Bu çalışma, Würzburg Üniversitesi Enfeksiyon Hastalıkları Araştırma Merkezi (ZINF) gelen, Genç Araştırmacı Araştırma Programı tarafından finanse edilmektedir. Juan C Garcia-Betancur Würzburg Üniversitesi Yaşam Bilimleri Enstitüsü (GSLS) bir doktora üyesidir.

1. Etiketleme B. subtilis ve Biyofilm Oluşumu Deneyi <ol><li> PCR ile, ilgilenilen geni promoter bölgesi amplifiye. Bu örnek olarak P tapa, Tasa matriks proteini 26 üretimi sorumlu genlerin klonlanması arttırıcının göstermektedir. Pkm008 vektör (Özlü laboratuar, Harvard Tıp Okulu. Boston, ABD tarafından yaratılmış) içine Clone P tapa (Şekil 2). </li><li> Enzimatik sindirimi (Enzyme önerilen, XhoI) ile plazmit doğrusallaştırmak. </li><li> B. doğal yetkinlik neden subtilis, daha önce tarif Harwood tek adımlı protokolü takip eden ve 27 keserek 168 süzülür. </li><li> Yetenekli hücrelerin kültürüne doğrusallaştırılmış plazmid ekleyin ve inkübasyon iki saat sonra spectinomycin direniş için seçin. </li><li> Elde Suşlarının B. nötr amyE odağı haline yapı taktınız çift ​​rekombinasyon tarafından subtilis (Şekil 4). Oluşturmak içinBir çift-etiketli suşu, bu şekil 3&#39;de ortaya plazmid pDR183 kullanılarak nötr odağına Laca içine ikinci bir raportör entegre. Bu pKM008 içinde klonlanmış Muhabirlerin yerleştirilmesi için yukarıda açıklanan aynı teknik kullanılarak, bu raportör yerleştirin. </li><li> Biyofilm oluşturan yapabiliyor NCIB3610 süzün 168 muhabir aktarın. SPP1 faj iletim protokolü 28,29 kullanın. TY ortamda donör suşu (LB +10 mM MgSO 4 +10 uM MnSO 4) Grow. Faj stok seyreltme 100 ul kültürünün 200 ul karıştırın. Inkübasyon 30 dakika sonra yumuşak agar 3 ml ekleyin ve faj haleler 37 ortaya izin ° C </li><li> Yumuşak agar toplayın. O Santrifüj ve supernatant geçmesi bir şırınga 0.22 mikron filtre düşündüm. TY ortamda yetiştirilen alıcı suşu bir kültür bulaştırmak için bu süpernatant kullanın. 30 ul 10 kültürü seyreltilmiş 1:10 arasında ml ilave edilir. 30 dakika inkübe ve inkübasyon 24 saat sonra antibiyotik direnci için seçin. </li><li> Se37 bir dosyayı içeren bir koloni ve LB gecede büyümek ° C </li><li> % 1.5 agar 30 MSgg katı biyofilm uyaran ortamda gecede kültür 3 uL Nokta. Hücreler 30 ° C (Şekil 3) 72 saat boyunca büyümeye olanak sağlar. Büyüme Üç gün sonra, MSgg agar yüzeyi üzerinde oluşturulmuş biyofilmlerde agar yüzeyinde bir kompleks morfolojik mimarisini geliştirmiştir. </li></ol> 2. Biyofilm Dispersiyon ve Hücre Sabitleme <ol><li> Biyofilm şeklinde bir kürdan veya cımbız kullanarak MSgg agar yüzeyine çıkarın. Biyofilm tutarlılığı size tek parça agar yüzeyinden soyma kapalı izin vermelidir. </li><li> PBS tamponu 3 ml biyofilm yerleştirin ve bir pipet veya iğne yoluyla tekrarlanan geçişi ile biyofilm dağıttı. Alternatif olarak, biyofilm dispersiyon hafif sonikasyon kullanılarak yapılabilir. Hafif sonikasyon bir 3 çıktı ve 0.7 saniye genliği 12 darbe gerektirir. </li><li> Numuneler hücre tek analiz Fix. ResuspenTam olarak, yedi dakika için oda sıcaklığında 4% paraformaldehit çözeltisi ve inkübe 1 ml hücre süspansiyonu d 300 uL. 4% paraformaldehit eriyiğinin bileşimi: Paraformaldehitten 2 g PBS tampon 50 ml 4 ul 10 N NaOH 0,22 um bir alikot filtre ve yoluyla çözeltisi süzmek </li><li> PBS tamponu fiksasyon üç kez yıkayın ve sonra hücreler PBS tamponu 300 uL onları tekrar süspansiyon. </li></ol> 3. Floresans Mikroskopi <ol><li> Bir mikroskop lamı üzerinde% 0.8 agaroz 200 uL dökün ve dikkatli bir slayt ile örtün. Alt slayt bağlı agaroz bir tabaka elde etmek için 2 dakika sonra usulca üst slayt çıkarın. </li><li> Nokta 2 agaroz tabakanın yüzeyi üzerinde sabit bir hücre uL ve bir mikroskop cam kapak ile birlikte kapsar. </li><li> Floresans mikroskobu Örnek yerleştirin. Biz bir Leica CRT6000 iIluminat ile donatılmış bir Floresans mikroskop Leica DMI6000B kullanınsistemi iyon. BP500/20, Em: YFP için filtre Ex olan BP535/30 ve CFP Ex şunlardır: BP426/20, Em: 480/40 </li><li> Numunenin Açığa 50-200 ms arasında bir uyarma floresan. Deney için seçilen koşullar herhangi bir floresans gösteren bir negatif kontrol göre eksitasyon süresi ayarlanır. </li><li> Parlak alan ile elde edilen aynı görüntü floresan görüntü bakın. Bir resimde iki görüntü birleştirme. Sonuçlar P tapa-YFP Şekil 6 &#39;da reporter temsil edilirler barındıran bir tek-etiketli suşu kullanılarak akış floresans mikroskobu elde edilmiştir. </li></ol> 4. Akım Sitometri Kullanımı Tek Hücreli Kantitasyonu <ol><li> Hafif sonikasyon kullanarak sabit hücre örneği Dispers. Hücre erimesi neden olmadan tek hücrelere kümeleri dağıtmak için, bir 5 çıktı ve 0.7 saniye genliği ile 12 bakliyat 2 serisi performans örnek sonikasyon. Işık mikroskobu ile hücre dağılımı verimliliği onaylayın. </li&gt; <li> Sitometresi analizi önce PBS tamponu örnek 1:100 sulandırınız. Biz bir akış sitometresi BD FACS Canto II kullanın. YFP floresan için, 530/30 filtre ile birleştiğinde 488 nm dalga boyunda lazer uyarma kullanın. CFP floresans, bir 408/40 filtresi ile birleştiğinde 405 nm&#39;de lazer eksitasyon kullanabilir. </li><li> Iki negatif kontroller ile akış sitometresi makine kalibre. Süspansiyon hiçbir hücreler PBS ile tampon A örneği akış sitometresi ile duyulana partikül boyutu için negatif kontrol olarak hizmet olmalıdır. Hiçbir floresan muhabiri etiketli örnek bir akış sitometresinin floresans duyarlılığı için negatif kontrol olarak hizmet edilmelidir. </li><li> Akış sitometresi içinde flüoresan raportör etiketli Örnek yerleştirin. Her numune için, saniyede 300 ile 3000 olayları arasında bir akış hızı ile en az 50.000 olayları analiz. </li><li> FACS Diva yazılımı (BD Biosciences) kullanarak veri yakalama ve FlowJo 8.5.2 yazılımı kullanarak bunları analiz. Gösteriyor ki kontrol için floresan sinyalleri bakınyok floresans. </li><li> İki eksenli grafik bir tek etiketli suşu floresans sinyal izleme verileri sunmak. X ekseni ve Y eksen floresans farklı seviyelerde ifade eden hücrelerin sayısı tespit floresans sinyali çizilir. Sonuçlar P tapa-YFP şekil 8&#39;de temsil muhabiri barındıran tek etiketli suşu kullanılarak flow sitometri analizi ile elde. </li><li> Üç eksenli grafik bir çift etiketli suşu floresans sinyal izleme verileri sunmak. X ve Y ekseni (örneğin, GFP Y ekseni olarak X-eksenine ve CFP ölçülen olacaktır) takip kanalların her birinin floresans sinyali çizilir. Z-eksenine plot her bir raportör ve kağıt düzlem (Şekil 9 ve 10) dik olacak konturu izohatlar olarak eksprese eden hücrelerin sayısı. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Zaman B. subtilis b bir plaka üzerinde büyüriofilm tetikleyen orta MSgg, biyofilm oluşumu 30 ° C 30 inkübasyon üç gün sonra görülür. Biyofilm güçlü tutarlılık gösteren ve bu tek parça agar yüzeyinden soyulmuş olabilir. Dahası, belirgin biyofilm katılan hücre alt (Şekil 5) bir göstergesidir karmaşık bir morfolojik mimarisini göstermektedir. Örneğin, koloninin yüzeyinde kırışıklık oluşumunda biyofilmler sonuçlar hücredışı matrisin üretimi. Bu özellik matriks üreticileri 19 subpopülasyonu farklılaşması ile korele edilebilir. Sporların, bu yapıların 30 apikal alanda beri lokalize Benzer şekilde, biyofilm yüzeyinde hava yapıların yaratma, sporlanan hücrelerin bir alt varlığında bir göstergesidir. Bir tek etiketli ve floresan mikroskobu kullanarak bir çift etiketli olan gerginlik r hücre farklılaşmasının görselleştirme örneklerisırası ile, Şekil 6 ve 7&#39;de epresented. Tek-etiketli suşu flüoresan raportör barındıran matris üreten hücrelerin subpopülasyonu olarak ifade edilir P tapa-CFP. Bu subpopülasyonu biyofilm (Şekil 6) oluşturan hücre dışı matriks üretmek ve salgılamak sorumludur. Çift etiketli suşu muhabiri barındıran P tapa-CFP 26 ve ek muhabiri P srfAA-YFP 31. Bu ikinci muhabiri matris üreticilerin farklılaşma (Şekil 7) sinyal basamaklarını tetikler sinyal molekülü surfactin salgılamaya sorumlu hücrelerin subpopülasyonu izlemenizi sağlar. Surfactin üreticilerin subpopülasyonu sarı renkli yanlış ise matris üreticilerin subpopülasyonu mavi renkli yanlıştır. Muhabir P tapa-YFP Şekil 8&#39;de sunulmaktadır barındıran tek etiketli suşu kullanılarak flow sitometri analizi. Tedavi edilmeyen kontrol susu barındıran değilHerhangi bir floresan protein genleri tek bir nüfusu düşük bağıl floresans gösterdi. Olmayan biyofilm uyaran koşullarda P tapa-YFP barındıran Hücreleri matris üreticilerin subpopülasyonu ayırt etmedi ve bütün nüfusun düşük bağıl floresans gösterdi. Biyofilm tetikleyen durumda, yüksek nisbi floresan hücrelerin bir alt düşük bağıl floresan tepe noktasında 23 sağında bir omuz olarak gözlenen, oluştu. Bir çift-etiketli suşu akış sitometresi kullanılarak analizinden elde edilen sonuçlar Şekil 9 ve 10&#39;da temsil edilir. Şekil 9 çift etiketli suşu P tapa-CFP, P srfAA-YFP kullanarak matrisi üretici ve surfactin üreticilerin subpopülasyonunun izlenir. Arkaplan floresan kontrolü olarak biz herhangi bir floresan protein genleri barındıran olmayan bir suş kullanılmıştır. Sonra, tek etiketli suşu kullanarak her floresan kanal matrisi üretici ve surfactin üreticilerin her subpopülasyonu tespit<html> kontrol olarak s. Çift etiketli suşu P tapa-CFP, P srfAA-YFP floresan gazetecilere yüksek düzeyde eksprese eden hücrelerin iki subpopülasyonunun gösterdi. Her nüfus özel hücreler 15 iki alt popülasyonlar arasındaki gazetecilere ifadesi hiçbir örtüşme olduğunu gösteren çerçeveli. Çift etiketli kullanarak Benzer şekilde, akım sitometri analizi suşu P skf-YFP, P tapa-YFP rakam 10 sunulmuştur. Geni skf için reportör matris üreticileri 24 subpopülasyonu ile koordineli ayırt etmek için tarif edilmiştir yamyamlar 32, bir subpopülasyonu farklılaşmasını izler. Bu durumda, çift-etiketli suşu YFP ve CFP hem de ifade flöresanlı hücre tek bir subpopülasyonu gösterdi. Bu iki hücre farklılaşması yollarının koordineli aynı subpopülasyonu aktive olduğunu göstermiştir. &quot;1.jpg /&gt; Şekil 1.. Deney genel şeması. Protokolü üç ana adımda ayrılır. Birinci adımda B&#39;nin suşu etiketlenmesi gerektirir ilgi subpopülasyonu izler muhabiri füzyon subtilis. İkincisi, biyofilm uyaran koşulları etiketli suşları büyür. Üçüncü olarak, biyofilm dağıtmak ve floresan mikroskobu ve akım sitometri kullanarak nüfusun tek hücreli analizi yürütmek. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig2.jpg" /> Şekil 2. Entegrasyon vektör pKM008 şematik gösterimi. Bu vektör çift rekombinasyon tarafından nötr odağı amyE içine ilgi muhabiri füzyon bütünleştirir. Ilgi (P tapa) ile promotör EcoRI sınırlama sitelerini ve HindIII kullanılarak vektörüne klonlanır. Sonra, CFP genin ekspresyonu promotör P tapa kontrolü altındadır. Orientatplazmid içinde genlerin iyon bir ok olarak temsil edilir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig3.jpg" /> Şekil 3. Entegrasyon vektör pDR183 şematik gösterimi. Bu vektör çift rekombinasyon tarafından nötr odağı Laca içine ilgi muhabiri füzyon bütünleştirir. Ilgi (P tapa - CFP) arasında füzyon EcoRI sınırlama sitelerini ve BamHI ile vektörüne klonlanır. Plazmid içinde genlerin yönelimi bir ok olarak temsil edilir. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig4.jpg" /> Şekil 4. B. kromozom içine gazetecilere entegrasyon şeması çift ​​rekombinasyon tarafından subtilis. (A) B. subtilis kromozom biyofilm gelişimini etkilemeden muhabiri füzyonları bütünleştirmek için iki nötr lokusları, amyE ve Laca sahiptir. (B) </spKM008 çift rekombinasyon&gt; Süreci Lüks. Doğrusallaştırılmış plazmid B. genomunun içine entegre çift ​​rekombinasyon tarafından subtilis. Muhabiri füzyon istikrarlı bir şekilde nötr lokus entegre. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/3796/3796fig5.jpg" /> Şekil 5. B. biyofilm suşu B. subtilis bioflm oluşumu NCIB3610. Proses subtilis NCIB 3610 30 az üç gün boyunca biyofilm uyaran orta MSgg büyüyen ° C Biyofilm gelişmesi Sıralı resimleri 12 saatte çekildi. <img alt="Şekil 6" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig6.jpg" /> 6 Şekil. Floresan mikroskop altında matriks üreticilerin subpopülasyonu Görselleştirilmesi. B. bir biyofilm gelen bir örnek subtilis P tapa - metreden parmak sayma floresan mikroskop altında sabit ve incelenmiştir. Floresans 200 mseksitasyon hücrelerinin geri kalanından daha yüksek floresans yayan hücrelerin bir alt kanıtlandığı. Bu matris üreten hücrelerin subpopülasyonu olarak kabul subpopülasyonu. Ölçek bar 3 mikron olduğunu. <img alt="Şekil 7" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig7.jpg" /> Şekil 7. Floresan mikroskop altında matrisi üretici ve surfactin üreticilerin subpopülasyonu Görselleştirilmesi. B. bir biyofilm örnek subtilis P tapa-metreden parmak sayma, P srfAA-YFP çift etiketli zorlanma tespit ve floresan mikroskop altında incelendi. Hücrelerin geri kalanından daha yüksek floresans yayan hücre 250 ms kanıtladığı iki alt popülasyonlarının Pozlama süresi. Bir subpopülasyonu YFP ifade ve münhasıran YFP kanal (sarı renkli yanlış) ile tespit edildi. Bu surfactin üreticilerin alt nüfusudur. Başka subpopülasyonu CFP ifade ve münhasıran OBP chann ile tespit edildi<html> El. Bu matris üreticilerin alt nüfusudur. Ölçek bar 3 mikron olduğunu. <img alt="Şekil 8" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig8.jpg" /> Şekil 8. 2-B akım sitometri. Kullanarak matris üreticilerin subpopülasyonu Kantitasyonu B. bir biyofilm hücreleri Dağınık subtilis P tapa-YFP akım sitometri ile takip edildi. Akış sitometresi 50.000 olaylar sayılır ve her olay için floresan sinyal izlendi. YFP sinyal yoğunluğu X ekseni çizilir iken sayılır hücre sayısı Y ekseni çizilir. Hücre dışı biyofilm uyaran koşulları elde etmek için LB ortamda yetiştirildi. Hücreler biyofilm uyaran koşulları elde etmek için orta MSgg yetiştirildi. Matris üreticilerin subpopülasyonu sadece biyofilm uyaran koşullarda farklılaştırır. Bu rakam López ark uyarlanmıştır., PNAS (2009) 106 :280-285. s/ftp_upload/3796/3796fig9.jpg &quot;/&gt; Şekil 9. 3-D akış sitometresi kullanılarak matris üretici ve surfactin üreticilerinin subpopülasyonu Kantitasyonu. Izlenir kanalların Floresans sinyali X ekseni (YFP için) ve Y ekseni (CFP için) &#39;de verilmiştir. Z-eksenine her reporter eksprese eden hücrelerin sayısını ölçer ve konturu izohatlar kağıt düzlemine dik olarak ölçülür. Bu deneyde kontrol olayların sayısı 50,000 olaylardı. Sol üst panel hiçbir floresan protein genleri barındıran eşiğe bir kontrol sunuyor. Sağ üst panel tek etiketli suşu P srfAA-YFP kullanarak YFP floresans kanal (sarı çerçeveli) içinde surfactin üreticilerin subpopülasyonu algılar. Sol alt panel tek etiketli suşu P tapa-CFP kullanarak OBP floresans kanal (mavi çerçeveli) matris üreticilerin subpopülasyonu algılar. Çift etiketli suşu P tapa &lt;/ Em&gt;-CFP, P srfAA-YFP sağ alt panelde izlenir. Bu sarı ve mavi çerçeveli iki subpopülasyonunun gösterdi. Bu rakam López ark uyarlanmıştır., Genler ve Gelişim (2009) 23 :1631-1638. <img alt="Şekil 10" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig10.jpg" /> 10 Şekil. Matris üretici ve 3-D akış sitometresi kullanılarak yamyamız subpopülasyonu Kantitasyonu. Izlenir kanalların Floresans sinyali X ekseni (YFP için) ve Y ekseni (CFP için) &#39;de verilmiştir. Bu deneyde kontrol olayların sayısı 50,000 idi. Sağ üst panel tek etiketli suşu P skf-YFP içinde YFP floresans kanal (sarı çerçeveli) içinde yamyamız subpopülasyonu algılar. Sol alt panel tek etiketli suşu P tapa-CFP içinde OBP floresans kanal (mavi çerçeveli) matris üreticilerin subpopülasyonu algılar. Double etiketli suşu P tapa-CFP, P skf-YFP X ve Y eksenleri (yeşil çerçeveli) için çapraz hücrelerin sadece bir alt gruptaki gösterdi. Aynı anda iki muhabir ifade Çünkü subpopülasyonu YFP ve CFP kanal tespit edilir. Lopez ve ark., Genes and Development (2009) 23 :1631-1638.

<ol>
	<li>Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+microbial+biofilms.">Overview of microbial biofilms.</a> J. Ind. Microbiol. 15, 137-140 (1995).</li><li>Davey, M. E., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+biofilms:+from+ecology+to+molecular+genetics.">Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64, 847-867 (2000).</li><li>Kolenbrander, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+microbial+communities:+biofilms,+interactions,+and+genetic+systems.">Oral microbial communities: biofilms, interactions, and genetic systems.</a> Annu. Rev. Microbiol. 54, 413-437 (2000).</li><li>O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation+as+microbial+development.">Biofilm formation as microbial development.</a> Annu. Rev. Microbiol. 54, 49-79 (2000).</li><li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+microbial+life+on+surfaces.">Biofilms: microbial life on surfaces.</a> Emerg. Infect. Dis. 8, 881-890 (2002).</li><li>Lopez, D., Vlamakis, H., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms.">Biofilms.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, a000398-a000398 (2010).</li><li>Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+the+matrix+revisited.">Biofilms: the matrix revisited.</a> Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).</li><li>Branda, S. S., Chu, F., Kearns, D. B., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+protein+component+of+the+Bacillus+subtilis+biofilm+matrix.">A major protein component of the Bacillus subtilis biofilm matrix.</a> Mol. Microbiol. 59, 1229-1238 (2006).</li><li>Latasa, C., Solano, C., Penades, J. R., Lasa, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm-associated+proteins.">Biofilm-associated proteins.</a> C. R. Biol. 329, 849-857 (2006).</li><li>O'Gara, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ica+and+beyond:+biofilm+mechanisms+and+regulation+in+Staphylococcus+epidermidis+and+Staphylococcus+aureus.">ica and beyond: biofilm mechanisms and regulation in Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus aureus.</a> FEMS Microbiol Lett. 270, 179-188 (2007).</li><li>Chai, Y., Chu, F., Kolter, R., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bistability+and+biofilm+formation+in+Bacillus+subtilis.">Bistability and biofilm formation in Bacillus subtilis.</a> Mol. Microbiol. 67, 254-263 (2008).</li><li>Chen, R., Guttenplan, S. B., Blair, K. M., Kearns, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+sigmaD-dependent+autolysins+in+Bacillus+subtilis+population+heterogeneity.">Role of the sigmaD-dependent autolysins in Bacillus subtilis population heterogeneity.</a> J. Bacteriol. 191, 5775-5784 (2009).</li><li>Guttenplan, S. B., Blair, K. M., Kearns, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+EpsE+flagellar+clutch+is+bifunctional+and+synergizes+with+EPS+biosynthesis+to+promote+Bacillus+subtilis+biofilm+formation.">The EpsE flagellar clutch is bifunctional and synergizes with EPS biosynthesis to promote Bacillus subtilis biofilm formation.</a> PLoS Genet. 6, e1001243-e1001243 (2010).</li><li>Kearns, D. B., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+population+heterogeneity+during+growth+of+Bacillus+subtilis.">Cell population heterogeneity during growth of Bacillus subtilis.</a> Genes Dev. 19, 3083-3094 (2005).</li><li>Lopez, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+signaling+in+a+bacterium.">Paracrine signaling in a bacterium.</a> Genes Dev. 23, 1631-1638 (2009).</li><li>Veening, J. W., Smits, W. K., Hamoen, L. W., Jongbloed, J. D., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+differential+gene+expression+by+improved+cyan+fluorescent+protein+and+yellow+fluorescent+protein+production+in+Bacillus+subtilis.">Visualization of differential gene expression by improved cyan fluorescent protein and yellow fluorescent protein production in Bacillus subtilis.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 6809-6815 (2004).</li><li>Veening, J. W., Smits, W. K., Hamoen, L. W., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+analysis+of+gene+expression+patterns+of+competence+development+and+initiation+of+sporulation+in+Bacillus+subtilis+grown+on+chemically+defined+media.">Single cell analysis of gene expression patterns of competence development and initiation of sporulation in Bacillus subtilis grown on chemically defined media.</a> J. Appl. Microbiol. 101, 531-541 (2006).</li><li>Veening, J. W., Kuipers, O. P., Brul, S., Hellingwerf, K. J., Kort, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+phosphorelay+perturbations+on+architecture,+sporulation,+and+spore+resistance+in+biofilms+of+Bacillus+subtilis.">Effects of phosphorelay perturbations on architecture, sporulation, and spore resistance in biofilms of Bacillus subtilis.</a> J. Bacteriol. 188, 3099-3109 (2006).</li><li>Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+fate+by+the+formation+of+an+architecturally+complex+bacterial+community.">Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community.</a> Genes Dev. 22, 945-953 (2008).</li><li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+heterogeneity+in+biofilms.">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nat. Rev. Microbiol. 6, 199-210 (2008).</li><li>Veening, J. W., Smits, W. K., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bistability,+epigenetics,+and+bet-hedging+in+bacteria.">Bistability, epigenetics, and bet-hedging in bacteria.</a> Annu. Rev. Microbiol. 62, 193-210 (2008).</li><li>Aguilar, C., Vlamakis, H., Guzman, A., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KinD+is+a+checkpoint+protein+linking+spore+formation+to+extracellular-matrix+production+in+Bacillus+subtilis+biofilms.">KinD is a checkpoint protein linking spore formation to extracellular-matrix production in Bacillus subtilis biofilms.</a> MBio. 1, (2010).</li><li>Lopez, D., Fischbach, M. A., Chu, F., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structurally+diverse+natural+products+that+cause+potassium+leakage+trigger+multicellularity+in+Bacillus+subtilis.">Structurally diverse natural products that cause potassium leakage trigger multicellularity in Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 280-285 (2009).</li><li>Lopez, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannibalism+enhances+biofilm+development+in+Bacillus+subtilis.">Cannibalism enhances biofilm development in Bacillus subtilis.</a> Mol. Microbiol. 74, 609-618 (2009).</li><li>Arima, K., Kakinuma, A., Tamura, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfactin,+a+crystalline+peptidelipid+surfactant+produced+by+Bacillus+subtilis:+isolation,+characterization+and+its+inhibition+of+fibrin+clot+formation.">Surfactin, a crystalline peptidelipid surfactant produced by Bacillus subtilis: isolation, characterization and its inhibition of fibrin clot formation.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 31, 488-494 (1968).</li><li>Romero, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+accessory+protein+required+for+anchoring+and+assembly+of+amyloid+fibres+in+B.+subtilis+biofilms.">An accessory protein required for anchoring and assembly of amyloid fibres in B. subtilis biofilms.</a> Mol. Microbiol. 80, 1155-1168 (2011).</li><li>Hardwood, C. R., Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biological Methods for Bacillus. , (1990).</li><li>Novick, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+systems+in+staphylococci.">Genetic systems in staphylococci.</a> Methods Enzymol. 204, 587-636 (1991).</li><li>Yasbin, R. E., Young, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+in+Bacillus+subtilis+by+bacteriophage+SPP1.">Transduction in Bacillus subtilis by bacteriophage SPP1.</a> J. Virol. 14, 1343-1348 (1974).</li><li>Branda, S. S., Gonzalez-Pastor, J. E., Ben-Yehuda, S., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fruiting+body+formation+by+Bacillus+subtilis.">Fruiting body formation by Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11621-11626 (2001).</li><li>Nakano, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=srfA+is+an+operon+required+for+surfactin+production,+competence+development,+and+efficient+sporulation+in+Bacillus+subtilis.">srfA is an operon required for surfactin production, competence development, and efficient sporulation in Bacillus subtilis.</a> J. Bacteriol. 173, 1770-1778 (1991).</li><li>Gonzalez-Pastor, J. E., Hobbs, E. C., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannibalism+by+sporulating+bacteria.">Cannibalism by sporulating bacteria.</a> Science. 301, 510-513 (2003).</li><li>Aguilar, C., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinking+about+Bacillus+subtilis+as+a+multicellular+organism.">Thinking about Bacillus subtilis as a multicellular organism.</a> Curr. Opin. Microbiol. 10, 638-643 (2007).</li><li>Shapiro, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinking+about+bacterial+populations+as+multicellular+organisms.">Thinking about bacterial populations as multicellular organisms.</a> Annu. Rev. Microbiol. 52, 81-104 (1998).</li></ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Bakteri toplulukları genler delillerin mikrobiyal topluluklar 33,34 karmaşıklığı belirli ifade hücrelerin subpopülasyonunun gösteriyor olması. Bu protokol ilgi herhangi bir gen ekspresyonu mikrobiyal toplum içinde özel hücreler belli bir subpopülasyonu kısıtlı olup olmadığını belirlemek için yardımcı olmalıdır. Geleneksel yöntemlerin bütün mikrobiyal topluluk ve mikrobiyal toplum içinde gen ekspresyon dalgalanmalara gen ekspresyonu veya mikroarray analizi oranı gen ekspresyonu d...

<table border="1"><tbody><tr><td> Teknik </td><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td rowspan="11"> Kompozisyon MSgg </td><td> 5 mM potasyum fosfat </td><td> Roth </td><td> 6878 </td></tr><tr><td> 100mM MOPS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M1254 </td></tr><tr><td> Magnezyum klorür 2mm </td><td> Roth </td><td> 2189.1 </td></tr><tr><td> Kalsiyum klorür 700μM </td><td> Roth </td><td> A119.1 </td></tr><tr><td> Demir klorür 50μM </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 157740 </td></tr><tr><td> Çinko klorid 1 mikrona </td><td> ¸ </td><td> A2076 </td></tr><tr><td> Tiamin 2μM </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 74625 </td></tr><tr><td> Gliserol% 0.5 </td><td> Roth </td><td> 7533 </td></tr><tr><td> Glutadostum% 0.5 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 49621 </td></tr><tr><td> Triptofan 50μg/ml </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T0254 </td></tr><tr><td> Fenilalanin 50μg/ml </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P2126 </td></tr><tr><td> Hücre fiksasyon </td><td> Paraformaldehyde </td><td> Roth </td><td> 0335 </td></tr><tr><td></td><td> Ekipman Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Sonikasyon </td><td> Hücre Sonicator </td><td> Bandelin </td><td> D-1000 </td></tr><tr><td> Floresans Mikroskopi </td><td> Floresan Mikroskop </td><td> Leica </td><td> DMI6000B </td></tr><tr><td></td><td> Yazılım Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td></tr><tr><td> Floresans Mikroskopi </td> &lt;td&gt; Asaf </td><td> Leica </td><td></td></tr><tr><td> Flow sitometri </td><td> FCASDiva </td><td> BD </td><td></td></tr><tr><td> Flow sitometri </td><td> FlowJo </td><td> Treestar </td><td></td></tr></tbody></table>

single-cell analysis of bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry

Biyofilm oluşumu hemen hemen tüm bakterileri 1-6 genel bir niteliktir. Bakteriler biyofilmler oluştururlar, hücreler çoğunlukla 7-10 diğer faktörler arasında proteinler ve ekzopolisakkarit tarafından oluşturulmuştur hücre dışı matris içinde kaplı vardır. Mikrobiyal topluluk genellikle 11-17 özel hücreler farklı subpopülasyonu farklılaşması gösterir biyofilm içinde kaplı. Bu subpopülasyonunun arada ve genellikle 18-21 biyofilm içinde zamansal ve mekansal organizasyonu gösterir. Model organizma Bacillus subtilis Biyofilm oluşumu özel hücreler farklı alt popülasyonlarının farklılaşmayı gerektirir. Bunlar arasında, biyofilm hücre dışı matriks üretmek ve salgılamak sorumlu matriks üreticileri, en subpopülasyonu 11,19 biyofilm oluşumu için gereklidir. Bu nedenle, matris üreticilerinin farklılaşması B. biyofilm oluşumu hallmark subtilis. Biz B. Biyofilmlererde matris üreticilerin subpopülasyonu görselleştirmek ve ölçmek için floresan gazetecilere kullanmış subtilis 15,19,22-24. Somut olarak, bu matris üreticilerinin subpopülasyonu kendi ürettiği ekstraselüler sinyal surfactin 25 varlığında karşılık olarak ayırt olduğu araştırmacılar tarafından gözlenmiştir. İlginç bir şekilde, surfactin matris üreticileri 15 subpopülasyonu farklı özelleşmiş hücre bir alt tarafından üretilir. Bu raporu B. subtilis biyofilmler içinde matrisi üretici ve surfactin üreticilerin subpopülasyonu görselleştirmek ve ölçmek için gerekli teknik yaklaşım ayrıntılı var. Bunu yapmak için, matris üretimi ve surfactin üretimi için gerekli olan genlerin flüoresan gazetecilere B&#39;nin kromozom içine sokulur subtilis. Reporters sadece özel bir hücre subpopülasyonu cinsinden ifade edilmiştir. Daha sonra, alt popülasyonlar olabilirfloresan mikroskobu ve akım sitometri (Şekil 1&#39;e bakınız) kullanılarak izlenir. Özel hücrelerin farklı alt popülasyonlarda bakterilerin çok hücreli topluluklar içinde bir arada olması, bize Prokaryotlarda gen ifadesinin düzenlenmesinde hakkında farklı bir bakış açısı kazandırır. Bu protokol deneysel olarak bu fenomeni adresleri ve kolay bir mikrobiyal topluluk içinde fenotipik heterojenite altında yatan moleküler mekanizmaları aydınlatmak için, başka herhangi bir çalışma modeline adapte edilebilir.

Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry at JoVE.com

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Mikrobiyal biyofilmler genellikle özel hücreler farklı subpopülasyonunun oluşturduğu edilir. Bu alt popülasyonlarının Tek hücreli analizi floresan gazetecilere kullanımını gerektirir. Burada birkaç subpopulationswithin görselleştirmek ve izlemek için bir protokol tarif<em&gt; B. subtilis</em&gt; Floresan mikroskobu ve akım sitometri kullanarak biyofilm.

Tek hücreli Analizi Bacillus subtilis</emFloresan Mikroskobu ve Akım Sitometri Kullanma> Biyofilmler

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

single-cell-analysis-bacillus-subtilis-biofilms-using-fluorescence

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

20.3K Görüntüleme.  University of Würzburg. Mikrobiyal biyofilmler genellikle özel hücreler farklı subpopülasyonunun oluşturduğu edilir. Bu alt popülasyonlarının Tek hücreli analizi floresan gazetecilere kullanımını gerektirir. Burada birkaç subpopulationswithin görselleştirmek ve izlemek için bir protokol tarif B. subtilis Floresan mikroskobu ve akım sitometri kullanarak biyofilm.

Video: Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam cells, immune cells, vascular endothelial and smooth muscle cells, platelets, extracellular matrix, and a lipid-rich core with extensive necrosis and fibrosis of surrounding tissues.1 The innate and adaptive arms of the immune response are involved in the initiation, development and persistence of atherosclerosis.2, 3 There is a significant body of evidence that different subsets of the immune cells, such as macrophages, dendritic cells, T and B lymphocytes, are present within the aortas of healthy and atherosclerosis-prone mice4. Additionally, immune cells are found in the surrounding aortic adventitia which suggests an important role of this tissue in atherogenesis.2
For some time, the quantitative detection of different types of immune cells, their activation status, and the cellular composition within the aortic wall was limited by RT-PCR and immunohistochemical methods for the study of atherosclerosis. Few attempts were made to perform flow cytometry using human aortas, and a number of problems, such as a high autofluorescence, have been reported5,6. Human atherosclerotic plaques were digested with collagenase 1, and free cells were collected and stained for CD14+/CD11c+ to highlight macrophage-derived foam cells. In this study, a "mock" channel was used to avoid false-positive staining.6 Necrotic materials accumulating during the digestion process give rise in a large amount of debris that generates a high autofluorescence in aortic samples. To resolve this problem, a panel of negative and positive controls has been proposed, but only double staining could be applied in these samples. We have developed a new flow cytometry-based method7 to analyze the immune cell composition and characterize the activation, proliferation, differentiation of immune cells in healthy and atherosclerosis-prone aorta. This method allows the investigation of the immune cell composition of the aortic wall and opens possibilities to use a broad spectrum of immunological methods for investigations of immune aspects of this disease.

This paper presents a flow cytometry-based method to investigate the immune composition of aortas. The paper also illustrates an additional technique that allows examining surrounding adventitia and vessel wall separately. This method opens possibilities to perform phenotypical analyses of aortic leukocytes and apply several immunological assays for atherosclerosis studies.

Bağışıklık Hücreleri murin aorta içinde Sitometrisi Analizi

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

Canlı Hücre Görüntüleme Bacillus subtilis Ve Streptococcus pneumoniae Otomatik Zaman atlamalı Mikroskopi

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted as an important hallmark of cancer. Our research on breast cancer focuses on the active role that tumor infiltrating lymphocytes play in tumor progression and patient outcome. Toward this goal, we developed a methodology for the rapid isolation of intact lymphoid cells from normal and abnormal tissues in an effort to evaluate them proximate to their native state. Homogenates prepared using a mechanical dissociator show both increased viability and cell recovery while preserving surface receptor expression compared to enzyme-digested tissues. Furthermore, enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45+ cells indicating that quantitative and qualitative measurements in the primary homogenate likely genuinely reflect infiltrating subpopulations in the tissue fragment. The lymphoid cells in these homogenates can be easily characterized using immunological (phenotype, proliferation, etc.) or molecular (DNA, RNA and/or protein) approaches. CD45+ cells can also be used for subpopulation purification, in vitro expansion or cryopreservation. An additional benefit of this approach is that the primary tissue supernatant from the homogenates can be used to characterize and compare cytokines, chemokines, immunoglobulins and antigens present in normal and malignant tissues. This protocol functions extremely well for human breast tissues and should be applicable to a wide variety of normal and abnormal tissues.

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45+ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

İnfiltratif Lenfositlerinin Analiz Olmayan enzimatik ayırmak Taze İnsan Dokusuna Basit ve Hızlı Protokolü

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Prevention of Heat Stress Adverse Effects in Rats by Bacillus subtilis Strain

This study was designed to evaluate the protective effect of the Bacillus subtilis strain against complications related to heat stress. Thirty-two Sprague-Dawley rats were used in this study. Animals were orally treated twice a day for two days with B. subtilis BSB3 strain or PBS. The next day after the last treatment, each group was divided and two experimental groups (one treated with PBS and one treated with B. subtilis) were placed at 45 oC for 25 min. Two control groups stayed for 25 min at room temperature. All rats were euthanized and different parameters were analyzed in all groups. Adverse effects of heat stress are registered by the decrease of villi height and total mucosal thickness in the intestinal epithelium; translocation of bacteria from the lumen; increased vesiculation of erythrocytes and elevation of the lipopolysaccharides (LPS) level in the blood. The protective efficacy of treatment is evaluated by prevention of these side effects. The protocol was set up for the oral treatment of rats with bacteria for prevention of heat stress complications, but this protocol can be modified and used for other routes of administration and for analysis of different compounds.

Prevention of Heat Stress Adverse Effects in Rats by Bacillus subtilis Strain

We described a protocol for prevention of heat stress effects in rats by oral pre-treatment with beneficial bacteria. This protocol can be modified and used for various routes of administration and for analysis of different compounds.

Isı Önlenmesi ile Sıçanlarda Olumsuz Etkileri Stres<em&gt; Bacillus subtilis</em&gt; Gerilme

This study was designed to evaluate the protective effect of the Bacillus subtilis strain against complications related to heat stress. Thirty-two ...

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

Araştırma yöntemleri<em&gt; B. subtilis</emKüçük Molekül Biyofilm İnhibitörleri Karakterizasyonu için Bir Model Olarak&gt; Biyofilmler

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Fare kemik iliğinden plazmasitoid dendritik hücreleri Saflaştırılması floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Yalıtım ve fare ve insan alveoler makrofajlar Vitro kültürü

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can have pathological significance. An ideal method for examining alterations to monocytes is whole blood flow cytometry as the minimal handling of samples by this method limits artifactual cell activation. However, many different approaches are taken to gate the monocyte subsets leading to inconsistent identification of the subsets between studies. Here we demonstrate a method using whole blood flow cytometry to identify and characterize human monocyte subsets (classical, intermediate, and non-classical). We outline how to prepare the blood samples for flow cytometry, gate the subsets (ensure contaminating cells have been removed), and determine monocyte subset expression of surface markers &#8212; in this example M1 and M2 markers. This protocol can be extended to other studies that require a standard gating method for assessing monocyte subset proportions and monocyte subset expression of other functional markers.

Here we present a protocol for characterizing monocyte subsets by whole blood flow cytometry. This includes outlining how to gate the subsets and assess their expression of surface markers and giving an example of the assessment of the expression of M1 (inflammatory) and M2 markers (anti-inflammatory).

İnsan monosit alt kümeleri tam kan tarafından karakterizasyonu Akış Sitometresi Analizi

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

Efferocytosis tek hücreli floresans mikroskobu tarafından miktar

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

Nötrofil kütle sitometri analizi için tüm kemik Iliği hazırlanması-Lineage hücreler

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Tek hücreli Analizi Bacillus subtilis Biyofilmler