الكتاب ممتنون للدعم من الجوائز NIH المدير الجديد المبتكر (1DP2 OD006499 AA-01 لو1DP2 OD006460-01 لAJE)، ومدينة الملك عبد العزيز للعلوم والتقنية (جامعة كاليفورنيا في سان دييغو مركز التميز في لطب النانوي). نود أن نشكر السيدة جيسيكا مور على تعليقاتها الهامة على المخطوطة.

1. توليف fluorescently المسمى Acryloyl-PEG-RGDS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الرد على الببتيد RGDS مع استر كاربوكسيميثيل acryloyl-PEG-succinimidyl (aPEG-SCM، PEG MW: 3400 جم / مول) وdiisopropylethylamine NN (DIPEA) في نسب 1.2:1:2 الرحى في سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO) تحت الأرجون في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكيد اقتران بواسطة مصفوفة بمساعدة وقت الامتزاز / التأين الليزر الطيران (TOF MALDI-) مطياف الكتلة. إضافة 1 ميكرولتر من محلول التفاعل aPEG-RGDS إلى بقعة العينة على الهدف MALDI والجافة. إعداد محلول مشبع من MALDI العالمي مصفوفة في رباعي هيدرو الفوران (THF) ودوامة لمدة 1 دقيقة. إضافة ~ 1 ميكرولتر من هذا الحل الى مكان الحادث نفس العينة. كرر الإجراء aPEG-SCM للمقارنة. تحميل وتحليلها. يجب أن الوزن الجزيئي للaPEG-RGDS تكون أكبر من aPEG-SCM (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لالمتقارن على fluorophore، إضافة مبلغ متساوي المولية للحمض فلور اليكسا 350 الكربوكسيلية (succinimydyl استر)، حلفي الحد الأدنى من حجم DMSO، إلى محلول التفاعل aPEG-RGDS من 1.1 والرد تحت الأرجون في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية aPEG-RGDS-350 من dialyzing (MW 3500 دا) ضد O 2 H DI-C ° 4 في مدة 48 ساعة في نسبة 1،000:1 الحجمي، وتبادل ديالة على الأقل مرتين في اليوم الواحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميد تجفيف تنقية aPEG-RGDS-350 في المنطقة الحرة بالإضافة إلى Labconco أو ما يعادلها نظام تجميد الجافة ومخزن في -20 ° C. </li></ol> 2. إعداد قالب 2D وتصنيع مادة هلامية PEG 2D بالتناوب مع الطبقات RGDS-350 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الشرائح الزجاجية مسعور. وضع الشرائح الزجاجية النظيفة في طبق فرن الزجاج في فراغ. الحرارة إلى 80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة حتى يجف تماما السطوح. مكان الطبق مع شرائح الموجودة في غطاء الدخان وإضافة 250 ميكرولتر Sigmacote إلى كل شريحة، هزاز بلطف لمدة 30 ثانية إلى سطح طبقة بأكملها. شطف جيدا الشرائح المغلفة مع الميثانول بنسبة 100٪، تليها الغسيل في الماء المقطر، تمرغ مرتين لمدة 5 دقائق في LEAS فير 10 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الفواصل سيليكون (0.8 مم) مع 10 ملم خزعة اللكمات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأوتوكلاف الفواصل سيليكون والشرائح الزجاجية Sigmacote المعاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع حلول لكل طبقة منها في أنابيب microfuge الفردية عن طريق خلط diacrylate PEG (PEGda) السلائف (تركيز النهائي 15٪ ث / ت) مع كميات مختلفة من iodixanol (60٪ محلول في الماء) لانتاج تركيزات متفاوتة النهائي (على سبيل المثال 40٪، 30٪، 20٪ و 10٪)، المكمل لحجم المتبقية مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) للحصول على الحلول للكثافات متدرج. بطريقة مماثلة، لطبقات متبادلة، مزيج aPEG-RGDS-350 (تركيز النهائي 8 ملم) مع iodixanol وPBS لانتاج تركيزات مختلفة (على سبيل المثال 35٪، 25٪، و 15٪). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة photoinitiator (2-هيدروكسي 4&#39;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone، والأوراق المالية في 333mg/ml N-الفينيل pyrrolidone) لكل حل لمختلف الطبقات (10 ميكرولتر من محلول المخزون في كل مل من محلول طبقة). أنا Photoinitiatorوأضاف ق الماضي لمنع البلمرة قبل طبقات من المواد الهلامية في القالب، كما أنه حساس للضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سيتم تنفيذ الخطوات اللاحقة من هذا البروتوكول في خزانة السلامة البيولوجية لضمان العقم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فلتر تعقيم كل حل معقمة باستخدام حقنة 1 مل و 0.2 ميكرومتر التصفية. تجميع الإعداد قالب من يقحم التبادل بين شريحتين من الزجاج Sigmacore المعالجة وآمنة مع وضع المشابك كما هو مبين في الشكل 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يلقي المواد الهلامية الطبقات بإضافة الحل الأكثر كثافة (على سبيل المثال PEGda مع iodixanol 40٪) أولا، تليها حلا أقل كثافة (على سبيل المثال، aPEG RGDS-350 مع iodixanol 35٪). تكرار طبقات بديلة لتحقيق عدة طبقات من تكوين وكثافة المطلوب كما هو مبين في الشكل 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أشرق ضوء مقلب مع نانومتر 365 لل3 دقائق باستخدام الأشعة فوق البنفسجية المحمولة-9000 مصباح. السماح للبلمرة المواد الهلامية لعلاج لمدة 5 دقائق. إزالة المشابك، ثم رفع بلطف الزجاج الأعلى<html> الشريحة والعفن و؛ فإن المواد الهلامية DGMP الطبقية لا تزال على الشرائح. باستخدام ملعقة معقمة، ضع بعناية المواد الهلامية في أنبوب 50 مل تحتوي على معقمة PBS أو مستنبت للغسيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل المواد الهلامية في بلمرة PBS في نسبة 1،000:1 الحجمي، وتبادل عازلة على الأقل مرتين في اليوم لإزالة معدل الكثافة، photoinitiator، والبوليمر غير المتفاعل. وبدلا من ذلك، يمكن تبادل PBS مع نمو الخلايا المتوسطة. تخزين المواد الهلامية في DGMP PBS أو متوسطة النمو للخلية تجربة الثقافة موضح في الخطوة 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتصور طبقات بالتناوب، وترتيب DGMP هلام (جل هذه لن تكون قابلة للاستخدام للثقافة الخلية) على طول المسطرة في علبة عينة من الوثائق VersaDoc حدة هلام. كشف المواد الهلامية في 350 نانومتر، وزمن التعرض سوف تختلف تبعا للتركيز fluorophore. بالتناوب عصابات الظلام والأزرق في هيدروجيل DGMP تثبت تشكيل طبقات منفصلة من التركيب الكيميائي متميزة (الشكل 3). </li></ol>&quot;jove_title&quot;&gt; 3. 2D زراعة الخلايا على الهلام DGMP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لدمج المواد الهلامية RGDS الببتيد، استخدام الخلايا التصاق التابعة، مثل C2C12 myoblasts. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج بلطف المواد الهلامية DGMP (المخزنة في PBS) في الآبار من 48 لوحات جيدة زراعة الخلايا باستخدام مكشطة الخلية معقمة في خزانة السلامة الأحيائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل الدافئة المتوسطة النمو (وسط Dulbecco لتعديل النسر أو DMEM تستكمل مع مصل الجنين 10٪ V / V الأبقار و 1٪ V / V 100X حل البنسلين الستربتوميسين) وPBS في حمام مائي وضعت في 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل لوحة 60٪ متموجة (10 ملم) من C2C12 الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. نضح قبالة PBS الحصاد والخلايا عن طريق إضافة 1 مل من التربسين 0.25٪ واحتضان EDTA-C ° 37 في لمدة 2 دقيقة. إعادة تعليق الخلايا في النمو والمتوسطة خلايا العد. البذور التي تحتوي على هلام DGMP زراعة الخلايا بشكل جيد مع C2C12 myoblasts (20،000 خلية / سم 2). احتضان الخلايا في C ° 37٪ CO في 5 2 / الرطوبة النسبية 95٪. متوسطة بلطف تبادل بعد 4 ساعة، الحرص على عدم إعادةنقل الخلايا برفق الالتزام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 24 ساعة، قد أكدت الحجز على C2C12 myoblasts على الطبقات التي تحتوي على RGDS من المواد الهلامية التي كتبها DGMP epifluorescence ومرحلة المجهر النقيض (زايس Axiovert 200). </li></ol>

<ol>
	<li>Place, E. S., Evans, N. D., Stevens, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexity+in+biomaterials+for+tissue+engineering.">Complexity in biomaterials for tissue engineering.</a> Nat. Mater. 8, 457-470 (2009).</li><li>Liu, V. A., Jastromb, W. E., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+protein+and+cell+adhesivity+using+PEO-terminated+triblock+polymers.">Engineering protein and cell adhesivity using PEO-terminated triblock polymers.</a> J. Biomed. Mater. Res. 60, 126-134 (2002).</li><li>Sharma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+zonal+organization+into+tissue-engineered+cartilage.">Designing zonal organization into tissue-engineered cartilage.</a> Tissue Eng. 13, 405-414 (2007).</li><li>Hahn, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolithographic+patterning+of+polyethylene+glycol+hydrogels.">Photolithographic patterning of polyethylene glycol hydrogels.</a> Biomaterials. 27, 2519-2524 (2006).</li><li>Kizilel, S., Sawardecker, E., Teymour, F., Perez-Luna, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+formation+of+covalently+bonded+hydrogel+multilayers+through+surface+initiated+photopolymerization.">Sequential formation of covalently bonded hydrogel multilayers through surface initiated photopolymerization.</a> Biomaterials. 27, 1209-1215 (2006).</li><li>Harley, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+multiphase+osteochondral+scaffold.+II.+Fabrication+of+a+mineralized+collagen-glycosaminoglycan+scaffold.">Design of a multiphase osteochondral scaffold. II. Fabrication of a mineralized collagen-glycosaminoglycan scaffold.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 92, 1066-1077 (2010).</li><li>Cuchiara, M. P., Allen, A. C., Chen, T. M., Miller, J. S., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayer+microfluidic+PEGDA+hydrogels.">Multilayer microfluidic PEGDA hydrogels.</a> Biomaterials. 31, 5491-5497 (2010).</li><li>Roam, J. L., Xu, H., Nguyen, P. K., Elbert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+of+protein+concentration+gradients+mediated+by+density+differences+of+poly(ethylene+glycol)+microspheres.">The formation of protein concentration gradients mediated by density differences of poly(ethylene glycol) microspheres.</a> Biomaterials. 31, 8642-8650 (2010).</li><li>Gleghorn, J. P., Lee, C. S., Cabodi, M., Stroock, A. D., Bonassar, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesive+properties+of+laminated+alginate+gels+for+tissue+engineering+of+layered+structures.">Adhesive properties of laminated alginate gels for tissue engineering of layered structures.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 85, 611-618 (2008).</li><li>Karpiak, J. V., Ner, Y., Almutairi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Density+gradient+multilayer+polymerization+for+creating+complex+tissue.">Density gradient multilayer polymerization for creating complex tissue.</a> Adv. Mater. 24, 1466-1470 (2012).</li><li>Pierschbacher, M. D., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+attachment+activity+of+fibronectin+can+be+duplicated+by+small+synthetic+fragments+of+the+molecule.">Cell attachment activity of fibronectin can be duplicated by small synthetic fragments of the molecule.</a> Nature. 309, 30-33 (1984).</li><li>Kaushik, G., Fuhrmann, A., Cammarato, A., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=+In+Situ+Mechanical+Analysis+of+Myofibrillar+Perturbation+and+Aging+on+Soft,+Bilayered+Drosophila+Myocardium."> In Situ Mechanical Analysis of Myofibrillar Perturbation and Aging on Soft, Bilayered Drosophila Myocardium.</a> Biophysical Journal. 101, 2629-2637 (2011).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم مصالح متضاربة الكشف.

DGMP هي استراتيجية بسيطة لإعداد المواد الهلامية التي متعدد الطبقات لا تعتمد على الأجهزة باهظة الثمن. ويمكن تكييف هذا البروتوكول لإنشاء السقالات باستخدام مواد حيويا الأخرى، مثل الكولاجين وحمض الهيالورونيك. النشطة بيولوجيا الجزيئات الصغيرة، على سبيل المثال خلية التصاق المعززة للRGDS الببتيد، يمكن مصطفة على البوليمر لمنع اختلاط بين طبقات العظة. يمكن تغليف البروتينات في طبقات متميزة دون الحاجة لتصريف المواد الكيميائية لأنها، تبعا لحجم فتحات الشباك مصفوفة، هي أقل عرضة للنشر من خلال الهلاميات المائية 10. المستخدمة هنا نحن iodixanol (Nycoprep)، وهو معدل كثافة خاملة، والتي سبق استخدامها في تطبيقات خلايا قابلة للحياة. ويمكن أيضا معدلات الكثافة أخرى مثل السكروز وسكر العنب يمكن استخدامها. من خلال تغيير الوقت تسوية (ر ق)، ويمكن للمرء أن ضبط واجهات بين طبقتين لإنتاج الانتقال السلس الحاد أو حسب الحاجة (مرة يعطي سلاسة تسوية تعد التحولات) &lt;سوب&gt; 10. على سبيل المثال، يمكن أن تستخدم أكثر سلاسة الانتقال بين طبقات هلام DGMP لإنشاء الانحدار المستمر لجديلة البيولوجية لدراسة عمليات الخلية مثل الكيميائي. يظهر تأثير معدل الكثافة على تصلب هلام في الشكل (5) لهلام aPEGda 15٪؛ توصيف أكثر اكتمالا من الصلابة والمسامية بوصفها وظيفة من وتركيزات PEGda iodixanol يجري حاليا تقييمها. في حين أن تركيز PEGda في هذا المثال مرتفع نسبيا، لاحظنا ومعامل مرونة أكبر 60٪ في المواد الهلامية مع iodixanol 30٪ مقارنة مع المواد الهلامية دون. ويمكن تعديل التغيير في تصلب هلام عليها تحوير أو تركيز macromer الكثافة يشابك. لقد طبقنا أيضا تقنية DGMP لخلق 3D باستخدام المواد الهلامية متعدد الطبقات بولكرلميد والسلائف PEG 10. تركيز متفاوتة أو درجة يشابك من سابق البلمرة يسمح التباين في الهيكليةالسقالات، والتي يمكن استخدامها لاستكشاف السلوك الخلية مثل النمو والهجرة الاستقطاب في 3D. وخلاصة القول، DGMP هو أسلوب للتكيف التي يمكن تطبيقها على افتعال السقالات 2D و 3D من مجموعة متنوعة من المواد حيويا لمجموعة واسعة من التطبيقات والبحوث الطبية الحيوية الأساسية.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> كاشف أو صك </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td></tr><tr><td> البولي ايثيلين جلايكول succinimydyl كاربوكسيميثيل (A-PEG-SCM) </td><td> Laysan </td><td> 120-64 </td></tr><tr><td> Polyethelyene جليكول diacrylate (PEGda) </td><td> Dajac مختبرات </td><td> 9359 </td></tr><tr><td> أرجينين جليكاين-الأسبارتيك حمض سيرين (RGDS) </td><td> الببتيد الأمريكية </td><td> 49-01-4 </td></tr><tr><td> N، N - Diisopropylethylamine (DIPEA) </td><td> سيجما </td><td> D125806 </td></tr><tr><td> ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) </td><td> سيجما </td><td> D2438 </td></tr><tr><td> N، N-ثنائي ميثيل فورماميد (DMF) </td><td> الصياد </td><td> D119-4 </td></tr><tr><td> رباعي هيدرو الفوران (THF) </td><td> الصياد </td><td> T397 </td></tr><tr><td> كاسيت غسيل الكلى (3500دا) </td><td> الحرارية العلمية </td><td> 66330 </td></tr><tr><td> الكسا فلور 350 الكربوكسيلية استر حمض succinimydyl </td><td> الحياة تكنولوجيز </td><td> A-10168 </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> سيجما </td><td> SL2 </td></tr><tr><td> سيليكون الفواصل </td><td> غرينجر </td><td> 1MWA4 </td></tr><tr><td> خزعة اللكمات </td><td> Acuderm </td><td> P1025 (10 ملم) P850 (8 ملم) </td></tr><tr><td> الفوسفات مخزنة المالحة في Dulbecco (DPBS) </td><td> Hyclone </td><td> SH30028 </td></tr><tr><td> Iodixanol (NycoPrep) </td><td> الصياد </td><td> NC9388846 </td></tr><tr><td> 2-هيدروكسي 4&#39;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone </td><td> سيجما </td><td> 410896 </td></tr><tr><td> Dulbecco لتعديل النسر المتوسط ​​(DMEM) </td><td> الحياة تكنولوجيز </td><td> 11054 </td></tr><tr><td> المصل البقري الجنين </td><td> الحياة تكنولوجيز </td><td> 10082 </td></tr><tr><td> البنسلين الستربتوميسين </td><td> الحياة تكنولوجيز </td><td> 15140 </td></tr><tr><td> C2C12 myoblasts </td><td> ATCC </td><td> CRL-1772 </td></tr><tr><td> MALDI </td><td> بروكر </td><td> N / A </td></tr><tr><td> الأشعة فوق البنفسجية-9000 </td><td> Bayco </td><td> الأشعة فوق البنفسجية-9000 </td></tr><tr><td> VersaDoc </td><td> بيو راد </td><td> N / A </td></tr></tbody></table>

density gradient multilayered polymerization (dgmp): a novel technique for creating multi-compartment, customizable scaffolds for tissue engineering

ومصفوفات معقدة زراعة الأنسجة، في أي نوع من أنواع وتركيزات من المحفزات البيولوجية (مثل عوامل النمو، ومثبطات، أو جزيئات صغيرة) أو هيكل المصفوفة (على سبيل المثال تكوين، والتركيز، أو صلابة من المصفوفة) تختلف على الفضاء، وتمكين طائفة واسعة من التحقيقات بشأن كيفية هذه المتغيرات تؤثر تمايز الخلايا، والهجرة، وغيرها من الظواهر. التحدي الرئيسي في خلق مصفوفات الطبقات والحفاظ على السلامة الهيكلية واجهات طبقة دون انتشار المكونات الفردية من كل طبقة 1. المنهجيات الحالية لتحقيق ذلك ما يلي photopatterning 2-3، الطباعة الحجرية 4، functionalization5 متتابعة، وتجميد التجفيف 6، على microfluidics 7، أو الطرد المركزي 8، العديد من الأجهزة المتطورة التي تتطلب والمهارات التقنية. الاعتماد على الآخرين المرفقات من طبقات متتابعة الفردية، والتي قد تؤدي إلى طبقات التبطين 9 </سوب&gt;. DGMP يتغلب على هذه القضايا باستخدام معدل كثافة خاملة مثل iodixanol لخلق طبقات متفاوتة من الكثافة 10. يمكن أن تكون مختلطة منذ المعدل الكثافة مع أي سابق البلمرة أو جزيء النشطة بيولوجيا، DGMP يسمح تخصيص كل طبقة سقالة. ببساطة تركيز متفاوتة من معدل الكثافة يمنع الاختلاط بين الطبقات المجاورة في حين أنها لا تزال مائي. البلمرة اللاحقة خطوة واحدة يؤدي إلى سقالة متعددة الطبقات المستمر هيكليا، والذي لديه كل طبقة متميزة الكيميائية والخواص الميكانيكية. يمكن المعدل الكثافة إزالتها بسهولة مع الشطف كافية دون اضطراب من طبقات الفردية أو مكوناتها. ولذلك هذه التقنية مناسبة تماما لخلق الهلاميات المائية من مختلف الأحجام والأشكال والمواد. ويرد على بروتوكول للافتعال 2D-البولي ايثيلين جلايكول (PEG) هلام، في أي الطبقات بالتناوب دمج RGDS-350، أدناه. نستخدم PEG بecause من حيويا والخاملة. يستخدم RGDS، والتصاق الخلايا الببتيد 11، لإثبات تقييد المكاني للجديلة البيولوجية، واقتران من fluorophore (اليكسا فلور 350) تمكننا من التمييز بين الطبقات المختلفة بصريا. ويمكن تكييف هذا الإجراء لمواد أخرى (مثل الكولاجين، hyaluronan، الخ) ويمكن تمديدها لصنع المواد الهلامية 3D مع بعض التعديلات 10.

MALDI-TOF التحليل يؤكد اقتران من الببتيد RGDS لacryloyl-PEG (الشكل 2). هلام التصوير يكشف بالتناوب RGDS-350 (الأزرق) بعد بلمرة ضوئية المنشأ طبقات (الشكل 3A). كما هو مبين في الشكل 3A، يمكن أن تتفاوت 2D حجم هلام DGMP يعتمد على القطر من قوالب السيليكون (10 مم، اليسار و 8 مم، الحق)، وبالتالي فهي قابلة للتخصيص بسهولة لاستخدامها في فحوصات متعددة - في هذه الحالة لتتناسب مع 48 لوحة جيدا زراعة الخلايا (الشكل 3B). وEpifluorescence المرحلة المجهر النقيض من C2C12 myoblasts مثقف على هلام DGMP يبين المرفق انتقائية على RGDS-350-تحتوي على طبقات PEG (الشكل 4)، مما يدل على تجزئة الخلية التصاق الببتيد (RGDS). <img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig1.jpg" alt="الشكل 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50018/50018fig1highres.jpg"/> الشكل 1. الجزيئية weigHT-MALDI تحليل TOF مقارنة aPEG-SCM لaPEG-RGDS تم الحصول عليها بعد الاقتران من الببتيد RGDS. <img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig2.jpg" alt="الشكل 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50018/50018fig2highres.jpg"/> الشكل 2. التمثيل التخطيطي لتصنيع هلام DGMP. بعد أن يتم الطبقات والتدرجات، يمكن أن يسمح لهم لتسوية لفترات زمنية مختلفة (ر ق) لإنشاء واجهات تخرج، تليها بلمرة ضوئية المنشأ. ويمكن استخراج طبقات الهلام DGMP بسهولة من القالب لاستخدامها مرة أخرى. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50018/50018fig2large.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية</a> . <img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. تصوير A) جل متعدد الطبقات 2D تم الحصول عليها بعد بلمرة ضوئية المنشأ باستخدام 350 نانومتر والقنوات الضوء الأبيض من العكسثيقة وحدة جل الوثائق. تدرج الرمادي صورة تكشف طبقات متبادلة تحتوي على RGDS باللون الأبيض. B) الإدراج من هلام DGMP إلى جانب 48-الأطباق ثقافة الخلية. <img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig4.jpg" alt="الشكل 4" /> الشكل 4. مدموجة النقيض المرحلة وصورة من epifluorescence C2C12 myoblasts نمت على المواد الهلامية DGMP (مقياس بار 50 ميكرومتر). <img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig5.jpg" alt="الشكل 5" /> الشكل 5. تأثير على مرونة iodixanol سطح هلام. المجهري القوة الذرية قياسات للعينات ثابتة من ركائز PEG crosslinked باستخدام أساليب المحددة سابقا مع مشغل 2 ن ن القوة 12. * p &lt;0.05 و ** p &lt;0.01.

Watch this Scientific Journal Video about Density Gradient Multilayered Polymerization DGMP: A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering at JoVE.com

Density Gradient Multilayered Polymerization DGMP: A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

نحن هنا وصف استراتيجية فريدة من نوعها لخلق حيويا، المصفوفات الطبقات مع واجهات المستمر بين طبقات متميزة لهندسة الأنسجة. يمكن لهذه السقالة توفير بيئة مثالية للتخصيص لتعديل سلوك الخلية عن طريق إشارات مختلفة البيولوجية أو الكيميائية أو الميكانيكية

التدرج الكثافة متعدد الطبقات البلمرة (DGMP): تقنية جديدة لإنشاء موضوع متعدد المقصورة، السقالات للهندسة الأنسجة تخصيص

Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix ...

density-gradient-multilayered-polymerization-dgmp-novel-technique-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Density Gradient Multilayered Polymerization (DGMP): A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

12.4K Views.  University of California, San Diego. نحن هنا وصف استراتيجية فريدة من نوعها لخلق حيويا، المصفوفات الطبقات مع واجهات المستمر بين طبقات متميزة لهندسة الأنسجة. يمكن لهذه السقالة توفير بيئة مثالية للتخصيص لتعديل سلوك الخلية عن طريق إشارات مختلفة البيولوجية أو الكيميائية أو الميكانيكية

Video: Density Gradient Multilayered Polymerization DGMP: A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and increasing obesity1. Currently, bypass surgery using autologous vessels, allografts, and synthetic grafts are known as a commonly used for arterial substitutes2. However, these grafts have limited applications when an inner diameter of arteries is less than 6 mm due to low availability, thrombotic complications, compliance mismatch, and late intimal hyperplasia3,4. To overcome these limitations, tissue engineering has been successfully applied as a promising alternative to develop small-diameter arterial constructs that are nonthrombogenic, robust, and compliant. Several previous studies have developed small-diameter arterial constructs with tri-lamellar structure, excellent mechanical properties and burst pressure comparable to native arteries5,6. While high tensile strength and burst pressure by increasing collagen production from a rigid material or cell sheet scaffold, these constructs still had low elastin production and compliance, which is a major problem to cause graft failure after implantation. Considering these issues, we hypothesized that an elastometric biomaterial combined with mechanical conditioning would provide elasticity and conduct mechanical signals more efficiently to vascular cells, which increase extracellular matrix production and support cellular orientation.
The objective of this report is to introduce a fabrication technique of porous tubular scaffolds and a dynamic mechanical conditioning for applying them to arterial tissue engineering. We used a biodegradable elastomer, poly (glycerol sebacate) (PGS)7 for fabricating porous tubular scaffolds from the salt fusion method. Adult primary baboon smooth muscle cells (SMCs) were seeded on the lumen of scaffolds, which cultured in our designed pulsatile flow bioreactor for 3 weeks. PGS scaffolds had consistent thickness and randomly distributed macro- and micro-pores. Mechanical conditioning from pulsatile flow bioreactor supported SMC orientation and enhanced ECM production in scaffolds. These results suggest that elastomeric scaffolds and mechanical conditioning of bioreactor culture may be a promising method for arterial tissue engineering.

Elastomeric PGS scaffolds with vascular smooth muscle cells cultured in a pulsatile flow bioreactor may lead to promising small-diameter arterial constructs with native ECM production in a relatively short culture period.

PGS السقالات المرنة في هندسة الأنسجة الشرياني

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and ...

Postproduction Processing of Electrospun Fibres for Tissue Engineering

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo undergo biaxial distension to varying extents such as skin, bladder, pelvic floor and even the hard palate as children grow. In producing scaffolds for these purposes there is a need to develop scaffolds of appropriate biomechanical properties (whether achieved without or with cells) and which are sterile for clinical use. The focus of this paper is not how to establish basic electrospinning parameters (as there is extensive literature on electrospinning) but on how to modify spun scaffolds post production to make them fit for tissue engineering purposes - here thickness, mechanical properties and sterilisation (required for clinical use) are considered and we also describe how cells can be cultured on scaffolds and subjected to biaxial strain to condition them for specific applications.
Electrospinning tends to produce thin sheets; as the electrospinning collector becomes coated with insulating fibres it becomes a poor conductor such that fibres no longer deposit on it. Hence we describe approaches to produce thicker structures by heat or vapour annealing increasing the strength of scaffolds but not necessarily the elasticity. Sequential spinning of scaffolds of different polymers to achieve complex scaffolds is also described. Sterilisation methodologies can adversely affect strength and elasticity of scaffolds. We compare three methods for their effects on the biomechanical properties on electrospun scaffolds of poly lactic-co-glycolic acid (PLGA).
Imaging of cells on scaffolds and assessment of production of extracellular matrix (ECM) proteins by cells on scaffolds is described. Culturing cells on scaffolds in vitro can improve scaffold strength and elasticity but the tissue engineering literature shows that cells often fail to produce appropriate ECM when cultured under static conditions. There are few commercial systems available that allow one to culture cells on scaffolds under dynamic conditioning regimes - one example is the Bose Electroforce 3100 which can be used to exert a conditioning programme on cells in scaffolds held using mechanical grips within a media filled chamber.4 An approach to a budget cell culture bioreactor for controlled distortion in 2 dimensions is described. We show that cells can be induced to produce elastin under these conditions. Finally assessment of the biomechanical properties of processed scaffolds cultured with or without cells is described.

Electrospun scaffolds can be processed post production for tissue engineering applications. Here we describe methods for spinning complex scaffolds (by consecutive spinning), for making thicker scaffolds (by multi-layering using heat or vapour annealing), for achieving sterility (aseptic production or sterilisation post production) and for achieving appropriate biomechanical properties.

المعالجة بعد الإنتاج من الألياف Electrospun للهندسة الأنسجة

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce  scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

سقالات الإبلاغ الذاتي للخلية ثقافة 3 الأبعاد

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

A Novel Bioreactor for High Density Cultivation of Diverse Microbial Communities

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past studies have evaluated the performance of the reactor for the removal of COD1 and nitrogen species2-4 by heterotrophic and chemoautotrophic bacteria, respectively. The HDBR design eliminates the requirement for external flocculation/sedimentation processes while still yielding effluent containing low suspended solids. In this study, the HDBR is applied as a photobioreactor (PBR) in order to characterize the nitrogen removal characteristics of an algae-based photosynthetic microbial community. As previously reported for this HDBR design, a stable biomass zone was established with a clear delineation between the biologically active portion of the reactor and the recycling reactor fluid, which resulted in a low suspended solid effluent. The algal community in the HDBR was observed to remove 18.4% of total nitrogen species in the influent. Varying NH4+ and NO3- concentrations in the feed did not have an effect on NH4+ removal (n=44, p=0.993 and n=44, p=0.610 respectively) while NH4+ feed concentration was found to be negatively related with NO3- removal (n=44, p=0.000) and NO3- feed concentration was found to be positively correlated with NO3- removal (n=44, p=0.000). Consistent removal of NH4+, combined with the accumulation of oxidized nitrogen species at high NH4+ fluxes indicates the presence of ammonia- and nitrite-oxidizing bacteria within the microbial community.

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Here, the HDBR is successfully applied in a photobioreactor (PBR) configuration for the study of nitrogen metabolism by a mixed high density algal community.

مفاعل حيوي رواية لزراعة ارتفاع كثافة المجتمعات الميكروبية متنوعة

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past ...

Rod-based Fabrication of Customizable Soft Robotic Pneumatic Gripper Devices for Delicate Tissue Manipulation

Soft compliant gripping is essential in delicate surgical manipulation for minimizing the risk of tissue grip damage caused by high stress concentrations at the point of contact. It can be achieved by complementing traditional rigid grippers with soft robotic pneumatic gripper devices. This manuscript describes a rod-based approach that combined both 3D-printing and a modified soft lithography technique to fabricate the soft pneumatic gripper. In brief, the pneumatic featureless mold with chamber component is 3D-printed and the rods were used to create the pneumatic channels that connect to the chamber. This protocol eliminates the risk of channels occluding during the sealing process and the need for external air source or related control circuit. The soft gripper consists of a chamber filled with air, and one or more gripper arms with a pneumatic channel in each arm connected to the chamber. The pneumatic channel is positioned close to the outer wall to create different stiffness in the gripper arm. Upon compression of the chamber which generates pressure on the pneumatic channel, the gripper arm will bend inward to form a close grip posture because the outer wall area is more compliant. The soft gripper can be inserted into a 3D-printed handling tool with two different control modes for chamber compression: manual gripper mode with a movable piston, and robotic gripper mode with a linear actuator. The double-arm gripper with two actuatable arms was able to pick up objects of sizes up to 2 mm and yet generate lower compressive forces as compared to elastomer-coated and non-coated rigid grippers. The feasibility of having other designs, such as single-arm or hook gripper, was also demonstrated, which further highlighted the customizability of the soft gripper device, and it's potential to be used in delicate surgical manipulation to reduce the risk of tissue grip damage.

This protocol describes a rod-based approach, combining 3D-printing and soft lithography techniques for fabricating the soft gripper devices. This approach eliminates the need for an external air source by incorporating a chamber component and reduces the chance of occlusion during the sealing process, particularly for miniaturized pneumatic channels.

تصنيع مقرها قضيب من تخصيص لينة الروبوتية هوائي أجهزة القابض للتلاعب الأنسجة الحساسة

Soft compliant gripping is essential in delicate surgical manipulation for minimizing the risk of tissue grip damage caused by high stress concentrations ...

Neonatal Cardiac Scaffolds: Novel Matrices for Regenerative Studies

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation. Each year, it is estimated that more than 100,000 donor hearts are needed for cardiac transplantation procedures in the United States1-2. Due to the limited numbers of donors, only approximately 2,400 transplants are performed each year in the U.S.2. Numerous approaches, from cell therapy studies to implantation of mechanical assist devices, have been undertaken, either alone or in combination, in an attempt to coax the heart to repair itself or to rest the failing heart3. In spite of these efforts, ventricular assist devices are still largely used for the purpose of bridging to transplantation and the utility of cell therapies, while they hold some curative promise, is still limited to clinical trials. Additionally, direct xenotransplantation has been attempted but success has been limited due to immune rejection. Clearly, another strategy is required to produce additional organs for transplantation and, ideally, these organs would be autologous so as to avoid the complications associated with rejection and lifetime immunosuppression. Decellularization is a process of removing resident cells from tissues to expose the native extracellular matrix (ECM) or scaffold. Perfusion decellularization offers complete preservation of the three dimensional structure of the tissue, while leaving the bulk of the mechanical properties of the tissue intact4. These scaffolds can be utilized for repopulation with healthy cells to generate research models and, possibly, much needed organs for transplantation. We have exposed the scaffolds from neonatal mice (P3), known to retain remarkable cardiac regenerative capabilities,5-8 to detergent mediated decellularization and we repopulated these scaffolds with murine cardiac cells. These studies support the feasibility of engineering a neonatal heart construct. They further allow for the investigation as to whether the ECM of early postnatal hearts may harbor cues that will result in improved recellularization strategies.

In these studies, we provide methodology for novel, neonatal, murine cardiac scaffolds for use in regenerative studies.

حديثي الولادة القلب السقالات: مصفوفات رواية للدراسات التجدد

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation.  Each year, it is estimated that more than 100,000 donor ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology with great potential for biomedical applications. The technique facilitates the direct deposition of biocompatible polymer fibers to fabricate well-ordered scaffolds in the sub-micron to micro scale range. The establishment of a stable, viscoelastic, polymer jet between a spinneret and a collector is achieved using an applied voltage and can be direct-written. A significant benefit of a typical porous scaffold is a high surface-to-volume ratio which provides increased effective adhesion sites for cell attachment and growth. Controlling the printing process by fine-tuning the system parameters enables high reproducibility in the quality of the printed scaffolds. It also provides a flexible manufacturing platform for users to tailor the morphological structures of the scaffolds to their specific requirements. For this purpose, we present a protocol to obtain different fiber diameters using melt electrospinning writing (MEW) with a guided amendment of the parameters, including flow rate, voltage and collection speed. Furthermore, we demonstrate how to optimize the jet, discuss often experienced technical challenges, explain troubleshooting techniques and showcase a wide range of printable scaffold architectures.

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&amp;#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This protocol serves as a comprehensive guideline to fabricate scaffolds via electrospinning with polymer melts in a direct writing mode. We systematically outline the process and define the appropriate parameter settings for achieving targeted scaffold architectures.

تذوب الكتابة اليكتروسبينينج من السقالات Poly(ε-caprolactone) ثلاثي الأبعاد مع مورفولوجيس يمكن السيطرة عليها لتطبيقات هندسة الأنسجة

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both cartilage and skin analogs were fabricated after bioink pre-cellularization utilizing a novel passive mixing unit technique. This technique was developed with the aim to simplify the steps involved in the mixing of a cell suspension into a highly viscous bioink. The resolution of filaments deposited through bioprinting necessitates the assurance of uniformity in cell distribution prior to printing to avoid the deposition of regions without cells or retention of large cell clumps that can clog the needle. We demonstrate the ability to rapidly blend a cell suspension with a bioink prior to bioprinting of both cartilage and skin analogs. Both tissue analogs could be cultured for up to 4 weeks. Histological analysis demonstrated both cell viability and deposition of tissue specific extracellular matrix (ECM) markers such as glycosaminoglycans (GAGs) and collagen I respectively.

Cartilage and skin analogs were bioprinted using a nanocellulose-alginate based bioink. The bioinks were cellularized prior to printing via a single step passive mixing unit. The constructs were demonstrated to be uniformly cellularized, have high viability, and exhibit favorable markers of differentiation.

بيوبرينتينج الغضاريف والجلد الأنسجة النظير استخدام سلبية رواية خلط وحدة تقنية بريسيلولاريزيشن بيوينك

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current regenerative medicine strategies have focused on transplanting stem cells or genetic manipulation of surrounding support cells in the inner ear to encourage replacement of damaged stem cells to correct hearing loss. Yet, the extracellular matrix (ECM) may play a vital role in inducing and maintaining function of hair cells, and has not been well investigated. Using the cochlear ECM as a scaffold to grow adult stem cells may provide unique insights into how the composition and architecture of the extracellular environment aids cells in sustaining hearing function. Here we present a method for isolating and decellularizing cochleae from mice to use as scaffolds accepting perfused adult stem cells. In the current protocol, cochleae are isolated from euthanized mice, decellularized, and decalcified. Afterward, human Wharton&#39;s jelly cells (hWJCs) that were isolated from the umbilical cord were carefully perfused into each cochlea. The cochleae were used as bioreactors, and cells were cultured for 30 days before undergoing processing for analysis. Decellularized cochleae retained identifiable extracellular structures, but did not reveal the presence of cells or noticeable fragments of DNA. Cells perfused into the cochlea invaded most of the interior and exterior of the cochlea and grew without incident over a duration of 30 days. Thus, the current method can be used to study how cochlear ECM affects cell development and behavior.

The goal of this protocol is to demonstrate an effective method to decellularize and decalcify mouse cochleae for utilization as scaffolds for tissue engineering applications.

بروتوكول ديسيلولاريزينج كوكليا الماوس لهندسة الأنسجة الإذن الداخلية

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an environment that closely mimics the structural features of non-polarized tissue. Furthermore, the particular intrinsic nanofiber structure of the scaffold makes it transparent to visual light, which allows for easy visualization of the sample under microscopy. This advantage was largely used to study cell migration, organization, proliferation, and differentiation and thus any development of their particular cellular function by staining with specific dyes or probes. Furthermore, in this work, we describe the good performance of this system to easily study the redifferentiation of expanded human articular chondrocytes into cartilaginous tissue. Cells were encapsulated into self-assembling peptide scaffolds and cultured under specific conditions to promote chondrogenesis. Three-dimensional cultures showed good viability during the 4 weeks of the experiment. As expected, samples cultured with chondrogenic inducers (compared to non-induced controls) stained strongly positive for toluidine blue (which stains glycosaminoglycans (GAGs) that are highly present in cartilage extracellular matrix) and expressed specific molecular markers, including collagen type I, II and X, according to Western Blot analysis. This protocol is easy to perform and can be used at research laboratories, industries and for educational purposes in laboratory courses.

Here, we present a protocol to obtain 3D-culture systems in self-assembling peptide scaffolds to promote the differentiation of dedifferentiated human articular chondrocytes into cartilage-like tissue.

استزراع خلايا الثدييات في السقالات ببتيد ثلاثي الأبعاد

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...