Bu eser Amerikan Kalp Derneği (J.Q.K.) üzerinden hibe fon tarafından desteklenmiştir.

Bu protokol için açıklanan tüm yöntemleri kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi, Emory Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
Not: Mitokondrial Ca2 + akını bir plaka okuyucu kullanarak izole kardiyak mitokondri içinde ölçmek için deneysel işlemin ilk bölümüdür.
1. reaktifler ve çözümleri
<ol><li>MS-EGTA arabellek mitokondrial yalıtım için 500 mL olun: 225 mM mannitol, 75 mM sukroz, 5 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic asit (HEPES), 1 mM etilen glikol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-tetraacetic asit (EGTA), pH 7.4 için ayarlanabilir KOH ile. 0,22 mikron filtre sterilize ve 4 ° C'de saklayın MS-EGTA arabellek kullanmadan önce 4 ° c önceden soğutulmuş olduğundan emin olun.</li>
	<li>100 mL KCl arabelleği hazırlamak: 125 mM KCl, 20 mM HEPES, 1 mM KH2PO4, 2 mM MgCl2, 40 mikron EGTA ve pH 7.2 KOH ile için ayarlanabilir. Oda sıcaklığında saklayın.</li>
	<li>1 mM kalsiyum Dimetil sülfoksit (DMSO) yeşil-5N stokta hazır olun. Kalsiyum yeşil-5N stok aliquotted olabilir ve -20 ° C'de depolanan</li>
	<li>
Yüzeylerde Ca2 + alımı için hazırlayın.
	<ol>
<li>1 M sodyum pyruvate, pH 7.4 hazırlayın. Aliquots-20 ° C'de depolayın</li>
		<li>500 mM malat, pH 7.4 hazırlayın. Aliquots-20 ° C'de depolayın</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. kardiyak mitokondri yalıtım
<ol><li>Fareyi kurumsal standartlarına göre ötenazi. Not: ötenazi için bizim kurumsal olarak onaylanmış yöntemi fareler tarafından isofluorane inhalasyon anestezi ve servikal çıkığı tarafından kurban.</li>
	<li>Kalp, göğüs boşluğu açma, kaburga iki tarafında boyunca kesme, kalp kanat, uzakta diyafram kesme ve kalp doku bilincin tarafından toplamak. Not: Bu protokol için 3-4 deneyler için yeterli olmalıdır bir yetişkin fare (yaklaşık 120 mg), toplanan bütün yürekten mitokondrial yalıtım yapılır. Karaciğer gibi diğer mitokondri bakımından zengin dokular mitokondrial izolasyonu için en çok 200 mg doku açıklanan protokol sonrası kullanılabilir.</li>
	<li>Doku buz gibi 1 fosfat tamponlu tuz (PBS) tüm kan ventrikül dışarı sıkılmış sağlanması x 25 mL içinde iyice durulayın. Not: kalp dışarı sıkılmış sıvı açık çalıştığında kalbi yeterince durulanır.</li>
	<li>Kalbin buz gibi 1 x PBS keskin makas kullanarak 5 ml küçük parçalar halinde kıyma.</li>
	<li>PBS atın ve kıyılmış kalp doku 0,10-0.15 mm giriş izni önceden soğutulmuş 7 mL cam-teflon dounce homogenizer transfer.</li>
	<li>Buz gibi MS-EGTA arabellek 5 mL ekleyin ve doku parçaları artık görünür (yaklaşık 11 vuruş) kadar örnek lunaparkçı. Not: sağlam ve işler durumda mitokondri elde etmek için amaç olduğu gibi doku aşırı homojenize değil.</li>
	<li>Homogenate 15 mL tüp aktarın.</li>
	<li>Homogenate 600 x g çekirdeği ve kesilen hücreleri cips 5 min için 4 ° C'de, santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Bir taze 15 mL tüp süpernatant aktarmak ve 10.000 x g mitokondri cips için 10 dakika için 4 ° C'de, santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Süpernatant atın ve buz üzerinde mitokondrial Pelet koruyun.</li>
	<li>İki kez buz gibi MS-EGTA tampon kullanarak mitokondrial Pelet yıkayın. Her yıkama için mitokondrial Pelet MS-EGTA arabellek 5 mL resuspend, 10.000 x g 10 dk 4 ° C'de, santrifüj kapasitesi ve süpernatant atmak.</li>
	<li>Son yıkama sonra süpernatant atın ve mitokondri buz soğuk MS-EGTA arabellek 100 μL içinde resuspend. Mitokondri buz üzerinde tutun. Not: Mitokondri deneme 1 saat içinde kullanılmalıdır.</li>
	<li>Bir Bradford Protein tahlil26kullanarak mitokondrial protein konsantrasyonu ölçmek.</li>
</ol>3. plaka okuyucu tabanlı ölçümü mitokondrial kalsiyum alımı
Not: Burası multimod plaka okuyucu kullanarak mitokondrial Ca2 + alımı analiz enjektörleri ile donatılmış için protokol açıklanan. Herhangi bir plaka okuyucu kalsiyum yeşil-5N Floresans okuma yeteneği ile (uyarma/emisyon 506/532 nm) enjektörleri ışıktan korunan tepki tutmak için otomatik reaktif bir Kinetik modunda kullanılabilir.
<ol><li>Program bir Kinetik gerçekleştirmek için plaka okuyucu her saniye Toplam tahlil vakit geçirmek 1.000 alınan ölçümlere ile kalsiyum yeşil-5N Floresans okumak Ayrıca s., 5 μL CaCl2 çözüm 30 dağıtmak için reaktif enjektörleri program s, 150 s, 300 s , 480 s ve 690 s zaman puan. Not: CaCl2 enjeksiyonları zamanlaması kullanıcı tanımlı olan ve deneysel ihtiyaçlarına göre ayarlanabilir.</li>
	<li>Reaktif enjekte edenlerin CaCl2 çözüm ile kullanılmak üzere Başbakan. Not: CaCl2 çözüm konsantrasyonu kullanıcıya özgüdür ve sonraki çalışır MPTP açılış tetiklemek için Ca2 + miktarı titre için ayarlanabilir.</li>
	<li>Mitokondri 200 μg 96 iyi plaka tek tek bir şey için ekleyin.</li>
	<li>Öyle ki toplam hacmi mitokondri ve KCl arabellek için 197 μL gelir KCl arabellek uygun hacmi kuyuya ekleyin.</li>
	<li>1 M pyruvate 1 μL ve 500 mM malat 1 μL mitokondri karışıma ekleyin. Damlalıklı hafifçe karıştırın ve mitokondri mitokondri enerjik olmak izin vermek için oda sıcaklığında 2 min için yüzeyler ile kuluçkaya için.</li>
	<li>1 mM kalsiyum yeşil-5N stokunun 1 μL ekleyin. Pipetting tarafından karışımı yavaşça. Not: tepki kalsiyum yeşil-5N boya eklenmesi aşağıdaki ışıktan korumak.</li>
	<li>Önceden programlanmış Kinetik iletişim kuralı ve monitör kalsiyum yeşil-5N Floresans başlatın.</li>
</ol>4. reaktifler ve çözümleri
Not: İkinci bölümde mitokondrial Ca2 + kültürlü hücrelerdeki confocal görüntüleme için deneysel bir işlem olduğunu.
<ol><li>Tyrode'nın çözüm (130 mM NaCl, 4 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM glikoz ve 10 mM HEPES, pH 7.2 KOH ile) olun. 4 ° C'de depolayın O oda sıcaklığına kullanmadan önce sıcak.</li>
	<li>Yıkama çözüm (100 mM potasyum asetat, 15 mM KCl, 5 mM KH2PO4, 5 mM Mg-ATP, 0.35 mM EGTA, 0,12 mM CaCl2, 0,75 mM MgCl2, 10 mM phosphocreatine, 10 mM HEPES, pH 7.2 KOH ile) hazırlayın. 4 ° C'de depolayın O oda sıcaklığına kullanmadan önce sıcak.</li>
	<li>Permeabilization çözüm, %0,005 saponin yıkama çözüm içeren hazır olun. Taze günlük hazırlayın.</li>
	<li>0 hazırlamak Ca2 + iç çözüm (100 mM potasyum asetat, 15 mM KCl, 0.35 mM EGTA, 0,75 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7.2 KOH ile ayarlanır). 4 ° C'de depolayın O oda sıcaklığına kullanmadan önce sıcak.</li>
	<li>CA2 +içeren iç çözüm hazırlamak. Ücretsiz Ca2 +istenilen konsantrasyonu ulaşmak için CaCl2 iç çözüm ekleyin. Eklemek için CaCl2 miktarı MaxChelator programı (maxchelator.stanford.edu) kullanılarak hesaplanır.</li>
	<li>1 mM DMSO stokta Rhod-2/AM hazırlamak ve kadar kullanmak-20 ° C'de saklayın.</li>
	<li>1 mM MitoTracker yeşil DMSO stokta hazırlamak ve kadar kullanmak-20 ° C'de saklayın.</li>
</ol>5. kaplama hücreleri görüntüleme için
<ol><li>22 x 22 cm2 cam coverslips % 100 etanol ile yıkama ve kuru hava coverslips sağlar.</li>
	<li>Cam coverslips 6-iyi doku kültürü çanak bireysel kuyu yerleştirin. Not: Coverslips laminin, Poli-L-lizin veya hücre eki tanıtmak için benzer matrix ile kaplı olması.</li>
	<li>Trypsinize ve hücreleri görüntüleme gün üzerinde yaklaşık % 70 izdiham için amaçlayan coverslips üzerine plakası.</li>
</ol>6. yükleme hücreleri Rhod-2/AM ve MitoTracker yeşil
<ol><li>Rhod-2/AM-MitoTracker hazırlamak yeşil çalışma çözüm. 20 μL Rhod-2/AM 1 mM hisse senedi, MitoTracker yeşil 1 mM stokunun 0.2 μL ve Tyrode'nın çözüm % 20 pluronic F-127 1 ml 2.5 μL ekleyin. Rhod-2 son konsantrasyonu çalışma çözüm içinde 20 µM ve MitoTracker yeşil son konsantrasyonu 200 nM.</li>
	<li>Yavaşça büyüme medya coverslip çıkarın. Not: Bir yıkama adım boya çözüm ek önce gerekli değildir.</li>
	<li>Rhod-2/AM-MitoTracker eklemek kadar coverslip sadece coverslip üzerine dropwise bir biçimde yeşil çözüm kaplı (yaklaşık 3-4 damla coverslip başına).</li>
	<li>Işık hücreleri Boyar maddeler ile yüklemek izin vermek için korumalı oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>Rhod-2/AM de-esterify. Yavaşça çıkarın Rhod-2/AM-MitoTracker yeşil çözüm, eski yerine koymak o ile taze oda sıcaklığında Tyrode'nın çözüm ve ışıktan korunan oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.</li>
</ol>7. mitokondrial Rhod-2/AM ve MitoTracker yeşil Floresans confocal görüntüleme
<ol><li>Coverslip odası Imaging mikroskop aktarmak ve odası yıkama çözüm ile doldurun.</li>
	<li>Faz kontrast 40 X hücrelerde gözlemlemek için Ayarlar'ın altında hücreleri görünür hale gelene kadar ve odak odak ayarlamak.</li>
	<li>
Rhod-2/AM-MitoTracker plazma zarı permeabilize yeşil boya mitokondri lokalize koruyarak sitozol lokalize Rhod-2, kaldırmak için hücreleri yüklü.
	<ol>
<li>Yıkama çözüm coverslip kaldırın.</li>
		<li>Yaklaşık 1 dak Permeabilization çözüm ile değiştirin.</li>
		<li>Görsel olarak permeabilization sürecinde plazma zarı Morfoloji izlemek. Permeabilized hücre yapısı bir yüzey gelişecektir.</li>
		<li>Permeabilization tamamlandığında, hemen Permeabilization çözümü kaldırmak ve 0 Ca2 + ile iç çözüm değiştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aynı anda Rhod-2 floresan (559 nm lazer çizgi ve emisyon dalga boylarında 575-675 nm arasında toplanan kullanarak uyarma) görüntü ve MitoTracker yeşil floresan (uyarma 488nm lazer çizgi ve dalga boyu arasında toplanan emisyon kullanma 505-525 nm). Permeabilized hücre Rhod-2 ve MitoTracker yeşil açık bir colocalization görüntüleme odaklanın.</li>
	<li>Mikroskop lazer azaltmak ve mitokondrial Rhod-2 floresan loş ve sadece görünür olacak ayarları kazanç.</li>
	<li>Belirli bir uygulama için bir uygun çerçeve oranı ve saat ders 2-boyutlu taramalar elde etmek için mikroskop ayarları'nı seçin. En az 30 kare/s kare hızı doğru değişimler mitokondrial Ca2 +Kinetik yakalamak için önerilir.</li>
	<li>0 Ca2 + iç çözüm hücreleri ya da mikroskop odak bozmadan kaldırın.</li>
	<li>Resim alma başlatın.</li>
	<li>CA2 +Ekle-10 s zaman dolu iç çözüm noktası el ile veya bir perfüzyon sistemi ile.</li>
	<li>Faiz (ROIs colocalization arasında mitokondrial Rhod-2 ve MitoTracker yeşil sinyal görüntü edinme yazılımında bölgelerinde kapsayacak şekilde) bölgeleri seçin. Not: Rasgele floresan (F) değerleri kayıt her zaman için her yatırım Getirisi için elde edilir. Bu değerler çıkartılır ve (önce Ca2 + ek; ilk floresan için normalleştirilmiş arka plan F0) ve veri sunumu ve genlik değişikliğinin mitokondrial Ca2 +miktar için zaman içinde F/F0 çizilen.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Deluca, H. F., Engstrom, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+uptake+by+rat+kidney+mitochondria.">Calcium uptake by rat kidney mitochondria.</a> P Natl Acad Sci USA. 47, 1744-1750 (1961).</li><li>Lehninger, A. L., Rossi, C. S., Greenawalt, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiration-dependent+accumulation+of+inorganic+phosphate+and+Ca+ions+by+rat+liver+mitochondria.">Respiration-dependent accumulation of inorganic phosphate and Ca ions by rat liver mitochondria.</a> Biochem Biophys Res Co. 10, 444-448 (1963).</li><li>Kwong, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+calcium+uniporter+in+the+heart:+energetics+and+beyond.">The mitochondrial calcium uniporter in the heart: energetics and beyond.</a> J Physiol. 595 (12), 3743-3751 (2017).</li><li>Denton, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mitochondrial+dehydrogenases+by+calcium+ions.">Regulation of mitochondrial dehydrogenases by calcium ions.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (11), 1309-1316 (2009).</li><li>Jouaville, L. S., Pinton, P., Bastianutto, C., Rutter, G. A., Rizzuto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mitochondrial+ATP+synthesis+by+calcium:+evidence+for+a+long-term+metabolic+priming.">Regulation of mitochondrial ATP synthesis by calcium: evidence for a long-term metabolic priming.</a> P Natl Acad Sci USA. 96 (24), 13807-13812 (1999).</li><li>Haworth, R. A., Hunter, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ca2+-induced+membrane+transition+in+mitochondria.+II.+Nature+of+the+Ca2++trigger+site.">The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. II. Nature of the Ca2+ trigger site.</a> Arch Biochem Biophys. 195 (2), 460-467 (1979).</li><li>Hunter, D. R., Haworth, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ca2+-induced+membrane+transition+in+mitochondria.+I.+The+protective+mechanisms.">The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. I. The protective mechanisms.</a> Arch Biochem Biophys. 195 (2), 453-459 (1979).</li><li>Kwong, J. Q., Molkentin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+and+pathological+roles+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore+in+the+heart.">Physiological and pathological roles of the mitochondrial permeability transition pore in the heart.</a> Cell Metab. 21 (2), 206-214 (2015).</li><li>Luongo, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+Na+/Ca2++exchanger+is+essential+for+Ca2++homeostasis+and+viability.">The mitochondrial Na+/Ca2+ exchanger is essential for Ca2+ homeostasis and viability.</a> Nature. 545 (7652), 93-97 (2017).</li><li>De Stefani, D., Patron, M., Rizzuto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter+complex.">Structure and function of the mitochondrial calcium uniporter complex.</a> Biochim Biophys Acta. 1853 (9), 2006-2011 (2015).</li><li>Baughman, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genomics+identifies+MCU+as+an+essential+component+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 476 (7360), 341-345 (2011).</li><li>De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szabo, I., Rizzuto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+forty-kilodalton+protein+of+the+inner+membrane+is+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 476 (7360), 336-340 (2011).</li><li>Pan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiological+role+of+mitochondrial+calcium+revealed+by+mice+lacking+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">The physiological role of mitochondrial calcium revealed by mice lacking the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nat Cell Biol. 15 (12), 1464-1472 (2013).</li><li>Kwong, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mitochondrial+Calcium+Uniporter+Selectively+Matches+Metabolic+Output+to+Acute+Contractile+Stress+in+the+Heart.">The Mitochondrial Calcium Uniporter Selectively Matches Metabolic Output to Acute Contractile Stress in the Heart.</a> Cell Rep. 12 (1), 15-22 (2015).</li><li>Luongo, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mitochondrial+Calcium+Uniporter+Matches+Energetic+Supply+with+Cardiac+Workload+during+Stress+and+Modulates+Permeability+Transition.">The Mitochondrial Calcium Uniporter Matches Energetic Supply with Cardiac Workload during Stress and Modulates Permeability Transition.</a> Cell Rep. 12 (1), 23-34 (2015).</li><li>Brown, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expert+consensus+document:+Mitochondrial+function+as+a+therapeutic+target+in+heart+failure.">Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure.</a> Nat Rev Cardiol. 14 (4), 238-250 (2017).</li><li>Logan, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss-of-function+mutations+in+MICU1+cause+a+brain+and+muscle+disorder+linked+to+primary+alterations+in+mitochondrial+calcium+signaling.">Loss-of-function mutations in MICU1 cause a brain and muscle disorder linked to primary alterations in mitochondrial calcium signaling.</a> Nat Genet. 46 (2), 188-193 (2014).</li><li>Lewis-Smith, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homozygous+deletion+in+MICU1+presenting+with+fatigue+and+lethargy+in+childhood.">Homozygous deletion in MICU1 presenting with fatigue and lethargy in childhood.</a> Neurol Genet. 2 (2), e59 (2016).</li><li>Tosatto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+calcium+uniporter+regulates+breast+cancer+progression+via+HIF-1alpha.">The mitochondrial calcium uniporter regulates breast cancer progression via HIF-1alpha.</a> EMBO Mol Med. 8 (5), 569-585 (2016).</li><li>Cardenas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Vulnerability+of+Cancer+Cells+by+Inhibition+of+Ca(2+)+Transfer+from+Endoplasmic+Reticulum+to+Mitochondria.">Selective Vulnerability of Cancer Cells by Inhibition of Ca(2+) Transfer from Endoplasmic Reticulum to Mitochondria.</a> Cell Rep. 15 (1), 219-220 (2016).</li><li>Dedkova, E. N., Blatter, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+in+cardiac+mitochondria.">Calcium signaling in cardiac mitochondria.</a> J Mol Cell Cardiol. 58, 125-133 (2013).</li><li>Florea, S. M., Blatter, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mitochondria+for+the+regulation+of+cardiac+alternans.">The role of mitochondria for the regulation of cardiac alternans.</a> Front Physiol. 1, 141 (2010).</li><li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators.">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1057-1065 (2006).</li><li>Bonora, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+calcium+measurements+in+mammalian+cells+using+jellyfish+photoprotein+aequorin-based+probes.">Subcellular calcium measurements in mammalian cells using jellyfish photoprotein aequorin-based probes.</a> Nat Protoc. 8 (11), 2105-2118 (2013).</li><li>Zima, A. V., Kockskamper, J., Mejia-Alvarez, R., Blatter, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyruvate+modulates+cardiac+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++release+in+rats+via+mitochondria-dependent+and+-independent+mechanisms.">Pyruvate modulates cardiac sarcoplasmic reticulum Ca2+ release in rats via mitochondria-dependent and -independent mechanisms.</a> J Physiol. 550 (Pt 3), 765-783 (2003).</li><li>Kruger, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bradford+method+for+protein+quantitation.">The Bradford method for protein quantitation.</a> Methods Mol Biol. 32, 9-15 (1994).</li><li>Zazueta, C., Sosa-Torres, M. E., Correa, F., Garza-Ortiz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+properties+of+ruthenium+amine+complexes+on+mitochondrial+calcium+uptake.">Inhibitory properties of ruthenium amine complexes on mitochondrial calcium uptake.</a> J Bioenerg Biomembr. 31 (6), 551-557 (1999).</li><li>Davidson, S. M., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+mitochondrial+calcium+signalling+with+fluorescent+probes+and+single+or+two+photon+confocal+microscopy.">Imaging mitochondrial calcium signalling with fluorescent probes and single or two photon confocal microscopy.</a> Methods Mol Biol. 810, 219-234 (2012).</li><li>Matlib, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-bridged+dinuclear+ruthenium+amine+complex+specifically+inhibits+Ca2++uptake+into+mitochondria+in+vitro+and+in+situ+in+single+cardiac+myocytes.">Oxygen-bridged dinuclear ruthenium amine complex specifically inhibits Ca2+ uptake into mitochondria in vitro and in situ in single cardiac myocytes.</a> J Biol Chem. 273 (17), 10223-10231 (1998).</li><li>Chamberlain, B. K., Volpe, P., Fleischer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+calcium-induced+calcium+release+from+purified+cardiac+sarcoplasmic+reticulum+vesicles.">Inhibition of calcium-induced calcium release from purified cardiac sarcoplasmic reticulum vesicles.</a> J Biol Chem. 259 (12), 7547-7553 (1984).</li></ol>

Yazarlar hiçbir açıklamaları rapor var.

Burada, mitokondrial Ca2 + akını ölçmek için iki farklı yaklaşımlar açıklayın. Plaka okuyucu tabanlı kalsiyum yeşil-5N yöntemi monitörler extramitochondrial Ca2 + düzeyleri ve izole mitokondri ölçümlerde için de uygun olan bir Ca2 + alımı tahlil olduğunu. Biz izole fare kardiyak mitokondri temsilcisi sonuçlar göstermiştir, bu tahlil dokulardan karaciğer, kas iskelet ve beyin de dahil olmak üzere yüksek mitokondrial bereket ile izole mitokondri için kolayca ad...

Mitokondri intrasellüler Ca2 + depolama ve sinyal kritik siteler vardır. Onlarca yıllık araştırma mitokondri yeteneği alma ve Ca2 + 1,2çekilmek zorunda gösterdi. Mitokondri, ancak, Ca2 + depolama sadece pasif siteler değildir. CA2 + mitokondrial yuvası, metabolik çıkış düzenlenmesi de dahil olmak üzere temel sinyal işlevleri gerçekleştirir ve olmuştur harekete geçirmek-in mitokondrial aracılı hücre ölüm yolları, daha önce3gözden. Metabolik regülasyon için Ca2 + üç matris lokalize dehydrogenases tricarboxylic asit döngüsü hem de solunum zinciri kompleksleri, mitokondrial enerji üretim4,5 artırmak için etkinliğini artırır . Mitokondrial Ca2 + aşırı yük ve mitokondrial Ca işleme2 + dysregulated ile Ca2 + Tetikleyicileri mitokondrial geçirgenliği geçiş (MPTP) açılış, mitokondriyal iç zar permeabilization için önde gelen gözenek, membran potansiyel kaybı, şişme, mitokondrial disfonksiyon rüptürü ve sonuçta, hücre ölüm6,7,8,9. Böylece, mitokondrial Ca2 + sinyal doğrudan hücresel yaşam ve ölüm yolları metabolik kontrol ve MPTP-ölüm eksen etkiler.
Son yıllarda, orada hızla mitokondrial Ca2 + dinamikleri nedeniyle çalışmanın ilgi genişleyen büyük kısmı mitokondrial Ca2 + uniporter karmaşık moleküler bileşenlerin tanımlaması için mitokondri iç bir baş tarz-in Ca2 + şey zar ışınlama mitokondrial matris 10,11,12alın. Bu yapısal ve düzenleyici alt birimleri uniporter, tanımlaması ileri genetik olarak mitokondriyal Ca2 + akını mitokondriyal işlev ve fonksiyon bozukluğu modüle için hedefleme olasılığı getirdi ve çalışma kolaylaştırdı uniporter karmaşık ve mitokondrial Ca2 + akını hastalığı13,14,15' e katkı. Nitekim, mitokondrial Ca2 + sinyal hastalıkları kalp hastalığı ateş ve kanser16,17,18kadar çeşitli bir dizi patolojiler de karıştığı olmuştur, 19,20.
Temel metabolizması ve hücre ölümüne içinde sinyal mitokondrial Ca2 + önemi göz önüne alındığında ve biyolojik sistemleri geniş ulaşmak ile kombine o mitokondrial Ca2 + sinyal etkiler, mitokondrial Ca2 + değerlendirmek için yöntemleri akın büyük ilgi vardır. Doğal olarak, çeşitli teknikler ve araçlar mitokondrial Ca2 + ölçmek için geliştirilmiştir. Bu alet öyle aynı derecede floresan Ca2 +kullanmak yöntemleri içerir-hassas boyalar21,22 ve mitokondri cameleon ve aequorin23, gibi hedefleyen genetik olarak kodlanmış Ca2 + sensörler 24. Bu makalede, farklı yöntemler ve mitokondrial Ca2 + alımı ölçülebilir sistemleri modellemek vurgulamak için hedeftir. Biz mitokondrial Ca2 + akını kapasitesini değerlendirmek için iki deneysel yöntem mevcut. Kardiyak mitokondri örnek olarak kullanarak, bir plaka okuyucu tabanlı platform ayrıntı mitokondrial Ca2 + ölçmek için Ca2 + hassas kullanarak alımı boya kalsiyum yeşil-5N izole doku mitokondri14 için idealdir . Kültürlü NIH 3T3 hücreleri kullanarak, Ayrıca görüntüleme tabanlı bir confocal mikroskobu tahlil mitokondrial Ca2 + permeabilized hücrelerdeki Ca2 + hassas boya Rhod-2/AM25kullanarak ölçüm için açıklar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Olympus FV1000 Laser Scanning confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy Neo2 Multimode microplate reader with injectors</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Homogenizer</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>886000-0022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 x 22 mm coverslips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2850-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Green-5N</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C3737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker green FM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M7514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhod-2, AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R1244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P3000MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>8510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E8145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-malic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium acetate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP364-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate magnesium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatine disodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ru360</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>557440</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyses of mitochondrial calcium influx in isolated mitochondria and cultured cells

Mitokondri tarafından işleme Ca2 + hücreleri geniş bir yelpazede fizyolojik ve patofizyolojik işlemlerinde düzenleyen bir kritik işlevdir. Yeteneği doğru akın ve sızma Ca2 + mitokondri üzerinden ölçmek için bu işlemlerde işleme mitokondrial Ca2 + rolünü belirlemek için önemlidir. Bu rapor halinde mitokondrial Ca2 + işleme izole mitokondri ve kültürlü hücreleri ölçümü için iki yöntem sunar. Biz ilk Ca2 + hassas boya kalsiyum yeşil-5N kullanarak mitokondrial Ca2 + alımı ölçmek için plaka okuyucu tabanlı platform ayrıntı. Plaka okuyucu tabanlı biçimi özel ekipman ihtiyacını kaçınmanızı sağlar ve kalsiyum yeşil-5N boya Ca2 + izole doku mitokondri üzerinden ölçmek için idealdir. Bizim uygulamamız için ölçüm mitokondrial Ca2 + Alım fare kalp dokusundan izole mitokondri içinde açıklar; Ancak, bu yordamı diğer doku karaciğer, kas iskelet ve beyin gibi gelen izole mitokondri mitokondrial Ca2 + anlamazdın ölçmek için uygulanır. İkinci olarak, biz bir confocal mikroskobu tabanlı tahlil mitokondrial Ca2 + Ca2 + hassas boya Rhod-2/AM kullanarak ve 2 boyutlu lazer tarama mikroskobu kullanarak görüntüleme permeabilized hücrelerdeki ölçüm için tanımlamak. Bu permeabilization Protokolü sitozolik boya kirlenme, mitokondrial Ca2 +değişikliklerin belirli kayıt için izin ortadan kaldırır. Ayrıca, lazer tarama mikroskobu yüksek kare hızları mitokondrial Ca2 + çeşitli ilaçlar veya dış çözümde uygulanan reaktifler yanıt olarak hızlı değişimlerin yakalamak için izin verir. Bu iletişim kuralı mitokondrial Ca2 + anlamazdın kardiyak miyositler ve nöronlar ve ölümsüzleştirdi hücre hatları gibi Primer hücre de dahil olmak üzere birçok hücre tipleri ölçmek için uygulanır.

Şekil 1 gösterir mitokondrial Ca2 + alımı ölçümleri plaka okuyucu tabanlı platformu kullanarak izole kardiyak mitokondri içinde ve Ca2 + boya kalsiyum yeşil-5N. Denetim koşullarda (şekil 1A), kardiyak mitokondri kalsiyum yeşil-5N içeren KCl arabellekte askıya ve 30'eklendi CaCl2 (0.6 mm CaCl2 çözüm 5 μL) ve ardışık darbeleri ile meydan s, 150 s, 300 s, 480 s ve 690...

Watch this Scientific Journal Video about Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells at JoVE.com

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Mitokondrial kalsiyum akını izole mitokondri ve kültürlü hücreleri analizleri

Burada, iki protokol mitokondrial Ca2 + akını izole mitokondri ve kültürlü hücreleri ölçümü için mevcut. İzole mitokondri için biz bir plaka okuyucu tabanlı Ca2 + alma detaylı tahlil Ca2 + hassas kullanarak boya kalsiyum yeşil-5N. Kültürlü hücreler için Ca2 + boya Rhod-2/AM kullanarak bir confocal mikroskopi yöntemi açıklanmaktadır.

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

analyses-mitochondrial-calcium-influx-isolated-mitochondria-cultured

Research

JoVE Journal

Biochemistry

13.7K Görüntüleme.  Emory University School of Medicine. Burada, iki protokol mitokondrial Ca2 + akını izole mitokondri ve kültürlü hücreleri ölçümü için mevcut. İzole mitokondri için biz bir plaka okuyucu tabanlı Ca2 + alma detaylı tahlil Ca2 + hassas kullanarak boya kalsiyum yeşil-5N. Kültürlü hücreler için Ca2 + boya Rhod-2/AM kullanarak bir confocal mikroskopi yöntemi açıklanmaktadır.

Video: Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için<em&gt; İn Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Biyokimya

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently tagged proteins have revolutionized the study of subcellular protein distribution. However, it is difficult to quantify the distribution with fluorescent microscopy, especially when proteins are partially cytosolic. Moreover, it is often important to study endogenous proteins. Biochemical assays such as immunoblots remain the gold standard for quantification of protein distribution after subcellular fractionation. Although there are commercial kits that aim to isolate cytosolic or certain membrane fractions, most of these kits are based on extraction with detergents, which may be unsuitable for studying peripheral membrane proteins that are easily extracted from membranes. Here we present a detergent-free protocol for cellular homogenization by nitrogen cavitation and subsequent separation of cytosolic and membrane-bound proteins by ultracentrifugation. We confirm the separation of subcellular organelles in soluble and pellet fractions across different cell types, and compare protein extraction among several common non-detergent-based mechanical homogenization methods. Among several advantages of nitrogen cavitation is the superior efficiency of cellular disruption with minimal physical and chemical damage to delicate organelles. Combined with ultracentrifugation, nitrogen cavitation is an excellent method to examine the shift of peripheral membrane proteins between cytosolic and membrane fractions.

Here we present protocols for detergent-free homogenization of cultured mammalian cells based on nitrogen cavitation and subsequent separation of cytosolic and membrane-bound proteins by ultracentrifugation. This method is ideal for monitoring the partitioning of peripheral membrane proteins between soluble and membrane fractions.

Azot kavitasyon ve diferansiyel Santrifüjü sağlar periferik membran proteinlerinin kültürlü hücrelerdeki dağılımını izlemek için

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from the oxidation of reduced compounds such as nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and flavin adenine dinucleotide (FADH2). The complete annotation of the Arabidopsis thaliana genome has established it as the most widely used plant model system, and thus the need to purify mitochondria from a variety of organs (leaf, root, or flower) is necessary to fully utilize the tools that are now available for Arabidopsis to study mitochondrial biology. Mitochondria are isolated by homogenization of the tissue using a variety of approaches, followed by a series of differential centrifugation steps producing a crude mitochondrial pellet that is further purified using continuous colloidal density gradient centrifugation. The colloidal density material is subsequently removed by multiple centrifugation steps. Starting from 100 g of fresh leaf tissue, 2 - 3 mg of mitochondria can be routinely obtained. Respiratory experiments on these mitochondria display typical rates of 100 - 250 nmol O2 min-1 mg total mitochondrial protein-1 (NADH-dependent rate) with the ability to use various substrates and inhibitors to determine which substrates are being oxidized and the capacity of the alternative and cytochrome terminal oxidases. This protocol describes an isolation method of mitochondria from Arabidopsis thaliana leaves using continuous colloidal density gradients and an efficient respiratory measurements of purified plant mitochondria.

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

As mitochondria are only a small percentage of the plant cell, they need to be purified for a range of studies. Mitochondria can be isolated from a variety of plant organs by homogenization, followed by differential and density gradient centrifugation to obtain a highly purified mitochondrial fraction.

Yalıtım ve solunum ölçümleri mitokondri Arabidopsis thaliana üzerinden

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle

Oxygen consumption, proton motive force (PMF) and proton leak are measurements of mitochondrial respiration, or how well mitochondria are able to convert NADH and FADH into ATP. Since mitochondria are also the primary site for oxygen use and nutrient oxidation to carbon dioxide and water, how efficiently they use oxygen and produce ATP directly relates to the efficiency of nutrient metabolism, nutrient requirements of the animal, and health of the animal. The purpose of this method is to examine mitochondrial respiration, which can be used to examine the effects of different drugs, diets and environmental effects on mitochondrial metabolism. Results include oxygen consumption measured as proton dependent respiration (State 3) and proton leak dependent respiration (State 4). The ratio of State 3 / State 4 respiration is defined as respiratory control ratio (RCR) and can represent mitochondrial energetic efficiency. Mitochondrial proton leak is a process that allows dissipation of mitochondrial membrane potential (MMP) by uncoupling oxidative phosphorylation from ADP decreasing the efficiency of ATP synthesis. Oxygen and TRMP+ sensitive electrodes with mitochondrial substrates and electron transport chain inhibitors are used to measure State 3 and State 4 respiration, mitochondrial membrane PMF (or the potential to produce ATP) and proton leak. Limitations to this method are that liver tissue must be as fresh as possible and all biopsies and assays must be performed in less than 10 h. This limits the number of samples that can be collected and processed by a single person in a day to approximately 5. However, only 1 g of liver tissue is needed, so in large animals, such as dairy cattle, the amount of sample needed is small relative to liver size and there is little recovery time needed.

Here, we share methods for measuring mitochondrial oxygen consumption, a defining concept of nutritional energetics, and proton leak, the primary cause of inefficiency in mitochondrial generation of ATP. These results can account for 30% of the energy lost in nutrient utilization to help evaluate mitochondrial function.

Karaciğer mitokondrial oksijen tüketimi ve Proton sızıntı kinetik Holstein süt sığır mitokondrial solunum tahmin etmek için ölçme

Oxygen consumption, proton motive force (PMF) and proton leak are measurements of mitochondrial respiration, or how well mitochondria are able to convert ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary mechanism of amyloid aggregate-induced toxicity in neurodegenerative diseases. However, most reports describing the mechanisms of membrane disruption are based on phospholipid model systems, and studies directly targeting events occurring at the level of biological membranes are rare. Described here is a model for studying the mechanisms of amyloid toxicity at the membrane level. For mitochondrial isolation, density gradient medium is used to obtain preparations with minimal myelin contamination. After mitochondrial membrane integrity confirmation, the interaction of amyloid fibrils arising from &#945;-synuclein, bovine insulin, and hen egg white lysozyme (HEWL) with rat brain mitochondria, as an in vitro biological model, is investigated. The results demonstrate that treatment of brain mitochondria with fibrillar assemblies can cause different degrees of membrane permeabilization and ROS content enhancement. This indicates structure-dependent interactions between amyloid fibrils and mitochondrial membrane. It is suggested that biophysical properties of amyloid fibrils and their specific binding to mitochondrial membranes may provide explanations for some of these observations.

Provided here is a protocol for investigating the interactions between native form, prefibrillar, and mature amyloid fibrils of different peptides and proteins with mitochondria isolated from different tissues and various areas of the brain.

Amiloid Fibrils ile Beyin Mitokondrisi ile Etkileşimler ve Membran Permeabilizasyonu

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore

Eryptosis, erythrocyte programmed cell death, occurs in a number of hematological diseases and during injury to erythrocytes. A hallmark of eryptotic cells is the loss of compositional asymmetry of the cell membrane, leading to the translocation of phosphatidylserine to the membrane outer leaflet. This process is triggered by increased intracellular concentration of Ca2+, which activates scramblase, an enzyme that facilitates bidirectional movement of phospholipids between membrane leaflets. Given the importance of eryptosis in various diseased conditions, there have been efforts to induce eryptosis in vitro. Such efforts have generally relied on the calcium ionophore, ionomycin, to enhance intracellular Ca2+ concentration and induce eryptosis. However, many discrepancies have been reported in the literature regarding the procedure for inducing eryptosis using ionomycin. Herein, we report a step-by-step protocol for ionomycin-induced eryptosis in human erythrocytes. We focus on important steps in the procedure including the ionophore concentration, incubation time, and glucose depletion, and provide representative result. This protocol can be used to reproducibly induce eryptosis in the laboratory.

A protocol for the induction of eryptosis, programmed cell death in erythrocytes, using the calcium ionophore, ionomycin, is provided. Successful eryptosis is evaluated by monitoring the localization phosphatidylserine in the membrane outer leaflet. Factors affecting the success of the protocol have been examined and optimal conditions provided.

Kalsiyum İyonofor Kullanarak Kırmızı Kan Hücrelerinde Eritotoz İndüksiyonu

Eryptosis, erythrocyte programmed cell death, occurs in a number of hematological diseases and during injury to erythrocytes. A hallmark of eryptotic ...

Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry

Mounting evidence has shown that the accumulation of senescent cells in the central nervous system contributes to neurodegenerative disorders such as Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s diseases. Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest that typically occurs in response to exposure to sub-lethal stresses. However, like other non-dividing cells, senescent cells remain metabolically active and carry out many functions that require unique transcriptional and translational demands and widespread changes in the intracellular and secreted proteomes. Understanding how protein synthesis and decay rates change during senescence can illuminate the underlying mechanisms of cellular senescence and find potential therapeutic avenues for diseases exacerbated by senescent cells. This paper describes a method for proteome-scale evaluation of protein half-lives in non-dividing cells using pulsed stable isotope labeling by amino acids in cell culture (pSILAC) in combination with mass spectrometry. pSILAC involves metabolic labeling of cells with stable heavy isotope-containing versions of amino acids. Coupled with modern mass spectrometry approaches, pSILAC enables the measurement of protein turnover of hundreds or thousands of proteins in complex mixtures. After metabolic labeling, the turnover dynamics of proteins can be determined based on the relative enrichment of heavy isotopes in peptides detected by mass spectrometry. In this protocol, a workflow is described for the generation of senescent fibroblast cultures and similarly arrested quiescent fibroblasts, as well as a simplified, single-time point pSILAC labeling time-course that maximizes coverage of anticipated protein turnover rates. Further, a pipeline is presented for the analysis of pSILAC mass spectrometry data and user-friendly calculation of protein degradation rates using spreadsheets. The application of this protocol can be extended beyond senescent cells to any non-dividing cultured cells such as neurons.

This protocol describes the workflow for metabolic labeling of senescent and non-dividing cells with pulsed SILAC, untargeted mass spectrometry analysis, and a streamlined calculation of protein half-lives.

Metabolik Etiketleme ve Kütle Spektrometrisi ile Yaşlanan ve Bölünmeyen Kültürlü Hücrelerde Protein Devir Hızlarının Ölçülmesi

Mounting evidence has shown that the accumulation of senescent cells in the central nervous system contributes to neurodegenerative disorders such as ...

mtDNA'nın sentezi ve dağılımının yüksek verimli miktar tayini

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells produce most of their ATP in the mitochondria by oxidative phosphorylation. Mitochondria are unique organelles because they have their own genome that is replicated and passed on to the next generation of cells. In contrast to the nuclear genome, there are multiple copies of the mitochondrial genome in the cell. The detailed study of the mechanisms responsible for the replication, repair, and maintenance of the mitochondrial genome is essential for understanding the proper functioning of mitochondria and whole cells under both normal and disease conditions. Here, a method that allows the high-throughput quantification of the synthesis and distribution of mitochondrial DNA (mtDNA) in human cells cultured in vitro is presented. This approach is based on the immunofluorescence detection of actively synthesized DNA molecules labeled by 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) incorporation and the concurrent detection of all the mtDNA molecules with anti-DNA antibodies. Additionally, the mitochondria are visualized with specific dyes or antibodies. The culturing of cells in a multi-well format and the utilization of an automated fluorescence microscope make it easier to study the dynamics of mtDNA and the morphology of mitochondria under a variety of experimental conditions in a relatively short time.

Yazar Spotlight: Mitokondriyal DNA Sentezi ve Dağılımının Yüksek Verimli Görüntü Tabanlı Miktar Tayini  

A procedure for studying the dynamics of mitochondrial DNA (mtDNA) metabolism in cells using a multi-well plate format and automated immunofluorescence imaging to detect and quantify mtDNA synthesis and distribution is described. This can be further used to investigate the effects of various inhibitors, cellular stresses, and gene silencing on mtDNA metabolism.

Mitokondriyal DNA Sentezi ve Dağılımının Yüksek Verimli Görüntü Tabanlı Nicelleştirilmesi

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...