in the P9 pocket.</a> J. Immunol. 168 (3), 1235-1243 (2002).</li><li>Yssl, H., Spits, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+maintenance+of+cloned+human+T+cell+lines.">Generation and maintenance of cloned human T cell lines.</a> Curr. Protoc. Immunol. 7, (2002).</li><li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes.">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274 (5284), 94-96 (1996).</li><li>Moon, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naive+CD4++T+cell+frequency+varies+for+different+epitopes+and+predicts+repertoire+diversity+and+response+magnitude.">Naive CD4+ T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude.</a> Immunity. 27 (2), 203-213 (2007).</li><li>Chicz, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+and+promiscuity+among+naturally+processed+peptides+bound+to+HLA-DR+alleles.">Specificity and promiscuity among naturally processed peptides bound to HLA-DR alleles.</a> J. Exp. Med. 178 (1), 27-47 (1993).</li><li>Ni, P. P., Allen, P. M., Morris, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ability+to+rearrange+dual+TCRs+enhances+positive+selection,+leading+to+increased+allo-+and+autoreactive+T+cell+repertoires.">The ability to rearrange dual TCRs enhances positive selection, leading to increased allo- and autoreactive T cell repertoires.</a> J. Immunol. In press, (2014).</li><li>Morris, G. P., Uy, G. L., Donermeyer, D., DiPersio, J. F., Allen, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+receptor+T+cells+mediate+pathologic+alloreactivity+in+patients+with+acute+graft-versus-host+disease.">Dual receptor T cells mediate pathologic alloreactivity in patients with acute graft-versus-host disease.</a> Sci. Transl. Med. 5 (188), (2013).</li><li>Altman, J. D., Reay, P. A., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+functional+peptide+complexes+of+class+II+major+histocompatibility+complex+proteins+from+subunits+produced+in+Escherichia+coli.">Formation of functional peptide complexes of class II major histocompatibility complex proteins from subunits produced in Escherichia coli.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90 (21), 10330-10334 (1993).</li><li>Sabatino, J. J., Huang, J., Zhu, C., Evavold, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+prevalence+of+low+affinity+peptide-MHC+II+tetramer-negative+effectors+during+polyclonal+CD4++T+cell+responses.">High prevalence of low affinity peptide-MHC II tetramer-negative effectors during polyclonal CD4+ T cell responses.</a> J. Exp. Med. 208 (1), 81-90 (2011).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

T cell alloreactivity is a long-studied and clinically-relevant phenomenon. The robust proliferative and effector responses of T cells to allogeneic stimulation has enabled extensive analyses of human T cell responses in vitro through relatively straightforward mixed lymphocyte reactions of peripheral blood T cells against inactivated allogeneic cells. However, these primary alloreactive T cell responses are oligoclonal, comprised of a large number of individual T cells responding to specific alloantigens. This ...

T lenfositleri adaptif bağışıklık sisteminin önemli bileşenleridir. T hücreleri, sadece doğrudan değil, efektör çeşitli mekanizmalar aracılığıyla patojenlere karşı koruyucu bir immün yanıtlara aracılık değil, aynı zamanda aktif kendini immünolojik toleransı muhafaza edilmesi ve bağışıklık sisteminin diğer hücrelerinin tepkileri yönlendirilmesi için sorumludur. Bu işlevler, bir T hücresi reseptörü (TCR) bağlanması, sitokinler ve kemokinlerin ve metabolitleri dahil olmak üzere 1, entegre sinyalleri, bir dizi içine yönlendirilir. Adaptif bağışıklık T hücre rolü tanımlayan karakteristik spesifisite sağlamaktadır Bu sinyaller arasında, TCR, özel bir önem taşır. TCR, T hücre efektör işlevi başlatmak sinyallerini temin etmek üzere bir çok özel ve hassas bir şekilde MHC (insan ortologu HLA) molekülleri (pMHC kompleksleri) tarafından sunulan lineer peptid antijen ile etkileşime girer. PMHC ligandlar ile TCR etkileşimleri biyokimyasal parametreleri T özgüllük sadece sağlarHücre aktivasyonu, aynı zamanda daha sonra T-hücresi işlevinin 2 niteliksel etkisi vardır. Bu nedenle, eğitim T hücre fonksiyon, genellikle tanımlanmış antijenik özgünlüğe sahip klonal T hücrelerinin tepkileri incelenmesi gerekir. 10 8 farklı αβTCRs 3-4 - yaklaşık 10 ila 12 αβ hücresi içeren insan T hücresi bölmesi, tahminen 10 7 içerir. Bu farklı repertuar koruyucu bağışıklık için bir T hücre yanıtını gerektirecek potansiyel patojenlerin peptidlerin geniş bir dizi tanınması için bir fırsat sunuyor. Bu antijene 5 önce bağışıklık yanıtının yokluğunda 10 -7 - kendi kendine MHC tarafından sunulan belirli bir yabancı antijene yanıt olarak T hücrelerinin frekansı 10 -4 mertebesinde olduğu tahmin edilmektedir. Naif T hücre repertuar peptid antijenleri ve sınır tepki gösteren öz-MHC tanıma yeteneğini sağlamak için timus seçimi ile şekillenmektedirkendinden peptit antijenlerine karşı ivity koruyucu bağışıklığı 2 aracılık potansiyel kullanımını maksimize edilmesidir. Bu ihlali reaktifliği, göreceli olarak büyük bir frekans, 10 -3 tasarlanmış Bununla birlikte, - İmmünolojik olarak naif bulunan bireylerden alınan T hücrelerinin, 10 -4, yabancı MHC moleküllerini hem de onlar mevcut endojen peptidler hem de göz önünde bulundurarak, farklı genetik yapıdaki hücreler ile uyarılmaya yanıt 6. Allojenik pMHC ligandların tanınması, bireysel MHC tarafından sunulan yabancı antigenlerin tanınmasına yapısal olarak benzer olduğu; TCR, allojenik MHC molekülü hem de sunulan peptit 7 her iki kritik biyokimyasal etkileşimleri yapar. PMHC çeşitliliğine allojeneik stimülasyonu sonucunda T hücrelerinin yanıtı sağlam yapısı farklı genetik yapıdaki hücreler, 8 yüzeyi üzerinde mevcut olan kompleksler. Bu, her bir MHC yaklaşık 2 x 10 4 farklı endojen peptit antijenlerini 9 sunulur olduğu tahmin edilmektedir. Bu bAllojenik stimülasyona yanıt readth T hücre alo-tepkiselliği sonuçlanan, host hastalığı (GVHD) alograft reddi veya doku yaması gibi klinik olarak ilgili patolojisi arasında önemli bir yönüdür. Insan T hücresi alloreaktif yanıtlarının Çalışma, geleneksel olarak allojenik hücreleri ile stimüle edilmesini müteakkip bir hassas T hücreleri poliklonal tepkilerin test üzerine yaslanmaktadır. Sınırlayıcı seyreltme ile birlikte aynı allojeneik hücre hattı ile tekrarlı uyarım allojenik HLA 10 tanımlanan tanınması klonal T hücrelerinin üretme yeteneğine sahiptir analiz eder. Endojen pMHC en büyük ve farklı bir repertuar HLA T-hücrelerinin geniş bir repertuar uyaran belirli bir alogeneik kapsamayabilir kompleksleri Ancak, bu yaklaşım tek tek allojenik pMHC ligandlarına yanıtları incelenmesi için sorunludur. Bu toplu popülasyon uyarılması ve sınırlayıcı seyreltme yaklaşım arzu edilen Reacti T hücreleri izole etmek için klonların çok sayıda tarama gerektirecektirTek pMHC bağına karşı vite. Buna ek olarak, tek bir allojenik pMHC liganda yanıt T hücrelerinin frekansı, belirli bir antijene tepki veren, insan T hücresi klonlarının verimli üretimi için bir engel sunulur naif T hücresi popülasyonları arasında nispeten düşüktür. Tanımlama ve poliklonal popülasyonlarından antijen-spesifik T hücrelerinin elde edilmesi fluoroforla işaretlenmiş pMHC multimerlerinin 11 geliştirilmesi ile sağlanmıştır. Bu yaklaşım, bir streptavidin-işaretli flüorofor bağlanarak etiketli rekombinant çözünür biyotinile MHC molekülleri, yüklenen özel peptit antijenlerini kullanmaktadır. PMHC bir multimerizasyon çözünür pMHC ligandlar için TCR&#39;nin bünyesinde düşük bir düzeyde (uM) bir afinite telafi avidite artırır. Etiketlenmiş hücreler tanımlanır ve akış sitometrisi ile izole edilebilir. Bununla birlikte, bu yaklaşım, halen tipik olarak naif T hücresi popülasyonları arasında, antijen-spesifik T hücrelerin, en düşük frekans ile sınırlıdırEn akış sitometrelerinde doğru tanımlama ve tayin sınırından daha az büyüklükte siparişleri. Bu sınırlama gidermek için, tetramer-etiketli hücreler için pMHC tetramer etiketleme ve daha sonra manyetik boncuk zenginleştirmek için bir yöntem, 12 geliştirilmiştir. Bu yöntem, güvenli bir tespit numaralandırma ve düşük frekanslı antijen-spesifik T hücrelerinin elde edilmesi göstermiştir. Bu protokol, spesifik olarak bireysel allojenik pMHC-ligantlarına tepki veren, insan T hücresi klonlarının oluşturulması için etkili bir protokolü tarif eder. Bu protokol, tek kriteri hücrelerinden T hücresi klonlarının üretimini (etkinleştirmeniz sıralama hücre bağlanımını akış sitometrisiyle ve insan T hücrelerinin in vitro kültürü için güçlü bir yöntemle Alloantijen özgü insan T hücrelerinin izolasyonu için multimer, etiketleme ve zenginleştirme pMHC (HLA) &#39;nin uygulandığı Şekil 1&#39;de genel bakış).

<table><tbody><tr><td>Sodium heparin venous blood collection tube 16 x 100 mm</td><td>Becton, Dickenson and Company</td><td>366480</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7801</td><td></td></tr><tr><td>Rosette Sep Human T Cell Enrichment Kit</td><td>Stemcell Technologies</td><td>15061</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s PBS, 1x without Ca or Mg</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6635</td><td></td></tr><tr><td>Fluorophore-labeled pMHC tetramer</td><td>NIH Tetramer Facility</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Biotin Selection Kit</td><td>Stemcell Technologies</td><td>18553</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Selection magnet</td><td>Stemcell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>TruStain FcX Human Fc blocking solution</td><td>Biolegend</td><td>422301</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD5 PE-Cy7 (clone UCHT2)</td><td>Biolegend</td><td>300621</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD14 FITC (clone HCD14)</td><td>Biolegend</td><td>325603</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD19 FITC (clone HIB19)</td><td>Biolegend</td><td>302205</td><td></td></tr><tr><td>Iscove&#039;s DMEM, without b-ME or L-glutamine</td><td>Corning</td><td>15-016-CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Corning</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>b-Mercaptoethanol&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin sulfate (50 mg/ml)</td><td>Omega Scientific</td><td>GT-50</td><td></td></tr><tr><td>Human AB serum, male donor</td><td>Omega Scientific</td><td>HS-30</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human IL-2</td><td>Peprotech</td><td>AF 200-02</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28</td><td>Life Technologies</td><td>11131D</td><td></td></tr><tr><td>Media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell sorting buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>1 L</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>10 g</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0.5 M)</td><td>2 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human T Cell Culture Medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iscove&#039;s DMEM</td><td>351.6 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heat-inactivated human AB serum</td><td>40 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>4 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutamax (100x)</td><td>4 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin (50 mg/ml)</td><td>0.4 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>b-mercaptoethanol (14.3 M)</td><td>1.4 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human IL-2 (1 mg/ml)</td><td>1 ml</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generation of human alloantigen-specific t cells from peripheral blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

Strateji sıralama Akış sitometrisi, bir manyetik tanecik zenginleştirme ve tek hücreli akışı aracılığı ile özgüllük Alloantijen tanımlanmış olan bu protokol, klonal insan T hücre kültürlerinin üretimini tarif eder. 1, sürecin bir özeti verilmektedir Şekil. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52257/52257fig1highres.jpg" /> Şekil 1: Protokol genel protokolü, burada a...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood at JoVE.com

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

Periferik Kan İnsan alloantijen-özgü T hücrelerinin üretilmesi

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

generation-of-human-alloantigen-specific-t-cells-from-peripheral-blood

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.9K Görüntüleme.  University of California, San Diego. This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

Video: Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

Induction of Alloantigen-specific Anergy in Human Peripheral Blood Mononuclear Cells by Alloantigen Stimulation with Co-stimulatory Signal Blockade

Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (AHSCT) offers the best chance of cure for many patients with congenital and acquired hematologic diseases. Unfortunately, transplantation of alloreactive donor T cells which recognize and damage healthy patient tissues can result in Graft-versus-Host Disease (GvHD)1. One challenge to successful AHSCT is the prevention of GvHD without associated impairment of the beneficial effects of donor T cells, particularly immune reconstitution and prevention of relapse. GvHD can be prevented by non-specific depletion of donor T cells from stem cell grafts or by administration of pharmacological immunosuppression. Unfortunately these approaches increase infection and disease relapse2-4. An alternative strategy is to selectively deplete alloreactive donor T cells after allostimulation by recipient antigen presenting cells (APC) before transplant. Early clinical trials of these allodepletion strategies improved immune reconstitution after HLA-mismatched HSCT without excess GvHD5, 6. However, some allodepletion techniques require specialized recipient APC production6, 7and some approaches may have off-target effects including depletion of donor pathogen-specific T cells8and CD4 T regulatory cells9.One alternative approach is the inactivation of alloreactive donor T cells via induction of alloantigen-specific hyporesponsiveness. This is achieved by stimulating donor cells with recipient APC while providing blockade of CD28-mediated co-stimulation signals10.This "alloanergization" approach reduces alloreactivity by 1-2 logs while preserving pathogen- and tumor-associated antigen T cell responses in vitro11. The strategy has been successfully employed in 2 completed and 1 ongoing clinical pilot studies in which alloanergized donor T cells were infused during or after HLA-mismatched HSCT resulting in rapid immune reconstitution, few infections and less severe acute and chronic GvHD than historical control recipients of unmanipulated HLA-mismatched transplantation12. Here we describe our current protocol for the generation of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) which have been alloanergized to HLA-mismatched unrelated stimulator PBMC. Alloanergization is achieved by allostimulation in the presence of monoclonal antibodies to the ligands B7.1 and B7.1 to block CD28-mediated costimulation. This technique does not require the production of specialized stimulator APC and is simple to perform, requiring only a single and relatively brief ex vivo incubation step. As such, the approach can be easily standardized for clinical use to generate donor T cells with reduced alloreactivity but retaining pathogen-specific immunity for adoptive transfer in the setting of AHSCT to improve immune reconstitution without excessive GvHD.

This paper describes a simple technique to induce alloantigen-specific anergy in human peripheral blood mononuclear cells. The technique can be applied clinically to generate non-alloreactive donor cells. Infusion of these cells could improve immune reconstitution and reduce toxicity after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation.

Co-uyarıcı Sinyal Abluka Alloantigen Uyarım İnsan periferik kan mononükleer hücreleri içinde Alloantigen özel anerji indüksiyonu

Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (AHSCT) offers the best chance of cure for many patients with congenital and acquired hematologic ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in immunologic homeostasis with the vast amount of self and commensal antigens in and on the human body. Perturbations in the balance between Tregs and inflammatory conventional T cells can result in immunopathology or cancer. Although therapeutic injection of Tregs has been shown to be efficacious in murine models of colitis1 , type I diabetes2 , rheumatoid arthritis and graft versus host disease,4 several fundamental differences in human versus mouse Treg biology5 has thus far precluded clinical use. The lack of sufficient number, purity, stability and homing specificity of therapeutic Tregs necessitated a dynamic platform of human Treg development on which to optimize conditions for their ex vivo expansion6.
Here we describe a method for the differentiation of induced Tregs (iTregs) from a single human peripheral blood donor which can be broken down into four stages: isolation of peripheral blood mononuclear cells, magnetic selection of CD4+ T cells, in vitro cell culture and fluorescence activated cell sorting (FACS) of T cell subsets. Since the Treg signature transcription factor forkhead box P3 (FoxP3) is an activation-induced transcription factor in humans7 and no other unique marker exists, a combinatorial panel of markers must be used to identify T cells with suppressor activity. After six days in culture, cells in our system can be demarcated into na&iuml;ve T cells, memory T cells or iTregs based on their relative expression of CD25 and CD45RA. As memory and na&iuml;ve T cells have different reported polarization requirements and plasticities8 , pre-sorting of the initial T cell population into CD45RA+ and CD45RO+ subsets can be used to examine these discrepancies. Consistent with others, our CD25HiCD45RA- iTregs express high levels of FoxP39 , GITR and CTLA-411 and low levels of CD12712 . Following FACS of each population, resultant cells can be used in a suppressor assay which evaluates the relative ability to retard the proliferation of carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeled autologous T cells.

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&#239;ve and Memory T Cells

We describe a method for generating regulatory, memory and na&#239;ve T cells from a single human blood donor. Polarized Tregs can be then compared to other subsets in a variety of genetic and functional applications with genetic homogeneity, including a suppression assay also detailed here.

İlköğretim İnsan naif ve Bellek T Hücreleri gelen İsteyerek Düzenleyici T Hücreleri Üretimi

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal Vectors (EV) to generate integration-free iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PB MNCs). The episomal vectors used are DNA plasmids incorporated with oriP and EBNA1 elements from the Epstein-Barr (EB) virus, which&#160;allow for replication and long-term retainment of plasmids in mammalian cells, respectively. With further optimization, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood. Two critical factors for achieving high reprogramming efficiencies&#160;are: 1) the use of a 2A &#34;self-cleavage&#34; peptide to link OCT4 and SOX2, thus achieving equimolar expression of the two factors; 2) the use of two vectors to express MYC and KLF4 individually. Here we describe a step-by-step protocol for generating integration-free iPSCs from adult peripheral blood samples. The generated iPSCs are integration-free as residual episomal plasmids are undetectable after five passages. Although the reprogramming efficiency is comparable to that of Sendai Virus (SV) vectors, EV plasmids are considerably more economical than the commercially available SV vectors. This affordable EV reprogramming system holds potential for clinical applications in regenerative medicine and provides an approach for the direct reprogramming of PB MNCs to integration-free mesenchymal stem cells, neural stem cells, etc.

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

Epizomal vektörlerin kullanılması insan periferik kan mononükleer hücrelerinden entegrasyon içermeyen uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Gelişim Biyolojisi

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of patients with advanced cancer. Adoptive T cell transfer (ACT) of highly enriched tumor antigen-specific T cells has been shown to cause durable regression of metastatic cancer in some patients. However, during expansion, these cells may become exhausted or senescent, limiting their effector function and persistence in vivo. Induced pluripotent stem cell (iPSC) technology may overcome these obstacles by leading to in vitro generation of large numbers of less differentiated tumor antigen-specific T cells. Human iPSC (hiPSC) have the capacity to differentiate into any type of somatic cell, including lymphocytes, which retain the original T cell receptor (TCR) genomic rearrangement when a T cell is used as a starting cell. Therefore, reprogramming of human tumor antigen-specific T cells to hiPSC followed by redifferentiation to T cell lineage has the potential to produce rejuvenated tumor antigen-specific T cells. Described here is a method for generating tumor antigen-specific CD8&#945;&#946;+ single positive (SP) T cells from hiPSC using OP9/DLL1 co-culture system. This method is a powerful tool for in vitro T cell lineage generation and will facilitate the development of in vitro derived T cells for use in regenerative medicine and cell-based therapies.

This article describes a method to generate functional tumor antigen-specific induced pluripotent stem cell-derived CD8&#945;&#946;+ single positive T cells using OP9/DLL1 co-culture system.

Tümör Antijene Özgü T Hücrelerinin Üretimi için İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Kullanılması

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Kanser Araştırmaları

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer immunotherapy 1-3. Compared to Dendritic cells (DCs), the best characterized APC, CD40-B cells have several distinct biological and technical properties. Similar to DCs, B cells show an increased expression of MHC and co-stimulatory molecules (Fig.1b), exhibit a strong migratory capacity and present antigen presentation efficiently to T cells, after stimulation with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L). However, in contrast to immature or mature DCs, CD40-B cells express the full lymph node homing triad consisting of CD62L, CCR7/CXCR4, and leukocyte function antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessary for homing to secondary lymphoid organs (Fig.1a) 3. CD40-B cells can be generated without difficulties from very small amounts of peripheral blood which can be further expanded in vitro to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients (Fig.1c,d) 1,4. 
In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated CD40-B cells from human PBMC. Key molecules for the cell culture are CD40 ligand, interleukin-4 (IL-4) and cyclosporin A (CsA), which are replenished in a 3-4 day culture cycle. For laboratory purposes CD40-stimulation is provided by NIH/3T3 cells expressing recombinant human CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the human CD40 ligand on the transfectants has to be checked regularly (Fig.2). 
After 14 days CD40-B cell cultures consist of more than 95% pure B cells and an expansion of CD40-B cells over 65 days is frequently possible without any loss of function 1, 4. CD40-B cells efficiently take up, process and present antigens to T cells 6. They do not only prime na&#970;ve, but also expand memory T cells 7,8. CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation, differentiation and function. Moreover, they represent a promising tool for therapeutic or preventive vaccination against tumors 9.

In this video we present the ex vivo generation and expansion of human CD40-activated B cells (CD40-B) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by stimulation with CD40 ligand and interleukin-4.

İnsan CD40 aktive B hücreleri üretilmesi

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Biyoloji

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been considered as the only source of &#945;&#946;T cells. Yet, thymic involution begins early in life leading to a drastically reduced output of na&#239;ve &#945;&#946;T cells into the periphery. Nevertheless, even centenarians can build immunity against newly acquired pathogens. Recent research suggests extrathymic &#945;&#946;T cell development, however our understanding of pathways that may compensate for thymic loss of function are still rudimental. &#947;&#948; T cells are innate lymphocytes that constitute the main T-cell subset in the tissues. We recently ascribed a so far unappreciated outstanding function to a &#947;&#948; T cell subset by showing that the scarce entity of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells can transdifferentiate into &#945;&#946;T cells in inflammatory conditions. Here, we provide the protocol for the isolation of this progenitor from peripheral blood and its subsequent cultivation. V&#948;1 cells are positively enriched from PBMCs of healthy human donors using magnetic beads, followed by a second step wherein we target the scarce fraction of CD4+ cells with a further magnetic labeling technique. The magnetic force of the second labeling exceeds the one of the first magnetic label, and thus allows the efficient, quantitative and specific positive isolation of the population of interest. We then introduce the technique and culture condition required for cloning and efficiently expanding the cells and for identification of the generated clones by FACS analysis. Thus, we provide a detailed protocol for the purification, culture and ex vivo expansion of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells. This knowledge is prerequisite for studies that relate to this &#945;&#946;T cell progenitor`s biology and for those who aim to identify the molecular triggers that are involved in its transdifferentiation.

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral V&#948;1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic &#945;&#946; T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

İzolasyon ve<em&gt; Ex Vivo</emVδ1 of&gt; Kültür<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; γδ T hücrelerinin bir Extrathymic αβT hücre Progenitör

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

Yaratma<em&gt; De Novo</em&gt; Merkezli Hemichain retroviral transdüksiyonu ile antijen-özel insan T hücre reseptörleri

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

Tüm kan İnsan monosit türevli dendritik hücrelerin oluşumu

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

Kanda dolaşan nadir antijen spesifik B hücreleri Discriminative insan monoklonal antikorların üretimi

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Generation of Human Regulatory T Cell Clones

Human regulatory T cells (Treg) are notoriously difficult to isolate in high purity given the current methods of Treg enrichment. These methods are based on the identification of Treg through several activation-dependent cellular surface markers with varying expression levels in different physiologic and pathologic conditions. Populations isolated as &#8220;Treg&#8221; therefore often contain considerable numbers of non-Treg effector cells (i.e., Teff) which hamper the precise phenotypic and functional characterization of these cells, their genomic and proteomic characterization, their reliable enumeration in different states of health and disease, as well as their isolation and expansion for therapeutic purposes. The latter, in particular, remains a major hurdle, as the inadvertent expansion of effector cells homing in Treg-relevant cellular compartments (e.g., CD4+CD25+ T cells) may render Treg-based immunotherapy ineffective, or even harmful. This work presents a method that circumvents the problems associated with population-based isolation and expansion of Treg and shows that the generation of Treg candidate clones with the subsequent selection, culture, and expansion of only carefully vetted, monoclonal cells, enables the generation of an ultrapure Treg cell product that can be kept in culture for many months, enabling downstream investigation of these cells, including for possible therapeutic applications.

This protocol describes the cloning and expansion of human regulatory T cells for the generation of ultra-high purity viable human Treg with stable demethylation at the Treg-specific demethylated region (TSDR) and Treg-specific phenotypic features.

Human regulatory T cells (Treg) are notoriously difficult to isolate in high purity given the current methods of Treg enrichment. These methods are based ...

Periferik Kan İnsan alloantijen-özgü T hücrelerinin üretilmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler