Yazarlar NIH Müdür&#39;ün Yeni Yenilikçi Ödülleri (1DP2 OD006499-01 AA ve 1DP2 AJE için OD006460-01) destek ve Bilim ve Teknoloji (Nanotıp Mükemmellik UC San Diego Merkezi) King Abdulaziz City için minnettarız. Biz el yazması onu eleştirel yorumlar için Bayan Jessica Moore teşekkür etmek istiyorum.

1. Floresan etiketli akriloil-PEG-RGDS sentezi <ol><li> , Oda sıcaklığında, argon altında, dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 1.2:1:2 molar oranda ve NN diizopropiletilamin (DIPEA): akriloil-PEG-karboksimetil süksinimidil ester (3400 g / mol aPEG-SCM, PEG MW) RGDS peptid React gecede. </li><li> Uçuş matriks destekli lazer desorpsiyon / iyonizasyon zamanı (MALDI-TOF) kütle spektrometresi ile konjugasyon onaylayın. MALDI hedef ve kuru bir örnek nokta aPEG-Rgds Reaksiyon çözeltisi 1 ul ekleyin. Üniversal MALDI tetrahidrofuran Matris (THF) ve 1 dakika süreyle girdap doymuş bir çözeltisi hazırlayın. Aynı örnek nokta bu çözüm ~ 1 ul ekleyin. Karşılaştırma için aPEG-SCM için prosedürü tekrarlayın. Yük ve analiz. APEG-Rgds molekül ağırlığı aPEG-SCM (Şekil 2) fazla olmalıdır. </li><li> Florofor olarak konjuge edifmesi için, çözülmüş Alexa Fluor 350 karboksilik asit (succinimydyl ester) bir eşit mol miktarı eklemekDMSO en az bir hacim içinde, 1.1 &#39;dan aPEG-RGDS reaksiyon çözeltisi ile ve gece boyunca oda sıcaklığında, argon altında reaksiyona girerler. </li><li> Günde en az iki kez diyalizat değişimi, 1.000:1 hacimsel oranı az 48 saat süreyle 4 ° C&#39;de DI-H 2 O karşı (MW 3500 Da) diyaliz tarafından aPEG-Rgds-350 arındırın. </li><li> Saflaştırılmış bir Labconco Freezone Plus veya eşdeğer bir dondurma kuru sisteminde aPEG-Rgds-350 ve -20 ° C&#39;de mağaza kuru dondurun </li></ol> 2. Rgds-350 Katmanlar Alternatif bir 2D PEG Jel bir 2D Kalıp ve İmalat hazırlanması <ol><li> Hidrofobik cam slaytlar hazırlayın. Bir vakumlu fırın içinde bir cam tabak içine temiz cam slaytlar yerleştirin. Isı 80 ° C&#39;de 30 dakika süre ile tamamen yüzeyler kuru. Sıra bir davlumbaz slaytlar ile çanak ve hafifçe kat tüm yüzeyine 30 sn sallanan, her slayt için 250 ul Sigmacote ekleyin. İyice açılacak en az 5 dakika süreyle iki defa ıslatma, distile su ile yıkama, ardından% 100 metanol ile kaplanmış slaytlara durulamat 10 ml. </li><li> 10 mm biyopsi yumruklar ile silikon parçaları (0.8 mm kalınlığında) kesin. </li><li> Silikon spacers ve Sigmacote işlenmiş cam slaytlar otoklavlayınız. </li><li> Karıştırma PEG diakrilat (PEGda) tarafından ayrı mikrofüj tüpler içinde her bir katman için ilgili çözümler formüle öncü (son konsantrasyon% 15 w / v) ve değişen nihai konsantrasyonlarda (örneğin,% 40 verim ile iodixanol farklı miktarlarda (su içinde% 60 stok çözelti) ile % 30,% 20 ve% 10), fosfat ile takviye dereceli kalan hacim yoğunlukları çözeltileri elde etmek için (PBS) ile tamponlu salin. Benzer bir tarzda, alternatif tabakalar için, iodixanol ve PBS ile bir karışımı aPEG-RGDS-350 (nihai konsantrasyon 8 mM), çeşitli konsantrasyonlarda (örneğin,% 35,% 25 ve% 15) elde edildi. </li><li> Çeşitli tabakalar (her bir katman, bir ml solüsyon başına stok solüsyonu 10 ul) için her bir çözeltisi (2-Hidroksi-4&#39;-(2-hidroksietoksi)-2-methylpropiophenone, N-vinil pirolidon içinde stok 333mg/ml) foto başlatıcı ekleyin. Photoinitiator is ışığa karşı hassas olduğu için, kalıp jellerin katmanlama önce polimerizasyonu önlemek için son eklenen. </li><li> Bu protokolün sonraki adımları kısırlık sağlamak için bir biyogüvenlik kabini yapılacaktır. </li><li> Steril 1 ml şırınga ve 0.2 mikron filtre kullanarak her çözüm filtre sterilize. İki Sigmacore işlenmiş cam slaytlar ve Şekil 1&#39;de gösterildiği gibi yerleştirerek kelepçeler ile güvenli arasındaki boşluk sandwiching tarafından kalıp kurulum birleştirin. </li><li> Daha az yoğun bir çözelti (% 35 iodixanol örn. aPEG-RGDS-350) ve ardından en yoğun çözelti (% 40 iodixanol örn. PEGda) ilk olarak, ekleme tarafından katmanlı jel döküm. Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, istenen bileşim ve yoğunluklarda çeşitli katmanları elde etmek için alternatif katman tekrarlayın. </li><li> Bir taşınabilir UVR-9000, lamba kullanarak, 3 dakika için 365 nm ışık ile kalıp saçmak. Polimerize jeller 5 dakika dinlenmeye bırakılmalıdır. Kelepçeleri çıkarın, sonra yavaşça üst camı kaldırınslayt ve kalıp; tabakalı DGMP jeller slaytlar üzerinde kalacaktır. Steril bir spatula kullanarak, dikkatli steril PBS veya yıkama için kültür ortamı içeren 50 ml&#39;lik bir tüp jel yerleştirin. </li><li> Yoğunluk değiştirici, photoinitiator ve reaksiyona girmemiş polimerleri kaldırmak için günde en az iki kez tampon değişimi, 1.000:1 hacimsel oranında PBS içinde polimerize jeller yıkayın. Alternatif olarak, PBS hücre büyüme ortamı ile değiştirilebilir. PBS veya Adım 3 de ana hatları hücre kültürü deneyi için büyüme ortamında DGMP jeller saklayın. </li><li> Alternatif katmanları görselleştirmek için bir VersaDoc jel dokümantasyon birimi örnek tepsi üzerinde bir cetvel boyunca DGMP jel (bu jelleri hücre kültürü için kullanışlı olmayacaktır) ayarlayabilir. 350 nm de jeller Açığa, maruz kalma süresi fluorofor konsantrasyonuna bağlı olarak değişebilir. DGMP hidrojel karanlık ve mavi şeritler farklı kimyasal bileşimi (Şekil 3) ayrık tabakalarının oluşumu göstermektedir. </li></ol><ol><li> RGDS peptid içeren jeller için, bu tür C2C12 iskelet hücreleri gibi bağımlı yapışma hücreleri kullanılır. </li><li> Yavaşça bir biyogüvenlik kabini içinde steril bir hücre kazıyıcı kullanarak 48-iyi hücre kültürü tabak kuyulara DGMP jeller (PBS içinde saklanan) takın. </li><li> Ön-ılık büyüme ortamı (Dulbecco&#39;nun modifiye Eagle ortamı ya da DMEM,% 10 v / v cenin sığır serumu ve% 1 v / v 100x penisilin-streptomisin ile takviye çözelti) ve 37 olarak ayarlanmış bir su banyosu içinde PBS ° C. </li><li> PBS ile C2C12 hücreleri üç kez 60% konfluent plakası (10 mm) yıkayın. % 0.25 tripsin-EDTA, 1 ml ekleme ve 2 dk için 37 ° C &#39;de kuluçkaya alarak PBS ve hasat hücrelerini aspire. Büyüme ortamı ve hücre sayımı hücrelerin yeniden süspanse edin. Tohum DGMP jel içeren C2C12 miyoblastları (20,000 hücre / cm 2) ile iyi bir hücre kültürü. % 5 CO2 /% 95 bağıl nem altında 37 ° C &#39;de hücreler inkübe edin. Dikkatli 4 saat sonra yavaşça döviz orta, yeniden değilhafifçe yapıştırılmış hücreleri hareket. </li><li> 24 saat sonra, DGMP jel RGDS içeren katmanların C2C12 miyoblastları eki Epifloresans ile faz kontrast mikroskop (Zeiss Axiovert 200) ile teyit edilebilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Place, E. S., Evans, N. D., Stevens, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexity+in+biomaterials+for+tissue+engineering.">Complexity in biomaterials for tissue engineering.</a> Nat. Mater. 8, 457-470 (2009).</li><li>Liu, V. A., Jastromb, W. E., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+protein+and+cell+adhesivity+using+PEO-terminated+triblock+polymers.">Engineering protein and cell adhesivity using PEO-terminated triblock polymers.</a> J. Biomed. Mater. Res. 60, 126-134 (2002).</li><li>Sharma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+zonal+organization+into+tissue-engineered+cartilage.">Designing zonal organization into tissue-engineered cartilage.</a> Tissue Eng. 13, 405-414 (2007).</li><li>Hahn, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolithographic+patterning+of+polyethylene+glycol+hydrogels.">Photolithographic patterning of polyethylene glycol hydrogels.</a> Biomaterials. 27, 2519-2524 (2006).</li><li>Kizilel, S., Sawardecker, E., Teymour, F., Perez-Luna, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+formation+of+covalently+bonded+hydrogel+multilayers+through+surface+initiated+photopolymerization.">Sequential formation of covalently bonded hydrogel multilayers through surface initiated photopolymerization.</a> Biomaterials. 27, 1209-1215 (2006).</li><li>Harley, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+multiphase+osteochondral+scaffold.+II.+Fabrication+of+a+mineralized+collagen-glycosaminoglycan+scaffold.">Design of a multiphase osteochondral scaffold. II. Fabrication of a mineralized collagen-glycosaminoglycan scaffold.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 92, 1066-1077 (2010).</li><li>Cuchiara, M. P., Allen, A. C., Chen, T. M., Miller, J. S., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayer+microfluidic+PEGDA+hydrogels.">Multilayer microfluidic PEGDA hydrogels.</a> Biomaterials. 31, 5491-5497 (2010).</li><li>Roam, J. L., Xu, H., Nguyen, P. K., Elbert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+of+protein+concentration+gradients+mediated+by+density+differences+of+poly(ethylene+glycol)+microspheres.">The formation of protein concentration gradients mediated by density differences of poly(ethylene glycol) microspheres.</a> Biomaterials. 31, 8642-8650 (2010).</li><li>Gleghorn, J. P., Lee, C. S., Cabodi, M., Stroock, A. D., Bonassar, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesive+properties+of+laminated+alginate+gels+for+tissue+engineering+of+layered+structures.">Adhesive properties of laminated alginate gels for tissue engineering of layered structures.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 85, 611-618 (2008).</li><li>Karpiak, J. V., Ner, Y., Almutairi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Density+gradient+multilayer+polymerization+for+creating+complex+tissue.">Density gradient multilayer polymerization for creating complex tissue.</a> Adv. Mater. 24, 1466-1470 (2012).</li><li>Pierschbacher, M. D., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+attachment+activity+of+fibronectin+can+be+duplicated+by+small+synthetic+fragments+of+the+molecule.">Cell attachment activity of fibronectin can be duplicated by small synthetic fragments of the molecule.</a> Nature. 309, 30-33 (1984).</li><li>Kaushik, G., Fuhrmann, A., Cammarato, A., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=+In+Situ+Mechanical+Analysis+of+Myofibrillar+Perturbation+and+Aging+on+Soft,+Bilayered+Drosophila+Myocardium."> In Situ Mechanical Analysis of Myofibrillar Perturbation and Aging on Soft, Bilayered Drosophila Myocardium.</a> Biophysical Journal. 101, 2629-2637 (2011).</li></ol>

Yazarlar ifşa etmek çakışan çıkarları var.

DGMP pahalı aletlerle dayanmaz katmanlı jeller hazırlamak için basit bir stratejidir. Bu protokol, kollajen ve hyaluronik asit gibi diğer biyolojik olarak uyumlu malzemeler kullanılarak, iskeleler oluşturmak için adapte edilebilir. Tabakalar arasındaki kuyruklarının karıştırma önlemek için Biyoaktif küçük moleküller, örneğin, hücre yapışma arttırıcı RGDS peptid, polimer matris için gergin edilebilir. Bunlar, matris ağ boyutuna bağlı olarak, hidrojeller ile 10 arasındaki yaymak için daha az eğilimli olduğunu Proteinler kimyasal konjugasyon için gerek kalmadan farklı katmanlar halinde yerleştirilebilir. Burada iodixanol (Nycoprep), önceden canlı hücre uygulamalar için tercih edilen bir atıl yoğunluk değiştirici kullanılmaktadır. Sukroz ve glukoz gibi diğer yoğunluk değiştiriciler de kullanılabilir. Yerleşme zamanı (t s) değiştirerek, bir ihtiyaç olarak iki katman arasındaki arabirimleri (uzun yerleşme zamanı yumuşak geçişler verir) yumuşak veya keskin geçişler üretmek için ince ayar yapabilirsiniz &lt;&gt; 10 sup. Örneğin, DGMP jel tabakalar arasında yumuşak geçiş örneğin kemotaksisi gibi hücre çalışma süreçleri için bir biyolojik işaret sürekli bir gradyan oluşturmak için kullanılabilir. Jel üzerinde yoğunluk sertlik değiştirici etkileri bir% 15 jel aPEGda için, Şekil 5&#39;te gösterilmiştir; PEGda ve iodixanol konsantrasyonlarının bir fonksiyonu olarak sertlik ve gözeneklilik daha ayrıntılı bir tanımlama şu anda değerlendirilmektedir. Bu örnekte PEGda konsantrasyonu nispeten yüksek olsa da, bu olmadan jel ile karşılaştırıldığında% 30 iodixanol ile jeller içinde% 60 daha fazla elastik modül görülmektedir. Jel sertlik değişim modüle makromer konsantrasyon veya çapraz bağ yoğunluğu için ayarlanabilir. Biz de poliakrilamid ve PEG öncüleri 10 kullanarak 3D katmanlı jeller oluşturmak için DGMP tekniği uyguladık. Konsantrasyon veya prepolimerin çapraz bağlanma derecesi değişen sağlayan yapısal varyasyon3D polarize büyüme ve göç gibi hücre davranışlarını incelemek için kullanılabilir iskelelerinin. Özet olarak, DGMP biyomedikal ve temel araştırmalar, geniş bir uygulama yelpazesi için biyo-uyumlu malzemeler çeşitli 2D ile 3D iskelelerinin üretmek için uygulanabilir bir uyarlanabilir bir tekniktir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif veya Enstrüman </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Polietilen glikol succinimydyl karboksimetil (a-PEG-SCM) </td><td> Laysan </td><td> 120-64 </td></tr><tr><td> Polyethelyene glikol diacrylate (PEGda) </td><td> Dajac Labs </td><td> 9359 </td></tr><tr><td> Arginin-glisin-Aspartik asit-serin (RGDS) </td><td> Amerikan Peptid </td><td> 49-01-4 </td></tr><tr><td> N, N - Diisopropiletilamin (DIPEA) </td><td> Sigma </td><td> D125806 </td></tr><tr><td> Dimetil sülfoksit (DMSO) </td><td> Sigma </td><td> D2438 </td></tr><tr><td> N, N-dimetilformamid (DMF) </td><td> Balıkçı </td><td> D119-4 </td></tr><tr><td> Tetrahidrofuran (THF) </td><td> Balıkçı </td><td> T397 </td></tr><tr><td> Diyaliz kaset (3500Da) </td><td> Thermo Scientific </td><td> 66330 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 350 karboksilik asit ester succinimydyl </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> A-10168 </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> Sigma </td><td> SL2 </td></tr><tr><td> Silikon tutucular </td><td> Grainger </td><td> 1MWA4 </td></tr><tr><td> Biyopsi yumruklar </td><td> Acuderm </td><td> P1025 (10 mm) P850 (8 mm) </td></tr><tr><td> Dulbecco&#39;nun fosfat (DPBS) tamponlu salin </td><td> Hyclone </td><td> SH30028 </td></tr><tr><td> Iodixanol (NycoPrep) </td><td> Balıkçı </td><td> NC9388846 </td></tr><tr><td> 2-Hidroksi-4&#39;-(2-hidroksietoksi)-2-methylpropiophenone </td><td> Sigma </td><td> 410896 </td></tr><tr><td> Dulbecco&#39;nun modifiye edilmiş Eagle ortamında (DMEM) </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 11054 </td></tr><tr><td> Fetal bovin serumu </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 10082 </td></tr><tr><td> Penisilin-streptomisin </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 15140 </td></tr><tr><td> C2C12 miyoblastları </td><td> ATCC </td><td> CRL-1772 </td></tr><tr><td> MALDI </td><td> Bruker </td><td> N / A </td></tr><tr><td> UVR-9000 </td><td> Bayco </td><td> UVR-9000 </td></tr><tr><td> VersaDoc </td><td> Bio-Rad </td><td> N / A </td></tr></tbody></table>

density gradient multilayered polymerization (dgmp): a novel technique for creating multi-compartment, customizable scaffolds for tissue engineering

Türleri ve biyolojik uyarıcı (örneğin büyüme faktörleri, inhibitörler, veya küçük molekül) veya matris yapısı konsantrasyonları (örneğin, matris bileşimi, konsantrasyonu ya da sertliği), uzay içinde değişebilir olan kompleks doku kültürü matrisler araştırmalar geniş bir yelpazede izin verecek Bu değişkenler hücre farklılaşmasını, göç ve diğer fenomenler nasıl etkilediğini ilgili. Katmanlı matrisler yaratmada önemli bir sorun her katman 1 tek tek bileşenlerin difüzyon olmadan katman arayüzleri yapısal bütünlüğünü muhafaza edilir. Bunu başarmak için, Mevcut metodolojiler photopatterning 2-3, litografi 4, sıralı functionalization5, 6 dondurularak kurutulur, ve arayüz 7, ya da hangi birçok gelişmiş enstrümantasyon ve teknik beceri gerektiren santrifüj 8, içerir. Diğer katmanlar 9 delaminasyon yol açabilir bireysel katmanların, sıralı eki güveniyor </&gt; sup. DGMP yoğunlukları 10 değişik katmanları oluşturmak için böyle iodixanol gibi inert bir yoğunluk değiştirici kullanarak bu sorunların üstesinden. Yoğunluk değiştirici herhangi prepolimer ya da biyolojik olarak aktif molekül ile karışabilir olduğundan, DGMP her bir iskele katman özel izin verir. Bunlar sulu kalırken Bunun için yoğunluk değiştiricisi yoğunluğunu çeşitlendirerek bitişik tabakaların karıştırma önler. Müteakip tek adım polimerizasyon her katmanı ayrı kimyasal ve mekanik özelliklere sahip olduğu yapısal olarak sürekli katmanlı iskele, yol açmaktadır. Yoğunluk değiştirici kolaylıkla tek tek katmanları ya da bunların bileşenleri karışıklık olmadan yeterli çalkalama ile temizlenebilir. Bu teknik, bu nedenle de çeşitli boyutlarda, şekiller ve malzemelerin hidrojeller oluşturmak için uygundur. Alternatif tabakalar RGDS-350 dahil edildiği bir 2D-polietilen glikol (PEG) jel, imalatı için bir protokol aşağıda verilmiştir. Biz PEG b kullanınbu biyouyumlu ve hareketsizdir ecause. Rgds, bir hücre adezyon peptid 11, biyolojik bir işaret mekansal kısıtlama göstermek için kullanılan ve bir fluorofor (Alexa Fluor 350) konjugasyon bize görsel çeşitli katmanlarını ayırt etmek mümkün kılınmaktadır. Bu işlem diğer malzemeler için adapte edilebilir (örneğin kollajen, hyaluronan, vb) ve 10 bazı değişiklikler ile 3D jeller imal uzatılabilir.

MALDI-TOF analiz akriloil-PEG RGDS peptid (Şekil 2) birleşme teyit etmektedir. Jel görüntüleme fotopolimerizasyon (Şekil 3A) sonra Rgds-350 (mavi) katmanlar ortaya koymaktadır. Şekil 3A&#39;da gösterildiği gibi, 2B DGMP jel boyut silikon kalıp (sol 10 mm, 8 mm, sağ) çapına göre değişebilir, ve bu nedenle birden fazla tahlillerde kullanım için kolayca özelleştirilebilir - bu durumda uygun bir 48. iyi hücre kültür plakasına (Şekil 3B). Epifloresans ve bir DGMP jel üzerinde kültive C2C12 miyoblastları faz kontrast mikroskop üzerinde seçici bağlanma gösteren RGDS-350-ihtiva eden hücre yapışması peptid (RGDS) arasında bölmelere gösteren PEG analiz edilmiştir (Şekil 4). <img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig1.jpg" alt="Şekil 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50018/50018fig1highres.jpg"/> Şekil 1. Moleküler weigMALDI-TOF RGDS peptid birleşme sonrası elde edilen aPEG-RGDS ile aPEG-SCM karşılaştırarak HT analizi. <img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig2.jpg" alt="Şekil 2," fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50018/50018fig2highres.jpg"/> Şekil 2. DGMP jel üretim şematik gösterimi. Gradyanlar katmanlı sonra, fotopolimerizasyon ardından mezun arabirimleri oluşturmak için zaman dönemleri (t s) değişen yerleşmek için izin verilebilir. Tabakalı DGMP jeller kolayca daha fazla kullanım için kalıp elde edilebilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50018/50018fig2large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. Fotopolimerizasyon sonra elde A) 2D katmanlı jeller 350 nm ve Versa beyaz ışık kanalları kullanarak görüntülendiDoktor jel dokümantasyon birimi. Görüntü. B) DGMP jel yerleştirilmesi 48-iyi hücre kültür kaplarına beyaz Rgds içeren katmanlar alternatif ortaya tonlamalı. <img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig4.jpg" alt="Şekil 4," /> Şekil 4. Birleştirilmiş faz kontrast ve DGMP jeller (ölçek çubuğu 50 mikron) yetiştirilen C2C12 miyoblastları arasında Epifloresans görüntü. <img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig5.jpg" alt="Şekil 5," /> Şekil 5,. 2 nN kuvvet tetik 12 ile daha önce kurulan yöntemler kullanarak çapraz PEG substratların statik örneklerinin jel yüzey esnekliğinden iodixanol Etkisi. Atomik kuvvet mikroskobu ölçümleri. * P &lt;0.05 ve ** p &lt;0.01.

Watch this Scientific Journal Video about Density Gradient Multilayered Polymerization DGMP: A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering at JoVE.com

Density Gradient Multilayered Polymerization DGMP: A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Burada doku mühendisliği için farklı katmanları arasında sürekli arabirimleri ile biyouyumlu, katmanlı matrisler oluşturmak için benzersiz bir strateji belirlemelidir. Böyle bir iskele çeşitli biyolojik, kimyasal ya da mekanik yardımlar yaparak hücre davranışı modüle ideal özelleştirilebilir ortamı sağlayabilir

Yoğunluk Gradient Katmanlı Polimerizasyonu (DGMP): Multi-bölmesi oluşturma için A Novel Tekniği, Doku Mühendisliği için Özelleştirilebilir İskelesi

Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix ...

density-gradient-multilayered-polymerization-dgmp-novel-technique-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Density Gradient Multilayered Polymerization (DGMP): A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

12.4K Görüntüleme.  University of California, San Diego. Burada doku mühendisliği için farklı katmanları arasında sürekli arabirimleri ile biyouyumlu, katmanlı matrisler oluşturmak için benzersiz bir strateji belirlemelidir. Böyle bir iskele çeşitli biyolojik, kimyasal ya da mekanik yardımlar yaparak hücre davranışı modüle ideal özelleştirilebilir ortamı sağlayabilir

Video: Density Gradient Multilayered Polymerization DGMP: A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and increasing obesity1. Currently, bypass surgery using autologous vessels, allografts, and synthetic grafts are known as a commonly used for arterial substitutes2. However, these grafts have limited applications when an inner diameter of arteries is less than 6 mm due to low availability, thrombotic complications, compliance mismatch, and late intimal hyperplasia3,4. To overcome these limitations, tissue engineering has been successfully applied as a promising alternative to develop small-diameter arterial constructs that are nonthrombogenic, robust, and compliant. Several previous studies have developed small-diameter arterial constructs with tri-lamellar structure, excellent mechanical properties and burst pressure comparable to native arteries5,6. While high tensile strength and burst pressure by increasing collagen production from a rigid material or cell sheet scaffold, these constructs still had low elastin production and compliance, which is a major problem to cause graft failure after implantation. Considering these issues, we hypothesized that an elastometric biomaterial combined with mechanical conditioning would provide elasticity and conduct mechanical signals more efficiently to vascular cells, which increase extracellular matrix production and support cellular orientation.
The objective of this report is to introduce a fabrication technique of porous tubular scaffolds and a dynamic mechanical conditioning for applying them to arterial tissue engineering. We used a biodegradable elastomer, poly (glycerol sebacate) (PGS)7 for fabricating porous tubular scaffolds from the salt fusion method. Adult primary baboon smooth muscle cells (SMCs) were seeded on the lumen of scaffolds, which cultured in our designed pulsatile flow bioreactor for 3 weeks. PGS scaffolds had consistent thickness and randomly distributed macro- and micro-pores. Mechanical conditioning from pulsatile flow bioreactor supported SMC orientation and enhanced ECM production in scaffolds. These results suggest that elastomeric scaffolds and mechanical conditioning of bioreactor culture may be a promising method for arterial tissue engineering.

Elastomeric PGS scaffolds with vascular smooth muscle cells cultured in a pulsatile flow bioreactor may lead to promising small-diameter arterial constructs with native ECM production in a relatively short culture period.

Elastomerik PGS Arter Doku Mühendisliği Yapı iskeleleri

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and ...

Biyomühendislik

Postproduction Processing of Electrospun Fibres for Tissue Engineering

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo undergo biaxial distension to varying extents such as skin, bladder, pelvic floor and even the hard palate as children grow. In producing scaffolds for these purposes there is a need to develop scaffolds of appropriate biomechanical properties (whether achieved without or with cells) and which are sterile for clinical use. The focus of this paper is not how to establish basic electrospinning parameters (as there is extensive literature on electrospinning) but on how to modify spun scaffolds post production to make them fit for tissue engineering purposes - here thickness, mechanical properties and sterilisation (required for clinical use) are considered and we also describe how cells can be cultured on scaffolds and subjected to biaxial strain to condition them for specific applications.
Electrospinning tends to produce thin sheets; as the electrospinning collector becomes coated with insulating fibres it becomes a poor conductor such that fibres no longer deposit on it. Hence we describe approaches to produce thicker structures by heat or vapour annealing increasing the strength of scaffolds but not necessarily the elasticity. Sequential spinning of scaffolds of different polymers to achieve complex scaffolds is also described. Sterilisation methodologies can adversely affect strength and elasticity of scaffolds. We compare three methods for their effects on the biomechanical properties on electrospun scaffolds of poly lactic-co-glycolic acid (PLGA).
Imaging of cells on scaffolds and assessment of production of extracellular matrix (ECM) proteins by cells on scaffolds is described. Culturing cells on scaffolds in vitro can improve scaffold strength and elasticity but the tissue engineering literature shows that cells often fail to produce appropriate ECM when cultured under static conditions. There are few commercial systems available that allow one to culture cells on scaffolds under dynamic conditioning regimes - one example is the Bose Electroforce 3100 which can be used to exert a conditioning programme on cells in scaffolds held using mechanical grips within a media filled chamber.4 An approach to a budget cell culture bioreactor for controlled distortion in 2 dimensions is described. We show that cells can be induced to produce elastin under these conditions. Finally assessment of the biomechanical properties of processed scaffolds cultured with or without cells is described.

Electrospun scaffolds can be processed post production for tissue engineering applications. Here we describe methods for spinning complex scaffolds (by consecutive spinning), for making thicker scaffolds (by multi-layering using heat or vapour annealing), for achieving sterility (aseptic production or sterilisation post production) and for achieving appropriate biomechanical properties.

Doku Mühendisliği için elektrospinning Liflerin Postprodüksiyon İşleme

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce  scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

3-Boyutlu Hücre Kültürü için Self-raporlama iskeleleri

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

A Novel Bioreactor for High Density Cultivation of Diverse Microbial Communities

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past studies have evaluated the performance of the reactor for the removal of COD1 and nitrogen species2-4 by heterotrophic and chemoautotrophic bacteria, respectively. The HDBR design eliminates the requirement for external flocculation/sedimentation processes while still yielding effluent containing low suspended solids. In this study, the HDBR is applied as a photobioreactor (PBR) in order to characterize the nitrogen removal characteristics of an algae-based photosynthetic microbial community. As previously reported for this HDBR design, a stable biomass zone was established with a clear delineation between the biologically active portion of the reactor and the recycling reactor fluid, which resulted in a low suspended solid effluent. The algal community in the HDBR was observed to remove 18.4% of total nitrogen species in the influent. Varying NH4+ and NO3- concentrations in the feed did not have an effect on NH4+ removal (n=44, p=0.993 and n=44, p=0.610 respectively) while NH4+ feed concentration was found to be negatively related with NO3- removal (n=44, p=0.000) and NO3- feed concentration was found to be positively correlated with NO3- removal (n=44, p=0.000). Consistent removal of NH4+, combined with the accumulation of oxidized nitrogen species at high NH4+ fluxes indicates the presence of ammonia- and nitrite-oxidizing bacteria within the microbial community.

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Here, the HDBR is successfully applied in a photobioreactor (PBR) configuration for the study of nitrogen metabolism by a mixed high density algal community.

Çeşitli mikrobiyal Toplulukları Yüksek Yoğunluklu Yetiştirme için Yeni Bir Biyoreaktör

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past ...

Rod-based Fabrication of Customizable Soft Robotic Pneumatic Gripper Devices for Delicate Tissue Manipulation

Soft compliant gripping is essential in delicate surgical manipulation for minimizing the risk of tissue grip damage caused by high stress concentrations at the point of contact. It can be achieved by complementing traditional rigid grippers with soft robotic pneumatic gripper devices. This manuscript describes a rod-based approach that combined both 3D-printing and a modified soft lithography technique to fabricate the soft pneumatic gripper. In brief, the pneumatic featureless mold with chamber component is 3D-printed and the rods were used to create the pneumatic channels that connect to the chamber. This protocol eliminates the risk of channels occluding during the sealing process and the need for external air source or related control circuit. The soft gripper consists of a chamber filled with air, and one or more gripper arms with a pneumatic channel in each arm connected to the chamber. The pneumatic channel is positioned close to the outer wall to create different stiffness in the gripper arm. Upon compression of the chamber which generates pressure on the pneumatic channel, the gripper arm will bend inward to form a close grip posture because the outer wall area is more compliant. The soft gripper can be inserted into a 3D-printed handling tool with two different control modes for chamber compression: manual gripper mode with a movable piston, and robotic gripper mode with a linear actuator. The double-arm gripper with two actuatable arms was able to pick up objects of sizes up to 2 mm and yet generate lower compressive forces as compared to elastomer-coated and non-coated rigid grippers. The feasibility of having other designs, such as single-arm or hook gripper, was also demonstrated, which further highlighted the customizability of the soft gripper device, and it's potential to be used in delicate surgical manipulation to reduce the risk of tissue grip damage.

This protocol describes a rod-based approach, combining 3D-printing and soft lithography techniques for fabricating the soft gripper devices. This approach eliminates the need for an external air source by incorporating a chamber component and reduces the chance of occlusion during the sealing process, particularly for miniaturized pneumatic channels.

Narin Doku Manipülasyon için Özelleştirilebilir Yumuşak Robotik Pnömatik Tutucu Cihazlar Rod tabanlı Fabrikasyon

Soft compliant gripping is essential in delicate surgical manipulation for minimizing the risk of tissue grip damage caused by high stress concentrations ...

Neonatal Cardiac Scaffolds: Novel Matrices for Regenerative Studies

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation. Each year, it is estimated that more than 100,000 donor hearts are needed for cardiac transplantation procedures in the United States1-2. Due to the limited numbers of donors, only approximately 2,400 transplants are performed each year in the U.S.2. Numerous approaches, from cell therapy studies to implantation of mechanical assist devices, have been undertaken, either alone or in combination, in an attempt to coax the heart to repair itself or to rest the failing heart3. In spite of these efforts, ventricular assist devices are still largely used for the purpose of bridging to transplantation and the utility of cell therapies, while they hold some curative promise, is still limited to clinical trials. Additionally, direct xenotransplantation has been attempted but success has been limited due to immune rejection. Clearly, another strategy is required to produce additional organs for transplantation and, ideally, these organs would be autologous so as to avoid the complications associated with rejection and lifetime immunosuppression. Decellularization is a process of removing resident cells from tissues to expose the native extracellular matrix (ECM) or scaffold. Perfusion decellularization offers complete preservation of the three dimensional structure of the tissue, while leaving the bulk of the mechanical properties of the tissue intact4. These scaffolds can be utilized for repopulation with healthy cells to generate research models and, possibly, much needed organs for transplantation. We have exposed the scaffolds from neonatal mice (P3), known to retain remarkable cardiac regenerative capabilities,5-8 to detergent mediated decellularization and we repopulated these scaffolds with murine cardiac cells. These studies support the feasibility of engineering a neonatal heart construct. They further allow for the investigation as to whether the ECM of early postnatal hearts may harbor cues that will result in improved recellularization strategies.

In these studies, we provide methodology for novel, neonatal, murine cardiac scaffolds for use in regenerative studies.

Yenidoğan Kardiyak iskeleleri: Rejeneratif Çalışmaları Roman Matrisler

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation.  Each year, it is estimated that more than 100,000 donor ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology with great potential for biomedical applications. The technique facilitates the direct deposition of biocompatible polymer fibers to fabricate well-ordered scaffolds in the sub-micron to micro scale range. The establishment of a stable, viscoelastic, polymer jet between a spinneret and a collector is achieved using an applied voltage and can be direct-written. A significant benefit of a typical porous scaffold is a high surface-to-volume ratio which provides increased effective adhesion sites for cell attachment and growth. Controlling the printing process by fine-tuning the system parameters enables high reproducibility in the quality of the printed scaffolds. It also provides a flexible manufacturing platform for users to tailor the morphological structures of the scaffolds to their specific requirements. For this purpose, we present a protocol to obtain different fiber diameters using melt electrospinning writing (MEW) with a guided amendment of the parameters, including flow rate, voltage and collection speed. Furthermore, we demonstrate how to optimize the jet, discuss often experienced technical challenges, explain troubleshooting techniques and showcase a wide range of printable scaffold architectures.

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&amp;#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This protocol serves as a comprehensive guideline to fabricate scaffolds via electrospinning with polymer melts in a direct writing mode. We systematically outline the process and define the appropriate parameter settings for achieving targeted scaffold architectures.

Üç boyutlu Poly(ε-caprolactone) İskele kontrol edilebilir türleri morfoloji ile Electrospinning yazma doku mühendisliği uygulamaları için erime

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both cartilage and skin analogs were fabricated after bioink pre-cellularization utilizing a novel passive mixing unit technique. This technique was developed with the aim to simplify the steps involved in the mixing of a cell suspension into a highly viscous bioink. The resolution of filaments deposited through bioprinting necessitates the assurance of uniformity in cell distribution prior to printing to avoid the deposition of regions without cells or retention of large cell clumps that can clog the needle. We demonstrate the ability to rapidly blend a cell suspension with a bioink prior to bioprinting of both cartilage and skin analogs. Both tissue analogs could be cultured for up to 4 weeks. Histological analysis demonstrated both cell viability and deposition of tissue specific extracellular matrix (ECM) markers such as glycosaminoglycans (GAGs) and collagen I respectively.

Cartilage and skin analogs were bioprinted using a nanocellulose-alginate based bioink. The bioinks were cellularized prior to printing via a single step passive mixing unit. The constructs were demonstrated to be uniformly cellularized, have high viability, and exhibit favorable markers of differentiation.

Bioprinting kıkırdak ve cilt doku analogları bir roman pasif birimi teknik Bioink Precellularization için karıştırma kullanmak

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current regenerative medicine strategies have focused on transplanting stem cells or genetic manipulation of surrounding support cells in the inner ear to encourage replacement of damaged stem cells to correct hearing loss. Yet, the extracellular matrix (ECM) may play a vital role in inducing and maintaining function of hair cells, and has not been well investigated. Using the cochlear ECM as a scaffold to grow adult stem cells may provide unique insights into how the composition and architecture of the extracellular environment aids cells in sustaining hearing function. Here we present a method for isolating and decellularizing cochleae from mice to use as scaffolds accepting perfused adult stem cells. In the current protocol, cochleae are isolated from euthanized mice, decellularized, and decalcified. Afterward, human Wharton&#39;s jelly cells (hWJCs) that were isolated from the umbilical cord were carefully perfused into each cochlea. The cochleae were used as bioreactors, and cells were cultured for 30 days before undergoing processing for analysis. Decellularized cochleae retained identifiable extracellular structures, but did not reveal the presence of cells or noticeable fragments of DNA. Cells perfused into the cochlea invaded most of the interior and exterior of the cochlea and grew without incident over a duration of 30 days. Thus, the current method can be used to study how cochlear ECM affects cell development and behavior.

The goal of this protocol is to demonstrate an effective method to decellularize and decalcify mouse cochleae for utilization as scaffolds for tissue engineering applications.

Fare Cochleae iç kulak doku mühendisliği için Decellularizing için bir iletişim kuralı

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an environment that closely mimics the structural features of non-polarized tissue. Furthermore, the particular intrinsic nanofiber structure of the scaffold makes it transparent to visual light, which allows for easy visualization of the sample under microscopy. This advantage was largely used to study cell migration, organization, proliferation, and differentiation and thus any development of their particular cellular function by staining with specific dyes or probes. Furthermore, in this work, we describe the good performance of this system to easily study the redifferentiation of expanded human articular chondrocytes into cartilaginous tissue. Cells were encapsulated into self-assembling peptide scaffolds and cultured under specific conditions to promote chondrogenesis. Three-dimensional cultures showed good viability during the 4 weeks of the experiment. As expected, samples cultured with chondrogenic inducers (compared to non-induced controls) stained strongly positive for toluidine blue (which stains glycosaminoglycans (GAGs) that are highly present in cartilage extracellular matrix) and expressed specific molecular markers, including collagen type I, II and X, according to Western Blot analysis. This protocol is easy to perform and can be used at research laboratories, industries and for educational purposes in laboratory courses.

Here, we present a protocol to obtain 3D-culture systems in self-assembling peptide scaffolds to promote the differentiation of dedifferentiated human articular chondrocytes into cartilage-like tissue.

Üç boyutlu peptid iskele memeli hücrelerinde kültür

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...