Yazarlar venöz erişim hattı yerleştirme ile ilgili cerrahi işlemler tamamlanması için Dr Silvia B Campos-Bilderback ve George J Rodos teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca Simonsen ve Frömter suşları hem de oluşan Münih-Wistar kolonileri korumak için Sara E Wean teşekkür etmek istiyorum.

1. Sulfo-Rodamin 101 Sülfanil Klorür (Texas Kırmızı) için Albümin Rat Serum Çekimi <ol><li> Nihai konsantrasyon 50 ml konik bir tüp içinde 15 mg / ml, 100 mM sodyum bikarbonat pH 9.0 arasında Rat (RSA) Serumu Albümini 6.667 ml, 100 mg çözülür. </li><li> Yeri buz / su kabı çözüm ve 0 ile 4 ° C arasında serin </li><li> 15 saniye boyunca ortam üzerinde girdap; Texas Kırmızı sülfonil klorit (TRSC) bir 10 mg flakon için yüksek kaliteli susuz dimetil formamid (DMF) içinde 200 ul ekleyin. </li><li> Vortex RSA ortamda çözüm ve çözünmüş TRSC ekleyin. </li><li> Folyo ile sarın 50 ml konik (oluşan Parafilm sıkı bir mühür sağlamak için kullanılabilir), yatay w / buz sadece ve yeri (kabarcık oluşumunu önlemek) yavaş yavaş çözüm kışkırtmak için rocker üzerinde buz kovası yer, reaksiyon 0 devam etmesine izin 4 ° C&#39;de 1 saat boyunca kanştınldı. </li><li> % 0.9 serum fizyolojik 5 L olun ve klipleri ile ya) diyaliz membran olabilir odası kesilmiş bir 50 kDa molekül ağırlığı, b) di ıslakbir float-bir-leriyle, veya c) slayt-bir-leriyle kaset (indirekt TRSC kaldırmak için tüm uygun) olduğu gibi alysis boru. </li><li> 5 litrelik konteyner w /% 0.9 tuzlu su çözeltisi içinde diyaliz bölmesi ve bir yerde yer Reaksiyon karışımı, bir karıştırma çubuğu kullanılarak hafif çalkalama ile 4 ° C&#39;de gece boyunca dialyze. </li><li> Neredeyse hiç renk değişimi bir gecelik inkübasyon sonuçları (Bu genellikle en az 4 değişim ile ~ 48 saat sürer) kadar sabah ve ikindi 5 L diyaliz solüsyonu değiştirin. Ayrıca, 50 kDa MWCO RSA, 66kDa en MW kadar yakın olmak, bu bir berrak bir solüsyon elde asla mümkün olduğunu, bu membran gözenek boyutu dağılımı bağlı olacaktır, 60 saat ve 5 değişim olduğu yeterli bir süre daha fazladır. </li><li> Ölçü hacmi ve TR-RSA yaklaşık konsantrasyon elde etmek için hacim ile 100 mg başlangıç ​​ağırlığı bölme, tipik konsantrasyon aralığı 10-13 mg / ml arasındadır. Son boya: albümin oranı 15,00 ~ 4:1 1 fluorofor olmalıdırProtein MW 0 Dalton. 4 ° C&#39;de saklayın; oluşabilir parçalanması sonucu geçirgenlik değerleri değiştirecek gibi, TR-RSA çözüm FREEZE ASLA. </li></ol> 2. Görüntüleme / Mikroskop Ayarları için Ters Mikroskop Sahne hazırlanması <ol><li> Yer ~ otoklav bant 4-7 parça (yaklaşık ¾ &quot;uzunluğunda) mükemmel bir şekilde, bir 40 mm altındaki lamel (lamel alt çanak) sahip 50 mm&#39;lik bir çanak içinde birbiri üzerine yığılmış. Bu kenar uçlarından biri ile daha yakın yerleştirilmesi gerekir, böylece bant kenarı böbrek eğrilik kenarı ile temas ancak objektif ışık yolu (Şekil 1A ve 1B) engellemez; büyük sıçan yemeğin bant ve kenar arasında daha fazla boşluk gerektirir. </li><li> 50 mm çanak (Şekil 1A) ile birlikte sahne yanında yer 2 Repti-therm pedleri. Sahne üzerinde bir ısınma su ceketi battaniye yerleştirin. </li><li> Objektif taret temin görüntüleri toplama bir 10x hava o olduğunda verimliliği maksimizer 20x (hava veya su daldırma) objektif ve kantitatif için görüntüleri toplamak için daha yüksek enerjili su daldırma hedefi. </li><li> Görüntüleme sırasında hedefleri su eklemek için en etkili yolu tarafa çevirin ve hedefleri üst ulaşabilirsiniz PE-200 boru uzun bir parça ile bir 1 cc şırınga kullanarak su eklemektir. </li><li> Yazılım nötral yoğunluk filtreleri kullanarak ~% 15-20 için 10watt lazer ikaz yoğunluğunu ayarlayın. Galyum-arsenit fosfit olmayan descanned fotodedektörler kırmızı emisyon toplamak için yeşil emisyon ve 625 toplamak için 750 olarak ayarlanır. Mavi emisyon (örneğin nükleer leke Hoechst 33.342 gibi) 750-800 arasında bir ayar ile standart nondescanned multialkaline dedektör kullanılarak toplanır. </li><li> Bowman alanı içinde düşük yoğunluklu emisyonlarının uygun toplama sağlamak için, dedektörlerin alt limitleri değerleri dışlamak için değil şekilde ayarlanmış olduğundan emin olun. Görsel uyarı işaretleri gösterir, hassasiyetayarı çok düşük ve bu değerler sıfır bir yoğunluk değeri verilmektedir. </li><li> 1 cc toplam hacmi getirmek için% 0.9 steril serum fizyolojik ile sulandırılmış floresan albumin çözüm ~ 5-8 mg ile 1 cc şırınga yükleyin. </li></ol> 3. Intravital için Münih Wistar Rat Böbrek açığa 2-Foton Görüntüleme <ol><li> Pentabarbitol (50 mg / ml solüsyon, 120 μl/100 g vücut ağırlığı), Inactin (130 mg / ml solüsyon, 120 μ/100 g vücut ağırlığı) ya da izofloran (% 5 indüksiyonu, 1,5 ile bir ön anestezi sıçan başla ) 2.5% bakım, bir kalıcı venöz erişim hattı (ya juguler veya femoral ven), ve sol kanattan sadece göğüs kafesi altında sadece sol uyluk yukarıdan tıraş. </li><li> Bu yüzden onun sağ tarafındaki düz sıçan yerleştirin ki sol, tıraşlı yüzü yukarı bakacak, onun duruş uzatılmış ve (Şekil ön pençeleri birbirlerine dokunmadan birbirleriyle ve arka pençeleri dokunmadan, çömelmiş değil ile, masada düz olmasına dikkat edin 2A). </li&gt; <li> Çok hafifçe doğal retroperiton içinde bırakır belirlemek ve bir Sharpie kullanarak vücudun (uyluk göğüs kafesi itibaren) (Şekil 2A) paralel düz bir çizgi çizmek için böbrek hissetmek palpe. </li><li> Dişli forseps bir çift ile cilt Pick up ve doku ezmek ve kanamayı önlemek için hemostat bir çift kullanarak çizilen hat boyunca cilt çimdik. Cerrahi bir makas kullanarak kesi boyunca kesin. Önce kesim için dış deri ve kas tabakaları Kırma önemli ölçüde azaltmak ve genellikle kanama ortadan kaldırır. </li><li> Ince dış kas tabakası, için bu yordamı yineleyin. </li><li> Periton gösterecektir iç kas tabakası, içine kesi için, boyutunu tahmin etmek böbrek yeniden palpe. Böbrek daha küçük bir kesi hat sıkıştırın; kesi güvence sadece böbrek bitti. Bu kesi çok küçük yapmak ve gerekirse daha büyük yapmak için en iyisidir. Bu çok büyük yapılmış ise, dikiş gerekli olacaktır.Bu son kesi önemlidir; çok uzakta herhangi bir yönde üzerinde sahnede istikrarı etkileyen ve neden nefes (en iyi durum senaryosu) den ya hareket eserler veya renal pedikül ve olumsuz azaltmak böbrek perfüzyon (en kötü durum senaryosu) uzatmak olacaktır. </li><li> El moda üzerinde el böbreğin alt kutbu doğru çalışma, böbrek (Şekil 2B gösterildiği gibi) ve kavrama forseps kullanarak çevreleyen yağ bulun. </li><li> Böbreğin alt kutbu ulaşıldığında çok yavaşça exteriorize için böbrek altında sıkma ise, hafifçe kesiden böbrek çekin. Kesi çok küçük ise, kas tabakası ezmek ve genişletmek için kesilmiş, böbrek exteriorize için prosedürü tekrarlayın. </li></ol> 4. Görüntüleme için Sahne Alanı&#39;nda Münih Wistar Rat yerleştirme <ol><li> Böbrek ile lamel çanak kenarına doğru böbrek yerleştirin biraz sıçan dorsal (arka taraf) doğru döndürülmüş böbreğin ventral tarafı bu yüzdens lamel alt çanak (Şekil 1A) ile temas. Çanak bir ılık, steril 09.% Tuz solüsyonu eklenir. </li><li> 10x veya 20x objektif bakmak ve hareket kontrol edin. Hareket tespit edilirse göğüs uzağa lamel alt çanak bu yüzden, biraz üzerinde fare döndürün; böbrek gibi renal pedikül (Şekil 1B) zorlamadan çanak kenarına yakın olduğundan emin olun. </li></ol> 5. Albümin renal geçirgenliği ölçmek için Görüntü Alma <ol><li> Glomerüler geçirgenlik (Glomeruluar Eleme Katsayısı; GSC) hesaplanması herhangi makromolekülün önce floresan molekülün infüzyon bireysel glomerül referans arka plan resimleri alarak gerektirecektir. Mikroskop işaretleme yerleri kapasitesine sahip motorlu bir sahne ile donatılmış ise, bulmak ve düşük güçlü amacı ile merkezi bireysel glomerüller ve her yeri işaretlemek. Bir iki geçişli Fluorescein / Rodamin Epifloresans filya emisyon filtresi (faz kontrast veya aydınlatma olmayan diğer floresan kaynakları çalışmaz) çalışacaktır rağmen ter bu işlem için idealdir. Glomerüller çift geçiş filtresi bakıldığında doğal bir sarı-turuncu autoflourescence olan proksimal tübüllerde çevrili boş dairesel yapılar olarak görünür. </li><li> Mikroskop motorlu bir sahne yoksa, düşük güç amacı ile bir raster desen böbrek tarama ve bireysel glomerül bulunduğu ilkel bir harita yapmak, bu tür böbrek kapsül üzerinde bulunan büyük yüzeysel kan damarları gibi doğal yerlerinden dayanarak veya yağ yamalar. </li><li> Yüksek güç suya daldırma hedefi için taret geçin ve kılcal döngüler ve Bowman adlı kullanıcının alanı açıkça görülebilir emin her glomerüller 3D veri setleri almak. Bir Pseudocolor palet (S / B başka bir şey) kullanarak bu yapıların görselleştirmek için yardımcı olacaktır. </li><li> Yüzeysel bir kan damarı üzerinde odaklanarak yavaş yavaş t demlenmeyeo floresan albümin verme emin zaman sistemik dağıtımı için izin verilir. Düşük GSC ile moleküller için plazma yoğunluk değerleri en üst düzeye çıkarmak, ancak mikroskop fotoğraf detektörler doyurabilecek olacak seviyelere ulaşmak için değil önemlidir. Bu süzüldü moleküllerin tespit edilebilirliğini arttırır. Not: (1 kare / saniye ~ tam kare edinme) ekranda görünür floresan albümin zaman tanıtıldı zaman arasında bir 5-7 saniye hızlandırılmış genellikle yoktur. </li><li> Yaklaşık 10 dakika süresince herhangi bir olası küçük molekül ağırlıklı parçalarının albümin GSC hesaplanmasında kullanılmak üzere 1 mm aralıklarla 3 boyutlu hacim elde önce temizlemek için izin verin. Tipik olarak, Münih Wistar sıçan Simonsen&#39;in gerginlik çok daha az yüzey glomerüllerde vardır, görülebilmesi tüm görüntülü ve sayısal böylece. Biz ~ 10 sayısal sayısını sınırlamak çok Frömter gerginlik çok daha büyük bir numarası vardır. </li><li> Çalışmanın sonunda, fare anesthet bir aşırı ile ötenaziic çalışmada kullanılan. Bir çift pneumothoracotamy ötenazi sağlamak için gerçekleştirilir. </li></ol> 6. 3D Birimleri gelen Floresan Albumin için GSC hesaplanması <ol><li> Metamorph görüntü işleme yazılımı kullanarak arka plan seti hem, her glomerüller için 3D veri setleri yük ve floresan albumin infüzyonu sonra alınan ayarlayın. </li><li> Tanımlanmış marjları ve Bowman kapsül kenarı arasında yeterli alan boş yere sahip bir yüzeysel kılcal döngü bulun floresan albümin içeren hacmi. </li><li> Arka hacmindeki albümin içeren görüntünün tüm görsel ipuçları içermelidir aynı odak düzlemi bulun. Ilgi kılcal döngü içinde bir bölge seçin ve ortalama yoğunluk okuma unutmayın. Sonraki Bowman alanı içinde bir bölge seçin ve ortalama yoğunluk okuma unutmayın. Bu arka plan değerleri olarak kullanılır. </li><li> Kantitatif için, albümin c Bowman alanı içinde benzer bölgeyi seçingörüntü ontaining. Bowman alanı içinde ortalama yoğunluğu için ortalama bir değer almak için en az iki diğer bölgeler için bunu yapın. </li><li> En parlak plazma yoğunluğu ile kılcal döngü seçin ve çevresinde bir bölge çizin. Eşik işlevini kullanarak sonraki, RBC en dolaşan karanlık çizgiler kaçınarak, dolaşımdaki plazma içindeki parlak değerleri vurgulayın. Seçilen plazma alanı ortalama yoğunluk değerleri unutmayın. Kan içinde faktörler sadece yol ve plazma floresan düzeylerinin küçümsenmesi hizmet edecektir çünkü tercihen plazma parlak alanları seçmek önemlidir. </li><li> Bir Microsoft Excel elektronik nerede GSC hesaplamak için değerleri girin kullanarak: </li></ol><img alt="Şekil 1" fo:content-width="2.95in" fo:src="/files/ftp_upload/50052/50052eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50052/50052eq1.jpg" />

<ol>
	<li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+normal+kidney+filters+nephritic+levels+of+albumin+retrieved+by+proximal+tubule+cells;+retrieval+is+disrupted+in+nephritic+states.">The normal kidney filters nephritic levels of albumin retrieved by proximal tubule cells; retrieval is disrupted in nephritic states.</a> Kidney International. 71, 504 (2007).</li><li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+tubular+uptake+explains+albuminuria+in+early+diabetic+nephropathy.">Impaired tubular uptake explains albuminuria in early diabetic nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 20 (3), 489 (2009).</li><li>Sandoval, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+factors+influence+glomerular+albumin+permeability+in+rats.">Multiple factors influence glomerular albumin permeability in rats.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 23 (3), 447 (2012).</li><li>Tojo, A., Endou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrarenal+handling+of+proteins+in+rats+using+fractional+micropuncture+technique.">Intrarenal handling of proteins in rats using fractional micropuncture technique.</a> American Journal of Physiology. 263, 601 (1992).</li><li>Asgeirsson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+sieving+of+three+neutral+polysaccharides,+polyethylene+oxide+and+bikunin+in+rat:+Effects+of+molecular+size+and+conformation.">Glomerular sieving of three neutral polysaccharides, polyethylene oxide and bikunin in rat: Effects of molecular size and conformation.</a> Acta Physiologica. 191 (3), 237 (2007).</li><li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+endocytosis+in+vivo+using+intravital+two-photon+microscopy.">Quantifying endocytosis in vivo using intravital two-photon microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 440, 389 (2008).</li><li>Dunn, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-animal+imaging+of+renal+function+by+multi-photon+microscopy.">Live-animal imaging of renal function by multi-photon microscopy.</a> Curr. Protoc. Cytom. Chapter 12, Unit 12.9 (2007).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Burada vurgulanan adımları biz aşağıdaki tuzaklar aşmak için tutarlı ve doğru geçirgenlik değerleri üretecek olanlar için ne hissediyorum temsil: <ol><li> Saçılma: uzun dalga boyu fotonlar dağılım daha az eğilimli olduğundan kırmızı yayan fluorophores kullanımı ışık daha verimli toplama için izin verir. Ya yeşil ya da mavi yayan fluorophores kullanarak çünkü kılcal döngüler ve Bowman adlı kullanıcının alanı 3 yoğunluk değerleri artan değişkenlik GSC yıllarda b...

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Olympus Floview 1000 confocal/Multi-photon microscope</td>
 <td>Olympus America</td>
 <td></td>
 <td>Filters for detectors: Blue 430/100, Green 525/50, Red 605/90</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mode-Locked Ti:Sapphire Mai Tai Laser</td>
 <td>Spectra-Physics</td>
 <td></td>
 <td>Tunable excitation wavelengths: ~750-1150 nm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gallium arsenide phosphide photodetectors</td>
 <td>Hamamatsu Corp</td>
 <td></td>
 <td>Note: Front or Side mounted configurations available.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Metamorph Image processing Software</td>
 <td>Molecular Dynamics</td>
 <td></td>
 <td>Note: Version 6.1r1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microsoft Excel</td>
 <td>Microsoft Corportation</td>
 <td></td>
 <td>2007 version</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Handling Forceps</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 78266-04</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mayo Dissecting Scissors</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 72962</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CA Micro scissors Model 1C300</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 78180-1C3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kelly Hemostatic Forceps (straight)</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 72930</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Water Jacket Blanket + Heating Pad</td>
 <td>Gaymar</td>
 <td></td>
 <td>T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Repti-Therm Under Tank Heater</td>
 <td>ZooMed</td>
 <td></td>
 <td>RH-4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Texas Red Sulfonyl Chloride</td>
 <td>Invitrogen/Molecular Probes</td>
 <td>Cat# T-353</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rat Serum Albumin</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>Cat# A-6272</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High Quality Anhydrous DMF</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>Cat# 270547</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Strate-Line Autoclave Tape</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>Cat# 11-889-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip)</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 70665-07</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

quantifying glomerular permeability of fluorescent macromolecules using 2-photon microscopy in munich wistar rats

Bu albümin serum, uzun geçirgenliği podocytes oluşan bariyer, damar endotel hücreleri ve uyum içinde çalışan bir bazal membran değişiklikler neden olduğu düşünülmüştür gibi büyük temel makromoleküllerin idrar kaybı, ilgili Böbrek hastalıkları. Intravital 2-foton mikroskopi kullanılarak laboratuarda elde edilen veriler, proksimal tübül hücreleri (PTC), 1,2 adlandırılan hücrelerin erken altkümedeki süzüldü albümin alma ile daha önce fizyolojik koşullar altında düşünce göre daha geçirgen glomerüler filtrasyon bariyer (GFB), ortaya 3. Önceki teknikler böbrek filtrasyon incelemek için kullanılır ve sıvı içerik ve analiz 4 örnekleme ile bu ilk boru bölümlerinin lümeninin micropuncture dahil Süzme bariyerinin karakteristik kurulması. İlgili yakından; Bu çalışmalar yok denecek kadar olması luminal sıvı albümin konsantrasyonu tespitnormalde idrarda tespit ne için. Ancak, bu teknik tarafından tanımlanan boyutlar ile dekstran polimerlerin karakterizasyonu serum albümin benzer bir büyüklükte, ortaya boru şekilli lümeni ve idrarda yüksek seviyelere sahipti; artan geçirgenliği 5 düşündürmektedir. Burada doğrudan görselleştirmek ve in vivo olarak glomerüler floresan albümin geçirgenliği ölçmek için kullanılan tekniğin ayrıntılı bir taslak olduğunu. Bu yöntem, Bowman adlı kullanıcının alanı (idrar filtrasyon ilk odası) içine filtrasyon bariyeri genelinde filtre albumin tespiti için izin verir ve aynı zamanda proksimal tübüllerde ve sonraki albümin transcytosis 6 görselleştirme ile albümin reabsorbsiyonu ölçümü sağlar. Mesane yolda daha sonra boru segmentleri boyunca floresan albumin yokluğu önceki proksimal tübül segmentlerinde alma yolunun etkinliğini vurgulamaktadır. Ayrıca, bu teknik uygulandığında geçirgenliğini saptamak içinalbumin, hemen hemen aynı geçirgenlik değerlerine benzer bir boyutu olan dekstranlar 2. bildirildi. Bu gözlemler doğrudan proksimal tübül hücre ıslahı dahil değişiklikler için birçok proteinürik böbrek hastalıklarının odak genişletmek için ihtiyaç destek.

Şekil 3 Münih Wistar Frömter sıçan ve floresan albumin geçirgenliğini belirlemek için atılan adımların bir yüzey glomerulus alınan bir görüntü bir örneğini göstermektedir. 0.0111 albumin için GSC değeri Münih Wistar rat zaman beslenen durumu 3 bu gerginlik görülen aralığında bu bireysel glomerulus sonbaharda elde. Bu görüntüler görülen kararlılık dikkatli planlama ve Şekiller 1 ve 2 de gösterilen, talimatların yürütülme...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats at JoVE.com

Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

2-foton mikroskopi yüksek çözünürlüklü intavital kullanan bir teknik doğrudan görselleştirmek ve yüzey glomerüllerde gloemrular filtrasyon ölçmek için. Bu yöntem, normal ve hastalıklı hem Devletler makromoleküllerin geçirgenlik özelliklerinin doğrudan belirlenmesi için olanak sağlar.

Münih Wistar Sıçanlarda 2-Foton Mikroskopi kullanarak Floresan Makromoleküllerin Glomerüler geçirgenliği miktarının

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

quantifying-glomerular-permeability-fluorescent-macromolecules-using

Research

JoVE Journal

Medicine

10.4K Görüntüleme.  Indiana University School of Medicine. 2-foton mikroskopi yüksek çözünürlüklü intavital kullanan bir teknik doğrudan görselleştirmek ve yüzey glomerüllerde gloemrular filtrasyon ölçmek için. Bu yöntem, normal ve hastalıklı hem Devletler makromoleküllerin geçirgenlik özelliklerinin doğrudan belirlenmesi için olanak sağlar.

Video: Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, the role of beta-cell dysfunction in type 2 diabetes has been clearly established 2. Research progress has required methods for the isolation of pancreatic islets. The protocol of the islet isolation presented here shares many common steps with protocols from other groups, with some modifications to improve the yield and quality of isolated islets from both the wild type and diabetic Leprdb (db/db) mice. A live-cell 2-photon imaging method is then presented that can be used to investigate the control of insulin secretion within islets.

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Tip 2 Diyabet Fare Modeli: Bozulmamış Islets Of Pankreas Adacık İzolasyonu ve Canlı hücre 2-Foton Görüntüleme

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

Tıp

Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static information and is often not sufficient for a correct interpretation. Intravital evaluation, in which a process is followed in time, provides extra and often unexpected information. With the creation of transgenic animals expressing cell-specific markers and live cell tracers, improvements to imaging equipment, and the development of several imaging chambers, intravital microscopy has become an important tool to better understand biological processes. This paper describes an experimental design for the investigation of tumor vessel development and of therapeutic effects in a spatial and temporal manner. Using this setup, the stage of vessel development, tip cell and lumen formation, blood flow, extravasation, an established vascular bed, and vascular destruction can be visualized and followed. Furthermore, therapeutic effects, intratumoral fate, and the localization of chemotherapeutic compounds can also be followed.

This protocol describes the intravital imaging of transgenic mice expressing cell-specific fluorescent markers. Intravital imaging provides a non-invasive method for high-resolution observations in living animals using implantable windows through which the microscopic visualization of processes is possible. This method is especially useful to study longitudinal processes.

Tümör ilişkili damarlara kullanmanın intravital mikroskobu gelişmiş Dorsal deri kıvrım pencere Chambers transgenik floresan fareler üzerinde

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static ...

A Method for Quantifying Upper Limb Performance in Daily Life Using Accelerometers

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. It has become important to measure a person's activities in daily life, and not just measure their capacity for activity in the structured environment of a clinic or laboratory. A wearable sensor that is now enabling measurement of daily movement is the accelerometer. Accelerometers are commercially-available devices resembling large wrist watches that can be worn throughout the day. Data from accelerometers can quantify how the limbs are engaged to perform activities in peoples' homes and communities. This report describes a methodology to collect accelerometry data and turn it into clinically-relevant information. First, data are collected by having the participant wear two accelerometers (one on each wrist) for 24 h or longer. The accelerometry data are then downloaded and processed to produce four different variables that describe key aspects of upper limb activity in daily life: hours of use, use ratio, magnitude ratio, and the bilateral magnitude. Density plots can be constructed that visually represent the data from the 24 h wearing period. The variables and their resultant density plots are highly consistent in neurologically-intact, community-dwelling adults. This striking consistency makes them a useful tool for determining if upper limb daily performance is different from normal. This methodology is appropriate for research studies investigating upper limb dysfunction and interventions designed to improve upper limb performance in daily life in people with stroke and other patient populations. Because of its relative simplicity, it may not be long before it is also incorporated in clinical neurorehabilitation practice.

This protocol describes a method to quantify upper limb performance in daily life using wrist-worn accelerometers.

Ivmeölçer kullanan Günlük Yaşamda Üst Ekstremite Performans miktarının Bir Yöntem

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. ...

In Vivo Morphometric Analysis of Human Cranial Nerves Using Magnetic Resonance Imaging in Meni&#232;re's Disease Ears and Normal Hearing Ears

Analysis of neural structures in Meni&#232;re's Disease (MD) is of importance, since a loss of such structures has previously been proposed for this patient group but has yet to be confirmed. This protocol describes a method of in vivo evaluation of neural changes especially well suitable for cranial nerve analysis using magnetic resonance imaging (MRI). MD-patients and normal hearing persons were examined in a 3-T MR-scanner using a scan protocol including strongly T2-weighted 3D gradient-echo-sequence (3D-CISS). In the patient group, MD was additionally confirmed using MRI-based assessment of endolymphatic hydrops. Morphometric analysis was performed using a freeware DICOM viewer. Evaluation of cranial nerves included measurements of cross-sectional areas (CSAs) of the nerves at different levels as well as orthogonal diametric measurements.

&lt;em&gt;In Vivo&lt;/em&gt; Morphometric Analysis of Human Cranial Nerves Using Magnetic Resonance Imaging in Meni&amp;#232;re&#039;s Disease Ears and Normal Hearing Ears

To evaluate morphological changes of cranial nerves such as loss of neural structures or swelling of cranial nerves in Meni&#232;re&#39;s Disease (MD) or in healthy persons in vivo, a protocol of evaluation has been developed using magnetic resonance imaging (MRI). Additional MRI-based confirmation of MD was performed.

Vivo Menière'nın hastalığı kulakları ve Normal işitme kulak manyetik rezonans görüntüleme kullanarak insan kranial sinirler xarakteristikaları analizi

Analysis of neural structures in Meni&#232;re's Disease (MD) is of importance, since a loss of such structures has previously been proposed for this ...

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function in diabetic nephropathy and podocyte-specific VEGF-A knock-out mice; therefore, this protocol describes the full kidney work-up used in our lab to assess these mouse models of glomerular disease, enabling a vast amount of information regarding kidney and glomerular function to be obtained from a single mouse. In comparison to alternative methods presented in the literature to assess glomerular function, the use of the method outlined in this paper enables the glomerular phenotype to be fully evaluated from multiple aspects. By using this method, the researcher can determine the kidney phenotype of the model and assess the mechanism as to why the phenotype develops. This vital information on the mechanism of disease is required when examining potential therapeutic avenues in these models. The methods allow for detailed functional assessment of the glomerular filtration barrier through measurement of the urinary albumin creatinine ratio and individual glomerular water permeability, as well as both structural and ultra-structural examination using the Periodic Acid Schiff stain and electron microscopy. Furthermore, analysis of the genes dysregulated at the mRNA and protein level enables mechanistic analysis of glomerular function. This protocol outlines the generic but adaptable methods that can be applied to all mouse models of glomerular disease.

This protocol describes a full kidney work-up that should be carried out in mouse models of glomerular disease. The methods allow for detailed functional, structural, and mechanistic analysis of glomerular function, which can be applied to all mouse models of glomerular disease.

Fare modelleri Glomerular hastalığı böbrek fonksiyonlarının değerlendirilmesi

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...

Transdermal Measurement of Glomerular Filtration Rate in Mice

Transdermal analysis of glomerular filtration rate (GFR) is an established technique that is used to assess renal function in mouse and rat models of acute kidney injury and chronic kidney disease. The measurement system consists of a miniaturized fluorescence detector that is directly attached to the skin on the back of conscious, freely moving animals, and measures the excretion kinetics of the exogenous GFR tracer, fluorescein-isothiocyanate (FITC) conjugated sinistrin (an inulin analog). This system has been described in detail in rats. However, because of their smaller size, measurement of transcutaneous GFR in mice presents additional technical challenges. In this paper we therefore provide the first detailed practical guide to the use of transdermal GFR monitors in mice based on the combined experience of three different investigators who have been performing this assay in mice over a number of years.

Here we describe a protocol to measure glomerular filtration rate (GFR) in conscious, freely moving mice using a transdermal GFR monitor.

Farelerde Glomerular filtrasyon transdermal ölçümü

Transdermal analysis of glomerular filtration rate (GFR) is an established technique that is used to assess renal function in mouse and rat models of ...

Highly Sensitive Measurement of Glomerular Permeability in Mice with Fluorescein Isothiocyanate-polysucrose 70

The loss of albumin in urine (albuminuria) predicts cardiovascular outcome. Under physiological conditions, small amounts of albumin are filtered by the glomerulus and reabsorbed in the tubular system up until the absorption limit is reached. Early increases in pathological albumin filtration may, thus, be missed by analyzing albuminuria. Therefore, the use of tracers to test glomerular permselectivity appears advantageous. Fluorescently labeled tracer fluorescein isothiocyanate (FITC)-polysucrose (i.e., FITC-Ficoll), can be used to study glomerular permselectivity. FITC-polysucrose molecules are freely filtered by the glomerulus but not reabsorbed in the tubular system. In mice and rats, FITC-polysucrose has been investigated in models of glomerular permeability by using technically complex procedures (i.e., radioactive measurements, high-performance liquid chromatography [HPLC], gel filtration). We have modified and facilitated a FITC-polysucrose tracer-based protocol to test early and small increases in glomerular permeability to FITC-polysucrose 70 (size of albumin) in mice. This method allows repetitive urine analyses with small urine volumes (5 &#181;L). This protocol contains information on how the tracer FITC-polysucrose 70 is applied intravenously and urine is collected via a simple urinary catheter. Urine is analyzed via a fluorescence plate reader and normalized to a urine concentration marker (creatinine), thereby avoiding technically complex procedures.

Here, we present a protocol to test glomerular permeability in mice using a highly sensitive, nonradioactive tracer. This method allows repetitive urine analyses with small urine volumes.

Floresan Isotiyoyanat-polisucrose 70 ile Farelerde Glomerüler Geçirgenliğin Yüksek Hassas Ölçümü

The loss of albumin in urine (albuminuria) predicts cardiovascular outcome. Under physiological conditions, small amounts of albumin are filtered by the ...

Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse

The electrical signal physiologically generated by pacemaker cells in the sinoatrial node (SAN) is conducted through the conduction system, which includes the atrioventricular node (AVN), to allow excitation and contraction of the whole heart. Any dysfunction of either SAN or AVN results in arrhythmias, indicating their fundamental role in electrophysiology and arrhythmogenesis. Mouse models are widely used in arrhythmia research, but the specific investigation of SAN and AVN remains challenging.
The SAN is located at the junction of the crista terminalis with the superior vena cava and AVN is located at the apex of the triangle of Koch, formed by the orifice of the coronary sinus, the tricuspid annulus, and the tendon of Todaro. However, due to the small size, visualization by conventional histology remains challenging and it does not allow the study of SAN and AVN within their 3D environment.
Here we describe a whole-mount immunofluorescence approach that allows the local visualization of labelled mouse SAN and AVN. Whole-mount immunofluorescence staining is intended for smaller sections of tissue without the need for manual sectioning. To this purpose, the mouse heart is dissected, with unwanted tissue removed, followed by fixation, permeabilization and blocking. Cells of the conduction system within SAN and AVN are then stained with an anti-HCN4 antibody. Confocal laser scanning microscopy and image processing allow differentiation between nodal cells and working cardiomyocytes, and to clearly localize SAN and AVN. Furthermore, additional antibodies can be combined to label other cell types as well, such as nerve fibers.
Compared to conventional immunohistology, whole-mount immunofluorescence staining preserves the anatomical integrity of the cardiac conduction system, thus allowing the investigation of AVN; especially so into their anatomy and interactions with the surrounding working myocardium and non-myocyte cells.

We provide a step-by-step protocol for whole-mount immunofluorescence staining of the sinoatrial node (SAN) and atrioventricular node (AVN) in murine hearts.

Faredeki Sinoatriyal ve Atriyoventriküler Düğümün Tam Montajlı İmmünofloresan Boyama, Konfokal Görüntüleme ve 3D Rekonstrüksiyonu

The electrical signal physiologically generated by pacemaker cells in the sinoatrial node (SAN) is conducted through the conduction system, which includes ...

Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by electrical impulses generated in sinoatrial node (SAN) and then conducted to ventricles via atrioventricular node (AVN). To further study the role of resident macrophages in cardiac conduction system, a proper isolation of resident macrophages from SAN and AVN is necessary, but it remains challenging. Here, we provide a protocol for the reliable microdissection of the SAN and AVN in murine hearts followed by the isolation and culture of resident macrophages.
Both, SAN which is located at the junction of the crista terminalis with the superior vena cava, and AVN which is located at the apex of the triangle of Koch, are identified and microdissected. Correct location is confirmed by histologic analysis of the tissue performed with Masson's trichrome stain and by anti-HCN4.
Microdissected tissues are then enzymatically digested to obtain single cell suspensions followed by the incubation with a specific panel of antibodies directed against cell-type specific surface markers. This allows to identify, count, or isolate different cell populations by fluorescent activated cell sorting. To differentiate cardiac resident macrophages from other immune cells in the myocardium, especially recruited monocyte-derived macrophages, a delicate devised gating strategy is needed. First, lymphoid lineage cells are detected and excluded from further analysis. Then, myeloid cells are identified with resident macrophages being determined by high expression of both CD45 and CD11b, and low expression of Ly6C. With cell sorting, isolated cardiac macrophages can then be cultivated in vitro over several days for further investigation. We, therefore, describe a protocol to isolate cardiac resident macrophages located within the cardiac conduction system. We discuss pitfalls in microdissecting and digesting SAN and AVN, and provide a gating strategy to reliably identify, count and sort cardiac macrophages by fluorescence-activated cell sorting.

The protocol presented here provides a step-by-step approach for the isolation of cardiac resident macrophages from the sinoatrial node (SAN) and atrioventricular node (AVN) region of mouse hearts.

Murine Sinoatriyal ve Atriyoventriküler Düğümden Yerleşik Kardiyak Makrofajların İzolasyonu ve Kültürü

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by ...

Analyzing Long-Term Electrocardiography Recordings to Detect Arrhythmias in Mice

Arrhythmias are common, affecting millions of patients worldwide. Current treatment strategies are associated with significant side effects and remain ineffective in many patients. To improve patient care, novel and innovative therapeutic concepts causally targeting arrhythmia mechanisms are needed. To study the complex pathophysiology of arrhythmias, suitable animal models are necessary, and mice have been proven to be ideal model species to evaluate the genetic impact on arrhythmias, to investigate fundamental molecular and cellular mechanisms, and to identify potential therapeutic targets.
Implantable telemetry devices are among the most powerful tools available to study electrophysiology in mice, allowing continuous ECG recording over a period of several months in freely moving, awake mice. However, due to the huge number of data points (&gt;1 million QRS complexes per day), analysis of telemetry data remains challenging. This article describes a step-by-step approach to analyze ECGs and to detect arrhythmias in long-term telemetry recordings using the software, Ponemah, with its analysis modules, ECG Pro and Data Insights, developed by Data Sciences International (DSI). To analyze basic ECG parameters, such as heart rate, P wave duration, PR interval, QRS interval, or QT duration, an automated attribute analysis was performed using Ponemah to identify P, Q, and T waves within individually adjusted windows around detected R waves. 
Results were then manually reviewed, allowing adjustment of individual annotations. The output from the attribute-based analysis and the pattern recognition analysis was then used by the Data Insights module to detect arrhythmias. This module allows an automatic screening for individually defined arrhythmias within the recording, followed by a manual review of suspected arrhythmia episodes. The article briefly discusses challenges in recording and detecting ECG signals, suggests strategies to improve data quality, and provides representative recordings of arrhythmias detected in mice using the approach described above.

Here we present a step-by-step protocol for a semiautomated approach to analyze murine long-term electrocardiography (ECG) data for basic ECG parameters and common arrhythmias. Data are obtained by implantable telemetry transmitters in living and awake mice and analyzed using Ponemah and its analysis modules.

Farelerde Aritmileri Tespit Etmek için Uzun Süreli Elektrokardiyografi Kayıtlarının Analizi

Arrhythmias are common, affecting millions of patients worldwide. Current treatment strategies are associated with significant side effects and remain ...