Name: pseudomonas aeruginosa and saccharomyces cerevisiae biofilm in flow cells
Uploaded: 2011-01-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells at JoVE.com

1. Tüm bileşenler Akış Hücre Sistemi Meclisi Monte akış sistemi içerir: otoklavlanabilir borular, kabarcık tuzakları, orta / atık şişe ve Şekil 1&#39;de gösterildiği gibi akış hücreleri. Bütün bu parçalar deneyler arasında yeniden kullanılabilir. <img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 akış hücresi sistemi kurulumu (setup temel bileşenler). Orta şişesi, bir peristaltik pompa, kabarcık tuzakları, akış hücresi, atık şişe, tüp ve çeşitli konektörler birbirine çeşitli bölümleri: akış hücresi sistemi birkaç bileşenden oluşur. Şekil nazik Rune Lyngklip tarafından sağlanmaktadır. 2. Akış Hücre Meclisi <ol><li> Akış hücresi (Şekil 2a) (Şekil 3) bir şırınga kullanılarak ince şerit, silikon yapıştırıcı ile tedavi edilir. </li><li> Silikon hatları (Şekil 3) üstüne bir kapak kayma yerleştirin. Cam kapak slipleri P. için alt tabaka olarak kullanılan aeruginosa, S. PVC kapak fişleri için uygulanır cerevisiae biyofilm </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 akış hücresi ve kabarcık tuzak 2 şematik çizimi. A) akış hücresi b) kabarcık tuzak, DTU Sistemleri Biyoloji üretimi için kullanılan boyutları ayrıntılı bir açıklama. John Wiley &amp; Sons, Inc (DTU Sistemleri Biyoloji eskiden figürü tasvir gibi, Biocentrum hak kazandı) izni ile yayımlanmaktadır <img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 tutturmak için cam alt tabaka silikon tutkal uygulama hatlarının çizimi. Akış hücresi eklemek belirtilen kapak cam silikon tutkal üzerine yerleştirilir. <ol start="3"><li> Akış hücresi ters çevirin ve kapağı aşağı kayma yüzü düz bir yüzey üzerine yerleştirin. Akışını hücrenin tabanına kapak kayma itmek için akış hücresi arka hafifçe basın. Akış hücresi ters çevirin ve silikon mühürlü olmayan alanlarda olup olmadığını kontrol edin. Bir şırınga kolu (piston) kısmını hafifçe cam ve akış hücresi birlikte basın için bir araç olarak kullanılabilir. </li></ol> 3. Orta Şişe <ol><li> Orta bir şişe içinde bir beslenme silikon tüp (2 mm iç çap) ve diğer ucunda düz bir bağlantı eklemek. </li><li> (Orta içerik için &quot;medya&quot; paragrafına bakınız) şişe orta Konnektör ve şişe metal görünümlü folyo ile örtün ve orta otoklavda. Otoklav zaman orta şişe boş tedarik tüp sonuna orta şişe veya bir sifon etkisi sıvı seviyesinden sabit olduğundan emin olun. </li></ol> 4. Bubble Trap, Akış Hücre ve Pompa bağlama Şekil 1&#39;de anahat göre tüm boru birleştirin. Marprene tüp uygulanan peristaltik pompa geçer parçası dışında silikon tüp kullanın. <ol><li> Tüm bireysel akış odalarına orta şişe tüp bağlanmak için gerekli sayıda deneyde uygulanan girişler bir tüp ayrıldı. T-konnektör (bkz. Şekil 1, T-konnektör) pompa Marprene tüplerine besleme tüpü istenilen sayıda bağlantı tüpleri yapmak için kullanın. Genellikle sisteminde arızalar durumunda bileşenlerinin belirlenmesi kolaylaştırmak için, sistem boyunca, boru ve akış hücreleri aynı sırasına tutmak iyi bir fikirdir. </li><li> Düz bağlantılar kullanarak pompa tüpler Marprene her bireyin beslenme tüpü (çapı 2 mm) bağlayın. Bir baloncuk kapanı Marprene boru (Şekil 2b), orta silikon tüp (çapı 1 mm) ile bağlayın. Pompa balonu tuzak en yüksek kısmında girişine bağlı olduğundan emin olun. </li><li> Akış hücresi girişi (çapı 1 mm) balonu tuzakları çıkış borusunun bağlayın, bu borulama uzunluğunun akış hücresi konfokal mikroskop (genellikle 1 m) sahneye taşınacak izin verdiğinden emin olun. </li><li> Balonu tuzakların üstüne yerleştirin 5 ml şırınga. Üstleri uygun kapaklarla kapatın. </li><li> Kısa, yaklaşık 40 mm parça (çapı 1 mm), boru akış hücresi çıkışına bağlamak ve gerekli uzunluğu (2 mm çapında) bir atık tüpü takmak için düz konnektör &quot;indirgeyici&quot; kullanabilirsiniz. Atık kabını atık tüpleri yerleştirin. </li><li> Önemlisi, atık konteyneri her zaman asla akış hücre düzeyinde aşağıda akış hücreleri gibi aynı düzeyde yer olmalıdır. Ayrıca, atık boru sonuna akış hücreleri işlerken gömme bir sifon etkisi nedeniyle geri önlemek için beklenen atık sıvı seviyesinden sabit olduğundan emin olun. </li></ol> 5. AKIŞ SİSTEMİ STERİLİZASYON VE YIKAMA <ol><li> Kabarcık tuzak kapaklarını çıkartın ve onları steril tutmak için% 70 etanol koyun. </li><li> % 0.5 (v / v) suda sodyum hipoklorit ile doldurmak için en yüksek pompa hızında çalıştırın. &lt;/ P&gt; <li> , Kabarcık tuzakları tamamen dolu olduğunda geri kabarcık tuzak kapakları yerleştirin. </li><li> Akış odasında kabarcıkları akış hücreleri dokunun. Kırılgan cam kapak zarar vermemeye özen gösterin. </li><li> 3 ml / h / kanal (0.2 mm / s lineer akış hızı) bir akış hızında 3-4 saat süreyle sterilize etmek için izin verin. </li><li> Sistemi tüm hipoklorit yıkamak için 2-3 kez yıkayın. Sistem steril su ile doldurun ve boş. Kabarcık tuzaklar her yıkama arasında tamamen boşaltılmalıdır. Bu kabarcık tuzakları boşaltılmış kadar hava pompalama tarafından yapılabilir. Boşalttıktan sonra, sistem doldurmadan önce balonu tuzakları kapaklarını çıkarın. Balonu tuzakları tamamen sıvı ile doldurulmuş sonra kapaklarını değiştirin. Gerektiği gibi tekrarlayın. </li><li> Gece boyunca düşük akış hızı (1-3 ml / h / kanal) sistemi aracılığıyla Run steril su ya da bir sonraki adıma geçin. </li><li> Orta şişe girişine bağlayın ve deney yapılacaktır sıcaklığında düşük akış hızı (3 ml / h / kanal) gece boyunca orta ile yıkayın. Not: Sistemin orta dolu önce kabarcık tuzakları su boşaltılmalıdır. </li></ol> 6. AKIŞ HÜCRESİ inokülasyonu <ol><li> Bir gecede kültürden istenen bir optik yoğunluk seyreltme (P. aeruginosa örneğin 0.001 OD 600Nm ve S. cerevisiae 0.1 OD 600Nm). </li><li> 27G iğne ile 0.5 ml şırınga odasına doldurmak için yeterli inokulum yüklemek için kullanın. 250 mcL (Şekil 2 x 4 mm x 1 mm, 40 mm) bu çalışmada belirtilen boyutlar akış odaları için yeterli. </li><li> Peristaltik pompa durdurun. </li><li> Kelepçe sistemine geri akışı önlemek için akış hücresi önde gelen silikon tüp. </li><li> % 70 etanol ile silerek silikon tüp aşılama sitesi sterilize edin. </li><li> Silikon tüp içine iğne takın ve akış hücresi giriş ucu tanıtmak. Yavaş yavaş odasına inokulum enjekte (hava kabarcıkları enjekte etmek için dikkatli olmak). </li><li> İğneyi çıkarın ve enjeksiyon sitesi üzerinden silikon yapıştırıcı kullanarak delik hemen mühürleme suretiyle% 70 etanol ile enjeksiyon yerinde silin. </li><li> Akış hücresi ters çevirin ve mikro-organizmalar altyapısını uygun akış hücresi akışı olmadan 1 saat izin verin. </li><li> Akış hücresi açın, orta pompa başlatmak (3 ml / h / kanal) ve silikon tüp kapalı kelepçe. </li><li> Sistem 37, inkübasyon için konur ° C P. durumda aeruginosa ve 30 ° C S. durumda cerevisiae. </li><li> Akışını odaları Biyofilm CLSM tarafından görüntülenmiştir olabilir. </li></ol> 7. MİKROSKOBİSİ İÇİN biyofilm boyama <ol><li> Uygun boyama bir seyreltme (örneğin 1:1000 Syto 9 leke canlı S. cerevisiae) </li><li> Peristaltik pompa durdurun. </li><li> Kelepçe akış hücresi önde gelen silikon boru. </li><li> % 70 etanol ile silerek silikon tüp aşılama sitesi sterilize edin. </li><li> 27G iğne ile 0.5 ml şırınga odasına doldurmak için yeterli boyama çözüm yüklemek için kullanın. 250 mcL Burada kullanılan akış odaları için yeterli. </li><li> Silikon tüp içine iğne takın ve akış hücresi giriş ucu tanıtmak. Yavaş yavaş odasına boyama solüsyonu (baloncuklar enjekte etmek için değil dikkatli) enjekte edilir. </li><li> İğneyi çıkarın ve enjeksiyon anında mühürleme suretiyle% 70 etanol ile enjeksiyon yerinde silin. </li><li> Akış hücresi, 15 dakika boyunca akışı olmadan bekletin. </li><li> Kelepçe çıkarın ve akışını başlatmak (3 ml / h / kanal) </li><li> CLSM veri elde </li></ol>

<ol>
	<li>Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+biofilms:+a+common+cause+of+persistent+infections.">Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections.</a> Science. 284, 1318-1322 (1999).</li><li>Sternberg, C., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+and+analyzing+biofilms+in+flow+cells.">Growing and analyzing biofilms in flow cells.</a> Curr Protoc Microbiol. Chapter 1, 2-2 (2006).</li><li>Heydorn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+reproducibility+in+flow-chamber+biofilms.">Experimental reproducibility in flow-chamber biofilms.</a> Microbiology. 146, 2409-2415 (2000).</li><li>Pamp, S. J., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+roles+of+biosurfactants+in+structural+biofilm+development+by+Pseudomonas+aeruginosa.">Multiple roles of biosurfactants in structural biofilm development by Pseudomonas aeruginosa.</a> J Bacteriol. 189, 2531-2539 (2007).</li><li>Haagensen, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+distribution+of+colistin-+and+sodium+dodecyl+sulfate-tolerant+cells+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Differentiation and distribution of colistin- and sodium dodecyl sulfate-tolerant cells in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> J Bacteriol. 189, 28-37 (2007).</li><li>Klausen, M., Aaes-Jorgensen, A., Molin, S., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+bacterial+migration+in+the+development+of+complex+multicellular+structures+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Involvement of bacterial migration in the development of complex multicellular structures in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Mol Microbiol. 50, 61-68 (2003).</li><li>Pamp, S. J., Gjermansen, M., Johansen, H. K., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+to+the+antimicrobial+peptide+colistin+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+is+linked+to+metabolically+active+cells,+and+depends+on+the+pmr+and+mexAB-oprM+genes.">Tolerance to the antimicrobial peptide colistin in Pseudomonas aeruginosa biofilms is linked to metabolically active cells, and depends on the pmr and mexAB-oprM genes.</a> Mol Microbiol. 68, 223-240 (2008).</li><li>Pamp, S. J., Sternberg, C., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insight+into+the+microbial+multicellular+lifestyle+via+flow-cell+technology+and+confocal+microscopy.">Insight into the microbial multicellular lifestyle via flow-cell technology and confocal microscopy.</a> Cytometry Part A. 75A, 90-103 (2009).</li><li>Barken, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+type+IV+pili,+flagellum-mediated+motility+and+extracellular+DNA+in+the+formation+of+mature+multicellular+structures+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Roles of type IV pili, flagellum-mediated motility and extracellular DNA in the formation of mature multicellular structures in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Environ Microbiol. 10, 2331-2343 (2008).</li><li>Qin, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+autolysin-mediated+DNA+release+in+biofilm+formation+of+Staphylococcus+epidermidis.">Role of autolysin-mediated DNA release in biofilm formation of Staphylococcus epidermidis.</a> Microbiology. 153, 2083-2092 (2007).</li><li>Allesen-Holm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+characterization+of+DNA+release+in+Pseudomonas+aeruginosa+cultures+and+biofilms.">A characterization of DNA release in Pseudomonas aeruginosa cultures and biofilms.</a> Mol Microbiol. 59, 1114-1128 (2006).</li><li>Heydorn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+biofilm+structures+by+the+novel+computer+program+COMSTAT.">Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT.</a> Microbiology. 146, 2395-2407 (2000).</li><li>Palmer, R. J., Haagensen, J. A., Neu, T. R., Sternberg, C., Palmer, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 882-900 (2006).</li><li>Haagensen, J. A., Regenberg, B., Sternberg, C., M&#252;ller, S., Bley, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> High Resolution Microbial Single Cell Analytics Advances in Biochemical Engineering and Biotechnology. , (2010).</li></ol>

Biz güçlü bir araç biyofilm soruşturmalarda temsil eden bir akış hücresi sistemi ortaya koymuştur. Konfokal mikroskobu ile 3D görüntüleme ile birlikte, sistem, daha geleneksel mikroskobik teknikler yoluyla mikrobiyal biyofilm analiz diğer yöntemlere göre avantajları bir dizi vardır. Bu sistem, 3 boyutlu görselleştirme mikrobiyal biyofilm toplulukların toplum rahatsız olmadan yaşam sağlar. Işık mikroskobu biyofilm nişler hakkında ayrıntılı bilgi sağlar ve biyofilm elektron mikroskobu nano ölçekli çözünürlüğü sağlarken, canlı hücre görüntüleme izin vermez. , Biz daha önce, birçok antibiyotiğe 5-8 (Şekil 4a) duyarlı bakteriyel hücreler, ekstrasellüler bileşiklerin dağılımı mekansal dağılımının aydınlatmıştır açıklanan akış kanal sistemi kullanarak, örneğin, DNA 9-11, hareketli ve hareketsiz olmayan hücrelerin dağılımı bir bakteri topluluğu 4,6,9 (Şekil 4c) içinde aynı türün. Biz akış hücresi sisteminin maya biyofilmlerin yönlerini incelemek amacıyla kullanılabilir olması öngörülüyor. Bu alansal ve zamansal dağılımı, maya biyofilm gelişimi alan genlerin belirlenmesi yanı sıra, mantar ilaçları gibi çevresel faktörlere yanıt maya biyofilm olabilir. Maya, hareketli ve hareketsiz olmayan hücrelerin içine ayırt bilinen olmasa da, biyofilm çeşitlendirme diğer yönleri gibi, maya pseudohyphal hücreleri morfolojik değişim ve diploid hücrelerinde haploid vardiya olarak çalışmalarına olabilir. Biz bazı mikrop türlerinin uymak ve çeşitli boyama teknikleri ile çalışacak bir sistem ortaya koymuştur. Gibi GFP gibi farklı boyama probları ve floresan proteinleri çeşitli, gelişmekte olan biyofilm belirli niş soruşturma etkinleştirmek ve antimikrobiyal ajanların veya diğer çevresel faktörlerin etkisi analiz etmede etkili bir araçtır. Bilgi elde edilebilir (Şekil 4) çok detaylı ve biyofilm özellikleri COMSTAT 12,13 gibi bilgisayar programları ile sayısal olabilir. Genel olarak, protokolün en kritik yönü, zaman alıcı bir süreç olduğu bir gerçektir. Aynı zamanda hücreler bir floresan olmayan, şeffaf yüzey üzerinde yükselmeye edebilmek için ihtiyaç duyduğu bir sınırlama yoktur. Sistem deneyimli bir araştırmacı olarak, yüksek verim tarama için uygun değildir: oluşturduğu biyofilm, birkaç yüz mikrometre 14 ile sınırlı araştırılmalıdır derinliği bir konfokal mikroskop kullanılarak analiz tasarım doğasında olduğundan daha fazla teknik sınırlamalar vardır buna hazırlanmak için birkaç gün sürebilir deney başına en fazla 15 kanal işleyebilir. Ancak, antibiyotik veya biyofilm çalışmaları ile ilgili olarak kabul edilir mutantlar başlangıçta en ilginç adaylar akış hücresi sistemine aktarılmadan önce kristal viyole boyama gibi diğer yöntemler ile tarandı kitle olabilir. Kapak cam levhalar çok ince ve kolay kırılabilir ve sistemleri işlerken dikkat edilmelidir. Buna ek olarak tüp günlük bir deney çalışması sırasında incelenebilir; giriş tüpler sadece yukarı akış hücrelerinin önemli &quot;back-büyüme&quot; oluşabilir. Böyle bir kirlenme steril tekniği kullanılarak, akış hücreleri giriş tarafında ortadan kaldırarak silikon tüp birkaç santimetre çözülebilir. <img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4) 4 gün eski PAO1 ölü boyama (kırmızı leke) b) üç günlük bir 3D sunum eski P. Kolistin ve Propidium iyodür ile 24 saat tedavi GFP biyofilm aeruginosa PAO1 (P. aeruginosa vahşi tip) - GFP biyofilm 6 c) bir PAO1 3D resim sunumu - CFP Pila mutant bir PAO1 vahşi tip YFP (sarı) d (mavi)) 5 gün eski PAO1 - GFP biyofilm 3D olarak sunulan resim e) 26 saat S. cerevisiae (CEN.PK arka planda PTR3 mutant) biyofilm Syto-9 (15) ile boyandı.

<ul><li> Kabarcık tuzakları, polietilen (DTU Sistemleri Biyoloji, Danimarka Teknik Üniversitesi,% 20Center/Resources/Biofilm% 20Setup.aspx http://www.csm.bio.dtu.dk/Instrument) </li><li> Clear polipropilen plastik bağlantıları ve T-konnektör (Cole Parmer, 1 / 8 inç (3.175 mm) ve 1 / 16 inç (1.588 mm)) </li><li> Kelepçe </li><li> Konfokal mikroskobu (Zeiss, Meta LSM510) </li><li> Lameller, cam (Knittel&#39;in Gläser) 50 x 24 mm </li><li> Lameller, PVC lamelleri (Rinzl) 50 x 24 mm </li><li> Akış hücreleri, polietilen (DTU Sistemleri Biyoloji, Danimarka Teknik Üniversitesi,% 20Center/Resources/Biofilm% 20Setup.aspx http://www.csm.bio.dtu.dk/Instrument </li><li> Orta şişe (Schott) </li><li> Peristaltik Pompa (Watson-Marlow, 205S) </li><li> Sepeti Rolling akış sistemleri ve pompalar </li><li> Silikon tutkal (3M Super Silikon sifresiz) </li><li> Şırınga 5 ml (Terumo) </li><li> Syto 9 (Moleküler Problar) </li><li> 0,5 mL Şırınga, iğne ile (27G, Terumo LU-100) </li><li> Çöp konteyneri </li></ul> Boru: <ul><li> Silikon, 3 mm dış çapı 1 mm iç çapı (Ole Dich) </li><li> Silikon, 4 mm, dış çapı 2 mm, iç çapı (Ole Dich) </li><li> Marprene, 3 mm dış çapı 1 mm iç çapı (Watson-Marlow) </li></ul> Medya <table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> P. aeruginosa orta </td></tr><tr><td> A10 </td><td> g / L </td></tr><tr><td> (NH 4) 2 SO4 </td><td> 2,0 </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 X 2H 2 O </td><td> 6,0 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 3,0 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 3,0 </td></tr><tr><td> Otoklav </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td></tr><tr><td colspan="2"> FB </td></tr><tr><td> MgCl 2 6H 2 O </td><td> 0,20 </td></tr><tr><td> 1 mL 1 M CaCl 2 </td><td> 0,01 </td></tr><tr><td colspan="2"> 100 mcL / L İz metaller (P. aeruginosa-biyofilm için) 4 </td></tr><tr><td colspan="2"> Otoklav </td></tr><tr><td colspan="2"> 1:10 &#39;lik bir oran A10 ve FB karıştırın. </td></tr><tr><td colspan="2"> Istenen konsantrasyon karbon kaynağı ekleyin. </td></tr></tbody></table> <table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> S. cerevisiae &quot;adlı sentetik tam (SC) orta </td></tr><tr><td></td><td> g / L </td></tr><tr><td> Adenin sülfat </td><td> 0,02 </td></tr><tr><td> L-triptofan </td><td> 0,02 </td></tr><tr><td> L-histidin-HCL </td><td> 0,02 </td></tr><tr><td> L-arjinin-HCL </td><td> 0,04 </td></tr><tr><td> L-metiyonin </td><td> 0,02 </td></tr><tr><td> L-tirozin </td><td> 0,05 </td></tr><tr><td> L-lösin </td><td> 0,06 </td></tr><tr><td> L-izolösin </td><td> 0,06 </td></tr><tr><td> L-lizin-HCL </td><td> 0,05 </td></tr><tr><td> L-fenilalanin </td><td> 0,05 </td></tr><tr><td> L-aspartik asit </td><td> 0,10 </td></tr><tr><td> L-glutamik asit </td><td> 0,10 </td></tr><tr><td> L-valin </td><td> 0,15 </td></tr><tr><td> L-treonin </td><td> 0,20 </td></tr><tr><td> L-serin </td><td> 0,40 </td></tr><tr><td> Maya Nitstresin baz w / o amino asitler ve amonyum (Bacto) </td><td> 1,6 </td></tr><tr><td> Amonyum sülfat </td><td> 5,0 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> 6,0 </td></tr><tr><td> Süksinik asit </td><td> 10,0 </td></tr><tr><td> Otoklav </td><td></td></tr><tr><td> Glikoz (ayrı ayrı otoklava) </td><td> 0,20 </td></tr></tbody></table>

pseudomonas aeruginosa and saccharomyces cerevisiae biofilm in flow cells

Birçok mikrobiyal hücrelerin serbest yaşayan mikroorganizmaların göre fizyolojik ve patolojik özelliklerini değiştirmiştir biyofilm olarak tanımlanan sesil mikrobiyal topluluklar oluşturmak için yeteneği var. Doğada Biyofilmler genellikle kötü tanımlanan koşulları 1 altında incelemek ve ikamet zor. Şeffaf bir alt tabaka kullanarak cihaza basit bir biyofilm tahribatsız bir şekilde gerçek zamanlı olarak kontrol edilebilir bir sistem mümkün: burada, in vitro 3D mikrobiyal biyofilm çalışmalarda, bir akış hücresi modeli sistemi montaj ve işletme göstermek 2,3 iyi tanımlanmış koşulları altında yüksek tekrarlanabilirlik üreten. Biyofilm büyüme odası olarak hizmet veren bir akış hücresi sistemi oluşur. Akış hücresi peristaltik bir pompa yoluyla besin ve oksijen ile orta şişesi verilir ve harcanan orta atık kapta toplanır. Bu inşaat akış sisteminin akış odasında yetiştirilen hücreler minimal rahatsızlık ile örneğin antibiyotik besin ve yönetim sürekli bir kaynağı sağlar. Ayrıca, akış hücresi içinde akış koşulları kesme strese maruz biyofilm çalışmaları izin verir. Bir kabarcık, aksi takdirde, akış hücresi biyofilm yapısını bozabilir boru cihaz sınırları hava kabarcıkları yakalama. Akış hücresi sistemi Konfokal Lazer Tarama Mikroskobu (CLSM) ile uyumludur ve böylece mikrobiyal biyofilm geliştirme hakkında son derece detaylı 3D bilgiler sağlayabilir. Biyofilm hücreler floresan probları veya CLSM analizi ile uyumlu proteinler etiketli olabilir. Bu online görselleştirme sağlar ve gelişmekte olan biyofilm nişler soruşturma sağlar. Mikrobiyal ilişkiler, antimikrobiyal ajanların incelenmesi veya spesifik genlerin ifadesi, birçok deney düzeneklerinin akış hücresi sistemi araştırılmalıdır.

Watch this Scientific Journal Video about Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells at JoVE.com

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Protokolü Konfokal Lazer Tarama Mikroskobu (CLSM) mikrobiyal biyofilm büyüyen ve analiz etmek için bir akış hücresi sistemi uygulama nitelendirdi.

Pseudomonas aeruginosa ve Saccharomyces cerevisiae Biyofilm Akış Hücreler

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

pseudomonas-aeruginosa-saccharomyces-cerevisiae-biofilm-flow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

36.7K Görüntüleme.  Danish Technical University. Protokolü Konfokal Lazer Tarama Mikroskobu (CLSM) mikrobiyal biyofilm büyüyen ve analiz etmek için bir akış hücresi sistemi uygulama nitelendirdi.

Video: Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living surfaces. In this paper, we describe protocols for forming Pseudomonas aeruginosa biofilms on human airway epithelial cells (CFBE cells) grown in culture. In the first method (termed the Static Co-culture Biofilm Model), P. aeruginosa is incubated with CFBE cells grown as confluent monolayers on standard tissue culture plates. Although the bacterium is quite toxic to epithelial cells, the addition of arginine delays the destruction of the monolayer long enough for biofilms to form on the CFBE cells. The second method (termed the Flow Cell Co-culture Biofilm Model), involves adaptation of a biofilm flow cell apparatus, which is often used in biofilm research, to accommodate a glass coverslip supporting a confluent monolayer of CFBE cells. This monolayer is inoculated with P. aeruginosa and a peristaltic pump then flows fresh medium across the cells. In both systems, bacterial biofilms form within 6-8 hours after inoculation. Visualization of the biofilm is enhanced by the use of P. aeruginosa strains constitutively expressing green fluorescent protein (GFP). The Static and Flow Cell Co-culture Biofilm assays are model systems for early P. aeruginosa infection of the Cystic Fibrosis (CF) lung, and these techniques allow different aspects of P. aeruginosa biofilm formation and virulence to be studied, including biofilm cytotoxicity, measurement of biofilm CFU, and staining and visualizing the biofilm.

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

This paper describes different methods of growing Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured human airway epithelial cells. These protocols can be adapted to study different aspects of biofilm formation, including visualization of the biofilm, staining of the biofilm, measuring the colony forming units (CFU) of the biofilm, and studying biofilm cytotoxicity.

Co-kültür Modelleri Pseudomonas aeruginosa</emCanlı İnsan Havayolu Hücreler Yetiştirilen> Biyofilmler

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings. In fact, life in a biofilm probably represents the predominate mode of growth for microbes in most environments. Mature biofilms have a few distinct characteristics. Biofilm microbes are typically surrounded by an extracellular matrix that provides structure and protection to the community. Microbes growing in a biofilm also have a characteristic architecture generally comprised of macrocolonies (containing thousands of cells) surrounded by fluid-filled channels. Biofilm-grown microbes are also notorious for their resistance to a range of antimicrobial agents including clinically relevant antibiotics.
The microtiter dish assay is an important tool for the study of the early stages in biofilm formation, and has been applied primarily for the study of bacterial biofilms, although this assay has also been used to study fungal biofilm formation. Because this assay uses static, batch-growth conditions, it does not allow for the formation of the mature biofilms typically associated with flow cell systems. However, the assay has been effective at identifying many factors required for initiation of biofilm formation (i.e, flagella, pili, adhesins, enzymes involved in cyclic-di-GMP binding and metabolism) and well as genes involved in extracellular polysaccharide production. Furthermore, published work indicates that biofilms grown in microtiter dishes do develop some properties of mature biofilms, such a antibiotic tolerance and resistance to immune system effectors.
This simple microtiter dish assay allows for the formation of a biofilm on the wall and/or bottom of a microtiter dish. The high throughput nature of the assay makes it useful for genetic screens, as well as testing biofilm formation by multiple strains under various growth conditions. Variants of this assay have been used to assess early biofilm formation for a wide variety of microbes, including but not limited to, pseudomonads, Vibrio cholerae, Escherichia coli, staphylocci, enterococci, mycobacteria and fungi.
In the protocol described here, we will focus on the use of this assay to study biofilm formation by the model organism Pseudomonas aeruginosa. In this assay, the extent of biofilm formation is measured using the dye crystal violet (CV). However, a number of other colorimetric and metabolic stains have been reported for the quantification of biofilm formation using the microtiter plate assay. The ease, low cost and flexibility of the microtiter plate assay has made it a critical tool for the study of biofilms.

The assay describes a rapid means to measure early biofilm formation in bacteria and fungi. This method uses a microtiter plate as the substratum for microbial biofilm formation, and the biofilm is visualized using crystal violet strain. The assay provides either a qualitative or quantitative assay for early biofilm formation.

Microtiter Bulaşık Biyofilm Oluşumu Testi

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings.  In fact, life in a biofilm ...

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

Most microbes in nature are thought to exist as surface-associated communities in biofilms.1 Bacterial biofilms are encased within a matrix and attached to a surface.2 Biofilm formation and development are commonly studied in the laboratory using batch systems such as microtiter plates or flow systems, such as flow-cells. These methodologies are useful for screening mutant and chemical libraries (microtiter plates)3 or growing biofilms for visualization (flow cells)4. Here we present detailed protocols for growing Staphylococcus aureus in two additional types of flow system biofilms: the drip flow biofilm reactor and the rotating disk biofilm reactor.
Drip flow biofilm reactors are designed for the study of biofilms grown under low shear conditions.5 The drip flow reactor consists of four parallel test channels, each capable of holding one standard glass microscope slide sized coupon, or a length of catheter or stint. The drip flow reactor is ideal for microsensor monitoring, general biofilm studies, biofilm cryosectioning samples, high biomass production, medical material evaluations, and indwelling medical device testing.6,7,8,9
The rotating disk reactor consists of a teflon disk containing recesses for removable coupons.10 The removable coupons can by made from any machinable material. The bottom of the rotating disk contains a bar magnet to allow disk rotation to create liquid surface shear across surface-flush coupons. The entire disk containing 18 coupons is placed in a 1000 mL glass side-arm reactor vessel. A liquid growth media is circulated through the vessel while the disk is rotated by a magnetic stirrer. The coupons are removed from the reactor vessel and then scraped to collect the biofilm sample for further study or microscopy imaging. Rotating disc reactors are designed for laboratory evaluations of biocide efficacy, biofilm removal, and performance of anti-fouling materials.9,11,12,13

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

Protocols for utilizing open system flow biofilms with drip flow reactors and rotating disk reactors are presented in detail.

Damla Akış ve Döner Disk Reaktörler kullanın Staphylococcus aureus Biyofilm Analizi

Most microbes in nature are thought to exist as surface-associated communities in biofilms.1  Bacterial biofilms are encased within a matrix and attached ...

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in porous media are relevant to several industrial and environmental processes such as wastewater treatment and CO2 sequestration. We used Pseudomonas fluorescens, a Gram-negative aerobic bacterium, to investigate biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media. The microfluidic device consists of an array of micro-posts, which were fabricated using soft-lithography. Subsequently, biofilm formation in these devices with flow was investigated and we demonstrate the formation of filamentous biofilms known as streamers in our device. The detailed protocols for fabrication and assembly of microfluidic device are provided here along with the bacterial culture protocols. Detailed procedures for experimentation with the microfluidic device are also presented along with representative results.

Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.

Mikro-ayağı ile bir mikroakışkan Aygıt Biyofilm Çıtası Formasyonu Protokolü

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Biyomühendislik

Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is strongly regulated by the surrounding flow and nutritional environment. Biofilm growth also increases the heterogeneity of the local microenvironment by generating complex flow fields and solute transport patterns. To investigate the development of heterogeneity in biofilms and interactions between biofilms and their local micro-habitat, we grew mono-species biofilms of Pseudomonas aeruginosa and dual-species biofilms of P. aeruginosa and Escherichia coli under nutritional gradients in a microfluidic flow cell. We provide detailed protocols for creating nutrient gradients within the flow cell and for growing and visualizing biofilm development under these conditions. We also present protocols for a series of optical methods to quantify spatial patterns in biofilm structure, flow distributions over biofilms, and mass transport around and within biofilm colonies. These methods support comprehensive investigations of the co-development of biofilm and habitat heterogeneity.

Biofilms have complex interactions with their surrounding environment. To comprehensively investigate biofilm-environment interactions, we present here a series of methods to create heterogeneous chemical environment for biofilm development, to quantify local flow velocity, and to analyze mass transport in and around biofilm colonies.

Biyofilm ve Habitat Heterojen Eş-geliştirme karakterize Yöntemleri

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, including Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). Here, we will describe how the system can be used to study the growth kinetics and the morphological properties such as the surface roughness and textural entropy of P. aeruginosa strain PA01 that expresses an enhanced green fluorescent protein (PA01-EGFP). A detailed protocol will describe how to grow and seed PA01-EGFP cultures, how to set up the microscope and autorun, and conduct the image analysis to determine growth rate and morphological properties using a variety of shear forces that are controlled by the microfluidic device. This article will provide a detailed description of a technique to improve the study of PA01-EGFP biofilms which eventually can be applied towards other strains of bacteria, fungi, or algae biofilms using the microfluidic platform.

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Here, we describe the use of a higher-throughput microfluidic bioreactor coupled with a fluorescent microscope for the analysis of shear stress effects on Pseudomonas aeruginosa biofilms expressing green fluorescent proteins, including instrument set up, the determination of biofilm coverage, growth rate, and morphological properties.

Canlı hücre analizi, yamultma stres bir otomatik yüksek üretilen iş mikrosıvısal sistemi kullanarak Pseudomonas aeruginosa

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. albicans is its ability to form biofilms, structured communities of cells attached to biotic and abiotic surfaces. C. albicans biofilms can form on host tissues, such as mucosal layers, and on medical devices, such as catheters, pacemakers, dentures, and joint prostheses. Biofilms pose significant clinical challenges because they are highly resistant to physical and chemical perturbations, and can act as reservoirs to seed disseminated infections. Various in vitro assays have been utilized to study C. albicans biofilm formation, such as microtiter plate assays, dry weight measurements, cell viability assays, and confocal scanning laser microscopy. All of these assays are single end-point assays, where biofilm formation is assessed at a specific time point. Here, we describe a protocol to study biofilm formation in real-time using an automated microfluidic device under laminar flow conditions. This method allows for the observation of biofilm formation as the biofilm develops over time, using customizable conditions that mimic those of the host, such as those encountered in vascular catheters. This protocol can be used to assess the biofilm defects of genetic mutants as well as the inhibitory effects of antimicrobial agents on biofilm development in real-time.

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

This protocol describes the use of a customizable automated microfluidic device to visualize biofilm formation in Candida albicans under host physiological conditions.

Görselleştirme bir otomatik mikrosıvısal aygıtı kullanarak Candida albicans biyofilm oluşumu

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. While models for the growth under flow have been developed, many of these systems are expensive, or do not allow imaging while the cells are under flow. We have developed a novel apparatus that allows us to image the growth and development of Candida albicans cells under flow and in real-time. Here, we detail the protocol for the assembly and use of this flow apparatus, as well as the quantification of data that are generated. We are able to quantify the rates that the cells attach to and detach from the slide, as well as to determine a measure of the biomass on the slide over time. This system is both economical and versatile, working with many types of light microscopes, including inexpensive benchtop microscopes, and is capable of extended imaging times compared to other flow systems. Overall, this is a low-throughput system that can provide highly detailed real-time information on the biofilm growth of fungal species under flow.

We describe the assembly, operation, and cleaning of a flow apparatus designed to image fungal biofilm formation in real time while under flow. We also provide and discuss quantitative algorithms to be used on the acquired images.

Gerçek zamanlı görüntüleme ve miktar iki aşamalı dolaşım akış sistemi kullanarak mantar biyofilm gelişimi

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...

Generation of Greater Bacterial Biofilm Biomass using PCR-Plate Deep Well Microplate Devices

Bacterial biofilms are difficult to eradicate from surfaces using conventional antimicrobial interventions. High-throughput 96-well microplate methods are frequently used to cultivate bacterial biofilms for rapid antimicrobial susceptibility testing to calculate minimal biofilm eradication concentration (MBEC) values. Standard biofilm devices consist of polystyrene pegged-lids fitted to 96-well microplates and are ideal for measuring biofilm biomass and MBEC values, but these devices are limited by available peg surface area for biomass accumulation and cost. Here, we outline a protocol to use self-assembled polypropylene 96-well deep well PCR-plate pegged-lid device to grow Escherichia coli BW25113 and Pseudomonas aeruginosa PAO1 biofilms. A comparison of 24-hour biofilms formed on standard and deep well devices by each species using crystal violet biomass staining and MBEC determination assays are described. The larger surface area of deep well devices expectedly increased overall biofilm formation by both species 2-4-fold. P. aeruginosa formed significantly greater biomass/mm2 on deep well pegs as compared to the standard device. E. coli had greater biomass/mm2 on standard polystyrene devices as compared the deep well device. Biofilm eradication assays with disinfectants such as sodium hypochlorite (bleach) or benzalkonium chloride (BZK) showed that both compounds could eliminate E. coli and P. aeruginosa biofilms from both devices but at different MBEC values. BZK biofilm eradication resulted in variable E. coli MBEC values between devices, however, bleach demonstrated reproducible MBEC values for both species and devices. This study provides a high throughput deep well method for growing larger quantities of biofilms on polypropylene devices for downstream studies requiring higher amounts of static biofilm.

This protocol presents methodology to perform biofilm growth and biomass measurements using self-assembled deep well PCR-plate devices for high-throughput 96-well pegged lid static biofilm screening.

PCR-Plate Deep Well Microplate Cihazları Kullanılarak Daha Büyük Bakteriyel Biyofilm Biyokütlesinin Oluşturulması

Bacterial biofilms are difficult to eradicate from surfaces using conventional antimicrobial interventions. High-throughput 96-well microplate methods are ...

<meta charset="utf8"></head><body>Antimikrobiyal Test ve Mikrobiyal Dinamik Analizi için Uyarlanabilir CF Modeli

Development of a Polymicrobial Colony Biofilm Model to Test Antimicrobials in Cystic Fibrosis

A range of bacteria biofilm models exist for the testing of antibiotics. However, many of these are limited to a single experimental output, such as colony-forming units or metabolic activity. Furthermore, many biofilm models do not reflect the biological and physiochemical properties of the human host environment. This is an important issue in many conditions, but most noticeably in cystic fibrosis (CF). A large proportion of people with CF suffer from both chronic and intermittent infections, and in vitro, antibiotic susceptibility testing poorly correlates with patient treatment outcomes. Some biofilm models incorporate CF lung-relevant media, including synthetic sputum mimics, but do not consider the polymicrobial nature of the environment, which alters biofilm architecture, physiology, and the way microbes respond to treatment. The solid-air interface colony biofilm model described here is highly adaptable and incorporates both CF-relevant media and a polymicrobial context. This model can also be used for mid-throughput screening of antimicrobials and to study their effect on polymicrobial dynamics. Output measurements from the model can be colony-forming units, metabolic activity, and confocal microscopy analysis. The model can easily be adapted to different microorganisms, media, temperatures, and variable oxygen conditions and can be used to test a wide range of chemical, biological, and physical treatments.

<meta charset="utf8"></head><body>Kistik Fibrozisde Antimikrobiyalleri Test Etmek İçin Polimikrobiyal Koloni Biyofilm Modelinin Geliştirilmesi

This methodology allows for the establishment of a polymicrobial biofilm model in cystic fibrosis for antimicrobial sensitivity testing in research and clinical laboratories. This model provides accurate and reliable results over a range of outputs.

Kistik Fibrozisde Antimikrobiyalleri Test Etmek İçin Polimikrobiyal Koloni Biyofilm Modelinin Geliştirilmesi

A range of bacteria biofilm models exist for the testing of antibiotics. However, many of these are limited to a single experimental output, such as ...