Tübüler yapıların imalatı damar ağlarıdoku mühendisliği için umut verici bir yaklaşımdır, hangi kalın dokuların in-vitro ekimi en büyük zorluklardan biri olmaya devam etmektedir. Çekirdek/kabuk tekniğinin en büyük avantajı, tek bir adımda içi boş filament iskelelerin basit üretimi, üretim süresini kısaltır ve hücrelerle doğrudan baskıya olanak sağlar. Uygun viskoelastik özelliklere sahip bir hidrojel formülasyonunun hazırlanması ve çekirdek/kabuk malzemelerinin sürekli dengeli akışının sürdürülmesi, kararlı iskelelerin 3Boyutlu baskısı için çok önemlidir.
Başlamak için steril 5 mL şırıngayı taze hazırlanmış hidrojel ile doldurun. 27 gauge blunt uçlu iğne ile donatılmış ikinci bir 5 mL şırınga, taze hazırlanmış crosslinking çözeltisi ile doldurun. Çekirdek/kabuk nozulu birleştirin.
Çekirdek bileşen olarak bir G27 künt uçlu iğne takın ve vidayı kullanarak iğneyi sabitleyin. İç iğne dış çekirdek kabuk başlığı meme yaklaşık 1 mm çıkıntı gerekir. Şırıngayı çapraz bağlama solüsyonuyla nozuldaki G27 iğnesine bağlayın ve şırıngayı etanol sterilize edilmiş 3D yazıcının ekstrüder yuvalarından birine yükleyin.
Şırıngayı hidrojelile ikinci ekstrüzyona monte edin ve enjektöre bağlayın. Çekirdek/kabuk başlığının yan Luer girişine kısa bir tüp bağlamak için luer kilidi kullanın. Nozul dış meme çapına eşit bir mesafeye geri çekmeden önce enjektör yüzeye değene kadar hizalamayı dikkatle ayarlayın.
Oluşturulan iskele g kodunu içe aktarın ve yazdırma işlemini başlatmak için Oynat'a basın. Baskıdan sonra, baskılı iskele ile dikkatlice substrat çıkarın ve tüm iskele üzerinde ikincil crosslinking çözüm dökün. Oda sıcaklığında bir dakika iskele kuluçka.
İskeleyi substrattan ayırmak için, iskeleyi hafifçe yana doğru çekin. İskele substrata güçlü bir şekilde yapışıyorsa, ayırmak için her iki malzemenin arasına keskin bir kenar takın. İskeleyi yeni bir konteynere aktarın.
UV, iskelenin her iki tarafını da 30 dakika boyunca sterilize eder. Sonra renksiz bir hücre kültürü orta içine iskele yerleştirin ve en az 24 saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derece iskele kuluçka. Ertesi gün, 37 santigrat derece beş dakika için% 0.25 tripsin ile bir in-vitro kültürden huvex hasat.
Hücreler ayrıldığında, taze hücre kültürü orta 3 mL ile enzimatik reaksiyon durdurmak ve santrifüj ile hücreleri toplamak. Fenol kırmızısı içeren taze kültür ortamında peleti yeniden askıya alın ve hücreleri mililitre konsantrasyonu başına 5 endotel hücresine 3,4 kat 10'a kadar seyreltin. Hücreleri 27 gauge iğne ile donatılmış steril 5 mL şırınga yükleyin ve iskelede bir giriş noktası bulun.
İğneyi iskele filamentinin düz bölümüyle hizalayarak, iskeleyi düşük açıyla dikkatlice delin. İğnenin kanalın içi boş filamentin içinde olduğunu doğrulayın ve iskeleye yaklaşık 1-2 mL hücre süspansiyonu enjekte etmek için pistonun yavaşça bastırılmasını onaylayın. Süspansiyon akışı yarı saydam iskele ile görünür olmalıdır.
Tüm iskele hücre süspansiyonu ile doldurulduğunda, iskeleyi taze hücre kültürü ortamına batırın ve iskeleyi 10 güne kadar hücre kültürü kuluçka makinesine geri döndürün. Kuluçka sonunda canlı/ölü görüntüleme için, iskeleyi PBS ile durulayın ve iskeleye canlı/ölü çözeltiyi dikkatlice enjekte etmek için künt uçlu bir iğne kullanın. Çözümün tüm iskeleyi doldurduğuna dair onaylayın ve iskeleyi 30 dakika boyunca 37 derecede yerleştirin.
Kuluçka sonunda, İskeleyi PBS ile durulayın ve iskeleyi dikkatlice cam bir slayta aktarın. Daha sonra boyalı hücreler bir floresan mikroskobu altında iskelelerde görülebilir. Yeni basılmış ve işlenme sonrası bir iskelenin bu kesitinde, filament içinde açıkça görülebilen içi boş bir kanal gözlemlenebilir.
Hücre kültürü ortamında 72 saatlik kuluçkadan sonra bile 37 santigrat derece, filament tüm iskele uzunluğu boyunca içi boş yapıyı korur. Burada, bir iskele içinde kültür 48 saat sonra endotel hücrelerinin bir temsilci canlı / ölü analizi gösterilir. Canlı hücreler parlak yeşil floresan sinyalleri ile tanımlanabilir.
Bu teknik içi boş borulu iskelelerin tek adımlı imalatının temelini oluşturur ve biyo-mürekkep le birleştirilmiş hücreler kullanılarak doğrudan baskı ile yükseltilebilir.
