1. 유리 Micropipettes를 당기는 장비 : Micropipette 풀러, Microforge. 유리 : Boroscillicate 유리 모세관 (~ 1.5 mm 외경 ~ 1.4 mm 내경). <ol><li> Micropipettes는 전기 생리학 녹음을 위해 유리 microelectrodes를 준비하는 데 사용되는 것과 동일한 기본 접근 방법을 사용하여 뽑아 있습니다. 간단히, 모세관 유리는 중간에 가열되어 유리가 녹기 시작할 때 모세의 두 절반은 두 명의 micropipettes을 생성 당겨 있습니다. 여러 상업 pullers는 풀의 속도 및 기타 매개 변수를 변경할 수있는 여러 프로그램 옵션을 제공합니다 높은 정교한 수평 pullers에 두 피펫를 분열하기 위해 중력을 이용해서 비교적 간단 수직 pullers 이르기까지이 과정을 수행 할 수 있습니다. pullers의 두 종류의 실험에 사용 하였다. </li><li> 요구 사항S는 피펫 팁의 형상에 대한 이러한 실험에 사용 된 피펫의 팁은 일반적으로 6-2 사이 μm 세포의 크기에 따라 외부 직경을 다양합니다. 또 다른 중요한 매개 변수는, 끝의 모양입니다해야 대략 원통형 관 (그림 1 참조). 이것은 풀의 매개 변수를 최적화하고 원하는 형태를 얻을 때까지 현미경 팁의 모양을 확인하여 달성 될 수있다. 피펫 생크의 최적 길이는 예상 변형의 양에 따라 달라집니다 변형이 작은 &lt;10 μm 경우,이 피펫의 실린더와 같은 부분이 짧은 (크기의 순서와 동일), 큰에도 상대적 것을 충분 변형이 적절하게 조정합니다. 일반적으로, &quot;풀&quot;에 열 및 / 또는 증가를 늘리면 끝의 직경을 감소시킵니다. &quot;풀&quot;의 증가는 더 이상 테이퍼가있는 팁을 생성합니다. 우리의 실험에서, 셔터 P-97 수평 피펫 풀러를 사용하여 프로그램이었습니다, 끌어 오기 22, 속도 22 시간 200, 압력 500 473의 열 다음 매개 변수를 최적화. 그것은 아주 긴 칼을 당겨하고 파괴하고 연마하여 원통형 팁을 생성 할 수도 있습니다. 피펫의 다른 유형을 준비하는 방법에 대한 자세한 지침은 셔터 설명서에 부여됩니다. </li><li> Microforge : 그것은 또한 플라즈마 막에 좋은 실을 만드는 부드러운 유리 표면을 생성 할 수있는 피펫의 팁을 발사 - 폴란드어하는 것이 좋습니다. 이것은 microforge를 사용하여 두 번째의 아주 일부에 대한 온수 유리 공의 주변에 피펫의 팁을 가져 통해 이루어집니다. 비슷한 기술은 정기적으로 electrophysiological 레코딩을위한 microelectrodes을 준비하는 데 사용됩니다. </li><li> Micropipette를 채운 : Micropipettes 이러한 PBS 또는 비 형광 성장 미디어와 같은 생리 생리 식염수, 가득해야합니다. 중요한 솔루션은 휴대 가상 할 수 있도록 그 30 %의 혈청 보충해야피펫으로 원활하게 이동 brane. 두 접근 방식은 피펫의 끝에서 기포를 제거하는 데 사용할 수 있습니다 :은 (i) 피펫의 팁은 액체가 피펫을 backfilling 다음 모세관 힘에 의해 팁을 작성 할 수 있도록 먼저 솔루션에 몰두 할 수 있습니다 다른 끝에서 또는 (ii) 전체 피펫은 부드럽게 끝에서 거품을 제거하기 위해 피펫의 칼에 활용하여 백 엔드에서 작성하실 수 있습니다. </li><li> 참고 : 피펫은 실험 당일 준비해야합니다. </li></ol> 2. 셀의 준비 <ol><li> 셀을 퍼 뜨리고 : Microaspiration이 중 정지 유지 또는 기판에 연결된 하나의 셀에 수행됩니다. 정지 세포를 대기음하기 위해 세포들은 기판에서 채취 오른쪽 실험 전에 역 현미경에 장착되어있는 얕은 세로 챔버에 pipetted 있습니다. 기판에 연결된 세포, 세포를 대기음하려면작은 커버 - 전표에 놓는 아르도 실험 전에 microaspiration 챔버에 배치 할 수 있습니다 (직경 ~ 10 ㎜). 얕은 종 방향 챔버를 사용하는 근거는 micropipette 가능한 수평에 가까이 아주 얕은 각도에서 셀을 접근 할 수 있도록하는 것입니다. 이것은 (그림 2 참조) 초점의 단일 비행기 시각화 될 수있는 micropipette으로 당겨 멤브레인을 허용하기위한 것입니다. </li><li> 세포막 시각화 : 피펫에 막 투영을 관찰하기를, 휴대 멤브레인는 표준 얼룩 프로토콜을 사용하여 같은 diI 같은 lipophilic 형광 염료, 물들입니다. <ol type="i"><li> 따뜻한 PBS 솔루션입니다. </li><li> 예열 PBS 솔루션으로 작업 농도 (5 μM)에 재고 diI을 희석. </li><li> 염료 집계을 깨고 5 분에 Sonicate. </li><li> 5 분을 위해 스핀 다운하고 표면에 뜨는보십시오. </li><li> PBS 3 회, 5 분 각 셀을 씻으십시오. </li><li> 그래서 염색으로 세포를 배양37 ° C 배양기에서 30 분에 lution. </li><li> 5 분 각각에 대한 PBS 3 회와 세포를 씻으십시오. </li></ol></li><li> 참고 : 또한 피펫으로 막과 함께 당겨되고있는 서브 막 세포 골격을 시각화와 멤브레인의 diI의 착색을 대체 할 수 있습니다. 이 세포 골격을 perturbing하면 셀의 biomechanical 속성을 변경할 수 그러나, 고려되어야합니다. 또한, 기판 첨부 된 셀과 microaspiration 실험을 수행 할 때, 그것은 세포의 초점 평면에 각도로 위치 피펫으로 막 투영의 길이를 추정하기 위해 3D 이미지를 사용하는 것이 좋습니다. </li></ol> 3. Microaspiration 및 이미지 수집 장비 : 역 형광 현미경, 바람직하게는 3D deconvolution 기능 (objectiv의 컴퓨터 제어 Z-축 운동과 Zeiss Axiovert 200M로ES 또는 이에 상응하는 금액), manipulators, 컴퓨터 (AxioCam MRM 또는 이에 상응하는 금액), 압력 변환기 (BioTek 또는 이에 상응하는 금액), 진동이없는 역 (TMD 또는 이에 상응하는 금액), Micromanipulator (Narishige, 셔터, Burleigh 또는 동급에 연결 videocamera ), 기계 유압 또는 압전 수 있습니다. 그렇게 microaspiration 이러한 적혈구의 1,2 또는 호중구 3 등 핵 4 인조 liposomes 5와 절연 세포 소기관과 같은 정지 세포의 강성을 추정하기 위해 3D 기능이없는 현미경을 사용하여 수행 할 수 있습니다 강조하는 것도 중요합니다. 이미지 수집 소프트웨어 : Zeiss AxioVision 또는 유사한. <ol><li> 위에서 설명한대로 역 형광 현미경에, microaspiration 챔버에 세포를 탑재합니다. 실험을 위해 셀을 선택 셀을 위치와 시야의 중심에 배치합니다. 이 perfo 중요합니다특히 기판에 연결된 세포와 실험을위한 진동없는 환경에서 RM이 실험 일반적으로 벤치 및 정기적 인 테이블에서 발생하는 분 진동은 완전히 인감의 작성을 손상에 micropipette 또는 결과의 끝을 깰 가능성이 있기 때문에 결과의 분석됩니다 스큐 끝의 위치에 중대한 변화. </li><li> 꼭 피팅을위한 피펫 소유자의 connecter으로 조정 직경 유연한 튜브하여 전력 변환기에 연결 피펫 홀더에 PBS / 미디어 w / 혈청 솔루션으로 가득한 micropipette를 놓습니다. 각 실험의 시작 부분에서 피펫의 압력이 대기 압력 equilibrated입니다. 피펫은 마이크론 범위에서 피펫 운동의 미세 제어를 할 수있는 micromanipulator에 장착된다. 챔버의 바닥에 얕은 각도로 피펫을 배치하고 시야의 중심에 피펫의 팁을 가져. 일피펫의 전자 생크, 멤브레인가 흡입되는에 피펫 팁의 원통형 부분은 가능한 가장 얕은 각도 (10-15 °)에서 (1) 위치 피펫으로 (2)에 의해 초점 평면에 수평으로 정렬되어 있습니다 챔버의 바닥에 대한 피펫의 칼을 flexing. 생크가 매우 얇은이기 때문에 그림 1에 개략적으로 도시 된 바와 같이 그것은 세포에 접근하는 동안 챔버의 하단에 밀어 정도로 유연하다. 천천히 셀에 대해 초점 비행기 근처까지 코스 속이는를 사용하여 단일 셀의 옆에 micropipette 내려 보내. 피펫의 끝이 부드럽게 막에 닿는 때까지, 좋은 속이는를 사용하면 셀의 가장자리에 micropipette 이동합니다. 피펫의 위치를​​ 관찰 한 이미지를보세요. 피펫의 전체 끝이 세포 표면 전체에 접촉하고 연락이 안정되면 좋은 바다 표범이 만들어집니다. 더 강한 객관적인 기준은 봉인 실이 얼마나 좋은 약하지만,이 없습니다시각적 시험 ept. </li><li> 변환기를 사용하여 부정적인 압력의 단계를 적용하고 막 프로젝션이 안정 될 때까지 그것을 유지하고 있습니다. 피펫으로 멤브레인을 대기음에 필요한 압력의 양이 세포 유형과 특정 실험 조건에 따라 다릅니다. -2로 - 15mm HG 사이의 범위에 압력을 적용 할 때 우리의 실험에서는 초기 변형은 일반적으로 관찰된다. 이 특정 길이, 일반적으로 2-3 분 소요하는 과정에서 안정화 될 때까지 압력이 적용되면, 멤브레인은 점차 피펫으로 변형된다. 이 기간 동안 막 변형의 이미지는 피펫으로 당겨 멤브레인의 진행을 추적 할 때마다 30 초를 획득합니다. </li><li> 2~5mm HG 단계에서 다음 단계로 압력을 높이고 막 투영이 실험이 중지되는 시점에서 피펫으로 셀 이동에서 분리 될 때까지 모든 절차를 반복합니다. </li></ol><p클래스 = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. 분석 막 변형의 정도를 수량화하기 위해 흡입 길이 (L)은 피펫의 끝에서 막 투영의 둘레의 정점에 측정됩니다. 그것은 큰 피펫은 압력의 동일한 수준에있는 세포막에 대한 자세한 힘을 적용 할 그러나, 유의하는 것이 중요합니다. 피펫의 직경 사이의 다양성을 위해 계정에 따라서, 흡입 길이는 각 실험 측정 피펫 직경 (D)에 대한 표준화되어 있습니다. 데이터는 더로 이전 연구 6,7에 설명 된 내피 세포의 표준 선형 점탄성 반 공간 모델을 사용하여 분석 할 수 있습니다. 특히, 세포의 탄성 계수는​​ 식을 사용하여 추정되었다 : <img alt="수식 1" src="/files/ftp_upload/3886/3886eq1.jpg" /> E는 영의 계수이고,이 내부입니다피펫 반경이 Δp는 압력 차이며, L은 해당 흡입 길이이며, φ (η)은 기능이 아니라 Theret 외 7에서 설명 된 힘 모델을 사용하여 계산 벽입니다. 그것은 여러 모델 셀 세포가 구형 모양을 형성 그 가정 등방성과 균일 한 재료 특성 및 액체 방울 모델과 변형 영역이 있다고 가정 유한 요소 모델을 포함하여 microaspiration 데이터를 분석하는 데 사용 된 점에 유의하는 것이 중요합니다 지속적으로 변형, 등 여러 뛰어난 리뷰에 설명 된 릴리스에 따라 복구 할 수 있습니다 : 8-10. Microaspiration는 또한 휴대 점탄성 특성, 세포 및 조직 biomechanics (자세한 내용은 위에 나열된 리뷰를 참조) 다른 구조 요소의 대뇌 피질의 긴장과 공헌 등의 세포와 조직의 다른 biomechanical 매개 변수를 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 5. 대표하는결과 이전 연구에서, micropipette의 열망은 liposomes 5 일 또는 기판 2,11-13에 부착되지 않은 세포에서 중 수행되었다. 우리의 연구에서, 그러나, 세포는 일반적으로 세포가 14-16를 분리 할 때 발생할 가능성이있는 cytoskeletal 구조의 변화를 방지하기 위해 기판에 부착 유지됩니다. 기판에 연결된 셀에 대한 microaspiration 기술의 사용을 확인하기 위해, 우리는 예상과 같이,이 같은 이러한 접근 방식에 의해 추정 소 대동맥 내피 세포 (BAECs)의 세포 강성의 감소에 F-고를 결과의 장애가 발생했습니다. 그림 3 쇼 여부를 테스트 이 참 경우가 있습니다. 특히, 그림 3A는 micropipette를 통해 적용 부정적인 압력에 대응하여 점진적으로 변형을 겪고 내피 멤브레인의 형광 이미지의 전형적인 시리즈를 보여줍니다. 예상대로, 멤브레인은 점차 피펫과 aspirat에 흡입되어에드 길이는 적용 압력의 함수로 증가한다. F-고를의 중단이 크게 모든 압력 조건 (그림 3B) 14 세 미만 예측의 흡입 길이를 증가하는 변형 쇼의 시간 코스. 이 방법을 사용하여 우리는 콜레스테롤 강화가 더 효과가 14 없었다 반면에 세포 멤브레인은 콜레스테롤 고갈 될 때 세포 강성이 증가 발견했다. 그림 4에서 최대 흡인 길이에 도달 한 후 콜레스테롤 강화 셀, 제어 셀 및 콜레스테롤 고갈 세포를 보여줍니다 -15 mm HG (4A). 예측은 일반적으로-10mmHg에서 개발하기 시작하고 막 변형의 시간 코스는 -10, -15 및 -20 mm HG (4B)의 부정적인 압력에 대한 측정 될 수 있습니다. - 25mmHg 이상 압력의 적용은 별도의 소포를 형성 흡입 투영의 부대있었습니다. 막 분리의 결과 압력 수준은 simila했습니다다른 콜레스테롤 조건에서 연구. 이전 연구 막 지질 bilayers에 막 콜레스테롤의 증가는 막 5,17의 강성을 증가 것으로 나타났다 때문 관찰 매우 예기치했다. 우리 더 연구가 원자 힘 현미경 18,19 및 강제 견인 현미경 20 등 여러 가지 독립적 인 방법을 사용하여 이러한 관찰을 확인했다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3886/3886fig1.jpg" /> 1 그림. 녹음 피펫의 개략적 인 측면보기는. 피펫은 팁 (사이드 뷰)에 원통형 칼을 생성하기 위해 당겨 있습니다. Micropipette 매개 변수 : D = 2A = 내부 직경 ED = 2B = 외부 직경. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3886/3886fig2.jpg" /> 그림 2. Micropipette은 기판에 연결된 셀을 접근 (A) 도식 쪽보기,. micropipette s의 (B) 밝은 명암 이미지행크는 흡인 실험에 사용되는 일반적으로 모양의 셀을 터치, DiIC 18라는 동일한 세포의 (C) 형광 이미지입니다. micropipette는 여전히 존재하지만, (14에서) 보이지 않는 것입니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3886/3886fig3.jpg" /> 그림 3. microaspiration를 사용하여 기판에 연결된 셀에 셀 강성을 측정의 유효성을 검사. A : 제어 조건 및 latrunculin에 노출 후 BAECs의 진보적 인 막 변형의 이미지가 형광을하지 않기 때문에 피펫은 이미지에 보이지 않는 수 있습니다.. 세포는 같은 rhodamine-phalloidin 형광에 의해 측정 극적 F-고를의 양을 감소 10 분, (표시되지 않음)에 대해 2 μM latrunculin에 노출 된 셀 모양에 아무런 상당한 효과가 없습니다. latrunculin - 처리 셀에 흡입 투영의 중간에 막의 숱이 있지만 투영 여전히 C에 부착되는이있다ells. B. L은 막 투영 및 D의 길이를 흡입되어 막 변형의 시간 코스에 latrunculin의 효과는 제어 세포에 대한 피펫의 직경 (N = 14), 2 μM의 latrunculin에 노출 세포입니다 10 분에 (N = 5). 세포는 -10 mm HG (다이아몬드), -15 mm HG (광장) 및 -20 mm HG (삼각형)로 흡입했다. (14 일부터). <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3886/3886fig4.jpg" /> 4 그림. BAECs의 막 변형에 대한 세포 콜레스테롤 수준의 효과. . 콜레스테롤 강화, 콜레스테롤 소모 및 제어 셀 (제어 세포의 막 변형의 전형적인 이미지는 MβCD에 노출 된 : 셀에서 무료 콜레스테롤의 수준에 아무런 영향을 미치지 않았다 1시 1분 비율 MβCD-콜레스테롤 혼합 (참조 ) 삽입. 표시된 이미지가 -15 mm HG에서 최대 변형을 도시한다. 화살표는 흡입 투영의 위치를​​ 나타냅니다. 바는 30 μm이다. B는. 세 실험 세포 인구를위한 흡입 길이의 평균 시간 코스. C. 최대 흡입 길이는 적용 압력의 함수로 꾸몄다. 소진 셀의 최대 정규화 된 길이는 압력 -15 mm HG와 -20 mm HG (P &lt;0.05)에 대한 제어 세포에 비해 훨씬 낮았다. (14 일부터).

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J., Levitan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OxLDL+increases+endothelial+stiffness,+force+generation,+and+network+formation.">OxLDL increases endothelial stiffness, force generation, and network formation.</a> J. Lipid Res. 47, 715-723 (2006).</li><li>Ohashi, T., Ishii, Y., Ishikawa, Y., Matsumoto, T., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+and+numerical+analyses+of+local+mechanical+properties+measured+by+atomic+force+microscopy+for+sheared+endothelial+cells.">Experimental and numerical analyses of local mechanical properties measured by atomic force microscopy for sheared endothelial cells.</a> Biomed. Mater. Eng. 12, 319-327 (2002).</li><li>Solon, J., Levental, I., Sengupta, K., Georges, P. C., Janmey, P. 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C., Agah, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+cancer+progression+on+the+viscoelasticity+of+ovarian+cell+cytoskeleton+structures.">The effects of cancer progression on the viscoelasticity of ovarian cell cytoskeleton structures.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. , (2011).</li><li>Kole, T. P., Tseng, Y., Huang, L., Katz, J. L., Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+kinase+regulates+the+intracellular+micromechanical+response+of+adherent+cells+to+rho+activation.">Rho kinase regulates the intracellular micromechanical response of adherent cells to rho activation.</a> Mol. Biol. Cell. 15, 3475-3484 (2004).</li><li>Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+GTPases+and+the+Actin+Cytoskeleton.">Rho GTPases and the Actin Cytoskeleton.</a> Science. 279, 509-514 (1998).</li><li>Okajima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+for+the+Examination+of+Single+Cell+Rheology.+In.">Atomic Force Microscopy for the Examination of Single Cell Rheology. In.</a> Methods Mol. Biol. 736, 303-329 (2011).</li><li>Wang, N., Butler, J. P., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+across+the+cell+surface+and+through+the+cytoskeleton.">Mechanotransduction across the cell surface and through the cytoskeleton.</a> Science. 260, 1124-1127 (1993).</li><li>Fabry, B., Maksym, G. N., Butler, J. P., Glogauer, M., Navajas, D., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+the+microrheology+of+living+cells.">Scaling the microrheology of living cells.</a> Physical Review Letters. 87, 148102 (2001).</li><li>Park, C. Y., Tambe, D., Alencar, A. M., Trepat, X., Zhou, E. H., Millet, E., Butler, J. P., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+cytoskeletal+prestress.">Mapping the cytoskeletal prestress.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 298, C1245-C1252 (2010).</li><li>Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+of+migrating+normal+and+H-ras+transformed+3T3+fibroblasts.">Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts.</a> Biophys. J. 80, 1744-1757 (2001).</li><li>Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle-tracking+microrheology+of+living+cells:+principles+and+applications.">Particle-tracking microrheology of living cells: principles and applications.</a> Annu. Rev. Biophys. 38, 301-326 (2009).</li><li>Shin, D., Athanasiou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoindentation+for+obtaining+cell+biomechanical+properties.">Cytoindentation for obtaining cell biomechanical properties.</a> J. Orthop. Res. 17, 880-890 (1999).</li><li>Ou-Yang, H. D., Wei, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+fluids:+probing+mechanical+properties+of+biological+systems+with+optical+tweezers.">Complex fluids: probing mechanical properties of biological systems with optical tweezers.</a> Annu. Rev. Phys. Chem. 61, 421-440 (2010).</li><li>Hosu, B. G., Sun, M., Marga, F., Grandbois, M., Forgacs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+membrane+tethers+revisited+using+magnetic+tweezers.">Eukaryotic membrane tethers revisited using magnetic tweezers.</a> Phys. Biol. 4, 67-78 (2007).</li></ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

Microaspiration는 세포막에 제외 압력을 적용하고 잘 정의 된 압력에 대한 응답으로 막 deformability을 측정하여 세포 강성 / deformability을 추정 할 수있는 간단하고 높은 재현 방법을 제공합니다. 그것은 첫째 세포 분열 21 다음 적혈구 1 기계적 성질을 살펴 보의 메커니즘에 통찰력을 제공하기 위해 바다 성게 알의 탄성 속성을 특성화 Mitchison와 스완 (1954)에 의해 개발되었습니다. 이 방법...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 / 모델 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 셔터 피펫 풀러 </td><td> 셔터 악기 </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Microforge </td><td> Narishige </td><td> MF-830 </td><td></td></tr><tr><td> 역 형광 현미경 </td><td> Zeiss </td><td> Axiovert 200M </td><td> 현미경은 바람직 3D/deconvolution 기능을 갖추고 있어야합니다. </td></tr><tr><td> Videocamera </td><td> Zeiss </td><td> AxioCam MRM </td><td></td></tr><tr><td> 이미지 수집 sotware </td><td> Zeiss </td><td> AxioVision </td><td></td></tr><tr><td> 공압 압력 변환기 </td><td> BioTek </td><td> DPM-1B </td><td> DPM1B 공압 변환기 테스터는 이제 우연으로 볼 수 있습니다. </td></tr><tr><td> 피펫 유리 </tD&gt; <td> 리치 랜드 </td><td> 사용자 정의 유리 </td><td> 피펫은 1.2 내경 1.6 외경으로 정의했다. </td></tr><tr><td> DiI 염료 </td><td> Invitrogen </td><td> D282 </td><td> DMSO에 잘 녹여 </td></tr></tbody></table>

micropipette aspiration of substrate-attached cells to estimate cell stiffness

연구 증가는 개별 세포의 biomechanical 속성이 세포 증식, 분화, 마이그레이션 및 세포 세포 상호 작용 등 여러 가지 세포 기능에 중요한 역할을 것으로 나타났습니다. 세포 biomechanics의 두 가지 주요 매개 변수 세포 deformability 또는 강성과 힘을 계약 생성하는 세포의 능력입니다. 여기 우리는 세포 표면에 유리 micropipette, Micropipette의 흡인 또는 Microaspiration라고 기술로 적용 부정적인 압력에 대한 응답으로 막 변형의 정도를 측정하여 세포 강성을 추정 할 수있는 빠르고 간단한 방법을 설명합니다. Microaspiration는 다음 공기 압력 변환기에 연결 가까이로 이동하는 아주 작은 팁 (셀 또는 조직 샘플의 크기에 따라 2-50 μm의 직경)로 micropipette을 만들 모세관 잔을​​ 당겨 수행 현미경으로 세포의 주변. 때피펫의 팁은 공기 압력 변환기는 세포막에 잘 정의 압력을 생성하여 피펫에 적용되는 셀, 부정적인 압력의 단계를 감동. 압력에 대응하여, 멤브레인은 피펫 및 프로그레시브 막 변형 또는 피펫은 시간의 함수로 측정됩니다에 &quot;막 투사&quot;로 흡입된다. 이 실험 방법의 기본 원리는 정의 된 기계 힘에 대한 응답으로 막 변형의 정도가 막 강성의 기능이라는 것입니다. 엄격한 멤브레인은 느린 막 변형의 속도와 짧은 정상 상태 흡인 length.The 기술은 정지하고 기판에 연결된, 큰 세포 소기관의 두 절연 셀에 수행 할 수 있으며, liposomes입니다. 분석은 다른 세포 집단 또는 실험 조건에 주어진 압력 하에서 달성 최대 막 변형을 비교하여 수행됩니다. A &quot;강성 계수는​​&quot;에스입니다적용 압력의 함수로 막 변형의 흡입 길이를 음모에 의해 timated. 또한, 데이터는 더욱 세포의 영 계수 (E), 재료의 강성을 특징하는 가장 일반적인 매개 변수를 추정하기 위해 분석 할 수 있습니다. 이 진핵 세포의 플라즈마 멤브레인은 막 지질 이중층은 하위 막 세포 골격으로하고 멤브레인의 기계적 비계를 구성 세포 골격이며, deformability을 지배 해당 underlied되어있는 이중 구성 요소 시스템으로 볼 수 있습니다하는 것이 중요합니다 세포 봉투. 이 방법은, 따라서, 서브 막 세포 골격의 biomechanical 속성을 탐색 할 수 있습니다.

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Micropipette Aspiration of Substrate-attached Cells to Estimate Cell Stiffness

여기 셀 강성을 측정 할 수있는 빠르고 간단한 방법을 설명합니다. 이 방법의 일반적인 원리는 세포 표면에 micropipette를 통해 적용 잘 정의 된 부정적인 압력에 대한 응답으로 막 변형을 측정하는 것입니다. 이 방법은 기판에 연결된 세포의 biomechanical 속성을 연구 할 수있는 강력한 도구를 제공합니다.

기판에 연결된 전지의 Micropipette의 열망은 셀 강성을 추정하기 위해

Growing number of studies show that biomechanical properties of individual cells play major roles in multiple cellular functions, including cell ...

micropipette-aspiration-substrate-attached-cells-to-estimate-cell

Research

JoVE Journal

Bioengineering

19.8K 조회수.  University of Illinois. 여기 셀 강성을 측정 할 수있는 빠르고 간단한 방법을 설명합니다. 이 방법의 일반적인 원리는 세포 표면에 micropipette를 통해 적용 잘 정의 된 부정적인 압력에 대한 응답으로 막 변형을 측정하는 것입니다. 이 방법은 기판에 연결된 세포의 biomechanical 속성을 연구 할 수있는 강력한 도구를 제공합니다.

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Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

의 순환 압력 생물 반응기 설계 예 VIVO</em대동맥 심장 밸브> 학습

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

연구

생체공학

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture indefinitely and differentiated to any cell types in the body. Various types of biomaterials have also been used in stem cell cultures to provide a microenvironment mimicking the stem cell niche1-3. The latter is important for promoting cell-to-cell interaction, cell proliferation, and differentiation into specific lineages as well as tissue organization by providing a three-dimensional (3D) environment4 such as encapsulation. The principle of cell encapsulation involves entrapment of living cells within the confines of semi-permeable membranes in 3D cultures2. These membranes allow for the exchange of nutrients, oxygen and stimuli across the membranes, whereas antibodies and immune cells from the host that are larger than the capsule pore size are excluded5. Here, we present an approach to culture and differentiate hESC DA neurons in a 3D microenvironment using alginate microcapsules. We have modified the culture conditions2 to enhance the viability of encapsulated hESC. We have previously shown that the addition of p160-Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) inhibitor, Y-27632 and human fetal fibroblast-conditioned serum replacement medium (hFF-CM) to the 3D platform significantly enhanced the viability of encapsulated hESC in which the cells expressed definitive endoderm marker genes1. We have now used this 3D platform for the propagation of hESC and efficient differentiation to DA neurons. Protein and gene expression analyses after the final stage of DA neuronal differentiation showed an increased expression of tyrosine hydroxylase (TH), a marker for DA neurons, &gt;100 folds after 2 weeks. We hypothesized that our 3D platform using alginate microcapsules may be useful to study the proliferation and directed differentiation of hESC to various lineages. This 3D system also allows the separation of feeder cells from hESC during the process of differentiation and also has potential for immune-isolation during transplantation in the future.

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

We have optimized a microencapsulation technique as an effective 3D platform for propagation and differentiation of embryonic stem cells to endoderm and dopaminergic (DA) neurons. It also provides an opportunity for immune-isolation of cells from the host during transplantation. This platform can be adapted for other cell types.

다른 Lineages로 인간 배아 줄기 세포 (hESC)의 전파 및 차별 화를위한 3D 플랫폼으로서 알긴산의 Microcapsule

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular functions and events1, 2. Their spatiotemporally dynamic nature has been revealed by visualization of their activity and localization in real time3. In order to gain deeper understanding of their roles in diverse cellular functions at the molecular level, the next step should be perturbation of protein activities at a precise subcellular location and timing. 
To achieve this goal, we have developed a method for light-induced, spatio-temporally controlled activation of small GTPases by combining two techniques: (1) rapamycin-induced FKBP-FRB heterodimerization and (2) a photo-caging method of rapamycin. With the use of rapamycin-mediated FKBP-FRB heterodimerization, we have developed a method for rapidly inducible activation or inactivation of small GTPases including Rac4, Cdc424, RhoA4 and Ras5, in which rapamycin induces translocation of FKBP-fused GTPases, or their activators, to the plasma membrane where FRB is anchored. For coupling with this heterodimerization system, we have also developed a photo-caging system of rapamycin analogs. A photo-caged compound is a small molecule whose activity is suppressed with a photocleavable protecting group known as a caging group. To suppress heterodimerization activity completely, we designed a caged rapamycin that is tethered to a macromolecule such that the resulting large complex cannot cross the plasma membrane, leading to virtually no background activity as a chemical dimerizer inside cells6. Figure 1 illustrates a scheme of our system. With the combination of these two systems, we locally recruited a Rac activator to the plasma membrane on a timescale of seconds and achieved light-induced Rac activation at the subcellular level6.

A method for spatio-temporal control of small GTPase activity by light is described. This method is based on rapamycin-induced FKBP-FRB heterodimerization and photo-caging systems. Optimization of light-irradiation enables the spatio-temporally controlled activation of small GTPases at the subcellular level.

리빙 셀의 Subcellular 수준과 초 Timescale에 작은 GTPase 활동의 Spatio-시간적 조작

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to high levels of NK cells after 4 weeks culture and can undergo further 2-log expansion with artificial antigen presenting cells. hESC- and iPSC-derived NK cells developed in this system have a mature phenotype and function. The production of large numbers of genetically modifiable NK cells is applicable for both basic mechanistic as well as anti-tumor studies. Expression of firefly luciferase in hESC-derived NK cells allows a non-invasive approach to follow NK cell engraftment, distribution, and function. We also describe a dual-imaging scheme that allows separate monitoring of two different cell populations to more distinctly characterize their interactions in vivo. This method of derivation, expansion, and dual in vivo imaging provides a reliable approach for producing NK cells and their evaluation which is necessary to improve current NK cell adoptive therapies.

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

This protocol describes the development, expansion, and in vivo imaging of NK cells derived from hESCs and iPSCs.

개발, 확대,<em&gt; 생체 내</em&gt; 인간 배아 줄기 세포 (hESCs에)에서 인간 NK 세포의 모니터링 및 및 유도 된 pluripotent 줄기 세포 (유도 만능)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells similar to pericyte-derived mesoangioblasts (iPSC-derived mesoangioblast-like stem/progenitor cells: IDEMs) can be established from iPSCs generated from patients affected by different forms of muscular dystrophy. Patient-specific IDEMs can be genetically corrected with different strategies (e.g. lentiviral vectors, human artificial chromosomes) and enhanced in their myogenic differentiation potential upon overexpression of the myogenesis regulator MyoD. This myogenic potential is then assessed in vitro with specific differentiation assays and analyzed by immunofluorescence. The regenerative potential of IDEMs is further evaluated in vivo, upon intramuscular and intra-arterial transplantation in two representative mouse models displaying acute and chronic muscle regeneration. The contribution of IDEMs to the host skeletal muscle is then confirmed by different functional tests in transplanted mice. In particular, the amelioration of the motor capacity of the animals is studied with treadmill tests. Cell engraftment and differentiation are then assessed by a number of histological and immunofluorescence assays on transplanted muscles. Overall, this paper describes the assays and tools currently utilized to evaluate the differentiation capacity of IDEMs, focusing on the transplantation methods and subsequent outcome measures to analyze the efficacy of cell transplantation.

Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived myogenic progenitors are promising candidates for cell therapy strategies to treat muscular dystrophies. This protocol describes transplantation and functional measurements required to evaluate the engraftment and differentiation of iPSC-derived mesoangioblasts (a type of muscle progenitors) in mouse models of acute and chronic muscle regeneration.

근육 재생의 마우스 모델에서 유도 만능 줄기 세포 유래 메소안지오블라스트 와 같은 근생 성 전구의 이식

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening based on cells in such environments have therefore serious limitations: cell organelles show extreme phenotypes, cell morphologies and sizes are heterogeneous and/or specific cell organelles cannot be properly visualized. In addition, cells in vivo are located in a 3D environment; in this situation, cells show different phenotypes mainly because of their interaction with the surrounding extracellular matrix of the tissue. In order to standardize and generate order of single cells in a physiologically-relevant 3D environment for cell-based assays, we report here the microfabrication and applications of a device for in vitro 3D cell culture. This device consists of a 2D array of microcavities (typically 105 cavities/cm2), each filled with single cells or embryos. Cell position, shape, polarity and internal cell organization become then normalized showing a 3D architecture. We used replica molding to pattern an array of microcavities, &#8216;eggcups&#8217;, onto a thin polydimethylsiloxane (PDMS) layer adhered on a coverslip. Cavities were covered with fibronectin to facilitate adhesion. Cells were inserted by centrifugation. Filling percentage was optimized for each system allowing up to 80%. Cells and embryos viability was confirmed. We applied this methodology for the visualization of cellular organelles, such as nucleus and Golgi apparatus, and to study active processes, such as the closure of the cytokinetic ring during cell mitosis. This device allowed the identification of new features, such as periodic accumulations and inhomogeneities of myosin and actin during the cytokinetic ring closure and compacted phenotypes for Golgi and nucleus alignment. We characterized the method for mammalian cells, fission yeast, budding yeast, C. elegans with specific adaptation in each case. Finally, the characteristics of this device make it particularly interesting for drug screening assays and personalized medicine.

We report a device and a new method to study cells and embryos. Single cells are precisely ordered in microcavity arrays. Their 3D confinement is a step towards 3D environments encountered in physiological conditions and allows organelle orientation. By controlling cell shape, this setup minimizes variability reported in standard assays.

단일 세포 및 3D 감금 단일 배아 주문 : 하이 콘텐츠 스크리닝을위한 새로운 장치

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Simple Polyacrylamide-based Multiwell Stiffness Assay for the Study of Stiffness-dependent Cell Responses

Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a matrix that is elastic and much softer (0.1 &#8211; 100 kPa). Since such stiffness mismatch greatly affects cell responses, there is a strong interest in developing hydrogel materials that span a wide range of stiffness to serve as cell substrates. Polyacrylamide gels, which are inexpensive and cover the stiffness range of all soft tissues in the body, are the hydrogel of choice for many research groups. However, polyacrylamide gel preparation is lengthy, tedious, and only suitable for small batches. Here, we describe an assay which by utilizing a permanent flexible plastic film as a structural support for the gels, enables the preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format. The technique is faster, more efficient, and less costly than current methods and permits the preparation of gels of custom sizes not otherwise available. As it doesn&#8217;t require any specialized equipment, the method could be easily adopted by any research laboratory and would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.

Here, a method that enables quick, efficient, and inexpensive preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format is described. The method does not require any specialized equipment and could be easily adopted by any research laboratory. It would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.

간단한 폴리 아크릴 아미드 기반 강성 의존 세포 반응의 연구를위한 멀티 웰 강성 분석

Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a ...

A Method to Estimate Cadaveric Femur Cortical Strains During Fracture Testing Using Digital Image Correlation

This protocol describes the method using digital image correlation to estimate cortical strain from high speed video images of the cadaveric femoral surface obtained from mechanical testing. This optical method requires a texture of many contrasting fiduciary marks on a solid white background for accurate tracking of surface deformation as loading is applied to the specimen. Immediately prior to testing, the surface of interest in the camera view is painted with a water-based white primer and allowed to dry for several minutes. Then, a black paint is speckled carefully over the white background with special consideration for the even size and shape of the droplets. Illumination is carefully designed and set such that there is optimal contrast of these marks while minimizing reflections through the use of filters. Images were obtained through high speed video capture at up to 12,000 frames/s. The key images prior to and including the fracture event are extracted and deformations are estimated between successive frames in carefully sized interrogation windows over a specified region of interest. These deformations are then used to compute surface strain temporally during the fracture test. The strain data is very useful for identifying fracture initiation within the femur, and for eventual validation of proximal femur fracture strength models derived from Quantitative Computed Tomography-based Finite Element Analysis (QCT/FEA).

In this protocol, the femur surface strains are estimated during fracture testing using the digital image correlation technique. The novelty of the method involves application of a high-contrast stochastic speckle pattern on the femur surface, carefully specified illumination, high speed video capture, and digital image correlation analysis for strain calculations.

방법 골절 디지털 이미지 상관 관계를 사용 하 여 테스트 하는 동안 싱가포르로 대 퇴 골 피 질 긴장을 예상

This protocol describes the method using digital image correlation to estimate cortical strain from high speed video images of the cadaveric femoral ...

Human Pluripotent Stem Cell Culture on Polyvinyl Alcohol-Co-Itaconic Acid Hydrogels with Varying Stiffness Under Xeno-Free Conditions

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by several researchers. However, most of these investigators have used polyacrylamide hydrogels for stem cell culture in their studies. Therefore, their results are controversial because those results might originate from the specific characteristics of the polyacrylamide and not from the physical cue (stiffness) of the biomaterials. Here, we describe a protocol for preparing hydrogels, which are not based on polyacrylamide, where various stem, cells including human embryonic stem (ES) cells and human induced pluripotent stem (iPS) cells, can be cultured. Hydrogels with varying stiffness were prepared from bioinert polyvinyl alcohol-co-itaconic acid (P-IA), with stiffness controlled by crosslinking degree by changing crosslinking time. The P-IA hydrogels grafted with and without oligopeptides derived from extracellular matrix were investigated as a future platform for stem cell culture and differentiation. The culture and passage of amniotic fluid stem cells, adipose-derived stem cells, human ES cells, and human iPS cells is described in detail here. The oligopeptide P-IA hydrogels showed superior performances, which were induced by their stiffness properties. This protocol reports the synthesis of the biomaterial, their surface manipulation, along with controlling the stiffness properties and finally, their impact on stem cell fate using xeno-free culture conditions. Based on recent studies, such modified substrates can act as future platforms to support and direct the fate of various stem cells line to different linkages; and further, regenerate and restore the functions of the lost organ or tissue.

A protocol is presented to prepare polyvinyl alcohol-co-itaconic acid hydrogels with varying stiffness, which were grafted with and without oligopeptides, to investigate the effect of the stiffness of biomaterials on the differentiation and proliferation of stem cells. The stiffness of the hydrogels was controlled by the crosslinking time.

폴 리 비닐 알코올-Co-Itaconic 산 Hydrogels 이종 없는 조건 하에서 다양 한 강성에 인간의 Pluripotent 줄기 세포 문화

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by ...

Stiffness Measurement of Soft Silicone Substrates for Mechanobiology Studies Using a Widefield Fluorescence Microscope

Soft tissues in the human body typically have stiffness in the kilopascal (kPa) range. Accordingly, silicone and hydrogel flexible substrates have been proven to be useful substrates for culturing cells in a physical microenvironment that partially mimics in vivo conditions. Here, we present a simple protocol for characterizing the Young's moduli of isotropic linear elastic substrates typically used for mechanobiology studies. The protocol consists of preparing a soft silicone substrate on a Petri dish or stiff silicone, coating the top surface of the silicone substrate with fluorescent beads, using a millimeter-scale sphere to indent the top surface (by gravity), imaging the fluorescent beads on the indented silicone surface using a fluorescence microscope, and analyzing the resultant images to calculate the Young's modulus of the silicone substrate. Coupling the substrate's top surface with a moduli extracellular matrix protein (in addition to the fluorescent beads) allows the silicone substrate to be readily used for cell plating and subsequent studies using traction force microscopy experiments. The use of stiff silicone, instead of a Petri dish, as the base of the soft silicone, enables the use of mechanobiology studies involving external stretch. A specific advantage of this protocol is that a widefield fluorescence microscope, which is commonly available in many labs, is the major equipment necessary for this procedure. We demonstrate this protocol by measuring the Young's modulus of soft silicone substrates of different elastic moduli.

Substrates with stiffness in the kilopascal-range are useful to study the response of cells to physiologically relevant micro-environment stiffness. Using just a widefield fluorescence microscope, the Young's modulus of soft silicone gels can be determined using an indentation with a suitable sphere.

Widefield 형광 현미경을 사용 하 여 Mechanobiology 연구에 대 한 부드러운 실리콘 기판의 강성 측정

Soft tissues in the human body typically have stiffness in the kilopascal (kPa) range. Accordingly, silicone and hydrogel flexible substrates have been ...