İç Mitokondriyal Membranın Na^+' ya Duyarlılığı Kısmen Segmente Edilmiş Fonksiyonel CoQ Havuzlarını Ortaya Çıkarır

Bu protokol, sodyumun ikinci bir haberci olarak rolünü vurgular ve ayrıca kısmen farklılaşmış ubikinol havuzlarının varlığını gösterir. Bu teknik, aksi takdirde çok spesifik hücre modelleri gerektiren ubikinol havuzlarının incelenmesi için son derece basit bir yaklaşım göstermektedir. Bu yaklaşım, diğer membranlarda, özellikle lipit damlaları içindeki enzimlerde elektron transferinin incelenmesi için kullanılabilir.

Numuneleri her biri 20 mikrogramlık dört alt örneğe bölün ve bunları A ila D.Split numuneleri A ve B'yi her biri 10 mikrogramlık iki alt örneğe bölün ve A1, A2, B1 ve B2 olarak etiketleyin. C1/C2 arabelleğini metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlayın ve 37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtın. Bir mililitrelik küvette, alt örneklerin her birini 30 mikrolitre sitokrom c ve 10 mikrolitre malonata ekleyin. A1 ve B1 küvetlerinde hacmi 980 mikrolitreye ve A2 ve B2'de 979 mikrolitreye çıkarmak için C1 / C2 tamponu ekleyin. A1 ve A2 küvetlerine 10 mikrolitre tek molar potasyum klorür ve B1 ve B2'ye 10 mikrolitre tek molar sodyum klorür ekleyin. A2 ve B2 küvetlerine bir mikrolitre bir milimolar rotenon ekleyin. Ölçümden hemen önce, tüm küvetlere 10 mikrolitre 10 milimolar NADH ekleyin.

Küveti üç kez çevirin ve spektrofotometreye yerleştirin. Ekli bir yazılım, Ölçüm'e ve ardından Parametreler'e tıklayın, ardından Genel'e gidin ve ölçüm parametrelerini 550 nanometre dalga boyuna ve dört dakikalık okumada zamana ayarlayın. Denemeye başlamak için Tamam'a ve Başlat'a tıklayın.

Ölçümün sonunda, Dosya üzerine tıklayarak emilimin doğrusal artışını içeren eğimi kaydedin ve C ve D örneklerini her biri 10 mikrogramlık iki alt örneğe kaydedin ve bunları C1, C2, D1 ve D2 olarak etiketleyin. Alt örneklerin her birini bir mililitrelik küvette 30 mikrolitre sitokrom c ve bir mikrolitre rotenon ile karıştırın. C1 ve D1 küvetlerinde hacmi 980 mikrolitreye ve C2 ve D2'de 970 mikrolitreye çıkarmak için 37 santigrat derecede önceden ısıtılmış C1 / C2 tamponu ekleyin. C1 ve C2 küvetlerine 10 mikrolitre tek molar potasyum klorür ve D1 ve D2'ye 10 mikrolitre tek molar sodyum klorür ekleyin. Ölçümden hemen önce C2 ve D2 küvetlerine bir mikrolitre bir milimolar antimisin A ve tüm küvetlere 10 mikrolitre tek molar süksinat ekleyin. Küveti üç kez çevirin ve spektrofotometreye yerleştirin.

Ölçümü gerçekleştirin ve ölçüm sonunda doğrusal absorbans artışını içeren eğimi kaydedin. Bu protokol, sodyum iyonlarının sitokrom c'nin mitokondriyal membranlar tarafından NADH veya süksinat ilavesi üzerine indirgenmesi üzerindeki etkisini incelemek için kullanıldı. A ve B örnekleri için 550 nanometrede üretilen absorbans izleri, karşılık gelen inhibisyonları için düzeltildi.

Bu izler, benzer NADH-sitokrom c oksidoredüktaz aktivitesini gösteren benzer bir eğim gösterdi. Bununla birlikte, C ve D örnekleri için izler farklıydı, bu da örnek C'nin süksinat-sitokrom c oksidoredüktaz aktivitesinin numuneninkinden daha yüksek olduğunu gösterdi D.In bu teknikle ölçülen değişim miktarını normalleştirmek için, izole kompleks I aktivitesi, kompleks II veya kompleks III gibi diğer yöntemler daha da uygulanabilir. Bu tekniği kullanarak, sodyumun ikinci bir haberci olarak dahil olabileceği fizyolojik ayarları araştırıyoruz.