Bu eser HL094536 (BJH) tarafından desteklenmiştir.

1. Fare Kalpten Mitokondri İzolasyonu <ol><li> Kalp mitokondri izole etmek, uyutmak ve yerel Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış prosedürlere göre fareler kurban. </li></ol> Not: mitokondri izolasyon protokolü tüm adımlar buz üzerinde yapılmalıdır. Buz soğuk tamponlar ve ön soğutulmuş Petri kapları, Falcon tüpleri ve Eppendorf tüpleri kullanın. Protokolü verilen hacimleri 2 fare kalpleri içeren bir örnek içindir. <ol start="2"><li> , Kalpler kaldırma soğuk Mitokondri İzolasyonu tampon içine yerleştirin (300 mM sukroz, 10 mM Na-HEPES, 200 mM EDTA, pH 7.4) ve kan durulayın. </li></ol> Not: En iyi sonuçlar için, mitokondriyal tamponların pH KOH ve Asetik Asit ile ayarlanabilir olmalıdır. <ol start="3"><li> Soğuk bir Petri kabı koyun kalpleri, yağ ve atriyumlar çıkarın ve elde edene kadar bir bıçak kullanarak ince kıymahomojen bir ürün Ing. </li><li> Bir 50 ml Falcon tüp ile kıyılmış kalpler transfer, 0.1 mg / ml tripsin ile Mitokondri izolasyon Tamponu 10 mL eklemek ve numune 10 dakika için buz üzerinde sindirimi için izin verir. </li></ol> Not: izolasyon prosedürü sırasında Tripsin izole mitokondri verimi artırır ve mitokondriyal hazırlıkları arasında sabit tutulmalıdır. Biz izole hazırlıkları mitokondrial fonksiyonları test enzim işlevselliği etkilemez emin olmak için tripsin yokluğudur öneririz. <ol start="5"><li> % 0.1 yağ asidi serbest BSA ve 5 mg tripsin inhibitörü (soya) ile Mitokondri İzolasyon Buffer 10 ml ekleyin ve tripsin nötralize etmek için ters tüp birkaç kez karıştırın. </li></ol> Not: Mitokondri izolasyon Tampon önceden hazırlanır ve -20 ° C&#39;de saklanabilir Çözdürme sırasında pH kontrol edin. Tripsin, tripsin inhibitörü ya da BSA, bir olmalıdırDeney günü Mitokondri İzolasyon Buffer dded. <ol start="6"><li> 4 az 1 dakika ° C için düşük-orta hızlı santrifüjleme ile sindirilir doku Kurtar </li><li> Teflon havaneli (1,200-14,00 devirde 4-6 geçer) ile motorlu Dounce homojenizatör kullanarak% 0.1 yağ asitsiz BSA ve homojenize ile 8 ml Mitokondri İzolasyonu Tamponunda süspanse doku. Homojenizasyon sırasında buz üzerinde örnek tutun. </li><li> 4. 10 dakika için 800xg bir 15 ml Falcon tüp ve santrifüj içine Homojenat aktarın ° C pelet çekirdekler ve doku enkaz. </li><li> 4, 15 dakika boyunca 8000 x g ile santrifüj Eppendorf tüpleri içine mitokondri içeren süpernatan kurtarma ° C. </li><li> Dikkatli bir şekilde üst beyaz tabaka çıkarın ve 1 ml Mitokondri İzolasyon Tamponunda mitokondri içeren kalan koyu pelet yıkayın. </li><li> 4 &#39;de 15 dakika için 8000xg santrifüjleyin ° C. 150 ul Mitokondriyal Isola süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet atın mitokondrition Tampon. Ileri testler için buz üzerinde mitokondri tutun. </li></ol> Not: Fonksiyonel testler sırasında en iyi sonuçları elde etmek için, izolasyon 4 saat içinde mitokondri kullanın. <ol start="12"><li> Bradford assay kullanarak mitokondriyal protein sayısal. </li></ol> 2. İzole Mitokondri Kalite Kontrolü 2.1. Solunum kontrolü oranı ölçümü (RCR) <ol><li> Maksimum oksijen hattı kurmak için hava doymuş su ile Oxytherm oksijen elektrodu kalibre. Oksijen kararlı seviyesi sıfır oksijen hattı kurmak için bir taze hazırlanmış olan 10 mM sodyum hidrosülfit çözeltisi 100 ul ekle elde edildiği zaman. 30 ° C&#39;de ölçümleri gerçekleştirin </li><li> Oda mühürlenir, Oxytherm oda 1 uM rotenon 2 ml Mitokondri solunum tamponu (125 mM KCI, 20 mM HEPES, 3 mM MgCl2, 400 uM EGTA, 300 uM DTT, 5 mM KH 2 PO 4, pH 7.2) ekleyin ve start recording. </li><li> Oksijen sinyali stabil olduğunda, 1 dakika süreyle 250 mitokondri mikrogram ve kayıt bazal solunum ekleyin. Mitokondri endojen substratların (Devlet 1 solunum) üzerine soluyarak olarak bu noktada solunum çok düşük olmalıdır. </li><li> 5 mM süksinat ve 1 dakika süreyle kayıt sinyali ekleyin. Oksijen tüketimi Devlet 2 solunum sırasında artmalıdır. </li><li> 150 mcM ADP ekleyerek Devlet 3 solunum øndükle. Bu noktada oksijen tüketimi ise oksidatif fosforilasyon yoluyla ATP sentezi nedeniyle artmalıdır. Rekor sinyal solunum ADP tüketimi ve 4 solunum Devlet geçiş gösteren, yavaşlatır kadar. En az 1 dakika süreyle kayıt durumu 4 solunum. </li><li> 1 uM CCCP ve 1 dakika süreyle kayıt sinyali ekleyin. Kuplajsız solunum maksimal olmalıdır. </li></ol> Not: mitokondriyal solunum üzerinde CCCP etkileri doza bağımlıdır: CCCP yüksek konsantrasyonlu oksijen tüketimi inhibe edebilir ve bu nedenle t özenle olmalıdıritrated. <ol start="7"><li> Devlet 4 solunum sırasında oksijen tüketimi oranıyla Devlet 3 solunum sırasında oksijen tüketim oranına bölünmesi ile solunum kontrolü oranı (RCR) hesaplayın. Bir hedef RCR ≥ 4 olmalıdır. </li></ol> 2.2. Mitokondrial membran bütünlüğünün Değerlendirilmesi (sitokrom c testi) <ol><li> İyice% 70 etanol ve su ile Oxytherm odasına yıkayın ve adımları 2.1.2 -2.1.4 tekrarlayın. </li><li> 1 mM ADP ve 1 dakika süreyle kayıt oksijen tüketimi ekleyin. </li><li> 10 uM sitokrom c ekleyin. Sitokrom c bozulmamış mitokondriyal membran geçirmez olduğundan, solunum artışı kırık veya hasarlı mitokondriyal membran gösterir. </li></ol> 3. Mitokondriyal Geçirgenlik Geçiş Gözenek Açılış Ölçümü <ol><li> MtPTP açıklığın çok parametre için ölçüm spectrofluorometer ayarlayın. FelixGx programını kullanarak, yeni bir donanım yapılandırması oluşturmak (Quanta ana sabit state) ışık kaynağı, uyarma monokromatör, numune kompartımanı ve uyarma monokromatör (Şekil 4) ile ilgili olarak 90 ° ve 270 ° &#39;de konumlandırılmış iki dedektör oluşan. Maksimal zaman çözünürlüğü elde etmek için, hem emisyon monokromatörler (90 ° ve 270 °) devre dışı bırakılır ve numune kompartımanı 90 ° ve 270 ° &#39;de emisyon filtresi donanım yapılandırması menüsü etkin olmalıdır. Bu adım emisyon dalga boylarında motor kontrol kaldırın ve belirli bir dalga boyunda her monokromatör çözecektir. Emisyon monokromatörler devre dışı değilse, her dedektör dalgaboyu ve yinelenen ölçümler arasında hem döngüsü kaydedilecektir olacaktır. </li><li> Çoklu Boya türünü kullanarak yeni bir satın alma protokolü oluşturun ve aşağıdaki boyalar girin: <ul><li> Fura (yüksek Ca + +): eksitasyon 340 nm, emisyon 525 nm (dedektör 1) </li><li> Fura (düşük Ca + +): eksitasyon 380 nm, emisyon 525 nm (dedektör 1) </li><li> JC1 (agrega): eksitasyon 543 nm, Emisyon 595 nm (dedektör 2) </li><li> JC1 (monomer): eksitasyon 498 nm, emisyon 525 nm (dedektör 1) </li><li> Şişme: eksitasyon 525 nm, emisyon 525 nm (dedektör 1) </li></ul></li><li> 37 ° C ve 1 nm eksitasyon ve emisyon yarıklar ve sıcaklık ayarlama </li><li> Fura ve JC-1 için rasyometrik sinyali elde etmek için, iki türetilmiş izleri oluşturur: Fura (yüksek Ca + +) / Fura (düşük Ca + +) ve JC1 (agrega) / JC1 (monomer). </li><li> Elle sırasıyla, dedektör 1 ve 2 ile 525 nm ve 595 nm emisyon dalga boyu ayarlayın. </li><li> Karıştırın 1 uM rotenon, 5 mM süksinat ve tek kullanımlık bir 4-yönlü, 800 nM Fura FF ile 1 ml mitokondri, tahlil tamponu (120 mM KCI, 10 mM NaCI, 1 mM KH 2 PO 4, 20 mM HEPES-Tris, pH 7.2) metakrilat küvet. Numune kompartımanı içinde 250 mikrogram mitokondri ve yerde örnek ekleyin. Manyetik karıştırıcı açık olduğundan emin olun. </li><li> Kayda başlayın. 1 dakika sonra, elde etme duraklatabilir, 500 nM JC-1 eklenir ve daha sonra bir yenidencquisition. JC-1 oranı sinyali aktif mitokondrilerde dye uptake gösteren artmalıdır. JC-1 sinyali bir plato (genellikle 5 dakika içinde) ulaşana kadar kayıt devam edin. </li><li> 20 uM CaCI2 ekleyin. Fura FF oran sinyali içinde bir ani artış, mitokondriyal Ca 2 + alımını dolayı bir kademeli azalma ardından, tayin tamponu içinde artan Ca +2 varlığında tarafından dikkate alınmalıdır. JC-1 oranı sinyali hafif mitokondrial membran depolarizasyon göstergesi kısa süreli azalmaya sergilemesi gerekir. </li><li> Önce başka bir CaCl 2 pulse (1-1.5 dk) eklenmesi ile bazal seviyeye Fura FF oranı sinyali dönene kadar bekleyin. Mitokondri Ca 2 birikmez kadar sabit aralıklarla darbe Devam + ve + deney tamponu içine Ca 2 bırakmadan başlar. mtPTP açılması nedeniyle Ca 2 Fura FF oran sinyali eş zamanlı artış ile görüntülenmiştir + serbest bırakma, membran pote bağlı olarak JC-1 sinyal oranında azalmantial çöküşü ve mitokondriyal şişme nedeniyle ışık saçılması bir azalma (Şekil 5). </li><li> MtPTP aktivasyonu takiben, 1 mM EGTA, 1 uM CCCP ve 5 ug / ml alamethicin ile sırasıyla Fura FF, JC-1 ve şişme sinyallerin özgüllüğünü teyit. </li><li> MtPTP açma özgüllük doğrulamak için tekrar adımları 3.6 - Siklofilin D inhibitörü siklosporin 1 uM&#39;si varlığında, 3.9 A (Siklofilin D mtPTP bir bileşenidir.) Siklosporin varlığında, mtPTP açılması kontrol numuneleri (Şekil 6) önemli ölçüde daha fazla CaCl2 darbe gerektirir. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Şekil 2, mitokondri izole edilmiş fare kalbinde tipik solunum kontrol göstermektedir. State 3 solunum süksinat üzerinde mitokondri Solunum için ADP ilavesi ile elde edilir, ve substra göre önemli ölçüde artmıştır oksijen tüketimi ile karakterize ediliryalnız te. Tükenmesi oksijen tüketimi yavaşlatır ve ADP ilavesinden önce ulaşmış oranları karşılaştırılabilir sırasında ADP inisiyeler Devlet 4 solunum, ekledi. RCR State 4 solunum bu göre State 3 solunum için oksijen tüketim hızı bölünmesi ile elde edilir. Sitokrom c testi deneyi dış mitokondrial membran bütünlüğünün için kullanılır: sitokrom c süksinat ve ADP, gözlenen solunum ilave bir artış üzerine mitokondri Solunum eklendiğinde, sağlam bir dış mitokondriyal membranların (Şekil 3) gösterir. Mitokondri içinde izole edilmiş kalp mtPTP açılması için temsili bir görüntü Şekil 4 &#39;de gösterilmiştir. Bu durumda, açma mtPTP 1.5 dk aralıklarla 4 CaCl2 puls (20 uM her biri) ilavesi ile tetiklenmiştir. mtPTP açılış mitokondrial Ca 2 yakın eşzamanlı yayın + (Fura FF oranı sinyal artışı), mitochond çöküşü ile açıktırriyali membran potansiyeli (JC-1 oranı sinyal azalması) ve artmış mitokondriyal hacmi (şişlik sinyal azalması). Bir ilave edildiğinde siklosporin, ki mtPTP ve Siklofilin D bileşeni bağlanır, mtPTP açma CaCl2 yerine 4 7 darbeleri (Şekil 5) gerektirir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig1.jpg" /> Şekil 1. Mitokondri izole kalp için çok parametre mitokondriyal permeabilite geçiş gözenek açılması protokolü akış şeması. Kalp farelerin hasat edilir ve mitokondri diferansiyel santrifüjleme yoluyla izole edilmiştir. Mitokondriyal hazırlama sonra niteliksel olarak sitokrom c varlığında solunum kontrol oranı ve mitokondrial zarın sağlamlık polarografik ölçümü ile değerlendirildi. Izole mitokondride mitokondriyal permeabilite geçiş gözenek açılması sıralı cac tarafından tetiklenenl 2 eklemeler ve mitokondri membran potansiyeli çöküşü Ca 2 + sürüm izleme ve mitokondrial matriks şişmesi ile spectrofluorometer ile ölçülür. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/4131/4131fig2.jpg" /> Şekil 2. Ölçümü mitokondri izole kalp, solunum kontrolü oranı (RCR). Mitokondri izole kalp oksijen tüketimi süksinat ve ADP varlığında Devlet 3 solunum sırasında ölçülen ve ADP tüketiminden sonra Devlet 4. solunum sırasında. Edilir Eşleşmeyenler ile izole mitokondri tepki CCCP ilavesi ile ölçülür. Grafikteki Numaraları nmol / dk / mg protein izole mitokondrilerde oksijen tüketimi oranları vardır. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig3.jpg" /> Şekil 3. Tedbir<html> mitokondri izole kalp membran bütünlüğünün Ment. Mitokondrial membran bütünlüğü süksinat ve ADP varlığında ve sitokrom c ilave edildikten sonra izole mitokondri içinde oksijen tüketimi ölçmek suretiyle belirlenir. Grafikteki Numaraları nmol / dk / mg protein izole mitokondrilerde oksijen tüketimi oranları vardır. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/4131/4131fig4.jpg" /> MtPTP açıklığın çok parametre ölçümleri için Şekil 4&#39;te. Spectrofluorometer donanım konfigürasyonu. Spectrofluorometer ve donanım yapılandırması bir ışık kaynağı, bir uyarım monokromatör, bir numune kompartımanı ve 525 nm ve 595 nm dalga boyunda sabit emisyon dalga boylarında iki dedektörleri içerir. Detektör 1 Fura FF, yüksek ve düşük Ca2 +, JC-1 monomer sinyal algılama ve şişme sinyali için kullanılır. Dedektör 2 JC-1 toplam sinyal ölçer. jove_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/4131/4131fig5.jpg" /> Şekil 5. Mitokondri izole kalp mtPTP açılış Multi-parametre ölçümü. mtPTP açılışı 20 mcM CaCl 2 sıralı eklemeler tetikledi ve Ca 2 ile karakterize edilmiştir + mitokondri, mitokondrial membran potansiyeli çöküşü salınımı ve mitokondrial matriks hacmi (şişlik) artmıştır. Extramitochondrial Ca 2 + ve membran potansiyeli rasyometrik göstergeleri Fura FF (yeşil iz) ve JC-1 (kırmızı iz) ile ölçüldü. Mitokondrinin şişmesi 525 nm (siyah iz) de ışık saçılması kayıt ile ölçüldü. JC-1 Özgünlük ve şişme sinyaller 1 uM CCCP ve 5 mg / ml alamethicin (mikrobiyal toksin) ile test edildi. <img alt="Şekil 6" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig6.jpg" /> Şekil 6. ÇokluSiklosporin A. Siklosporin varlığında mitokondri izole kalp mtPTP açılış-parametre ölçümleri A (1 uM) mitokondri izole kalp mtPTP açmak için gerekli CaCl2 darbe sayısını artırır.

<ol>
	<li>Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Membrane+Permeabilization+in+Cell+Death.">Mitochondrial Membrane Permeabilization in Cell Death.</a> Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).</li><li>Elrod, J., Wong, R., Mishra, S., Vagnozzi, R. J., Sakthievel, B., Goonasekera, S. A., Karch, J., Gabel, S., Farber, J., Force, T., Brown, J. H., Murphy, E., Molkentin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclophilin+D+controls+mitochondrial+pore-dependent+Ca2++exchange,+metabolic+flexibility,+and+propensity+for+heart+failure+in+mice.">Cyclophilin D controls mitochondrial pore-dependent Ca2+ exchange, metabolic flexibility, and propensity for heart failure in mice.</a> J. Clin. Invest. 120, 3680-3687 (2010).</li><li>Hom, J. R., Quintanilla, R. A., Hoffman, D. L., de Mesy Bentley, K. L., Molkentin, J. D., Sheu, S. S., Porter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+permeability+transition+pore+controls+cardiac+mitochondrial+maturation+and+myocyte.">The permeability transition pore controls cardiac mitochondrial maturation and myocyte.</a> 21, 469-478 (2011).</li><li>Halestrap, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+mitochondrial+permeability+transition+pore.">What is the mitochondrial permeability transition pore.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46, 821-831 (2009).</li><li>Wei, A. C., Liu, T., Cortassa, S., Winslow, R. L., O'Rourke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Ca2++influx+and+efflux+rates+in+guinea+pig+cardiac+mitochondria:+low+and+high+affinity+effects+of+cyclosporine+A.">Mitochondrial Ca2+ influx and efflux rates in guinea pig cardiac mitochondria: low and high affinity effects of cyclosporine A.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1813, 1373-1381 (2011).</li><li>Saks, V. A., Kuznetsov, A. V., Kupriyanov, V. V., Miceli, M. V., Jacobus, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creatine+kinase+of+rat+heart+mitochondria.+The+demonstration+of+functional+coupling+to+oxidative+phosphorylation+in+an+inner+membrane-matrix+preparation.">Creatine kinase of rat heart mitochondria. The demonstration of functional coupling to oxidative phosphorylation in an inner membrane-matrix preparation.</a> J. Biol. Chem. 260, 7757-7764 (1985).</li><li>Boehm, E. A., Jones, B. E., Radda, G. K., Veech, R. L., Clarke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+uncoupling+proteins+and+decreased+efficiency+in+palmitate-perfused+hyperthyroid+rat+heart.">Increased uncoupling proteins and decreased efficiency in palmitate-perfused hyperthyroid rat heart.</a> AJP - Heart. 280, 977-983 (2001).</li><li>Fontaine, E., Eriksson, O., Ichas, F., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Permeability+Transition+Pore+in+Skeletal+Muscle+Mitochondria.">Regulation of the Permeability Transition Pore in Skeletal Muscle Mitochondria.</a> J. Biol. Chem. 273, 12662-12668 (1998).</li><li>Berman, S. B., Watkins, S. C., Hastings, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+biochemical+and+ultrastructural+comparison+of+mitochondrial+permeability+transition+in+isolated+brain+and+liver+mitochondria:+evidence+for+reduced+sensitivity+of+brain+mitochondria.">Quantitative biochemical and ultrastructural comparison of mitochondrial permeability transition in isolated brain and liver mitochondria: evidence for reduced sensitivity of brain mitochondria.</a> Exp. Neurol. 164, 415-425 (2000).</li><li>Panov, A., Dikalov, S., Shalbuyeva, N., Hemendinger, R., Greenamyre, J. T., Rosenfeld, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-+and+tissue-specific+relationships+between+mitochondrial+permeability+transition+and+generation+of+ROS+in+brain+and+liver+mitochondria+of+rats+and+mice.">Species- and tissue-specific relationships between mitochondrial permeability transition and generation of ROS in brain and liver mitochondria of rats and mice.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 292, 708-718 (2007).</li><li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+isolation:+functional+mitochondria+from+mouse+liver,+muscle+and+cultured+filroblasts.">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured filroblasts.</a> Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).</li><li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines.">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada sunulan protokol mitokondri izole kalp (Şekil 1 ve Şekil 4) permeabilite geçiş gözenek açılması değerlendirmek için gerekli deney adımları açıklar: fare kalp mitokondri izolasyon prosedürü, bütünlük ve işlevselliği sağlamak solunum kontrolleri, mitokondriyal parametreleri sırasında takip mtPTP açılış ve ölçüm için kullanılan boyalar, spektrofluorometrik enstrümantasyon, kurma ve mtPTP açılış karakterizasyonu. Bu protokol istihdam spectrofluor...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Tripsin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T3030 </td></tr><tr><td> Tripsin inhibitörü (soya) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9128 </td></tr><tr><td> Sodyum hidrosülfit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 71699 </td></tr><tr><td> Rotenon </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R8875 </td></tr><tr><td> Sitokrom c </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7752 </td></tr><tr><td> Alamethicin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4665 </td></tr><tr><td> CCCP </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C2759 </td></tr><tr><td> Bir Siklosporin </td><td> Calbiochem </td><td> 239835 </td></tr><tr><td> Fura FF </td><td> Invitrogen </td><td> F14180 </td></tr><tr> &lt;td&gt; JC-1 </td><td> Invitrogen </td><td> T3168 </td></tr><tr><td> Doku değirmeni Teflon havaneli 15 ml Potter-Elvehjem </td><td> Wheaton Sektörler </td><td></td></tr><tr><td> Tepegöz karıştırıcı </td><td> Wheaton Sektörler </td><td> 903475 </td></tr><tr><td> Oxytherm (sıcaklık kontrollü oksijen elektrodu) </td><td> Hansatech Aletleri </td><td></td></tr><tr><td> QuantaMaster 80 çift emisyon spectrofluorometer </td><td> Foton Technology International, Inc </td><td></td></tr></tbody></table>

multi-parameter measurement of the permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria

Mitokondriyal permeabilite geçiş gözenek (mtPTP) 1.5 kDa daha küçük bir moleküler kütleye sahip çözünenlerin taşımak için iç mitokondrial membran oluşturan bir non spesifik kanalıdır. Gözenek kesin moleküler kimlik tartışmasının altında hala olmasına rağmen, bu tür Siklofilin D VDAC ve ANT gibi proteinlerin oluşumunu mtPTP katkıda bulunur. Hücre ölümü mtPTP açılış tutulumu iyi 1 yerleşmiş olmakla birlikte, biriken kanıtlar mtPTP mitokondrial Ca 2 + homeostaz 2, biyoenerji ve redoks 3 sinyal sırasında bir fizyolojik rol oynar belirtir. mtPTP açılış matrisi Ca 2 ile tetiklenir + ama faaliyet gibi oksidatif stres, adenin nükleotid tükenmesi, Pi yüksek konsantrasyonlarda, mitokondriyal membran depolarizasyon veya ayrılmasının ve 4 uzun zincirli yağ asitleri gibi diğer bazı faktörler tarafından modüle edilebilir. vitro, mtPTP yılında açılması ACH olabilirCa 2 + eksojen eklemeler (kalsiyum tutma kapasitesi) ile mitokondrial matriks içine Ca 2 + konsantrasyonu arttırarak ieved. Ca 2 mitokondri içindeki + düzeyleri belirli bir eşiğin ulaştığınızda, mtPTP açar ve Ca 2 kolaylaştırır + sürümü, proton itici güç yitimi, membran potansiyeli çöküşü ve sonuçta rüptürü yol mitokondrial matriks hacmi (şişlik) bir artış dış mitokondriyal membran ve organel fonksiyon geri dönüşümsüz kaybı. Burada mitokondri izole fare kalbinde mtPTP açılış kapsamlı karakterizasyonu sağlar florometrik tahlil açıklar. Mitokondrial Ca 2 + işleme (as Ca 2 tarafından tahlil orta + konsantrasyonu ölçülen alımı ve salınımı,), mitokondrial membran potansiyeli ve mitocho: assay mtPTP açılış oluşur değişmiş 3 mitokondriyal parametrelerin eş zamanlı ölçümü içerirndrial hacmi. Ca2 için kullanılan renklendiriciler deney ortamı ile mitokondriyal zar potansiyeli + ölçüm Fura FF, bir zar laktobionat, Ca 2 + ve JC-1, bir katyonik varlığında uyarma dalga boyunda bir değişim geçirir rasyometrik gösterge vardır sırasıyla, düşük ve yüksek membran potansiyelinde yeşil monomerlerin veya kırmızı agregaları rasyometrik göstergesi. Mitokondriyal hacmindeki değişiklikler mitokondriyal süspansiyon ışık saçılması kaydederek ölçülür. Yüksek kaliteli, fonksiyonel mitokondri mtPTP açılış tahlil için gerekli olduğundan, biz de sağlam, son derece birleştiğinde ve fonksiyonel izole kalp mitokondri elde etmek için gerekli adımları açıklar.

Watch this Scientific Journal Video about Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria at JoVE.com

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

Mitokondri izole fare kalbinde mitokondriyal permeabilite geçiş gözenek açılması ölçümü için bir spektrofluorometrik protokolü sunulmuştur. Tahlil mitokondri Ca eşzamanlı ölçüm içerir<sup&gt; 2 +</sup&gt; Taşıma, mitokondriyal membran potansiyeli ve mitokondriyal hacmi. Mitokondri, yüksek kaliteli ve fonksiyonel kalp elde edilmesi için işlem de tarif edilmektedir.

Mitokondri İzole Fare Heart Geçirgenliği Geçiş Gözenek Açma Multi-parametre ölçümü

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

multi-parameter-measurement-permeability-transition-pore-opening

Research

JoVE Journal

Biology

21.4K Görüntüleme.  University of Washington, Seattle. Mitokondri izole fare kalbinde mitokondriyal permeabilite geçiş gözenek açılması ölçümü için bir spektrofluorometrik protokolü sunulmuştur. Tahlil mitokondri Ca eşzamanlı ölçüm içerir 2 + Taşıma, mitokondriyal membran potansiyeli ve mitokondriyal hacmi. Mitokondri, yüksek kaliteli ve fonksiyonel kalp elde edilmesi için işlem de tarif edilmektedir.

Video: Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there have been significant advances in our understanding of the functions of mitochondria other than the generation of energy. These include their role in apoptosis, acting as signalling organelles, mammalian development and ageing as well as their contribution to the coordination between cell metabolism and cell proliferation. Our understanding of biological processes modulated by mitochondria is based on robust methods for isolation and handling of intact mitochondria from tissues of the laboratory animals. Mitochondria from rat heart is one of the most common preparations for past and current studies of cellular metabolism including studies on knock-out animals.
Here we describe a detailed rapid method for isolation of intact mitochondria with a high degree of coupling. Such preparation of rat heart mitochondria is an excellent object for functional and structural research on cellular bioenergetics, transport of biomolecules, proteomic studies and analysis of mitochondrial DNA, proteins and lipids.

We describe &#1072; protocol for isolation of pure, highly coupled rat heart mitochondria for functional or structural studies of cellular bioenergetics, biophysical measurements, proteomics or mitochondrial DNA and lipids analysis.

Mitokondri Yüksek Coupled Sıçan Kalp hazırlanması

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there ...

Biyoloji

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial dysfunction often accompanies and contributes to human disease. Majority of the approaches that have been developed to evaluate mitochondrial function and dysfunction are based on in vitro or ex vivo measurements. Results from these experiments have limited ability in determining mitochondrial function in vivo. Here, we describe a novel approach that utilizes confocal scanning microscopy for the imaging of intact tissues in live aminals, which allows the evaluation of single mitochondrial function in a real-time manner in vivo. First, we generate transgenic mice expressing the mitochondrial targeted superoxide indicator, circularly permuted yellow fluorescent protein (mt-cpYFP). Anesthetized mt-cpYFP mouse is fixed on a custom-made stage adaptor and time-lapse images are taken from the exposed skeletal muscles of the hindlimb. The mouse is subsequently sacrificed and the heart is set up for Langendorff perfusion with physiological solutions at 37 &deg;C. The perfused heart is positioned in a special chamber on the confocal microscope stage and gentle pressure is applied to immobilize the heart and suppress heart beat induced motion artifact. Superoxide flashes are detected by real-time 2D confocal imaging at a frequency of one frame per second. The perfusion solution can be modified to contain different respiration substrates or other fluorescent indicators. The perfusion can also be adjusted to produce disease models such as ischemia and reperfusion. This technique is a unique approach for determining the function of single mitochondrion in intact tissues and in vivo.

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal scanning microscopy is applied for imaging single mitochondrial events in perfused heart or skeletal muscles in live animal. Real-time monitoring of single mitochondrial processes such as superoxide flashes and membrane potential fluctuations enables the evaluation of mitochondrial function in a physiologically relevant context and during pathological perturbations.

Tek Mitokondriyal süperoksit Bozulmamış Kalp Flaşlar veya konfokal Görüntüleme<em&gt; In Vivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

İzole Kan-perfüze Sıçan Akciğer Hazırlık Tek Mikrodamar Geçirgenliği miktarının

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

Ozmotik Su Geçirgenliği Katsayısı (P Ölçme<sub&gt; F</sub&gt;) Küresel Hücreleri: Bir Örnek olarak İzole Bitki protoplastlan

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and pathophysiology. This protocol describes a technique where mitochondria isolated from rodent tissue are immunolabeled and analyzed by flow cytometry. Mitochondria are isolated from rodent spinal cords and subjected to a rapid enrichment step so as to remove myelin, a major contaminant of mitochondrial fractions prepared from nervous tissue. Isolated mitochondria are then labeled with an antibody of choice and a fluorescently conjugated secondary antibody. Analysis by flow cytometry verifies the relative purity of mitochondrial preparations by staining with a mitochondrial specific dye, followed by detection and quantification of immunolabeled protein. This technique is rapid, quantifiable and high-throughput, allowing for the analysis of hundreds of thousands of mitochondria per sample. It is applicable to assess novel proteins at the mitochondrial surface under normal physiological conditions as well as the proteins that may become mislocalized to this organelle during pathology. Importantly, this method can be coupled to fluorescent indicator dyes to report on certain activities of mitochondrial subpopulations and is feasible for mitochondria from the central nervous system (brain and spinal cord) as well as liver.

Described here is a method to detect and quantify mitochondrial outer membrane proteins by immunolabeling of mitochondria isolated from rodent tissue and analysis by flow cytometry. This method can be extended to assess functional aspects of mitochondrial subpopulations.

İzole Mitokondri Akış Sitometrisi ile Dış Zar Proteinleri imüno

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

Farmakoloji Araştırma İzole Doku Banyo-uygulamalarda Düz Kas Fonksiyon Ölçümü

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Yüksek Verimli Mikroplate Solunum Ölçümler için Fare İskelet Kası Minimal Miktarları gelen Mitokondri İzolasyonu

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of myocardial metabolism have been linked to the development of contractile dysfunction and heart failure. Therefore, unraveling the link between metabolism and contraction should shed light on some of the mechanisms governing cardiac adaptation or maladaptation in disease states. The isolated working rat heart preparation can be used to follow, simultaneously and in real time, cardiac contractile function and flux of energy providing substrates into oxidative metabolic pathways. The present protocol aims to provide a detailed description of the methods used in the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of the rates of oxidation for glucose and fatty acids, the main energy providing substrates of the heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed. In brief, the technique is based on the supply of 14C- radiolabeled glucose and a 3H- radiolabeled long-chain fatty acid to an ex vivo beating heart via normothermic crystalloid perfusion. 14CO2 and 3H2O, end byproducts of the enzymatic reactions involved in the utilization of these energy providing substrates, are then quantitatively recovered from the coronary effluent. With knowledge of the specific activity of the radiolabeled substrates used, it is then possible to individually quantitate the flux of glucose and fatty acid in the oxidation pathways. Contractile function of the isolated heart can be determined in parallel with the appropriate recording equipment and directly correlated to metabolic flux values. The technique is extremely useful to study the metabolism/contraction relationship in response to various stress conditions such as alterations in pre and after load and ischemia, a drug or a circulating factor, or following the alteration in the expression of a gene product.

The following protocol describes the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed.

İzole Çalışma Sıçan Kalp Glukoz ve Yağ Asidi Oksidasyonu Oranlarının Belirlenmesine Yöntemleri

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a prerequisite for studying the physiology of the isolated organ and for many innovative applications that may be possible in the future, including perfusion decellularization for kidney bioengineering or the administration of anti-rejection or genome-editing drugs in high doses to prime the kidney for transplantation. During the time of the perfusion, the kidney can be manipulated, renal function can be assessed, and various pharmaceuticals administered. After the procedure, the kidney can be transplanted or processed for molecular biology, biochemical analysis, or microscopy.
This paper describes the perfusate and the surgical technique needed for the ex vivo perfusion of mouse kidneys. Details of the perfusion apparatus are given and data are presented showing the viability of the kidney&#39;s preparation: renal blood flow, vascular resistance, and urine data as functional, transmission electron micrographs of different nephron segments as morphological readouts, and western blots of transport proteins of different nephron segments as molecular readout.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. The buffers and surgical technique are described in detail.

Fare İzole perfüze Böbrek Tekniği

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

MitoCeption: Transferring Isolated Human MSC Mitochondria to Glioblastoma Stem Cells

Mitochondria play a central role for cell metabolism, energy production and control of apoptosis. Inadequate mitochondrial function has been found responsible for very diverse diseases, ranging from neurological pathologies to cancer. Interestingly, mitochondria have recently been shown to display the capacity to be transferred between cell types, notably from human mesenchymal stem cells (MSC) to cancer cells in coculture conditions, with metabolic and functional consequences for the mitochondria recipient cells, further enhancing the current interest for the biological properties of these organelles.
Evaluating the effects of the transferred MSC mitochondria in the target cells is of primary importance to understand the biological outcome of such cell-cell interactions. The MitoCeption protocol described here allows the transfer of the mitochondria isolated beforehand from the donor cells to the target cells, using MSC mitochondria and glioblastoma stem cells (GSC) as a model system. This protocol has previously been used to transfer mitochondria, isolated from MSCs, to adherent MDA-MB-231 cancer cells. This mitochondria transfer protocol is adapted here for GSCs that present the specific particularity of growing as neurospheres in vitro. The transfer of the isolated mitochondria can be followed by fluorescence-activated cell sorting (FACS) and confocal imaging using mitochondria vital dyes. The use of mitochondria donor and target cells with distinct haplotypes (SNPs) also allows detection of the transferred mitochondria based on the concentration of their circular mitochondrial DNA (mtDNA) in the target cells. Once the protocol has been validated with these criteria, the cells harboring the transferred mitochondria can be further analyzed to determine the effects of the exogenous mitochondria on biological properties such as cell metabolism, plasticity, proliferation and response to therapy.

Here, a protocol (MitoCeption) is presented to transfer mitochondria, isolated from human mesenchymal stem cells (MSC), to glioblastoma stem cells (GSC), with the goal of studying their biological effects on GSC metabolism and functions. A similar protocol can be adapted to transfer mitochondria between other cell types.