1. Cam Mikropipetler Çekme Ekipman: Mikropipet Çektirme, Microforge. Cam: Boroscillicate cam kapilerleri (~ 1.5 mm dış çapı, ~ 1.4 mm iç çapı). <ol><li> Mikropipetler elektrofizyolojik kayıtları için cam mikroelektrot hazırlamak için kullanılan aynı temel yaklaşımı kullanılarak çekilir. Kısaca, bir kılcal cam orta ısıtılır ve cam erime başladığında kılcal iki yarısı ayrı iki mikropipetler üreten çekilir. Birden ticari Elcikler çekme hızı ve diğer parametreleri değiştirmek için birden fazla programlanabilir seçenekleri sunmak son derece sofistike yatay Elcikler için iki pipetler uzaklaşmayı yerçekimi kullanımı nispeten basit dikey Elcikler kadar bu işlemi gerçekleştirmek için kullanılabilir. Çekiciler Her iki tip deneylerde kullanılan edildi. </li><li> Gerekliliks pipet ucu geometri için: Bu deneylerde kullanılan pipet uçları tipik olarak 6-2 um arasında hücre boyutuna bağlı olarak, dış çap arasında değişir. Başka bir önemli parametre, uç şekli olan gereken yaklaşık olarak silindirik bir tüp (bkz. Şekil 1). Bu çekme parametrelerini optimize etmek ve istenen şekli elde edilene kadar mikroskop altında ucunun şeklini kontrol edilmesiyle elde edilebilir. Pipet gövdesinin optimum uzunluğu beklenen deformasyon miktarına bağlıdır: deformasyonların küçük &lt;10 um olup, bu pipet silindir benzeri parça kısa (büyüklükte aynı sıra), daha büyük için de göreceli olduğu yeterlidir deformasyonlar buna göre ayarlayın. Genel olarak, &quot;çekme&quot; olarak ısı arttırır ve / veya artan uç çapı azalır. &quot;Çekme&quot; artış da daha uzun bir konik bir ipucu oluşturur. Deneylerde, bir Sutter P-97 yatay pipet çektirmenin kullanarak, programı oldu; Çekme 22; Velocity 22 Saat 200; Basıncı 500 473 Isı: Aşağıdaki parametreleri optimize. Bu çok uzun bir sap çekilmesi ve daha sonra kırma ve parlatma ile silindirik ipuçları oluşturmak da mümkündür. Pipetler farklı hazırlamak için nasıl ayrıntılı talimatlar Sutter manuel olarak verilmektedir. </li><li> Microforge: Aynı zamanda, plazma zarının iyi bir sızdırmazlık sağlayan bir düz cam yüzey oluşturmak için pipet ucu yangın-parlatmak için tavsiye edilir. Bu, bir microforge kullanılarak bir ikinci bir çok bir kısmı için bir ısıtılmış cam bilye ve çevresinde pipet ucuyla getirilmesi ile yapılır. Benzer teknik rutin elektrofizyolojik kayıtları için mikroelektrot hazırlamak için kullanılır. </li><li> Mikropipet doldurulması: mikropipetler böyle PBS veya floresan olmayan büyüme ortamı olarak bir fizyolojik tuzlu su çözeltisi ile doldurulur. Önemli bir çözelti hücre mem izin verecek% 30 serum ilave edilmelidirpipeti içine düzgün hareket etmek Brane. Iki yaklaşım pipet ucu içinde hava kabarcıkları kurtulmak için kullanılabilir: (i) bir pipet ucu sıvı pipet dolgu ardından kılcal güçler yoluyla uç doldurmak için izin vermek için birinci solüsyon içinde daldırılarak diğer ucundan da (ii) bütün pipet yavaşça ucundan kabarcıklarını çıkarmak için pipet sap dokunarak arka ucundan doldurulabilir. </li><li> Not: Pipetler deney gününde hazırlanması gerekmektedir. </li></ol> 2. Hücre Hazırlanması <ol><li> Tohum hücreleri: Microaspiration ya da süspansiyon içinde muhafaza edilir ya da alt tabakaya bağlı olan tek bir hücre üzerinde gerçekleştirilir. Süspansiyon hücreleri aspire etmek, hücre, kendi substratları kaldırdı ve sağ deneyden önce inverted mikroskop üzerine monte edilir sığ bir uzunlamasına odasına pipetlenir. Alt tabaka tutturulmuş hücreler, hücre aspireküçük bir kapak-slip numaralı seribaşı da deneyden önce microaspiration odasına yerleştirilebilir (çapı ~ 10 mm). Sığ bir boyuna bölme kullanmak için gerekçe mikropipet mümkün olduğunca yatay olarak yakın bir çok sığ açıyla hücreleri yaklaşım sağlamaktır. Bu (bkz. Şekil 2) odak tek bir düzlem üzerinde görselleştirildiği gibi mikropipet içine çekilir zar izin vermek için yapılır. </li><li> Hücre zarı Görselleştirme: pipet içine membran projeksiyon gözlemlemek için, hücre zarının bir standart boyama protokolü kullanarak böyle Dii gibi bir lipofilik floresan boya ile boyanmış. <ol type="i"><li> Sıcak PBS çözeltisi. </li><li> Ilık PBS solüsyonu ile bir çalışma konsantrasyonu (5 mcM) için stok Dii seyreltin. </li><li> Boya agrega kırmaya 5 dakika sonikasyon. </li><li> 5 dakika aşağı spin ve süpernatant alır. </li><li> PBS 3 kez, her biri 5 dakika içinde hücreleri yıkayın. </li><li> Böylece boya sahip hücreler inkübebir 37 ° C kuluçka makinesi içinde 30 dakika için geçirdikleri evrim. </li><li> 5 dakika her PBS 3 kez hücreleri yıkayın. </li></ol></li><li> Not: Bu da pipet içine zar ile birlikte çekilmektedir alt zar, hücre iskeleti görüntülenmesi ile membran arasında uçucu, boyama ikame etmek mümkündür. Bu, hücre iskeleti dalgalanmayla hücrenin biyomekanik özelliklerini değiştirebilir ki, göz önüne alınması gerekmektedir. Ayrıca, alt tabaka tutturulmuş hücreler ile microaspiration deneyler, bu hücrelerin odak düzlemi ile bir açı ile konumlandırılmış pipet içine çıkıntı zar uzunluğu tahmin etmek için 3 boyutlu görüntüleme kullanılması tavsiye edilir. </li></ol> 3. Microaspiration ve Image Acquisition Ekipman: Ters Floresan Mikroskop, tercihen 3D Dekonvolüsyonun yetenekleri (objectiv bilgisayar kontrollü Z ekseni hareketi ile Zeiss Axiovert 200Mes veya eşdeğeri); manipülatörler, bir bilgisayar (AxioCam MRM veya eşdeğeri), Basınç Transducer (Biotek veya eşdeğeri), Titreşimsiz istasyonu (TMD veya eşdeğeri), Mikromanipülatör (Narishige, Sutter, Burleigh veya eşdeğer bağlı video kamera ), mekanik, hidrolik veya piezoelektrik olabilir. O microaspiration, kırmızı kan hücreleri 1,2 veya nötrofiller 3 gibi çekirdekler 4 veya yapay lipozomlar 5 olarak izole organelleri gibi süspansiyon hücrelerinin sertliği, tahmin etmek 3D yetenekleri olmayan bir mikroskop kullanılarak yapılabilir vurgulanması da önemlidir. Image Acquisition yazılımı: Zeiss AxioVision veya eşdeğer. <ol><li> Yukarıda tarif edildiği gibi bir ters flüoresan mikroskop üzerinde, bir microaspiration odasına hücreleri monte edin. Bir deney için bir hücreyi seçerek hücreleri konumlandırın ve görme alanının merkezinde yerleştirin. Bu perfo önemlidirözellikle substrat bağlı hücreleri ile deneyler için titreşimsiz ortamda rm Bu deneylerde, tipik banklar ve normal tablolar üzerinde meydana dakikalık titreşimler tamamen mühür oluşturulması tehlikeye içinde mikropipet veya sonucun ucu kırmak için muhtemeldir, çünkü Sonuçların analizi olacak eğriltme ucunun konumunu önemli kaymalar. </li><li> Sıkı bir uyum için pipet tutucu bağlayıcı ayarlanmış çapa sahip esnek boru vasıtası ile bir güç dönüştürücüye bağlı bir pipet tutucu içine PBS / medya w / serum çözeltisi ile doldurulmuş bir mikropipet yerleştirin. Her denemenin başında pipet içindeki basınç atmosfer basıncına dengelenmiş olduğunu. Pipet mikron aralığında bir pipet hareketlerinin kontrol sağlar bir micromanipulator üzerine monte edilir. Odasının altına sığ bir açıda bir pipet yerleştirin ve görme alanı merkeze pipet ucu getirmek. Thpipet e sap, zar aspire edilir içine pipet ucu bir silindirik kısmı, olası en sığ açı (10-15 °) (1) konumlandırma pipet ile ve (2) odak düzlemi yatay olarak hizalanmıştır odasının alt karşı pipet sap esnemektedir. Sap çok ince olduğu için Şekil 1 &#39;de şematik olarak gösterildiği gibi, bir hücre yaklaşırken odasının alt kayma için yeterince esnektir. Yavaşça hücre için odak düzlemi yakınında kadar derse manipülatör kullanılarak tek bir hücrenin yan mikropipet getir. Pipet ucu hafifçe membran temas edene kadar sonra, ince bir manipülatör kullanılarak hücre kenarına mikropipet hareket eder. Pipet yerini incelemek için bir imge al. Pipet ucu bütün hücre yüzeyi ile tam temas etmesini ve temas kararlı olduğu zaman iyi sızdırmazlık oluşturulur. Güçlü bir nesnel ölçüt mühür exc ne kadar iyi olduğunu, ancak varGörsel inceleme için EPT. </li><li> Transdüser kullanılarak negatif basınç bir adım uygulayın ve membran projeksiyon stabilize oluncaya kadar onu korumak. Pipet içine zar aspire için gerekli basınç miktarı hücre tipine ve özel deneysel koşullara bağlı olarak değişir. -2-15mm Hg aralığında basınç uygulayarak zaman bizim deneylerde, ilk deformasyon genellikle gözlenmektedir. Bu belirli bir uzunluk, genellikle 2-3 dakika sürer bir işlem de stabilize oluncaya kadar basınç uygulandığı zaman, kademeli olarak zar pipet içine deforme olur. Bu süre zarfında, membran deformasyon görüntüleri pipeti içine çekilir membran ilerlemesini izlemek için her 30 sn elde edilir. </li><li> 2-5 mm Hg adımlarla sonraki seviyeye basıncını arttırın ve membran projeksiyon deneme durduğu noktada pipet içine hücre ve hamle, ayrılana kadar bu işlemi tekrarlayın. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. Analiz Membran deformasyon derecesi ölçmek için, aspire uzunluk (L) pipetin ucundan zarın projeksiyon çevresinin tepe ile ölçülür. Bu, bir daha büyük bir pipet basınç ile aynı düzeyde hücre zarı üzerinde daha fazla kuvvet uygulanır ki, dikkat etmek önemlidir. Pipet çapları arasında değişkenlik dikkate almak için, bu nedenle, aspire uzunluğu her bir deney için ölçülen pipet çapı (D) için normalleştirilir. Bu veriler ayrıca olarak daha önceki çalışmalarda 6,7 tarif edilen endotelyal hücre, bir standart doğrusal viskoelastik bir yarı-uzay modeli kullanılarak analiz edilebilir. Spesifik olarak, hücrelerin elastik modül denklemi kullanılarak tahmin edildi: <img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/3886/3886eq1.jpg" /> E Young modülü olduğu durumlarda, bir iç olduğupipet yarıçapı, Δp basınç farkı, L karşılık gelen aspire uzunluğu, ve φ (η) işlev olarak Theret ve diğerleri tarafından tarif 7 kuvvet model kullanılarak hesaplanmıştır bir duvar. Bu, birden fazla model bir hücre hücreleri küresel bir şekil oluşturduğunu varsayalım izotropik ve homojen malzeme özellikleri ve sıvı damlası modeli, bir deforme küre olduğunu varsayan bir sonlu eleman modeli de dahil olmak üzere microaspiration verilerini analiz etmek için kullanılmış olduğunu not etmek önemlidir sürekli deforme, ve gibi birçok mükemmel değerlendirmeleri açıklanan sürüm, üzerine kurtarabilirsiniz: 8-10. Microaspiration aynı zamanda bu tür hücresel viskoelastik özellikleri, hücre ve doku biyomekanik (Daha fazla bilgi için yukarıda listelenen değerlendirme bakınız) farklı yapısal elemanların kortikal gerilim ve katkı olarak hücreler ve dokular, diğer biyomekanik parametreler araştırmak için kullanılabilir. 5. TemsilciSonuçlar Daha önceki çalışmalarda, mikropipet aspirasyon lipozomlar, 5 ya da alt tabaka 2,11-13 bağlı değildi hücreleri üzerinde ya da uygulandı. Çalışmalarımızda Bununla birlikte, hücreler tipik olarak 14-16 hücreleri ayırmak zaman meydana gelebilir iskelet yapısı değişiklikleri önlemek için alt tabaka ile bağlı tutulur. Substrat bağlı hücreleri için microaspiration tekniğin kullanımını doğrulamak için, beklendiği gibi, bu kadar bu yaklaşım ile tahmin sığır aort endotel hücreleri (BAECs), hücre sertliğinin azalması F-aktin sonuçları bozulması. Şekil 3 gösterileri olmadığını test , bu gerçekten böyledir. Spesifik olarak, Şekil 3A, bir mikropipet yoluyla uygulanan negatif basınca tepki olarak ilerleyen deformasyon geçirmekte olan endotelyal membran floresan görüntü tipik bir dizi gösterilmektedir. Beklendiği gibi, zar kademeli olarak pipet ile aspirat aspire edilired uzunluk uygulanan basıncın bir işlevi olarak artar. F-aktin bozulması önemli tüm basınç koşullarında (Şekil 3B) 14 yaşın altındaki projeksiyonlar aspire uzunlukları artar deformasyon gösterinin zaman içerisinde. Bu yaklaşımı kullanarak, biz kolesterol zenginleştirme hiçbir etkisi 14 sahipti, oysa hücre zarının kolesterol tükenmiş olduğunda hücre sertliği artar keşfetti. Şekil 4&#39;te maksimum aspirasyon uzunlukları ulaştıktan sonra bir kolesterol zenginleştirilmiş hücre, bir kontrol hücresi, ve kolesterol tükenmiş hücre gösterir -15 mm Hg (4A). Projeksiyonlar genellikle-10mmHg de gelişmeye başlamış ve membran deformasyon zaman kurslar -10, -15 ve -20 mm Hg (4B) ve negatif basınçları için ölçülen olabilir. -25mmHg üzerindeki basınçlarda uygulama ayrı bir vesikül şekillendirme aspire projeksiyon ayrılması ile sonuçlanmıştır. Membran dekolmanı sonuçlandı basınç seviyesi VB olduFarklı koşullar altında kolesterol r. Önceki çalışmalar membran lipid Bilayerlar membran kolesterol artış membran 5,17 sertliğini artırdığını göstermiştir çünkü bu gözlem son derece beklenmedik bir şeydi. Bizim ileri çalışmalar Atomik Kuvvet Mikroskobu 18,19 ve Kuvvet Traksiyon Mikroskopi 20 de dahil olmak üzere birçok bağımsız yaklaşımlar kullanarak bu gözlemleri doğruladı. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3886/3886fig1.jpg" /> Şekil 1. Bir kayıt pipet şematik yandan görünüşüdür. Pipet ucu (yandan görünüm) bir silindirik sap oluşturmak için çekilir. Mikropipet parametreleri: D = 2a = iç çapı ve ED = 2b = dış çapı. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/3886/3886fig2.jpg" /> Şekil 2. Mikropipet bir alt tabaka bağlı hücre yaklaşan (A) şematik yan görünüşüdür;. Bir mikropipet s (B) Parlak görüntü kontrastHank aspirasyon deneylerde kullanılan tipik bir hücre şeklinde dokunma; DiIC 18 etiketli aynı hücre (C) floresan imaj. Mikropipet hala mevcut ancak (14 Gönderen) görünmez. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3886/3886fig3.jpg" /> Şekil 3,. Microaspiration kullanarak substrat bağlı hücrelerinde hücre sertlik ölçme Doğrulama. A: Kontrol koşullarında ve latrunculin maruz kaldıktan sonra BAECs ilerleyici membran deformasyon Görüntüleri bunu floresan değil çünkü pipet görüntülerde görünmez.. Hücreleri gibi rodamin-phalloidin floresan ile ölçülen ölçüde F-aktin miktarı azalır 10 dakika, (gösterilmemiş) için 2 uM latrunculin A maruz fakat hücre şekli üzerinde belirgin bir etkisi yoktur edildi. Bir latrunculin işleme tabi tutulmuş hücre, bir aspire projeksiyon ortasında membran inceltme ancak yine de projeksiyon c iliştirilirarşın. B. L ve D yansıtma zar uzunluğu aspire edilir zar deformasyon sırasında içerisinde latrunculin üzerinde bir etkisi kontrol hücreleri için pipet çapı (n = 14), 2 uM latrunculin maruz kalan hücrelerin olan bir 10 dakika için (n = 5). Hücreleri -10 mm Hg (karo), -15 mm Hg (kareler) ve -20 mm Hg (üçgen) ile aspire edildi. (14 Gönderen.) <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/3886/3886fig4.jpg" /> Şekil 4. BAECs membran deformasyon hücresel kolesterol düzeylerinin etkisi. . Kolesterol ile zenginleştirilmiş, kolesterol-azalmış ve kontrol hücreler (kontrol hücrelerinin membran deformasyon bir Tipik görüntüleri MβCD maruz bırakıldı: hücrelerinde serbest kolesterol seviyesi üzerinde herhangi bir etkiye sahip 1:1 oranında MβCD-kolesterol karışımı (bakınız ) inset. gösterilen görüntüler -15 mm Hg maksimal deformasyon betimliyor. ok aspire projeksiyon konumunu gösterir. Bar 30 mikron. B. Üç deneysel hücre popülasyonlarının için aspire uzunlukları ortalama zaman kurslar. C. Maksimal uzunluk aspire uygulanan basıncın bir fonksiyonu olarak çizilmiştir. Tükenmiş hücrelerinde maksimal normalleştirilmiş uzunluğu basınçları -15 mm Hg ve -20 mm Hg (p &lt;0.05) kontrol hücrelerinin daha düşüktü. (14 Gönderen.)

<ol>
	<li>Rand, R. P., Burton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+the+red+cell+membrane.+I.+Membrane+stiffness+and+intracellular+pressure.">Mechanical properties of the red cell membrane. I. Membrane stiffness and intracellular pressure.</a> Biophys. J. 4, 115-135 (1964).</li><li>Discher, D. E., Mohandas, N., Evans, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+maps+of+red+cell+deformation:+hidden+elasticity+and+in+situ+connectivity.">Molecular maps of red cell deformation: hidden elasticity and in situ connectivity.</a> Science. 266, 1032-1035 (1994).</li><li>Schmid-Sch&#246;nbein, G. W., Sung, K. L., T&#246;zeren, H., Skalak, R., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+mechanical+properties+of+human+leukocytes.">Passive mechanical properties of human leukocytes.</a> Biophys. J. 36, 243-256 (1981).</li><li>Guilak, F., Tedrow, J. R., Burgkart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelastic+properties+of+the+cell+nucleus.">Viscoelastic properties of the cell nucleus.</a> Biochem. Biophys. Re.s Commun. 269, 781-786 (2000).</li><li>Needham, D., Nunn, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+deformation+and+failure+of+lipid+bilayer+membranes+containing+cholesterol.">Elastic deformation and failure of lipid bilayer membranes containing cholesterol.</a> Biophys. J. 58, 997-1009 (1990).</li><li>Sato, M., Theret, D. P., Wheeler, L. T., Ohshima, N., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+micropipette+technique+to+the+measurement+of+cultured+porcine+aortic+endothelial+cell+viscoelastic+properties.">Application of the micropipette technique to the measurement of cultured porcine aortic endothelial cell viscoelastic properties.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 112, 263-268 (1990).</li><li>Theret, D. P., Levesque, M. J., Sato, F., Nerem, R. M., Wheeler, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+a+homogeneous+half-space+model+in+the+analysis+of+endothelial+cell+micropipette+measurements.">The application of a homogeneous half-space model in the analysis of endothelial cell micropipette measurements.</a> J. of Biomechanical Engineering. 110, 190-199 (1988).</li><li>Hochmuth, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropipette+aspiration+of+living+cells.">Micropipette aspiration of living cells.</a> J. Biomech. 33, 15-22 (2000).</li><li>Lim, C. T., Zhou, E. H., Quek, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+models+for+living+cells--a+review.">Mechanical models for living cells--a review.</a> Journal of Biomechanics. 39, 195 (2006).</li><li>Zhao, R., Wyss, K., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+analytical+and+inverse+finite+element+approaches+to+estimate+cell+viscoelastic+properties+by+micropipette+aspiration.">Comparison of analytical and inverse finite element approaches to estimate cell viscoelastic properties by micropipette aspiration.</a> Journal of Biomechanics. 42, 2768 (2009).</li><li>Chien, S., Sung, K. L., Skalak, R., Usami, S., Tozeren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theoretical+and+experimental+studies+on+viscoelastic+properties+of+erythrocyte+membrane.">Theoretical and experimental studies on viscoelastic properties of erythrocyte membrane.</a> Biophys. J. 24, 463-487 (1978).</li><li>Evans, E., Kuhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+material+behavior+of+granulocytes+based+on+large+deformation+and+recovery+after+deformation+tests.">Passive material behavior of granulocytes based on large deformation and recovery after deformation tests.</a> Blood. 64, 1028-1035 (1984).</li><li>Sato, M., Levesque, M. J., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropipette+aspiration+of+cultured+bovine+aortic+endothelial+cells+exposed+to+shear+stress.">Micropipette aspiration of cultured bovine aortic endothelial cells exposed to shear stress.</a> Arteriosclerosis. 7, 276-286 (1987).</li><li>Byfield, F., Aranda-Aspinoza, H., Romanenko, V. G., Rothblat, G. H., Levitan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+depletion+increases+membrane+stiffness+of+aortic+endothelial+cells.">Cholesterol depletion increases membrane stiffness of aortic endothelial cells.</a> Biophys. J. 87, 3336-3343 (2004).</li><li>Byfield, F. J., Hoffman, B. D., Romanenko, V. G., Fang, Y., Crocker, J. C., Levitan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+the+role+of+cell+stiffness+in+modulation+of+volume-regulated+anion+channels.">Evidence for the role of cell stiffness in modulation of volume-regulated anion channels.</a> Acta. Physiologica. 187, 285-294 (2006).</li><li>Byfield, F. J., Reen, R. K., Shentu, T. -. P., Levitan, I., Gooch, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+actin+and+cell+stiffness+is+modulated+by+substrate+stiffness+in+2D+and+3D.">Endothelial actin and cell stiffness is modulated by substrate stiffness in 2D and 3D.</a> Journal of Biomechanics. 42, 1114 (2009).</li><li>Evans, E., Needham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+properties+of+surfactant+bilayer+membranes:+thermal+transitions,+elasticity,+rigidity,+cohesion+and+colloidal+interactions.">Physical properties of surfactant bilayer membranes: thermal transitions, elasticity, rigidity, cohesion and colloidal interactions.</a> Journal of Physical Chemistry. 91, 4219-4228 (1987).</li><li>Sun, M., Northup, N., Marga, F., Huber, T., Byfield, F. J., Levitan, I., Forgacs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cellular+cholesterol+on+membrane-cytoskeleton+adhesion.">The effect of cellular cholesterol on membrane-cytoskeleton adhesion.</a> J. Cell. Sci. 120, 2223-2231 (2007).</li><li>Shentu, T. P., Titushkin, I., Singh, D. K., Gooch, K. J., Subbaiah, P. V., Cho, M., Levitan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=oxLDL-induced+decrease+in+lipid+order+of+membrane+domains+is+inversely+correlated+with+endothelial+stiffness+and+network+formation.">oxLDL-induced decrease in lipid order of membrane domains is inversely correlated with endothelial stiffness and network formation.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 299, 218-229 (2010).</li><li>Norman, L. L., Oetama, R. J., Dembo, M., Byfield, F., Hammer, D. A., Levitan, I., Aranda-Espinoza, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+Cellular+Cholesterol+Content+Affects+Traction+Force,+Adhesion+and+Cell+Spreading.">Modification of Cellular Cholesterol Content Affects Traction Force, Adhesion and Cell Spreading.</a> Cell Mol. Bioeng. 3, 151-162 (2010).</li><li>Mitchinson, J. M., Swann, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mechanical+Properties+of+the+Cell+Surface:+I.+The+Cell+Elastimeter.">The Mechanical Properties of the Cell Surface: I. The Cell Elastimeter.</a> J. of Experimental Biology. 31, 443-460 (1954).</li><li>Byfield, F. J., Tikku, S., Rothblat, G. H., Gooch, K. J., Levitan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OxLDL+increases+endothelial+stiffness,+force+generation,+and+network+formation.">OxLDL increases endothelial stiffness, force generation, and network formation.</a> J. Lipid Res. 47, 715-723 (2006).</li><li>Ohashi, T., Ishii, Y., Ishikawa, Y., Matsumoto, T., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+and+numerical+analyses+of+local+mechanical+properties+measured+by+atomic+force+microscopy+for+sheared+endothelial+cells.">Experimental and numerical analyses of local mechanical properties measured by atomic force microscopy for sheared endothelial cells.</a> Biomed. Mater. Eng. 12, 319-327 (2002).</li><li>Solon, J., Levental, I., Sengupta, K., Georges, P. C., Janmey, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+adaptation+and+stiffness+matching+to+soft+elastic+substrates.">Fibroblast adaptation and stiffness matching to soft elastic substrates.</a> Biophysical Journal. 93, 4453 (2007).</li><li>Kowalsky, G. B., Byfield, F. J., Levitan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=oxLDL+facilitates+flow-induced+realignment+of+aortic+endothelial+cells.">oxLDL facilitates flow-induced realignment of aortic endothelial cells.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 295, 332-340 (2008).</li><li>Ketene, A. N., Schmelz, E. M., Roberts, P. C., Agah, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+cancer+progression+on+the+viscoelasticity+of+ovarian+cell+cytoskeleton+structures.">The effects of cancer progression on the viscoelasticity of ovarian cell cytoskeleton structures.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. , (2011).</li><li>Kole, T. P., Tseng, Y., Huang, L., Katz, J. L., Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+kinase+regulates+the+intracellular+micromechanical+response+of+adherent+cells+to+rho+activation.">Rho kinase regulates the intracellular micromechanical response of adherent cells to rho activation.</a> Mol. Biol. Cell. 15, 3475-3484 (2004).</li><li>Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+GTPases+and+the+Actin+Cytoskeleton.">Rho GTPases and the Actin Cytoskeleton.</a> Science. 279, 509-514 (1998).</li><li>Okajima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+for+the+Examination+of+Single+Cell+Rheology.+In.">Atomic Force Microscopy for the Examination of Single Cell Rheology. In.</a> Methods Mol. Biol. 736, 303-329 (2011).</li><li>Wang, N., Butler, J. P., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+across+the+cell+surface+and+through+the+cytoskeleton.">Mechanotransduction across the cell surface and through the cytoskeleton.</a> Science. 260, 1124-1127 (1993).</li><li>Fabry, B., Maksym, G. N., Butler, J. P., Glogauer, M., Navajas, D., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+the+microrheology+of+living+cells.">Scaling the microrheology of living cells.</a> Physical Review Letters. 87, 148102 (2001).</li><li>Park, C. Y., Tambe, D., Alencar, A. M., Trepat, X., Zhou, E. H., Millet, E., Butler, J. P., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+cytoskeletal+prestress.">Mapping the cytoskeletal prestress.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 298, C1245-C1252 (2010).</li><li>Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+of+migrating+normal+and+H-ras+transformed+3T3+fibroblasts.">Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts.</a> Biophys. J. 80, 1744-1757 (2001).</li><li>Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle-tracking+microrheology+of+living+cells:+principles+and+applications.">Particle-tracking microrheology of living cells: principles and applications.</a> Annu. Rev. Biophys. 38, 301-326 (2009).</li><li>Shin, D., Athanasiou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoindentation+for+obtaining+cell+biomechanical+properties.">Cytoindentation for obtaining cell biomechanical properties.</a> J. Orthop. Res. 17, 880-890 (1999).</li><li>Ou-Yang, H. D., Wei, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+fluids:+probing+mechanical+properties+of+biological+systems+with+optical+tweezers.">Complex fluids: probing mechanical properties of biological systems with optical tweezers.</a> Annu. Rev. Phys. Chem. 61, 421-440 (2010).</li><li>Hosu, B. G., Sun, M., Marga, F., Grandbois, M., Forgacs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+membrane+tethers+revisited+using+magnetic+tweezers.">Eukaryotic membrane tethers revisited using magnetic tweezers.</a> Phys. Biol. 4, 67-78 (2007).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Microaspiration bir hücre zarı negatif basınç uygulayarak ve iyi tanımlanmış bir baskıya tepki olarak membran deformabilite ölçüm yaparak hücre sertlik / deformabilitesi tahmin etmek için basit ve son derece tekrarlanabilir bir yöntem sağlar. İlk hücre bölünmesi 21 ve daha sonra kırmızı kan hücreleri 1 mekanik özelliklerine bakmak için mekanizmaları hakkında bilgi sağlamayı, deniz kestanesi yumurtalarının elastik özelliklerini karakterize etmek için Mitchison ve Swa...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog / Model Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Sutter pipet çektirmesi </td><td> Sutter Aletleri </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Microforge </td><td> Narishige </td><td> MF-830 </td><td></td></tr><tr><td> Ters Floresan Mikroskop </td><td> Zeiss </td><td> Axiovert 200M </td><td> Mikroskop tercihen 3D/deconvolution yetenekleri ile donatılmış olmalıdır. </td></tr><tr><td> Video kamera </td><td> Zeiss </td><td> AxioCam MRM </td><td></td></tr><tr><td> Image Acquisition sotware </td><td> Zeiss </td><td> AxioVision </td><td></td></tr><tr><td> Pnömatik Basınç Düşürücü </td><td> Biotek </td><td> DPM-1B </td><td> DPM1B Pnömatik Dönüştürücü Tester şimdi FLUKE bulunabilir. </td></tr><tr><td> Pipet cam </td&gt; <td> Richland </td><td> Özelleştirilmiş cam </td><td> Pipetler 1.2 iç çapı ve dış çapı 1,6 ile özelleştirilmiş. </td></tr><tr><td> DII Boya </td><td> Invitrogen </td><td> D282 </td><td> DMSO içinde erir </td></tr></tbody></table>

micropipette aspiration of substrate-attached cells to estimate cell stiffness

Çalışmalar artan sayıda bireysel hücrelerin biyomekanik özellikleri hücre proliferasyonu, farklılaşması, göç ve hücre-hücre etkileşimleri dahil çoklu hücresel fonksiyonları, önemli rol oynadığını göstermektedir. Hücresel biyomekanik iki anahtar parametreler hücresel şekil değiştirebilirlik veya sertlik ve güç kasılıp oluşturmak için hücrelerinin yeteneği vardır. Burada hücre yüzeyine bir cam mikropipet, Mikropipet Aspirasyon veya Microaspiration denir bir teknikle uygulanan negatif basınç yanıt olarak membran deformasyon derecesini ölçerek hücreye sertlik tahmin etmek için hızlı ve basit bir yöntem sunduk. Microaspiration sonra bir pnömatik basınç transdüktörüne bağlı ve bir yakın getirilir çok küçük bir uç (bir hücre ya da bir doku örneği boyutuna bağlı olarak, 2-50 mikron çap) ile bir mikropipet oluşturmak için kılcal bir cam çekerek gerçekleştirilir mikroskop altında bir hücre civarı. Nepipet ucu pnömatik basınç transdüseri hücre zarı üzerinde iyi tanımlanmış bir basınç oluşturarak pipet tatbik edilen bir hücre, bir negatif basınç adım dokunur. Basınç yanıt olarak, zar, pipet ve ilerici zar deformasyon ya da pipet zamanın bir fonksiyonu olarak ölçülür içine &quot;membran projeksiyon&quot; aspire edilir. Bu deneysel yaklaşım oluşturmanın temel ilkesi, bir tanımlanmış mekanik kuvvete yanıt olarak zar deformasyon derecesi zar sertliğinin bir fonksiyonu olmasıdır. Katı membran yavaş membran deformasyon oranı ve kısa kararlı durum aspirasyon length.The tekniği süspansiyon ve substrat bağlı, büyük organeller hem izole edilmiş hücreler üzerinde de yapılabilir ve lipozomlar vardır. Analiz farklı hücre popülasyonu veya deneysel koşulları için belirli bir basınç altında gerçekleştirilen azami membran deformasyonlar karşılaştırılarak gerçekleştirilir. Bir &quot;katılık katsayısı&quot; es olduğunuuygulanan basıncın bir işlevi olarak zar deformasyon uzunluğunu aspire çizim ile tahmin edilir. Dahası, veriler ayrıca hücrelerin en Young modülü (E), malzemenin sertliği karakterize etmek için, en yaygın parametre tahmin için analiz edilebilir. Bu ökaryotik hücrelerin plazma membranları membran lipid bilayeri alt membran hücre iskeleti tarafından ve membranın mekanik iskele oluşturan iskeleti ve deformabilitesi hakim olduğunu underlied bir iki bileşenli bir sistem olarak görülebilir dikkat etmek önemlidir hücresel Zarfın. Bu yaklaşım, bu nedenle, alt-zar iskelet biyomekanik özelliklerini tarama izin verir.

Watch this Scientific Journal Video about Micropipette Aspiration of Substrate-attached Cells to Estimate Cell Stiffness at JoVE.com

Micropipette Aspiration of Substrate-attached Cells to Estimate Cell Stiffness

İşte biz cep sertliği ölçmek için hızlı ve basit bir yöntem sunduk. Bu yaklaşımın genel prensip hücre yüzeyine bir mikropipet yoluyla uygulanan iyi tanımlanmış bir negatif basınca tepki olarak zar deformasyon ölçmektir. Bu yöntem substrat bağlı hücrelerin biyomekanik özelliklerini incelemek için güçlü bir araç sağlar.

Substrat bağlı Hücrelerinin Mikropipet Aspirasyon Hücre Rijitlik tahmin etmek

Growing number of studies show that biomechanical properties of individual cells play major roles in multiple cellular functions, including cell ...

micropipette-aspiration-substrate-attached-cells-to-estimate-cell

Research

JoVE Journal

Bioengineering

19.8K Görüntüleme.  University of Illinois. İşte biz cep sertliği ölçmek için hızlı ve basit bir yöntem sunduk. Bu yaklaşımın genel prensip hücre yüzeyine bir mikropipet yoluyla uygulanan iyi tanımlanmış bir negatif basınca tepki olarak zar deformasyon ölçmektir. Bu yöntem substrat bağlı hücrelerin biyomekanik özelliklerini incelemek için güçlü bir araç sağlar.

Video: Micropipette Aspiration of Substrate-attached Cells to Estimate Cell Stiffness

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Devirli Basınç Biyoreaktör Tasarım Ex vivo</emAort Kalp Vanalar> Eğitim

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Biyomühendislik

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture indefinitely and differentiated to any cell types in the body. Various types of biomaterials have also been used in stem cell cultures to provide a microenvironment mimicking the stem cell niche1-3. The latter is important for promoting cell-to-cell interaction, cell proliferation, and differentiation into specific lineages as well as tissue organization by providing a three-dimensional (3D) environment4 such as encapsulation. The principle of cell encapsulation involves entrapment of living cells within the confines of semi-permeable membranes in 3D cultures2. These membranes allow for the exchange of nutrients, oxygen and stimuli across the membranes, whereas antibodies and immune cells from the host that are larger than the capsule pore size are excluded5. Here, we present an approach to culture and differentiate hESC DA neurons in a 3D microenvironment using alginate microcapsules. We have modified the culture conditions2 to enhance the viability of encapsulated hESC. We have previously shown that the addition of p160-Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) inhibitor, Y-27632 and human fetal fibroblast-conditioned serum replacement medium (hFF-CM) to the 3D platform significantly enhanced the viability of encapsulated hESC in which the cells expressed definitive endoderm marker genes1. We have now used this 3D platform for the propagation of hESC and efficient differentiation to DA neurons. Protein and gene expression analyses after the final stage of DA neuronal differentiation showed an increased expression of tyrosine hydroxylase (TH), a marker for DA neurons, &gt;100 folds after 2 weeks. We hypothesized that our 3D platform using alginate microcapsules may be useful to study the proliferation and directed differentiation of hESC to various lineages. This 3D system also allows the separation of feeder cells from hESC during the process of differentiation and also has potential for immune-isolation during transplantation in the future.

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

We have optimized a microencapsulation technique as an effective 3D platform for propagation and differentiation of embryonic stem cells to endoderm and dopaminergic (DA) neurons. It also provides an opportunity for immune-isolation of cells from the host during transplantation. This platform can be adapted for other cell types.

Farklı soy İnsan Embriyonik Kök Hücreleri (hESC) Yayılması ve Farklılaşma için 3D Platformu olarak aljinat Mikrokapsül

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular functions and events1, 2. Their spatiotemporally dynamic nature has been revealed by visualization of their activity and localization in real time3. In order to gain deeper understanding of their roles in diverse cellular functions at the molecular level, the next step should be perturbation of protein activities at a precise subcellular location and timing. 
To achieve this goal, we have developed a method for light-induced, spatio-temporally controlled activation of small GTPases by combining two techniques: (1) rapamycin-induced FKBP-FRB heterodimerization and (2) a photo-caging method of rapamycin. With the use of rapamycin-mediated FKBP-FRB heterodimerization, we have developed a method for rapidly inducible activation or inactivation of small GTPases including Rac4, Cdc424, RhoA4 and Ras5, in which rapamycin induces translocation of FKBP-fused GTPases, or their activators, to the plasma membrane where FRB is anchored. For coupling with this heterodimerization system, we have also developed a photo-caging system of rapamycin analogs. A photo-caged compound is a small molecule whose activity is suppressed with a photocleavable protecting group known as a caging group. To suppress heterodimerization activity completely, we designed a caged rapamycin that is tethered to a macromolecule such that the resulting large complex cannot cross the plasma membrane, leading to virtually no background activity as a chemical dimerizer inside cells6. Figure 1 illustrates a scheme of our system. With the combination of these two systems, we locally recruited a Rac activator to the plasma membrane on a timescale of seconds and achieved light-induced Rac activation at the subcellular level6.

A method for spatio-temporal control of small GTPase activity by light is described. This method is based on rapamycin-induced FKBP-FRB heterodimerization and photo-caging systems. Optimization of light-irradiation enables the spatio-temporally controlled activation of small GTPases at the subcellular level.

Yaşayan hücreler içinde Subselüler Düzeyinde ve Seconds Zaman ölçeği üzerinde Küçük GTPaz Faaliyet uzay-zamansal Manipülasyon

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to high levels of NK cells after 4 weeks culture and can undergo further 2-log expansion with artificial antigen presenting cells. hESC- and iPSC-derived NK cells developed in this system have a mature phenotype and function. The production of large numbers of genetically modifiable NK cells is applicable for both basic mechanistic as well as anti-tumor studies. Expression of firefly luciferase in hESC-derived NK cells allows a non-invasive approach to follow NK cell engraftment, distribution, and function. We also describe a dual-imaging scheme that allows separate monitoring of two different cell populations to more distinctly characterize their interactions in vivo. This method of derivation, expansion, and dual in vivo imaging provides a reliable approach for producing NK cells and their evaluation which is necessary to improve current NK cell adoptive therapies.

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

This protocol describes the development, expansion, and in vivo imaging of NK cells derived from hESCs and iPSCs.

Geliştirme, Genişleme ve<em&gt; In vivo</em&gt; İnsan Embriyonik Kök Hücreleri (hESC) den İnsan NK Hücrelerinin İzleme ve ve Bağlı Pluripotent Kök Hücre (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells similar to pericyte-derived mesoangioblasts (iPSC-derived mesoangioblast-like stem/progenitor cells: IDEMs) can be established from iPSCs generated from patients affected by different forms of muscular dystrophy. Patient-specific IDEMs can be genetically corrected with different strategies (e.g. lentiviral vectors, human artificial chromosomes) and enhanced in their myogenic differentiation potential upon overexpression of the myogenesis regulator MyoD. This myogenic potential is then assessed in vitro with specific differentiation assays and analyzed by immunofluorescence. The regenerative potential of IDEMs is further evaluated in vivo, upon intramuscular and intra-arterial transplantation in two representative mouse models displaying acute and chronic muscle regeneration. The contribution of IDEMs to the host skeletal muscle is then confirmed by different functional tests in transplanted mice. In particular, the amelioration of the motor capacity of the animals is studied with treadmill tests. Cell engraftment and differentiation are then assessed by a number of histological and immunofluorescence assays on transplanted muscles. Overall, this paper describes the assays and tools currently utilized to evaluate the differentiation capacity of IDEMs, focusing on the transplantation methods and subsequent outcome measures to analyze the efficacy of cell transplantation.

Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived myogenic progenitors are promising candidates for cell therapy strategies to treat muscular dystrophies. This protocol describes transplantation and functional measurements required to evaluate the engraftment and differentiation of iPSC-derived mesoangioblasts (a type of muscle progenitors) in mouse models of acute and chronic muscle regeneration.

Kas Yenilenmesinin Fare Modellerinde İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücre türevi Mezoangioblast benzeri Miyojenik Progenitörlerin Nakli

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening based on cells in such environments have therefore serious limitations: cell organelles show extreme phenotypes, cell morphologies and sizes are heterogeneous and/or specific cell organelles cannot be properly visualized. In addition, cells in vivo are located in a 3D environment; in this situation, cells show different phenotypes mainly because of their interaction with the surrounding extracellular matrix of the tissue. In order to standardize and generate order of single cells in a physiologically-relevant 3D environment for cell-based assays, we report here the microfabrication and applications of a device for in vitro 3D cell culture. This device consists of a 2D array of microcavities (typically 105 cavities/cm2), each filled with single cells or embryos. Cell position, shape, polarity and internal cell organization become then normalized showing a 3D architecture. We used replica molding to pattern an array of microcavities, &#8216;eggcups&#8217;, onto a thin polydimethylsiloxane (PDMS) layer adhered on a coverslip. Cavities were covered with fibronectin to facilitate adhesion. Cells were inserted by centrifugation. Filling percentage was optimized for each system allowing up to 80%. Cells and embryos viability was confirmed. We applied this methodology for the visualization of cellular organelles, such as nucleus and Golgi apparatus, and to study active processes, such as the closure of the cytokinetic ring during cell mitosis. This device allowed the identification of new features, such as periodic accumulations and inhomogeneities of myosin and actin during the cytokinetic ring closure and compacted phenotypes for Golgi and nucleus alignment. We characterized the method for mammalian cells, fission yeast, budding yeast, C. elegans with specific adaptation in each case. Finally, the characteristics of this device make it particularly interesting for drug screening assays and personalized medicine.

We report a device and a new method to study cells and embryos. Single cells are precisely ordered in microcavity arrays. Their 3D confinement is a step towards 3D environments encountered in physiological conditions and allows organelle orientation. By controlling cell shape, this setup minimizes variability reported in standard assays.

Tek Hücreleri ve 3D Sınırlaması Tek Embriyolar Sipariş: Yüksek İçerik Tarama için Yeni Bir Cihaz

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Simple Polyacrylamide-based Multiwell Stiffness Assay for the Study of Stiffness-dependent Cell Responses

Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a matrix that is elastic and much softer (0.1 &#8211; 100 kPa). Since such stiffness mismatch greatly affects cell responses, there is a strong interest in developing hydrogel materials that span a wide range of stiffness to serve as cell substrates. Polyacrylamide gels, which are inexpensive and cover the stiffness range of all soft tissues in the body, are the hydrogel of choice for many research groups. However, polyacrylamide gel preparation is lengthy, tedious, and only suitable for small batches. Here, we describe an assay which by utilizing a permanent flexible plastic film as a structural support for the gels, enables the preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format. The technique is faster, more efficient, and less costly than current methods and permits the preparation of gels of custom sizes not otherwise available. As it doesn&#8217;t require any specialized equipment, the method could be easily adopted by any research laboratory and would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.

Here, a method that enables quick, efficient, and inexpensive preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format is described. The method does not require any specialized equipment and could be easily adopted by any research laboratory. It would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.

Basit Poliakrilamid-tabanlı Sertlik bağımlı Hücre Yanıtların Çalışmaları multiwell Sertlik Deneyi

Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a ...

A Method to Estimate Cadaveric Femur Cortical Strains During Fracture Testing Using Digital Image Correlation

This protocol describes the method using digital image correlation to estimate cortical strain from high speed video images of the cadaveric femoral surface obtained from mechanical testing. This optical method requires a texture of many contrasting fiduciary marks on a solid white background for accurate tracking of surface deformation as loading is applied to the specimen. Immediately prior to testing, the surface of interest in the camera view is painted with a water-based white primer and allowed to dry for several minutes. Then, a black paint is speckled carefully over the white background with special consideration for the even size and shape of the droplets. Illumination is carefully designed and set such that there is optimal contrast of these marks while minimizing reflections through the use of filters. Images were obtained through high speed video capture at up to 12,000 frames/s. The key images prior to and including the fracture event are extracted and deformations are estimated between successive frames in carefully sized interrogation windows over a specified region of interest. These deformations are then used to compute surface strain temporally during the fracture test. The strain data is very useful for identifying fracture initiation within the femur, and for eventual validation of proximal femur fracture strength models derived from Quantitative Computed Tomography-based Finite Element Analysis (QCT/FEA).

In this protocol, the femur surface strains are estimated during fracture testing using the digital image correlation technique. The novelty of the method involves application of a high-contrast stochastic speckle pattern on the femur surface, carefully specified illumination, high speed video capture, and digital image correlation analysis for strain calculations.

Kadavra Femur kortikal suşları kullanarak dijital görüntü korelasyon test kırık sırasında tahmin etmek için bir yöntem

This protocol describes the method using digital image correlation to estimate cortical strain from high speed video images of the cadaveric femoral ...

Human Pluripotent Stem Cell Culture on Polyvinyl Alcohol-Co-Itaconic Acid Hydrogels with Varying Stiffness Under Xeno-Free Conditions

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by several researchers. However, most of these investigators have used polyacrylamide hydrogels for stem cell culture in their studies. Therefore, their results are controversial because those results might originate from the specific characteristics of the polyacrylamide and not from the physical cue (stiffness) of the biomaterials. Here, we describe a protocol for preparing hydrogels, which are not based on polyacrylamide, where various stem, cells including human embryonic stem (ES) cells and human induced pluripotent stem (iPS) cells, can be cultured. Hydrogels with varying stiffness were prepared from bioinert polyvinyl alcohol-co-itaconic acid (P-IA), with stiffness controlled by crosslinking degree by changing crosslinking time. The P-IA hydrogels grafted with and without oligopeptides derived from extracellular matrix were investigated as a future platform for stem cell culture and differentiation. The culture and passage of amniotic fluid stem cells, adipose-derived stem cells, human ES cells, and human iPS cells is described in detail here. The oligopeptide P-IA hydrogels showed superior performances, which were induced by their stiffness properties. This protocol reports the synthesis of the biomaterial, their surface manipulation, along with controlling the stiffness properties and finally, their impact on stem cell fate using xeno-free culture conditions. Based on recent studies, such modified substrates can act as future platforms to support and direct the fate of various stem cells line to different linkages; and further, regenerate and restore the functions of the lost organ or tissue.

A protocol is presented to prepare polyvinyl alcohol-co-itaconic acid hydrogels with varying stiffness, which were grafted with and without oligopeptides, to investigate the effect of the stiffness of biomaterials on the differentiation and proliferation of stem cells. The stiffness of the hydrogels was controlled by the crosslinking time.

İnsan Pluripotent kök hücre kültürü ile Xeno-Alerjik koşullar altında değişik sertlik polivinil alkol-Co-İtakonik asit Hydrogels

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by ...

Stiffness Measurement of Soft Silicone Substrates for Mechanobiology Studies Using a Widefield Fluorescence Microscope

Soft tissues in the human body typically have stiffness in the kilopascal (kPa) range. Accordingly, silicone and hydrogel flexible substrates have been proven to be useful substrates for culturing cells in a physical microenvironment that partially mimics in vivo conditions. Here, we present a simple protocol for characterizing the Young's moduli of isotropic linear elastic substrates typically used for mechanobiology studies. The protocol consists of preparing a soft silicone substrate on a Petri dish or stiff silicone, coating the top surface of the silicone substrate with fluorescent beads, using a millimeter-scale sphere to indent the top surface (by gravity), imaging the fluorescent beads on the indented silicone surface using a fluorescence microscope, and analyzing the resultant images to calculate the Young's modulus of the silicone substrate. Coupling the substrate's top surface with a moduli extracellular matrix protein (in addition to the fluorescent beads) allows the silicone substrate to be readily used for cell plating and subsequent studies using traction force microscopy experiments. The use of stiff silicone, instead of a Petri dish, as the base of the soft silicone, enables the use of mechanobiology studies involving external stretch. A specific advantage of this protocol is that a widefield fluorescence microscope, which is commonly available in many labs, is the major equipment necessary for this procedure. We demonstrate this protocol by measuring the Young's modulus of soft silicone substrates of different elastic moduli.

Substrates with stiffness in the kilopascal-range are useful to study the response of cells to physiologically relevant micro-environment stiffness. Using just a widefield fluorescence microscope, the Young's modulus of soft silicone gels can be determined using an indentation with a suitable sphere.

Yumuşak silikon yüzeylerde sertlik ölçüm Widefield floresan mikroskop kullanarak Mechanobiology çalışmaları için

Soft tissues in the human body typically have stiffness in the kilopascal (kPa) range. Accordingly, silicone and hydrogel flexible substrates have been ...