We thank Lynette Henkel for her excellent support in performing the flow cytometric analysis. We thank Dr. Don Weldon and Dr. Victor Koong (Temecula, CA) for critical reading of the manuscript and helpful comments. This work was supported by grants from the German Research Foundation, KR-3770-7/1 and KR-3770-9/1 (M. K.), the Deutsche Stiftung f&#252;r Herzforschung, F/37/11 (M. K.), Dr. Rusche Research Grant 2014 from the Deutsche Stiftung f&#252;r Herzforschung and Deutsche Gesellschaft f&#252;r Thorax-, Herz- und Gef&#228;sschirurgie (M.-A. D.), and the Deutsches Zentrum f&#252;r Herz- und Kreislaufforschung S&#228;ule B Projekt, DZHK B 13-050A and DZHK B 14-013SE (M. K.).

Ortam, Reaktifler ve hücre kültürü koşullarının hazırlanması 1. <ol><li> İnsan HEK 293 embriyonik böbrek hücreleri <ol><li> DMEM / Ham F-12 ortamı içinde kültür HEK 293 hücreleri (CRL-1573, ATCC),% 5 FCS, L-glutamin (2 mM), penisilin (100 U / ml) / streptomisin (100 ug / ml) ile takviye edilmiştir. </li><li> Hücrelerin geçişi için, bir kez PBS ile yıkama hücreleri% 0.05 tripsin / EDTA ilave ve 37 ° C de 3 dakika karıştırıldı ve% 5 CO2 inkübe edin. 15 ml&#39;lik bir tüp içine hücreleri aktarın, 1200 rpm&#39;de (300 x g) ve 5 dakika boyunca santrifüj yeni bir T25 kültür şişelerinde içine yaklaşık 5x10 5 hücreleri transferi. </li></ol></li><li> Murin embriyonik fibroblastlar (MEF&#39;ler) <ol><li> Tek tek 6-çukurlu bir% 0.1 jelatin çözeltisi 1 ml ilave edilir ve 1 saat süre ile oda sıcaklığında (RT) enkübe edilir. Oda sıcaklığında sıvı aspire ve mağaza kullanıma kadar. </li><li> DMEM kültür MEF&#39;ler% 10 FCS, L-glutamin (2 mM), L-glukoz (4.5 g / l), sodyum piruvat (1 mM), penisilin (100 U ile takviye /jelatin kaplı 6-yuvalı plakalar üzerinde ml) / streptomisin (100 ug / ml). </li><li> 6-iyi tabak içine MEFS dağıtın ve onları izdiham kadar büyümesine izin verin. 2.5 saat hücreleri yakalama için mitomisin (5 ug / ml) eklenir. Orta aspire tam MEF orta ile iki kez hücreleri yıkayın ve her 6-kuyu için 3 ml MEF orta ekleyin. Bu hücreler sıçangil ve domuz iPS hücrelerinin için bir besleyici tabaka olarak görev yapar. </li></ol></li><li> Fare ES ve iPS hücrelerinin kültürü <ol><li> % 15 FCS, L-glutamin (2 mM), L-glukoz (4.5 g / l), MEM gerekli olmayan amino asitler (1X), β-merkaptoetanol (0.1 mM) içeren DMEM ortamı takviyesi, fare ES kültür ortamı hazırlamak ve lösemi önleyici faktörü (1,000 U / mL). </li><li> Serumsuz DMEM ile bir kez büyümesi durdurulmuş MEF&#39;ler 6-kuyu durulayın 2 ml fare ES orta ve murin iPS hücreleri (konfluent çanak hücrelerin% 20) ekleyin. Her gün yıkama hücreleri, bir sefer serumsuz DMEM ile 2 ml taze fare ES ortamı ilave edin. </li><li> Hücreler geçit için iyi serum serbest DMEM ile bir kez her yıkayın, 0 ekleyin0,25% tripsin / EDTA ile yıkandı ve 37 ° C de 3 dakika karıştırıldı ve% 5 CO2 inkübe edin. 1200 rpm&#39;de 5 dakika boyunca 15 ml tüp, santrifüje Aktarım hücreleri (300 x g) tekrar süspansiyon 500 ul fare ES ortam içinde hücreler ve bir yeni bir 6-2 ml fare ES ortamına süspansiyon 100 ul MEF besleyici katmanlı. </li></ol></li><li> Domuz Kültür hücreleri iPS <ol><li> Domuz iPS ortamı hazırlamak için, ek DMEM / Ham F-12 ortamı içinde% 20 nakavt serumu, L-glutamin (2 mM), MEM gerekli olmayan amino asitler (1X), β-merkaptoetanol (0.1 mM), penisilin (100 ile U / ml) / streptomisin (ug / ml 100 ug). 2 ila 3 hafta boyunca 4 ° C &#39;de, 0.22 uM filtre ve mağaza üzerinden filtre. İlk kullanımda, bFGF (10 ng / ml son konsantrasyon) ilave edin. </li><li> Serumsuz DMEM / Ham F-12 ve 1.5 ml ilave pik iPS orta ve domuz iPS hücrelerinin (konfluent çanak hücreleri 10%) ile bir kez büyümesi durdurulmuş MEF&#39;ler 6-kuyu durulayın. Serumsuz DMEM ile bir kez her gün yıkama hücre / Ham F-12 ve eklemek 1.5 ml taze domuz iPS ortamı. </li><li> Ayrışma tamponu% 2.5 tripsin, kollajenaz IV (10 mg / ml), Ca2 + içermeyen PBS nakavt serumu (20%) ve CaCl2 (1 mM) ekleyin hazırlamak. PBS ile iki kez yıkanır ve hücreler 37 ° C&#39;de 5 dakika karıştırıldı ve% 5 CO2 ayrışma tamponu ile inkübe edin. 1200 rpm&#39;de (300 x g) 5 dakika boyunca 15 ml tüp, santrifüje hücreleri aktarın. </li><li> 500 ul taze domuz iPS ortamında domuz iPS hücrelerini yeniden süspanse ve MEF besleyici tabaka ile taze 6 kuyuda 1.5 ml domuz iPS ortamına süspansiyon 50 ul ekleyin. Her gün yıkama hücreleri bir kez serum serbest DMEM / Ham F-12 ve ekleme 1.5 ml taze domuz iPS orta. </li></ol></li><li> İnsan iPS hücrelerinin besleyici içermeyen kültür <ol><li> 4 ° C &#39;de bazal membran preparatı ihtiva eden orjinal şişe çözülme ve sonraki kullanıma kadar -20 ° C&#39; de buz soğukluğunda serumsuz DMEM / Ham F-12-8 mg / ml, kısım ve mağaza seyreltin. </li><li> Bazın bir kısım Çözülmemembranda 4 ° C&#39;de hazırlanması ve buz soğukluğunda serumsuz DMEM / Ham F12 (90 ug / ml) ile seyreltilir. Pipet 1 3 cm&#39;lik kültür tabakları içine bu solüsyonu ve tüm yüzeyi kaplı olduğundan emin olmak için hafifçe karıştırılır. En fazla bir hafta boyunca 4 ° C&#39;de parafilm ve mağaza ile yemekleri Seal. Hücre kültürü için kullanımdan önce bazal membran preparasyonu polimerizasyonunu sağlamak için 37 ° C sıcaklıkta 30 dk ya da oda sıcaklığında 3 saat boyunca yemekler inkübe edin. </li><li> Tabaklardan aspire ortamı bazal membran ile kaplanmış ve serum içermeyen DMEM / Ham F-12 ile iki kez yıkanır. Kültür çanağı ve insan iPS hücrelerinin (konfluent çanak hücrelerin% 10) 1.5 mi E8 orta ekleyin. Her gün yıkama hücreleri, bir sefer serumsuz DMEM / Ham F-12 ve 1,5 ml ilave taze ortam ile E8. </li><li> Hücrelerin geçişi için, iki kez PBS ile yıkayın ve yemekleri 1 ml PBS / 0.5 mM EDTA ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca yemekler inkübe edin. Bir mikroskop altında hücrelerin izleyin. Not: koloniler ve appe kadar yuvarlak başladığınızdaar onlar transferi için hazır delikler var. </li><li> , Sıvı aspire hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme hücreleri 1.5 ml E8 orta ekleyin ve ayırmak. 15 ml&#39;lik bir tüpe transfer hücreleri, 1200 rpm&#39;de (300 x g) 5 dakika boyunca santrifüj 500 ul ortam içinde tekrar süspansiyon E8 ve bazal membran preparasyonu ile kaplanmış bir taze kültür tabağına 1.5 mi E8 ortamına süspansiyon 50 ul . </li></ol></li></ol> Türler Sınır Ötesi Hedef-dizilerin 2. Tasarım <ol><li> Seç referans insan, fare ve hedef genlerin (GAPDH, Nanog, GdF3) ve domuz cDNA dizileri ve CLUSTAL çok sekans hizalama analizi gerçekleştirmek. Not: Bu türler arasında homolog dizileri gösterecektir. <ol><li> Aşağıdaki çoklu uyum için ayarları kullanın: (sabit) boşluk cezası 10, boşluk cezası (değişen) 5, geçiş ağırlıklandırma 0, boşluk ayırma cezası aralığı 8, gecikme 40% özdeşlik, yineleme sayısı 3 gerçekleştirmek için. </li></ol></li><li> Prob tasarımı ve imalatı üreticiler (Malzeme Tabloya bakınız) istenen hedef dizileri gönderin. Not: Üretici, sonra teknoloji ile istenen dizinin uyumluluğunu teyit edecektir. İstenilen dizi uyumlu değilse, imalatçı alternatif dizileri önerecektir. <ol><li> Potansiyel yakalama büküm dizileri 27 bp&#39;lik bir uzunluğa sahip olarak kullanılabileceğini homolog bölgeleri sağlanması. Not: Sadece gerçek hücresel deneme bireysel dizisinin işlevselliği kesin bir kanıt verecek şekilde seçilmiş bir hedef genin farklı yakalama ipliklerini ile birkaç nanopartiküller sipariş tavsiye edilir. Üç farklı nanopartiküller Nanog ekspresyonunu değerlendirmek için test edildi iken Bu nedenle, GAPDH ve Gdf3 için iki farklı sekanslar değerlendirildi. Onların konumu ve tam dizileri yerde 17 yayınlanmıştır. Üretici ticari nanop üretmektediristenen dizileri ile eşyalar ve liyofilize biçimde sağlamaktadır. </li></ol></li></ol> 3. Nanopartiküller Sulandırma ve Hücre Kültürleri ile eklenmesi <ol><li> Karanlıkta 4 ° C&#39;da aldıktan sonra liyofilize nano partikülleri saklayın. </li><li> 100 nM&#39;lik bir son konsantrasyon verir 50 ul iki kez damıtılmış su eklenmesi ile nano-tanecikleri sulandırın. Bir kez karanlıkta oda sıcaklığında saklayın nanopartiküller yeniden. Not: Bu koşullar altında, en az bir yıl stabildir. 4 ° C&#39;de yeniden örneklerin depolama olumsuz yönde stabilitesini etkileyebilir. </li><li> Uygulama günde 2 (HEK 293 hücreleri) ya da 8 nM (iPS ES hücreleri) bir konsantrasyona PBS ile nanopartikül stok solüsyonu önceden seyreltin. Not: Bu konsantrasyon kültür kaplarına nihai konsantrasyon daha yüksek 20-kat fazladır. ES hücreleri ve iPS hücreleri, nanopartiküller 400 pM mikroskop altında kolayca algılanabilir bir flüoresan sinyal neden olmuştur. HEK 293 hücreleri için, AC100 pM bağlı yoğunlaşma yeterlidir. </li><li> Bir 24-yuvalı içeren 237,5 ul tam hücre kültür ortamına önceden seyreltilmiş nanopartiküller pipetleyin 12,5 ul. Farklı boyutlarda kuyuları, buna göre hacimleri ayarlayın. Nanopartiküllerin eşit dağılımını sağlamak için dikkatlice plaka girdap. Nemli bir atmosferde CO 2 37 ° C&#39;de gece boyunca (O / N) hücreler inkübe ve% 5. </li><li> Flöresanlı bir mikroskop altında - Bir sonraki gün 546 nm&#39;de (640 nm emisyon 575) bir eksitasyon dalga boyu ile gen spesifik Cy3 floresan için hücre kültürleri analiz eder. Not: hücre tipine ve hedef gen bağlıdır yeterince güçlü bir floresan elde etmek için gerekli süreyi. Bu deneylerde, bu sonda uygulamasından sonra 16 ve 20 saat arasında görülmüştür. </li></ol> Akış Sitometrisi ile 4. Kimlik Cy3 Olumlu Hücre popülasyonları <ol><li> HEK 293 veya bölüm 1.1 veya 1.3 belirtilen koşullar kullanılarak fare ES hücreleri, r büyütünespectively. Öncesinde, FACS analizi için bir günlük ES hücrelerinin murin 293 hücreleri (Şekil 6A) ve 400 uM&#39;de Hek için farklı konsantrasyonlarda GAPDH-spesifik nano partikülleri ekleyin. Nemli bir atmosferde CO2, 37 ° C&#39;de hücreler O / N inkübe ve% 5. </li><li> Flöresanlı bir mikroskop altında gen spesifik Cy3-kaynaklı floresan için hücre kültürleri analiz edin. </li><li> Nokta 1.1.2 altında belirtilen HEK 293 hücreleri ayırın. Santrifüj, 200 ul buz gibi soğuk PBS /% 0.5 BSA / 2 mM EDTA (FACS tamponu) içinde bir 1.5 ml tüp ve tekrar süspansiyon haline aktarın. Akım sitometri analizi kadar buz üzerinde koyu hücreleri tutun. </li><li> Nokta 1.3.3 altında belirtilen fare ES hücreleri ayırmak. Santrifüj, 200 ul buz gibi soğuk PBS /% 0.5 BSA / 2 mM EDTA, 1.5 ml tüp ve tekrar süspansiyon haline aktarın. Akım sitometri analizi kadar buz üzerinde koyu hücreleri tutun. </li><li> Propidyum iyodür hücresi toplanmasını önlemek ve eklemek için bir 30 uM filtre boyunca hücrelerin basın (2 ug / ml nihai konsantrasyon) 2 dakikaFACS analizi öncesinde ölü hücreleri hariç. </li><li> İlk FSC-A / SSC-A alt kümesi üzerinde hiyerarşik kapılarını set Cy3-pozitif hücrelerini analiz etmek, FSC-H / FSC-W-alt kümesi ve SSC-H / SSC-W alt kümesi. Hücre enkaz ve dağınık olmayan hücreleri hariç ileri ve yan dağılım kullanın. PE-Texas Kırmızı karşısında PE görüntüleyen kendi propidium iyodür boyama ile ölü hücreleri hariç. Cy3-PE pozitif hücreler üzerinde nihai sıralama kapısı gerçekleştirin (Şekil 4). </li></ol>

<ol>
	<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+adult+rhesus+monkey+fibroblasts.">Generation of induced pluripotent stem cells from adult rhesus monkey fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 3 (6), 587-590 (2008).</li><li>Liao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines+from+adult+rat+cells.">Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells.</a> Cell Stem Cell. 4 (1), 11-15 (2009).</li><li>Luo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+leukemia+inhibitory+factor+and+basic+fibroblast+growth+factor-dependent+induced+pluripotent+stem+cells+from+canine+adult+somatic+cells.">Generation of leukemia inhibitory factor and basic fibroblast growth factor-dependent induced pluripotent stem cells from canine adult somatic cells.</a> Stem Cells Dev. 20 (10), 1669-1678 (2011).</li><li>Bao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+ovine+adult+fibroblasts+to+pluripotency+via+drug-inducible+expression+of+defined+factors.">Reprogramming of ovine adult fibroblasts to pluripotency via drug-inducible expression of defined factors.</a> Cell Res. 21 (4), 600-608 (2011).</li><li>Esteban, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines+from+Tibetan+miniature+pig.">Generation of induced pluripotent stem cell lines from Tibetan miniature pig.</a> J. Biol. Chem. 284 (26), 17634-17640 (2009).</li><li>Nakagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+without+Myc+from+mouse+and+human+fibroblasts.">Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts.</a> Nat. Biotechnol. 6 (1), 101-106 (2008).</li><li>Maekawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+somatic+cells+is+promoted+by+maternal+transcription+factor+Glis1.">Direct reprogramming of somatic cells is promoted by maternal transcription factor Glis1.</a> Nature. 474 (7350), 225-229 (2011).</li><li>Marti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+pluripotent+stem+cells.">Characterization of pluripotent stem cells.</a> Nat. Protoc. 8 (2), 223-253 (2013).</li><li>Wada, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+gingival+fibroblasts+and+periodontal+ligament+fibroblasts.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human gingival fibroblasts and periodontal ligament fibroblasts.</a> J. Periodontal Res. 46 (4), 438-447 (2011).</li><li>Chan, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+distinguishes+bona+fide+human+iPS+cells+from+partially+reprogrammed+cells.">Live cell imaging distinguishes bona fide human iPS cells from partially reprogrammed cells.</a> Nat. Biotechnol. 27 (11), 1033-1037 (2009).</li><li>Singh, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+alkaline+phosphatase+substrate+for+identification+of+pluripotent+stem+cells.">Novel alkaline phosphatase substrate for identification of pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Rev. Rep. 8 (3), 1021-1029 (2012).</li><li>Kang, N. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cell+staining+and+sorting+with+the+live-cell+fluorescence+imaging+probe+CDy1.">Embryonic and induced pluripotent stem cell staining and sorting with the live-cell fluorescence imaging probe CDy1.</a> Nat. Protoc. 6 (7), 1044-1052 (2011).</li><li>Ban, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+cardiomyocytes+from+differentiating+pluripotent+stem+cells+using+molecular+beacons+targeting+cardiomyocyte-specific+mRNA.">Purification of cardiomyocytes from differentiating pluripotent stem cells using molecular beacons targeting cardiomyocyte-specific mRNA.</a> Circulation. 128 (17), 1897-1909 (2013).</li><li>Seferos, D. S., Giljohann, D. A., Hill, H. D., Prigodich, A. E., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-flares:+probes+for+transfection+and+mRNA+detection+in+living+cells.">Nano-flares: probes for transfection and mRNA detection in living cells.</a> J. Am. Chem. Soc. 129 (50), 15477-15479 (2007).</li><li>Lahm, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+fluorescent+RNA-based+detection+of+pluripotency+gene+expression+in+embryonic+and+induced+pluripotent+cells+of+different+species.">Live fluorescent RNA-based detection of pluripotency gene expression in embryonic and induced pluripotent cells of different species.</a> Stem Cells. 33 (2), 392-402 (2015).</li><li>Clark, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NANOG+and+GDF3+genes+are+expressed+in+pluripotent+cells+and+map+to+chromosome+12p13,+a+hotspot+for+teratocarcinoma.">NANOG and GDF3 genes are expressed in pluripotent cells and map to chromosome 12p13, a hotspot for teratocarcinoma.</a> Stem Cells. 22 (2), 169-179 (2004).</li><li>Wu, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+origin+of+a+bipotential+myocardial+and+smooth+muscle+cell+precursor+in+the+mammalian+heart.">Developmental origin of a bipotential myocardial and smooth muscle cell precursor in the mammalian heart.</a> Cell. 127 (6), 1137-1150 (2006).</li><li>Reubinoff, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+from+human+blastocysts:+somatic+differentiation+in+vitro.">Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro.</a> Nat. Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).</li><li>Yue, T., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+effect+in+receptor-mediated+endocytosis+of+multiple+nanoparticles.">Cooperative effect in receptor-mediated endocytosis of multiple nanoparticles.</a> ACS Nano. 6 (4), 3196-3205 (2012).</li><li>Andersson, L. I., Hellman, P., Eriksson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-mediated+endocytosis+of+particles+by+peripheral+dendritic+cells.">Receptor-mediated endocytosis of particles by peripheral dendritic cells.</a> Hum. Immunol. 60 (10), 625-633 (2008).</li><li>Weissleder, R., Nahrendorf, M., Pittet, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+macrophages+with+nanoparticles.">Imaging macrophages with nanoparticles.</a> Nat. Mater. 13 (2), 125-138 (2014).</li><li>Prigodich, A. E., Seferos, D. S., Massich, M. D., Giljohann, D. A., Lane, B. C., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-flares+for+mRNA+regulation+and+detection.">Nano-flares for mRNA regulation and detection.</a> ACS Nano. 3 (8), (2009).</li><li>Mehta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-trafficking+of+hERG+reverses+long+QT+syndrome+2+phenotype+in+human+iPS-derived+cardiomyocytes.">Re-trafficking of hERG reverses long QT syndrome 2 phenotype in human iPS-derived cardiomyocytes.</a> Cardiovasc. Res. 102 (3), 497-506 (2014).</li><li>Seftor, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoma+tumor+cell+heterogeneity:+a+molecular+approach+to+study+subpopulations+expressing+the+embryonic+morphogen+Nodal.">Melanoma tumor cell heterogeneity: a molecular approach to study subpopulations expressing the embryonic morphogen Nodal.</a> Sem. Oncol. 41 (2), 259-266 (2014).</li><li>Khare, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PYRIN+domain-only+protein+POP3+inhibits+ALR+inflammasomes+and+regulates+responses+to+infection+with+DNA+virus.">The PYRIN domain-only protein POP3 inhibits ALR inflammasomes and regulates responses to infection with DNA virus.</a> Nat. Immunol. 15 (4), 343-353 (2014).</li><li>Kratz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+expression+profiling+of+the+compartmentalized+translatome+of+Purkinje+neurons.">Digital expression profiling of the compartmentalized translatome of Purkinje neurons.</a> Genome Res. 24 (8), 1396-1410 (2014).</li></ol>

HL ücretsiz Merck Corporation nanopartiküller aldı. Diğer tüm yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu çalışma, doğrudan bir floresan mikroskobu altında çeşitli histogenetik kökenli farklı memeli türünden canlı hücrelerde hücre içi gen ekspresyonunun güvenilir bir şekilde değerlendirilmesine olanak sağlar floresans etiketli nanopartiküller kullanımını tarif eder. Bu yaklaşım, diğer yayınlanmış yöntemlere kıyasla avantajları bir çift vardır. Tüm araştırmacı ilk hedef gen ya da hücre tipi, ya ayn sınırlı değildir. Tüm antikor bazlı algılama yöntemleri, tek bir epitop ile sınırlıdır. Floresan moleküler işaretçileri de genlerin geniş spektrumunun için tasarlanmış olsa da, bu yöntem, hücrelerin ve daha sonra nucleofection 15 ayrılmasını gerektirir. Bunun aksine, gene özgü nanoparçacıkların uygulaması etkin endositoz ile nano-tanecikleri engulfs hedef hücrenin herhangi bir şekilde değiştirilmesine gerek yoktur. Daha sonra Pasajlanması sırasında altın parçacıkları yavaş yavaş hücreleri ayrılıp kültür downstrea kullanılabilirm deneyleri. Bununla birlikte, teknoloji de hala bazı sınırlamalar vardır. Bazı belirteçler sayesinde böyle SSEA-1 veya TRA-1-81 20 olarak karbonhidrat doğaya açıkça tespit edilebilir değildir. Şu anda, nanopartiküllerin büyük bir dizi ticari olarak temin edilebilir. Bu parçacıklar, hücresel deneylerde işlevleri açısından test edilmiş olan. Mevcut çalışmanın amacı türlerinin sınırların ötesine kullanılabilecek özel problar tasarım oldu. Yeni bir hedef gen biri için bir prob tasarlarken böyle bir yaklaşımı takip ya da ne zaman silico bir işlevselliği probu iyice in vitro değerlendirilmesi gereken tahmin farkında olmak zorundadır. Nanog-SF1 tek sıçangil eşleşmeyen tabanı ve domuz dizisi ile güzel bir floresan sinyal üretti ise dizi homoloji% 100 homoloji göstermiştir Nanog-SF3 sonda hiç işe yaramadı. Başka bir soru nanopartiküller verimli alımı anlamına gelir. Parçacıklar girmekendositoz nanopartiküller 21 büyüklüğüne etkilenir bir proses ile hücrelerin, hücre tipi ve farklılaşma durumu 22 ve hücresel kabiliyeti phago- gerçekleştirmek ve 23 makropinositoz etmek. Tatmin edici bir floresan sinyalini elde etmek üzere optimum konsantrasyonu, her bir uygulama ya da bir hücre hattı için test edilmesi gerekir. Bu amaçla, ilk deney, her zaman hedef spesifik gen ifade algılama geçmeden önce hücre tipleri ve kültür koşulları içindeki sondaların uyumluluğunu değerlendirmek için alım kontrolü uygulama olmalıdır. Yeni bir hücre kuşağına bu protokolü uygulanır veya hücre popülasyonunun uygun kontroller dahil olduğunda, kritik bir nokta güvenilir sonuçlar elde edilmiştir. Şimdiye kadar floresanlama alım kontrolü nanopartiküller konsantrasyonları, hedef hücre popülasyonunun yeterli bir floresan sinyali uyardığı bir ipucu sağlayacaktır. Floresan değerlendirilmesi gerekird sinyali olarak ertesi gün süre ile 17 kaybolacak. Aynı zamanda, aynı konsantrasyonda uygulanmıştır ökaryotik genomunda benzeri yok karıştırmak kontrol ihmal edilebilir bir arka plan sinyalini neden olmalıdır. Üçüncü bir kontrol olarak, bir bir ev bakıcısı geni için spesifik nanoparçacık (örneğin, GAPDH, β-aktin) kullanımı tavsiye edilmektedir. Bu yaklaşım, nanopartiküller seçilen bir hedef hücre popülasyonuna spesifik gen ekspresyonunu tespit etmek için kullanılabilecek bir pozitif kontrol olarak hizmet etmektedir. Bu kontroller açarsanız tatmin edici bir başka hedef genlerin özel nanopartiküller kullanılarak güvenilir özgü flüoresan sinyalleri elde etmek için bekleyebilirsiniz. Bu hedef sekans 24 aşağı regüle ettiği gösterilmiştir olarak tatbik nano-taneciklerinin konsantrasyonu kritik olabilir. Bununla birlikte bu etki burada (400 pM) sunulan deneylerde kullanılan konsantrasyonlarda çok daha yüksek konsantrasyonlarda (5 nM) gerektirir. Bu konsantrasyonda nanofla Atres hedef genin mRNA ya da protein seviyelerinin ve HEK293 ve sıçangil ES hücreleri 17 proliferasyonunu bozmaması 2 nM kadar yüksek konsantrasyonlarda etkilemez. Buna ek olarak, bir tüm genom ekspresyon analizi, gen ekspresyonu 25 herhangi bir önemli değişiklik göstermemiştir. Bu nedenle, 1 nM kadar olan konsantrasyonlarda nanoflares hiçbir önemli yan etkiler sergileyen olmamalıdır. Bu teknolojinin bir çok umut verici bir uygulama, belirli bir gen ile işaretlenmiş herhangi bir belirli hücre popülasyonu etiket olasılığıdır. Son zamanlarda, gen spesifik nanopartiküller başarılı seçici canlı ventriküler miyositleri 26, melanom hücrelerinin 27 subpopülasyonunun leke kullanılmıştır, 28 ve serebellar hücre kültürlerinin 29 monositler. Bu floresan işaretli hücre popülasyonları kriteri gibi canlı hücreler, akış sitometrisi ile saflaştırılabilir. Onkoloji alanında, hayvan modellerinde canlı metastatik tümör hücreleri izole etmek için akla gelebilecek olanCEA kendi ifadesi, genleri veya hedef yapıları teşvik potansiyel metastaz arama için en değerli dayalı. Son zamanlarda, gerçekten yeniden programlanması sıçangil iPS koloniler tespit floresan yoğunluğu 17 göre Nanog-spesifik nanopartiküller ile yerinde tespit edilebilir olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, gerçekten yeniden programlanması iPS kolonilerin tanımlanması en umut verici koloniler belirlemek için robot floresens toplama cihazları kullanmak yüksek kapasiteli platformlarda yapılabilir. Bu teknoloji spesifik hücresel alt popülasyonlar seçmek için birçok araştırma alanlarında uygun gibi görünmektedir ve yüksek kapasiteli platformlarda nanopartiküller uygulamak mümkün görünmektedir. Sonuç olarak, bu protokol, canlı hücreler, doğrudan hücre içi gen ifadesinin algılanmasını sağlar floresans etiketli nano-tanecikleri kullanılarak yeni bir yaklaşımı temsil etmektedir. Bu teknoloji, bir, arındırmak genişletmek için değerli bir araç ve daha fazla karakter olabilirBirçok araştırma alanlarında nadir hücresel subpopülasyonunun ize.

2006 yılında, yeni bir yaklaşım pluripotent haline somatik hücre yeniden programlamak için tarif edilmiştir. Potansiyel yeniden programlama bir dizinin prescreening sonra murin fibroblast başarılı bir şekilde uyarılmış pluripotent kök hücreler (IPS) Retroviral transdüksiyonun dört transkripsiyon faktörlerinin aşırı ifadesi ile sözde dönüştürülmüş olabilir faktörleri (Oct4, Sox2 Klf4 ve c-Myc) 1. Daha sonra, bu teknik, etkili bir şekilde, insanlarda 2, maymunlar 3, sıçan 4, köpeklerde 5, koyun ve domuz 6 7 de dahil olmak üzere, farklı memeli türlerinin somatik hücreler kullanılarak yeniden. Buna ek olarak, protokoller atlayarak ya MYC 8, 9 yayınlanmış c- potansiyel onkojenik transkripsiyon faktörünü yerine güncellenmiştir. Ne olursa olsun, ilk yeniden programlama büyüyen kolonilerin gerçek pluripotency, zahmetli ve zaman alıcı bir görev onaylanmalıdır yaklaşım. Önemli bir dezavantajıBu analizlerin büyük bir çoğunluğunun canlı hücreler üzerinde gerçekleştirilemez olmasıdır. Örneğin Oct4, Sox2 NANOG ya Rex1 olarak kurulan pluripotense faktörleri çekirdeğinde bulunan transkripsiyon faktörlerini temsil eder ve algılama RT-PCR analizi için 10 immünohistokimya veya hücre parçalama öncesinde hücrelerin tespit gerektirir -. 12 Bundan sonra, bu hücreler, gelecekte kaybolur Her koloninin çoğaltmak kültürleri gerektiren deneyler. Bu nedenle, canlı hücreler üzerinde pluripotensini analiz etmek için bir teknoloji arzu edilmektedir. Çeşitli yaklaşımlar gerçekten de membran bazlı antijenlere karşı antikorlar kullanılarak canlı hücreler üzerinde doğrudan ifa edilebilir (örn., TRA-1-60, SSEA4) 12, floresan özellikle embriyonik kök etiket alkalin fosfataz 13 ya da küçük moleküllerin tespit boyalar bildirilmiştir (ES) ve iPS hücreleri 14. Ancak, antikorlar yine olumsuz hücreleri ve her meth etkileyebilirod tek pluripotense işaretleyici ile sınırlıdır. Son olarak, floresan molekül işaretleri, hücrelerin canlı boyama sağlar hairpin yapılar, çift-antisens oligonükleotidler, 15 tarif edilmiştir. Bu yaklaşım, çok sayıda genin tatbik edilebilir olmasına rağmen, teknik, artan iPS koloniler için geçerli değildir, tek bir hücre süspansiyonu, nucleofection gerektirir. Bir kaç yıl önce gen spesifik nanoparçacıklarının SKBR3 meme kanseri hücreleri 16 survivin ekspresyonunu analiz etmek için tarif edilmiştir. Bu el yazması altın nanoparçacık konjugatlarında kullanımı yoluyla canlı ES ve iPS hücreleri pluripotency işaretçileri tespit için yeni bir yenilikçi bir yaklaşım anlatılmaktadır. Bu nanopartiküller tamamlayıcı RNA dizisi ve bir Cy3 etiketli muhabiri teli taşıyan bir birleştiğinde yakalama sarmalı ile merkezi altın parçacık oluşur. Raportör telinin flüoresan sinyal merkez altın parçacığı ile söndürülür. Buna ek olarak, uygun birnanopartiküller olarak negatif ve pozitif kontroller, sırasıyla (Şekil 1) hizmet vermektedir. (Şekil 3) bir uygulama için, nanopartiküller, sadece kültür ortamı (Şekil 2) ilave edilir ve endositoz vasıtasıyla hücrelere girmek. Hedef RNA ifade edilirse o zaman bir floresan sinyal yayan muhabiri strand değiştirir. Bu yöntem, hedef hücre, hedef genin ifade manipülasyon canlı hücreler direkt olarak bir floresan mikroskobu altında optik olarak izlenebilir gerektirmez. Bundan başka, teknik iPS hücrelerinin durumunda türler arasında arzu edilen herhangi bir hedef gene uygulanabilir ve böylece birçok farklı alanlarda, kullanılabilir. Son olarak, akım sitometri Cy3 pozitif hücrelerin belirlenmesi ve zenginleştirme izin analizleri.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM/Ham&#39;s F12 medium with stable glutamine</td>
			<td>Biochrome GmbH</td>
			<td>FG4815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>SV30160.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (100x)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>A2213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose with stable glutamine</td>
			<td>Biochrome GmbH</td>
			<td>FG0435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin C</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 107 409 001</td>
			<td>prevents cell division of MEFs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential amino acids (100x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leukemia inhibitory factor (107 U/ml)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ESG1107</td>
			<td>growth factor for murine ES and iPS cells, prevents differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin/EDTA (1x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>detaches adherent cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>supplement for human and porcine iPS cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>growth factor for human and porcine iPS cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004188</td>
			<td>dissociation of pig iPS cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>effective surface for feeder-free culture of human iPS cells, referred to as basement preparation membrane in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E8 medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05940</td>
			<td>defined medium for feeder-free culture of human iPS cells on Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5 M</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartFlare Probes</td>
			<td>EMD Millipore Corporation</td>
			<td>customized item</td>
			<td>detection of intracellular gene expression in live cells, referred to as nanoparticles in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 200M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeraCell 150i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatine (from porcine skin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6144</td>
			<td>enhances attachment of MEFs to surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide (1 mg/ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4864</td>
			<td>labels dead cells in flow cytometric analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS Aria Illu</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>A4544</td>
			<td>referred to as device 1 in Figure 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Navios</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>775213</td>
			<td>referred to as device 2 in Figure 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FloJo vX 10.0.7r2</td>
			<td>Treestar</td>
			<td></td>
			<td>software for analysis of flow cytometry data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of intracellular gene expression in live cells of murine, human and porcine origin using fluorescence-labeled nanoparticles

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.

Nano-tanecikleri kullanılarak canlı hücrelerde spesifik gen ekspresyonunun hücre içi algılama kontrol ve kurmak için bir birinci girişimde insan HEK 293 hücreleri bir yapıcı şekilde tanımlanmış bir ev tutma gen (GAPDH) kullanılarak pilot deneyler yapmaya karar verdik. Bu deneylerde kullanılan nano-taneciklerinin konsantrasyonu imalatçının tavsiyelerine göre seçildi. O / N inkübasyon (Şekil 5A) sonra, flöresanlı bir mikroskop altında görünür Bu hücrelerde net bir Cy3-floresan kaynaklı 100 uM nihai konsantrasyonda kültür ortamına bir GAPDH spesifik sonda eklenmesi. İki kontrol sonucu kanıtlamak için bu deneylere dahil edilmiştir. Bir kontrol raportör şerit, memeli ya da ökaryotik hücrelerde eşleşen bir sekansa sahip olmayan bir sözde &quot;karıştıran&quot; nanoparçacık içerir. &quot;Kapış&quot; nanoparçacık spesifik plan flüoresan belirlerolası prob bozulma veya floresan eksik soğutmadan dolayı ce. Karıştıran probu ilavesi ihmal edilebilir bir marjinal flüoresan sinyal (Şekil 5B) gösterdi. Bir sürekli fluoresan &quot;uptake&quot; kontrol farklı hücre tipleri arasında değişebilir endositoz ile nano-tanecikleri dahil hücre yeteneğini belirlemek için yardımcı olur. Bu pozitif kontrol parçacıklar HEK 293 hücreleri (Şekil 5C), parlak bir flüoresan sinyal üretti. Bu nedenle, ihmal edilebilir bir arka plan sinyali ile bir hücre içi genin özel bir flüoresan sinyal kaydetmek için teknolojinin fizibilitesi doğrulandı. Bu arka plan sinyali ve belirli bir floresan arasındaki fark, zaman içinde azalır belirtmek gerekir. Belirli floresan yavaş yavaş (Şekil 5D) soluyor ise bozulmasına ya da eksik söndürme soruşturma nedeniyle arka plan artar. Aynı GAPDH -spesifik nanopartiküller varfaregiller, domuz ve koyun kökenli 17 primer fibroblast kültürlerinde test edilmiştir. Hedefe özel flüoresan muhtemelen bu kültürlerin nispeten düşük çoğalma kapasitesi, oldukça zayıf ise, bu hücreler, HEK 293 hücreleri daha çok daha yüksek bir arka plan sinyalinin üretilmesi. Bu pilot deneyler, farklı türlerden elde edilen iPS olarak pluripotency gen ifadesinin tespiti için bu teknolojiyi kullanmak için bize istenir. Bu amaçla, Nanog ve Gdf3 pluripotent hücreler 18 ifade edilebilir olduğu bilinmektedir, her ikisi de incelenmiştir. Bir Nkx2.5 kalp güçlendirici transgenik fare hattı 19 kuyruk ucu fibroblastlardan alınan ilk iPS hücrelerinin de incelenmiştir. Güçlü bir flüoresan sinyal elde edildi her iki gen (Şekil 6A) ve karıştırmak kontrol ihmal edilebilir bir Cy3-floresans için (veriler gösterilmemiştir). Benzer sonuçlar, insan ve domuz iPS hücreleri (Şekil 6 elde edilmiştirB ve C). Önemlisi, floresan sinyali iPS kolonilerine sınırlı idi ve fare ve domuz iPS (Şekil 6A ve C okları bakınız) bir besleyici bir tabaka olarak kullanılan fibroblastlar etiket vermedi. Nanog gen ifadesinin analiz de silico tahmin değil, her dizi nihayet fonksiyonel &quot;iyi&quot; olarak ortaya koymuştur. Benzer bir sonuç insan ve domuz kaynaklı iPS hücrelerinin elde edildi sıçangil iPS hücrelerinin bir 100% sekans takımı (Şekil 6D). Rağmen, karıştırmak kontrolünkine benzer hemen hemen hiçbir fluoresan sinyali indüklenen Nanog-spesifik nanopartiküllerin üç tasarımlardan biri de Bu prob ile (veriler gösterilmemiştir). Bu durumda, nanotanecikler, her bir dizayn sondanın işlevsellik daha önce değerlendirilmesi gereken süre türler sınırlar arasında pluripotense gen ekspresyonunu tespit etmek için kullanılabilir. In situ umut verici sonuçlarHücre kültür tabaklarında canlı hücre markalama akış sitometrisi ile niceliksel olarak gen ekspresyonunu analiz etmek için istenir. Bu amaçla, GAPDH-spesifik nanopartiküller, hedef hücre popülasyonu içinde etiketleme etkinliğini karşılaştırmak amacıyla 293 tek tabakaları Hek için kademeli konsantrasyonlarda ilave edildi. Flüoresans mikroskopisi ile değerlendirilen zamanda gelişmiş bir Cy3-indüklemeli fluoresans nanopartikülleri almadı hücreleri ile karşılaştırıldığında en düşük konsantrasyon ile görüldü. Nanopartiküllerin artan konsantrasyonları in situ (Şekil 7A) &#39;de HEK 293 hücreleri, bir açık, konsantrasyona bağımlı floresans neden olmuştur. Bir akış sitometrik analizi bu hücrelerin tabi tutulması, konsantrasyona bağımlı etiketleme etkinliğini teyit etmiştir. Nanopartiküllerin en yüksek konsantrasyon (Şekil 7B) uygulandığında, Cy3 pozitif hücrelerin sayısı anlamlı (yedi kat daha daha fazla) artmıştır. Nkx2.5 kalp ile ilgili başka deneylerde ES hücrelerigüçlendirici transgenik fare hattı 19 akış sitometrisi ile pluripotense genlerin ekspresyonunu analiz etmek için kullanıldı. Pozitif alımı kontrol 400 pM ile pilot deneyleri mikroskop altında açıkça Cy3 pozitif canlı ES koloniler vermiştir ve sitometri Cy3 pozitif hücrelerin (Şekil 7C) neredeyse% 40 tespit akış. Buna karşılık, tedavi edilmemiş hücrelere benzer karıştırmak lekeli pozitifliği ile işlenmiş hücrelerin yaklaşık% 0.1 (veriler gösterilmemiştir). Benzer şekilde, GAPDH, Nanog ve Gdf3 özel nanopartiküllerin ilave işlemi, hücre kültür kaplarına ayrı ayrı koloniler belirgin bir floresan sinyalini bağlı. Akış sitometrisi ile belirlendiği gibi GAPDH Cy3 pozitif hücrelerin frekansı, her iki pluripotense geninin (Şekil 7C) oldukça benzer olmuştur. Nanog ve Gdf3, aynı zamanda, pluripotent ES hücrelerinde yapısal olarak ifade olduğu düşünülmektedir Bu sonuç, beklenebilir. Bu nedenle, bu veriler, indiBelirli bir geni ifade eden hücreler, akış sitometrik tarafından tespit edilebilir ka nitelik ve bunların nispi miktarı ile analiz eder. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53268/53268fig1.jpg" /> Şekil 1: Nanopartiküller Yapısı şematik gösterimi. Bir gen spesifik nanopartikül (A) yapısı. (B) Sinyal Değiştirme nanopartikül (negatif kontrol). (C) Alım nanopartikül (pozitif kontrol). Wiley izniyle, Lahm ve ark., 17 uyarlanmıştır. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53268/53268fig2.jpg" /> Şekil 2: Nanopartiküller Uygulama Kültürler Cell nanopartiküller Düzgün seyreltilmiş solüsyon sadece kültür ortamına pipetlenir.. O sonra / N kuluçka gene özel floresan hücreler af altında görülebilen<html> luorescent mikroskop. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53268/53268fig3.jpg" /> Şekil 3:. Endositoz yoluyla Hücrelerinin Nanopartiküller Aktif Alım (A) Hücreler aktif endositoz ile nanopartiküller yutmak (B) Hedef mRNA yakalama sarmalına bağlanır ve floresanlama muhabir değiştirir.. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53268/53268fig4.jpg" /> Şekil 4: Akım Sitometrisi için Yolluk Stratejisi. (A) Strateji fare ES hücreleri için HEK 293 hücrelerinden. (B) Strateji için. Veriler fare ES hücreleri için HEK 293 hücreleri veya aygıt 2 için cihaz 1 kullanılarak elde edildi ve daha sonra, bir yazılım aracı (Malzeme Tablo) ile analiz edilmiştir. /53268fig5.jpg &quot;/&gt; Şekil 5:., HEK 293 hücrelerinde GAPDH -Anlatım analizi bir GAPDH-spesifik nanopartikül 100 pM (son konsantrasyon) hücrelere ilave edildi ve floresan O / N kuluçkalamadan sonra kaydedilmiştir (A) GAPDH-spesifik nanopartikül (B.. ) Sinyal Değiştirme (negatif kontrol). (C) Alım (pozitif kontrol). (D) karıştırmak ve içeri alma kontrol kinetiği. Floresans GAPDH-spesifik nanopartiküllerin ilave edildikten sonra belirtilen zaman noktalarında belirlendi. Ölçek çubukları 50 uM temsil etmektedir. <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/53268/53268fig6.jpg" /> Şekil 6:. Farklı Türlerin 400 uM&#39;de hücrelere ilave edildi NANOG ya Gdf3 için Nanopartiküller Belirli iPS Hücrelerinde pluripotensin Gen İfade Analizi (nihai concentration) ve floresan O / N kuluçkalamadan sonra kaydedilmiştir. (A) murin iPS hücrelerini. (B) İnsan iPS hücrelerini. (C) domuz iPS hücreleri. (A) ve (C) &#39;de oklar etiketlenmemiş fibroblast besleyici katmanlı hücreler işaret etmektedir. Murin iPS hücrelerinin (D) Floresan Nanog-tasarım SF3 nanopartikül eklenmesinden sonra. Ölçek çubukları 50 uM temsil etmektedir. <img alt="Şekil 7," src="/files/ftp_upload/53268/53268fig7.jpg" /> Şekil 7: Nanopartikül Etiketli Canlı Hücreler Sitometrisi ile Belirlenen edilebilir. Akış sitometrisi ile tespit Cy3 pozitif hücrelerin (A) 293 hücreleri nanopartiküller farklı konsantrasyonlarda ilave edildikten sonra Cy3 pozitif HEK mikroskopik görünüşüdür. (B) Frekans. (C) fare ES hücre kolonilerinin canlı boyanması ve Cy3 pozitif frekansının belirlenmesi Hücreler. Nanopartiküller ilave edildi400 pM&#39;lik bir nihai yoğunlukta yürütüldüler. Ölçek çubukları 50 uM temsil etmektedir.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles at JoVE.com

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.

Floresan etiketli Nanopartiküller kullanma Fare, İnsan ve domuz Menşe Canlı hücreler hücre içi Gen İfade Algılama

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

detection-intracellular-gene-expression-live-cells-murine-human

Research

JoVE Journal

Biology

10.9K Görüntüleme.  Technische Universität München. This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species. 

Video: Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Bakteriyel Gen İfadesi Analizi Mikroarray&#39;ler Kullanımı

Biyoloji

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Hazırlık Elektroporasyon murin Kemik İliği itibaren İlköğretim Hematopoetik Hücre Kültürleri

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Yüksek Verimli Primer Hücre Transfect Gen Verici MXcell Elektroporasyon Sistemi

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Gen İfadesi Çalışmaları basitleştirin Otomatik Hücre Sayıcı kullanma: Namalwa Hücreler IL-4 Bağımlı Gen İfadesi siRNA demonte

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited from their latent state in the cytoplasm to cell surface receptors where they are activated by phosphorylation at a single tyrosine residue1. They then dimerize and translocate to the nucleus to drive the transcription of target genes, affecting growth, differentiation, homeostasis and the immune response. Not surprisingly, given their widespread involvement in normal cell processes, dysregulation of STAT function contributes to human disease, particularly to cancers2 and autoimmune diseases3. It is well established that transcription is regulated by alterations to the chromatin template4,5. These alterations include the activities of ATP-dependent complexes, as well as covalent histone modifications and DNA methylation6. Because STAT activation of gene expression is both rapid and transient, it requires specific mechanisms for modulating the chromatin template at STAT-dependent gene loci. To define these mechanisms, we characterize the histone modifications and the enzymatic activities that generate them at gene loci that respond to STAT signaling. This protocol describes chromatin immunoprecipitation, a method that is valuable for the study of STAT signaling to chromatin in activated gene expression.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

This protocol describes how chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used to study the dynamic alterations to the chromatin template that regulate transcription induced by a signal transduction pathway.

Kromatin Immunoprecipitation İnsan Hücrelerinde Aktif Gen İfadesi Testi Dinamik Histon Modifikasyon (ChIP)

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been understood at molecular level. One of the mechanisms mediating the effect of DNA variants on phenotypes is gene expression, which has been shown to be particularly relevant for complex traits1.
This method tests in a cellular context the effect of specific DNA sequences on gene expression. The principle is to measure the relative abundance of transcripts arising from the two alleles of a gene, analysing cells which carry one copy of the DNA sequences associated with disease (the risk variants)2,3. Therefore, the cells used for this method should meet two fundamental genotypic requirements: they have to be heterozygous both for DNA risk variants and for DNA markers, typically coding polymorphisms, which can distinguish transcripts based on their chromosomal origin (Figure 1). DNA risk variants and DNA markers do not need to have the same allele frequency but the phase (haplotypic) relationship of the genetic markers needs to be understood. It is also important to choose cell types which express the gene of interest. This protocol refers specifically to the procedure adopted to extract nucleic acids from fibroblasts but the method is equally applicable to other cells types including primary cells.
DNA and RNA are extracted from the selected cell lines and cDNA is generated. DNA and cDNA are analysed with a primer extension assay, designed to target the coding DNA markers4. The primer extension assay is carried out using the MassARRAY (Sequenom)5 platform according to the manufacturer's specifications. Primer extension products are then analysed by matrix-assisted laser desorption/ionization time of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS). Because the selected markers are heterozygous they will generate two peaks on the MS profiles. The area of each peak is proportional to the transcript abundance and can be measured with a function of the MassARRAY Typer software to generate an allelic ratio (allele 1: allele 2) calculation. The allelic ratio obtained for cDNA is normalized using that measured from genomic DNA, where the allelic ratio is expected to be 1:1 to correct for technical artifacts. Markers with a normalised allelic ratio significantly different to 1 indicate that the amount of transcript generated from the two chromosomes in the same cell is different, suggesting that the DNA variants associated with the phenotype have an effect on gene expression. Experimental controls should be used to confirm the results.

Genetic associations often remain unexplained at a functional level. This method aims to assess the effect of phenotype-associated genetic markers on gene expression by analyzing cells heterozygous for transcribed SNPs. The technology allows accurate measurement by MALDI-TOF mass spectrometry to quantify allele-specific primer extension products.

Genetik Dernekleri Fonksiyonel Dayanak Test bir Allel özel Gen İfadesi Testi

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Parafin ve Dondurulmuş Bölüm Drosophila Yetişkin Kaslar

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Active T. in vitro Sulandırma castaneum Telomeraz

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Ününüz Aşağıdaki Tek Hücre Düzeyinde Küresel RNA Sentezi Analizi

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

Kültür Memeli Hücrelerde Biyolojik tanımında ubikitin ve Ubiquitin benzeri Sistemi Regülatörleri tanımak siRNA Eleme

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...