Lecuyer laboratuarda yürütülen çalışmalar Ulusal Bilimler ve Kanada&#39;nın Mühendislik Konseyi (NSERC), Sağlık Araştırması (CIHR) ve Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) ve Kanada Enstitüsü fon tarafından desteklenmektedir. Carole Iampietro Angelo PIZZAGALLI doktora sonrası dostluk tarafından destekleniyor ise Fabio Alexis Lefebvre ve Gaël Moquin-Beaudry&#39;den, NSERC lisans araştırma studentships tarafından desteklenmektedir.

1. RNA Prob Hazırlanması Genel Bakış: Aşağıdaki bölümde FISH için uygundur digoxigenin (Dig) etiketli RNA problar yapmak için gereken adımları açıklar. İlk adım, bir klonlama ya da dizi spesifik prob oluşturmak için kullanılacak bir ilgi geninin transkripsiyonu bölgeye karşılık gelen bir dizi yükselterek PCR ile yapılır. Bu, çoklu klonlama sitesi sonra oluşturulmuş arttırıcı dizileri dahil komşu primerler kullanılarak PCR için bir şablon olarak hizmet edebilir bakteriyofaj promotör elemanları (T7, T3 ya da SP6) ile takviye edildiği bir plazmid içine ilk klonlama gen segmenti ile elde edilebilir böylece her bir uç (Şekil 1A) farklı promotor sekansları olan bir doğrusal PCR ürünü üreten. : Alternatif olarak, klonlama aşaması önlemek için, bir de genomik DNA ya da cDNA, T3, T7, ya da 5 &#39;uçlarında SP6 dizileri (örneğin, T7 içeren oligonükleotidler kullanılarak PCR amplifikasyon gerçekleştirebilir5&#39;-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3 &#39;; T3: 5&#39;-AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA-3&#39;; SP6: 5&#39;-ATTTAGGTGACACTATAGAAGAG-3 &#39;). Doğrusal PCR ürünleri daha sonra çalıştırmak mahsus uygun polimerazı (Şekil 1B) ile in vitro olarak transkripsiyonu ile DIG-labeled duyu veya antisense RNA probları sağlamak için şablon olarak kullanılır. Belirli genler için problar yaparken, biz FISH sinyal spesifitesi (yani faiz gen antisens yönde transkripsiyonu sürece değerlendirmek için yararlı olacak farklı polimerazlar kullanılarak duygusu ve antisens RNA problar hem hazırlanması tavsiye, sense RNA probu ortaya çıkaracaktır arka sinyal seviyesi). Aşağıdaki adımların tümünü, bir (örneğin su, ilk% 70 etanol veya ticari RNAse dekontaminasyon çözümleri ile tüm tezgah alanları ve ekipmanın temizlik ve RNAse-ücretsiz kaynakları kullanarak kirletici ribonükleazlar (RNaz) tarafından potansiyel düşüşü önlemek için büyük özen ipuçları, mikrosantrifüj tüpleri). Anneterials <ul><li> 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri, (Abgene, Rochester, NY, ABD Cat. No 0900) </li><li> Jel-ekstraksiyon kitleri (QIAGEN, Mississauga, ON, Kanada;. Cat No 28706). </li><li> RNAse ücretsiz su (Wisent, Inc Kat. No 809-115-CL) </li><li> RNA polimeraz (T3, T7, ya da SP6). (20 U / ul, Fermentas Biosciences. Cat. No EP0101, EP0111, EP0131). </li><li> RNAse-OUT Ribonükleaz inhibitörü (40 U / ml &#39;), (Invitrogen, Burlington. Canada.Cat. No 10777-019 ON). </li><li> Digoxigenin (DIG) nükleotid karışımları (DIG-11-UTP, Roche Uygulamalı Biosciences, Laval, QC, Kanada. Cat. No.11209256910). </li></ul> Ekipman <ul><li> Masa üstü mikro-santrifüj </li><li> Jel elektroforez cihazları </li></ul><ol><li> PCR genomik DNA, cDNA, veya bakteriyofaj T7 ve T3 ya da SP6 promoter dizileri ile çevrili bir doğrusal PCR ürünü üretmek için plazmid DNA ile gen spesifik sekans yükseltmek. PCR koşulları için üretici tavsiyelerine uyun. </li><li> Kalite ve si doğrulamaagaroz jel elektroforezi ile PCR ürünü ze. Tavsiyeler üretir ve 50 ul tampon içinde ürün elüt edilmesi için uygun bir standart Jel çıkarma kiti kullanılarak Tüketim ve temizleyen bir PCR ürünü. </li><li> 3M sodyum asetat (pH 5.2) ve buz gibi soğuk% 100 etanol 150 ul 5 ul ilave edilerek PCR ürünü çökeltmek ve -70 ° C&#39;da gece boyunca tüpleri. 4 ° C &#39;de 10 dakika boyunca 13.000 x g&#39;de santrifüje tüpler ve% 70 etanol ile pelet yıkayın. Yeniden Spin, etanol ve hava pelet kuru tüm izlerini kaldırmak. RNAse-serbest su 25-50 ul süspanse edin. </li><li> 10X T7 transkripsiyon tamponu 2 ul (Invitrogen), RNAse inhibitörü, 2 ul Dig-NTP karışımı 1 ul (20 U / ml &#39;) aşağıdaki gibi bir 20 mikrolitre reaksiyon içinde 200-500 ng saflaştırılmış PCR ürünü kullanılarak DIG-etiketli prob uyarlamak ve 2 ul T7 RNA polimeraz (20 U / ml &#39;den). RNAse-serbest su ile 20 ul son hacim getirin. 3-4 saat boyunca 37 ° C &#39;de transkripsiyon reaksiyon inkübe edin. </li><li> Transc ayarlayınRNAse-serbest su ile 50 ul ription karışımı ve benzeri gibi Aşama 4&#39;te tarif DIG-labeled RNA probu hızlandırabilir. RNAse-serbest su ve 100 ul içinde yıkanmış RNA pelet yeniden süspanse edin. -70 ° C&#39;de saklayın numuneleri yeniden süspanse </li><li> Bir Nanodrop spektrofotometre kullanılarak prob sayısal. Prob kalitesini doğrulamak için, etidyum bromür ile% 1-2 agaroz jel lekeli bir 1-2 ul örnek çalıştırın. </li></ol> 2. Drosophila embriyolar toplanması ve Fiksasyon Genel Bakış: Bu bölümde sahnelenen Drosophila embriyo toplama ve işleme için gereken adımları açıklar. Ihtiyaç duyulan embriyo sayısına bağlı olarak, farklı büyüklükte sinekler nüfus kafesler içinde muhafaza edilebilir. Koleksiyonları 100mm elma suyu toplama plakaları kullanılarak 900 cm 3 silindirik kafesler kullanılarak yapılır için aşağıdaki adımlar vardır. Uygun fiksasyon embriyo çevreleyen iki koruyucu katmanlarının çıkarılması gerekir: Dış koryon ve iç Vitelline zar 13. Bir kez hasat edilir, embriyolar birinci koryon çıkarmak için% 50 ağartıcı çözelti ile yıkanmış, daha sonra da heptan (vitellin zar permeabilizes) ve PBS% 3.7 formaldehit ihtiva eden ihtiva eden bir iki fazlı çözelti içinde karıştırılır. Vitellin zar sonra kırık ve heptan ile metanol ve bifazik bir karışım içine embriyo transfer ile ortadan kaldırılmaktadır. Uygun embriyo fiksasyon ve vitellin membran çıkarılması mansap FISH prosedürünün başarısı için kritik öneme sahiptir. Malzemeler <ul><li> Apple suyu on sent büyüklüğünde maya hamurlu agar plaklarına (% 40 elma suyu,% 4 sakkaroz,% 3.5 agar,% 0.3 metil paraben) (ekmek mayası tereyağı tutarlılık su ile karıştırılarak) </li><li> Toz paraformaldehid (Elektron Mikroskobu Bilimler, Hatfield, PA, USA;. Cat No 19208) </li><li> Heptan </li><li> Metanol </li><li> 3% Bleach çözümü </li><li> 20 ml cam sintilasyon şişeleri (Kanada, Thermo Fisher Scientific, Ottawa;. Cat No 03-337-15). </li></ul> Ekipman <ul><li> Nüfus kafesleri </li><li> Toplama sepetler (Nitex bir ağ ve bir delik kapak olarak kesilmiş olan bir kesik 50 ml polipropilen tüpün üst kısmını kullanarak yapılır). </li><li> Küçük boya fırçası </li><li> Masa üstü vorteks </li></ul><ol><li> 25 1 saat için taze elma suyu / maya plaka ile Pre-net, iyi beslenen nüfusun kafesleri ° C. </li><li> Erken evre embriyo hasat kafese yeni bir elma suyu / maya plaka ekleyin. 25 4 saat boyunca kafes inkübe ° C (toplama saatleri istenen aşamaları bağlı olarak ayarlanabilir unutmayın). </li><li> 3.7 g paraformaldehid tozu, 2N KOH 70 ul ve kimyasal başlık altında bir bardak sintilasyon flakon milliQ su 7.3 ml birleştirerek yeni bir% 37 formaldehit solüsyonu hazırlayın. Paraformaldehid tozu tamamen eriyene kadar yeni sintilasyon şişenin içine oda sıcaklığında ve filtre sonra serin, kaynatıp. </li><li> Bir bifazik fiksasyon çözeltisi hazırlayındaha sonra 7.5 ml heptan ekleyerek, bir sintilasyon şişesi içinde% 37 formaldehit 250 ml ile 1X PBS içinde 2.25 ml birleştirerek. </li><li> Kafesinden elma suyu plaka Harvest ve oda sıcaklığındaki musluk suyu biraz ekleyerek ve ince fırça ile plaka embriyolar fırçalayarak embriyolar toplamak. Bir sepet içine yeniden süspanse embriyo transferi ve ılık musluk suyu ile durulayın. </li><li> Çamaşır suyu çözeltisi içinde toplama sepetleri banyo tarafından 90 sn Dechorionate embriyolar, daha sonra ılık musluk suyu (çamaşır suyu kokusu gidene kadar) ile iyice yıkayınız. </li><li> Toplama sepeti sökün, hafifçe bir fırça kullanılarak embriyolar toplamak ve bifazik tesbit çözeltisi içine aktarabilirsiniz. Embriyolar PBS ve heptan katmanları arasındaki arayüzü de birikir. </li><li> Mühür sintilasyon şişeleri ve bir vorteks mikser sabitleyin. Düşük ayarda 20 dakika boyunca çalkalanır. </li><li> Çıkarın ve Pasteur pipeti kullanarak alt PBS ve üst heptan aşamalarının çoğu atın. Soluklupipet içine geri kalan PBS / heptan / embriyolar karışımı. Damla damla moda, embriyolar ortadan kaldırmak için özen, pipetle alt PBS faz atın. Bir 500 ul heptan iki fazlı çözelti (üst faz) ve 500 ul metanol (alt faz) ihtiva eden 1.5 ml bir tüp içine embriyolar yatır. </li><li> Vitellin membranlar çatlamak 30-45 sn için elle kuvvetlice tüpler sallayın. Bir kere kırık, embriyoların metanol içine batar. </li><li> Heptan / metanol ara yüzeyinde üst faz heptan ve çatlamamış embriyolar Sil ve metanol 500 ul ilave edin. 5 saniye sallayın. </li><li> Metanol ile 3 kere yıkayın ve -20 ° C (bu noktada embriyolar hafta / ay süreyle saklanabilir) de embriyolar saklayın. </li></ol> 3. Post-fiksasyon İşleme, Hibritleşme ve Post-hibridizasyon Yıkama Genel Bakış: BALIK Bu bölüm detayları embriyo permeabilization için işlem adımları önceden, öncesi melezleme,RNA problar ve post-hibridizasyon yıkar ile hibridizasyon. İlk permeabilization adımlar için embriyolar tek bir tüp (aşağıdaki adımları 1-9, yerleşmiş embriyo / numune 10-15 ul amaçlayan) bir havuz olarak işlenir, ancak bir 96-PCR plate bireysel kuyulara aliquoted edilir Ön hibridizasyon adım (Adım 10) ile devam etmeden önce. Bu deney ilk aşamalarında bile her embriyo tedavi edilmesine yardım eder. Bir BALIK deney kurarken, bireysel deneylerde arka sinyal seviyesini belirlemek için negatif kontroller dahil etmek önemlidir. Bunun için bölüm 1, tipik bir &#39;no-prob&#39; koşulu ile karşılaştırılabilir bir sinyal verecektir &#39;anlamda&#39; RNA probu ile melez bir örnek belirtildiği gibi, &#39;no-prob&#39; numune dahil tavsiye ve. Malzemeler: <ul><li> Metanol </li><li> Fosfat% 0.1 Tween-20 (PBT) ile tamponlu salin </li><li> Proteinaz-K, 1 mg / ml stok çözeltisi (Sigma Aldrich, Oakville, ON, Kanada. Katalog No P2308) </li><li> Glisin (20 mg / ml stok çözeltisi) </li><li> Hibritleşme çözeltisi:% 50 formamid, 5X SSC,% 0.1 Tween-20, yamultulmuş somon sperm DNA, 100 g / ml, 100 ug / ml heparin. </li><li> 0.2 ml 96-PCR plakaları, Abgene, Rochester, NY, ABD halfskirted Cat. 0900 yok) </li></ul> Ekipman <ul><li> 56 ile ayarlanabilir Hibridizasyon fırını, dijital ısıtma bloğu ya da su banyosu ° C, 80 ° C veya 100 ° C ya da bir PCR makinesi. </li><li> Çok kanallı pipet (yıkama adımları basitleştirmek için önerilir) </li><li> Karıştırıcı sallanan yanda </li></ul><ol><li> PBT iki kez daha sonra PBT, ve: metanol 1:1 lik bir karışım, daha sonra metanol içinde embriyolar durulayın. </li><li> PBT bir nutator sürekli sallama ile% 3.7 formalin (adım 11 &#39;de tarif edildiği gibi, taze hazırlanmış) ihtiva eden 1 ml içinde 20 dakika için embriyolar düzeltildi. </li><li> PBT 2 dakika sallanan ise 3 kez embriyo yıkayın. </li><li> 3 mg / PBT seyreltilir proteinaz K (PK) ml bir çözelti hazırlayın ve eklemekÖrnekler çözüm 500 ul. Sallayarak olmadan oda sıcaklığında 10 dakika için numune inkübe edin. Bir pipet ile jeti veya yavaşça tersine tüpler tarafından embriyoların her 2 dk karıştırın. </li><li> 1 saat boyunca buz üzerinde embriyo örnekleri aktarın. </li><li> Oda sıcaklığına örnekleri Taşı ve PK çözüm çıkarın. PBT + 2 mg / ml glisin 1 ml ile 2 dakika süreyle 2 kez yıkayın. </li><li> Sallanan ile PBT +% 3,7 formaldehit 1 ml numune 20 dk Fix. Embriyolar PBT 5 kez durulayın. </li><li> PBT ve Krm çözeltisi bir 1:1 karışımı 1 ml embriyolar durulayın. 100% Krm solüsyonu (bu aşamada embriyo -20 ° C&#39;de birkaç gün / hafta saklanabilir) ve 0.5-1 ml ile değiştirin. </li><li> 96-plaka (/ iyi, embriyoların zarar görmesini önlemek için geniş diyafram ipuçlarını kullanmaya özen yerleşen embriyoların ~ 10-15 ul için amaç) bireysel kuyulara tablet embriyolar. </li><li> 5 dakika buz üzerinde serin sonra 5 dakika için ve Krm çözelti 100 ul / numune kaynatılır. Bu çözelti (Ön Krm) örnek ön melezleme için kullanılmıştır. </li><li> Ön-Krm çözelti 100 ul / numune ilave edin ve 56 en az 2 saat süreyle inkübe ° C </li><li> Her numune için, Krm çözeltisinden 100 ul prob ~ 100 ng sulandırmak. 80 Isı 5 dakika (birkaç saat ısıtılmış problar için buz üzerinde muhafaza edilebilir) boyunca buz üzerinde daha sonra serin 3 dk için ° C. </li><li> Embriyolardan Öncesi Krm çözüm çıkarın ve RNA probu çözümü ile değiştirin. </li><li> 12-16 saat süre ile 56 ° C &#39;de melezleşir. </li><li> 56 de ön ısıtma aşağıdaki yıkama çözümler ° C: (A) 200 Krm çözeltisi ul / numune, (B) ve Krm 3:1 karışımından 100 ul / numune: PBT, bir (C) 100 ul / numune Krm 1:1 karışımı: PBT, (D) Krm 1:3 oranındaki karışımı 100 ul / numune: PBT, (E) PBT yaklaşık 400 ul / numune. </li><li> Yıkama solüsyonu A 100 ul örnekleri durulayın, daha sonra 15 dakika her biri için 56 de çözümler MS 100 ul / numune ile yıkama adımı ° C gerçekleştirin. Daha sonra, 56 ° C&#39;de E çözeltisi 100 ul / numune ile 5 dakika için numune 4 kez yıkayın </li><li> Oda sıcaklığında Cool örnekleri. </li></ol> Genel Bakış: Bu bölümde RNA prob sinyali aşağıdaki hibridizasyon dağılımını tespit etmek ve görselleştirmek için kullanılan antikorlar ve algılama reaktifler açıklar. Bu adımlar, Şekil 2, şematik olarak açıklanmaktadır. İşte biz güçlü sinyal amplifikasyon için kullandığınız standart saptama reaktifleri yalnızca mevcut, ancak protein-RNA çift için aynı anda farklı RNA&#39;lar co-algılamak için çift BALIK deneyler özellikle çeşitli alternatifler olarak kullanılabilirler ticari reaktifler, orada var boyama. Bu protokol ile elde edilen sonuçlar örnekleri Şekil 3 mRNA / lokalizasyon desen mozaik görüntülenir. Malzemeler <ul><li> HRP-konjüge fare monoklonal anti-DIG (Jackson Immunoresearch Laboratories Inc Cat. No 200-032-156) </li><li> Biotin-konjüge fare monoklonal anti-DIG (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc Kedi. No 200-062-156) </li><li> Streptavidin-HRP konjugat (Molecular Probes, Eugene OR, ABD, Kedi. No.S991) </li><li> Cy3-tyramide konjugatları (Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA, Cat. No SAT704A) </li><li> DABCO çözüm montaj: bir 50 ml tüp içinde, DABCO 1.25 gram seyreltik (1,4-diazabisiklo [2.2.2] oktan; Sigma D-2522) tam olarak kadar 1X PBS içinde 15 ml, sonra 35 ml gliserol ve karıştırılır homojen. PBS ile önceden karıştırmadan olarak, DABCO toz çok hızlı bir şekilde çözülür. -20 ° C&#39;de saklayın montaj çözümü </li><li> Cam slayt, lamelleri </li></ul> Ekipman <ul><li> Karıştırıcı sallanan yanda </li><li> Kanallı pipet </li><li> Flüoresans mikroskobu </li></ul><ol><li> PBT PBTB ihtiva eden çözelti, +% 1 yağsız kuru süt (genellikle 50-100 ml tüm tespit reaktif inkübasyon ve yıkama adımları için yeterli olan) hazırlayın. </li><li> Nutator sallanan ise PBTB 100 ul / numune içinde oda sıcaklığında 10 dakika için örnekler engelleme. </li> &lt;li&gt; sallanan ile 100 ul / numune monoklonal biyotin anti-DIG antikor çözüm (PBTB içine stoktan 1/400 seyreltilmiş) ile oda sıcaklığında 1.5-2 saat boyunca embriyo ve inkübe örnekleri engelleme çözüm çıkarın. </li><li> Her sallanan ile 100 ul PBTB / numune ile 5 dakika boyunca numuneler 6 kez yıkayın. </li><li> Sallanan ile streptavidin-HRP çözeltisi (PBTB, 10 ug / ml nihai konsantrasyonda stok ile 1/100 sulandırılmış) 75 ml / numune ile, oda sıcaklığında 1.5 saat inkübe edin. </li><li> Örnekleri yıkayın 5 dakika boyunca 6 kere her sallanan (DNA counterstaining için, PBTB içinde 1X çalışma konsantrasyonu DAPI sulandırmak ve ilk yıkama adımda bu çözümü kullanabilirsiniz) ile 100 ul PBTB / örnek. </li><li> PBT embriyolar durulayın, daha sonra PBS ile 5 dakika boyunca 2 kez yıkayın. </li><li> Cy3-tyramide çözeltisi (Tyramide amplifikasyon tampon içinde 1/50 seyreltilmiş), 50 ul / numune ile nutator oda sıcaklığında 2 saat için örnekler inkübe edin. Bu adımı itibaren, hafif korumalı priz örnekleri tutmak için emin olun. &lt;/ Li&gt; <li> 5 dk Her nutator 100 ul PBS / numune ile numuneler 6 kez yıkayın. </li><li> PBS çıkarın ve% 70 gliserol ve% 2.5 (DABCO) içeren montaj çözümü 100-125 ul / örnek ekleyin. Mağaza numuneler 4 ° C&#39;de Bu örnekler, birkaç yıl boyunca saklanabilir. </li><li> Geniş çaplı ucu ile hafifçe örnekleri pipetleme embriyoların tekrar süspansiyon ve bir cam slayt üzerine embriyoların 25 ul aktarın, sonra tırnak cilası ile slayt üzerine embriyolar ve mühür üzerine lamel yerleştirin. </li><li> Bir floresan mikroskop kullanılarak embriyo örnekleri analiz edin. </li></ol>

<ol>
	<li>Wilcox, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+principles+of+in+situ+hybridization.">Fundamental principles of in situ hybridization.</a> J. Histochem. Cytochem. 41, 1725-1733 (1993).</li><li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback.">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98, 81-85 (1989).</li><li>Lecuyer, E., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+gene+expression+universe.">Mapping the gene expression universe.</a> Curr Opin Genet Dev. 18, 506-512 (2008).</li><li>Tomancak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+patterns+of+gene+expression+during+Drosophila+embryogenesis.">Global analysis of patterns of gene expression during Drosophila embryogenesis.</a> Genome Biol. 8, 2007-208 (2007).</li><li>Thisse, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+expression+of+the+zebrafish+genome+by+large-scale+in+situ+hybridization+screening.">Spatial and temporal expression of the zebrafish genome by large-scale in situ hybridization screening.</a> Methods Cell Biol. 77, 505-519 (2004).</li><li>Quiring, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+expression+screening+by+automated+whole-mount+in+situ+hybridization.">Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization.</a> Mech. Dev. 121, 971-976 (2004).</li><li>Pollet, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atlas+of+differential+gene+expression+during+early+Xenopus+embryogenesis.">An atlas of differential gene expression during early Xenopus embryogenesis.</a> Mech. Dev. 122, 365-439 (2005).</li><li>Lein, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+atlas+of+gene+expression+in+the+adult+mouse+brain.">Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain.</a> Nature. 445, 168-176 (2007).</li><li>Lecuyer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+mRNA+localization+reveals+a+prominent+role+in+organizing+cellular+architecture+and+function.">Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function.</a> Cell. 131, 174-187 (2007).</li><li>Imai, K. S., Levine, M., Satoh, N., Satou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+blueprint+for+a+chordate+embryo.">Regulatory blueprint for a chordate embryo.</a> Science. 312, 1183-1187 (2006).</li><li>Bell, G. W., Yatskievych, T. A., Antin, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GEISHA,+a+whole-mount+in+situ+hybridization+gene+expression+screen+in+chicken+embryos.">GEISHA, a whole-mount in situ hybridization gene expression screen in chicken embryos.</a> Dev. Dyn. 229, 677-687 (2004).</li><li>Wilkie, G. S., Shermoen, A. W., O'Farrell, P. H., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcribed+genes+are+localized+according+to+chromosomal+position+within+polarized+Drosophila+embryonic+nuclei.">Transcribed genes are localized according to chromosomal position within polarized Drosophila embryonic nuclei.</a> Curr. Biol. 9, 1263-1266 (1999).</li><li>Rothwell, W. F., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+embryo+dechorionation.">Drosophila embryo dechorionation.</a> CSH Protoc. , (2007).</li><li>Stapleton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+gene+collection:+identification+of+putative+full-length+cDNAs+for+70%+of+D.+melanogaster+genes.">The Drosophila gene collection: identification of putative full-length cDNAs for 70% of D. melanogaster genes.</a> Genome Res. 12, 1294-1300 (2002).</li><li>Rubin, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+complementary+DNA+resource.">A Drosophila complementary DNA resource.</a> Science. 287, 2222-2224 (2000).</li><li>Tomancak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+determination+of+patterns+of+gene+expression+during+Drosophila+embryogenesis.">Systematic determination of patterns of gene expression during Drosophila embryogenesis.</a> Genome Biol. 3, (2002).</li><li>Terashima, J., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+available+food+into+the+number+of+eggs+laid+by+Drosophila+melanogaster.">Translating available food into the number of eggs laid by Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 167, 1711-1719 (2004).</li><li>Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+in+situ+hybridization+protocols+in+Drosophila+embryos+and+tissues.">Fluorescent in situ hybridization protocols in Drosophila embryos and tissues.</a> Methods Mol. Biol. 420, 289-302 (2008).</li><li>Lecuyer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+fluorescent+in+situ+hybridization+in+Drosophila.">High resolution fluorescent in situ hybridization in Drosophila.</a> Methods Mol. Biol. 714, 31-47 (2011).</li><li>Kosman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos.">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305, 846 (2004).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Prob sentez adımlar için, biz genellikle Drosophila Gen Koleksiyonu (DGC), aşağıdaki web sitesinden ayrıntılı bir kaynak bulunan plazmidler amplifiye tam uzunlukta Drosophila DNA&#39;larının in vitro transkripsiyon tarafından işletilen-off antisens RNA problar oluşturmak: <a href="http://www.fruitfly.org/DGC/index.html" target="_blank">http://www .fruitfly.org / DGC / index.html</a> 14,15. Bu yaklaşım sinek embriyolar 9,16 haritalama gen ekspresyonu ve mRNA...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> T7, T3 veya SP6 RNA Polimeraz </td><td> Fermentas Yaşam Bilimleri </td><td> EP0101, EP0111, EP0131 </td><td> Kitler reaksiyon tamponu içerir. </td></tr><tr><td> DIG RNA Etiketleme Mix </td><td> Roche Uygulamalı Bilimler </td><td> 11 277 073 910 </td><td></td></tr><tr><td> RNAguard </td><td> Amersham Biosciences </td><td> 27-0816-01 </td><td></td></tr><tr><td> 3M sodyum asetat </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Soğuk% 100 etanol. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Soğuk% 70 etanol. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Klor ağartıcı çözelti su ile 1:1 seyreltilmiştir. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Heptan </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Metanol </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> proteinaz K </td><td> Sigma Aldrich Oakville, ON, Kanada </td><td> Katalog No P2308 </td><td></td></tr><tr><td> % 40 formaldehit solüsyonu, taze hazırlanmış </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PBS-Tween solüsyonu (PBT) </td><td></td><td> 1xPBS,% 0.1 Tween-20 </td><td></td></tr><tr><td> Glisin çözümü </td><td></td><td> PBT içinde 2 mg / ml glisin </td><td></td></tr><tr><td> Monoklonal HRP-konjüge fare anti-DIG </td><td> Jackson Immunoresearch Laboratories Inc </td><td> 200-032 - 156 </td><td> (PBTB içinde bir 1 mg / ml stok çözeltisi 1/400 seyreltme </td></tr><tr><td> HRP-eşlenikli koyun anti-DIG monoklonal </td><td> Roche Uygulamalı Science, Laval, QC </td><td> 1 207 733 </td><td> PBTB stok solüsyonu 1/500 dilüsyon </td></tr><tr><td> Biotin-konjüge fare monoklonal anti-DIG </td><td> Jackson Immunoresearch Laboratories Inc, West Grove, PA, USA </td><td> 200-062-156 </td><td> (PBTB içinde bir 1 mg / ml stok çözeltisi 1/400 seyreltme </td></tr><tr><td> Streptavidin-HRP konjugat </td><td> Moleküler Probları, Eugene OR, ABD </td><td> S991 </td><td> (Bir 1 ug / ml stok, 1/100 seyreltme </td></tr></tbody></table>

whole mount rna fluorescent in situ hybridization of drosophila embryos

Bir gen, hem de kendi RNA transkripsiyonu hücre içi lokalizasyonu özellikleri, salgılama modelini değerlendirilmesi gelişme sırasında biyolojik işlevlerini anlamada için önemli özellikleri vardır. In situ hibridizasyon RNA (RNA-ISH) RNA dağılımı özelliklerine görselleştirmek için kullanılan güçlü bir yöntemdir, organizmalar, hücresel ya da hücre içi düzeylerinin 1 olması. RNA-ISH bir mRNA veya ilgi içinde bir 2 kodlayıcı olmayan RNA hedef sekansına tamamlayıcı bir etiketli nükleik asit sondası (örneğin, antisens RNA, oligonükleotidler) ve hibridizasyon dayanmaktadır. Işlem dizi spesifik prob oluşturmak için tek başına birincil sıralama bilgisinin gerektirdiği gibi, evrensel organizmalar ve doku örnekler, 3, geniş bir alanda uygulanabilir. Gerçekten de, büyük ölçekli ISH çalışmalar bir dizi gen ekspresyon belgelemek ve çeşitli model organizmaların yerelleştirme dinamikleri RNA uygulanan edilmiştir hangi yol açtıönemli topluluk kaynaklarını 4-11 kurulması. Prob etiketleme ve algılama çeşitli stratejiler yılda geliştirilmiş olmasına rağmen, floresan-etiketli algılama reaktifler ve enzimatik sinyal amplifikasyon adımlar kombine kullanımı prosedürü 12 hassasiyet ve çözünürlük önemli iyileştirmeler sunuyor. Burada sahnelenen Drosophila embriyolar RNA ekspresyonu ve lokalizasyonu dinamikleri görselleştirmek için tyramide sinyal amplifikasyon (TSA) kullanılarak in situ hibridizasyon metodu (FISH), optimize edilmiş floresan tarif. Işlem çok sayıda numune eş zamanlı olarak işlem kolaylaştırır 96-kuyulu plaka PCR formatında gerçekleştirilir.

Başarıyla yapıldığında, bu işlem erken Drosophila embriyogenez sırasında gen ekspresyonu ve mRNA lokalizasyonu dinamiklerinin uzay-zamansal analiz içerisinde detaylı bir çarpıcı gelişmiş seviyede sunuyor. Klasik çift-kural gen bücür (run) için Şekil 3A&#39;da gösterildiği gibi, aslında tek çekirdekler ifade gruplarında henüz olgunlaşmamış transkript odaklarının tespiti yoluyla gen ekspresyonu olayları gözlemlemek için bu protokolü kullanabilirsiniz. ...

Watch this Scientific Journal Video about Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos at JoVE.com

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Burada bir bütün montaj floresan tarif<em&gt; In situ</emMeyve sinekleri embriyogenez sırasında ifade RNA&#39;ların ekspresyonu ve lokalizasyonu özelliklerini belirlemek için&gt; hibridizasyon (FISH) protokolü,<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;.

Tüm Dağı RNA Floresan<em&gt; In situ</emVe&gt; Hibridizasyon<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

whole-mount-rna-fluorescent-situ-hybridization-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

18.2K Görüntüleme.  Institut de Recherches Cliniques de Montréal (IRCM). Burada bir bütün montaj floresan tarif In situ

Video: Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Erken Civciv Embriyolar in situ Hibridizasyon Çift Tüm Dağı

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Biyoloji

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebra balığı Tüm Dağı Yüksek Çözünürlüklü Çift Floresan Yerinde Hibridizasyon

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of specific mRNA transcripts within whole mount specimen. This technique (adapted from Albertson and Yelick, 2005) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom at Syracuse University. The first two thirds of the Comparative Vertebrate Biology lab course gave students the opportunity to study the embryology and gross anatomy of several organisms representing various chordate taxa primarily via traditional dissections and the use of models. The final portion of the course involved an innovative approach to teaching anatomy through observation of vertebrate development employing molecular techniques in which WISH was performed on zebrafish embryos. A heterozygous fibroblast growth factor 8 a (fgf8a) mutant line, ace, was used. Due to Mendelian inheritance, ace intercrosses produced wild type, heterozygous, and homozygous ace/fgf8a mutants in a 1:2:1 ratio. RNA probes with known expression patterns in the midline and in developing anatomical structures such as the heart, somites, tailbud, myotome, and brain were used. WISH was performed using zebrafish at the 13 somite and prim-6 stages, with students performing the staining reaction in class. The study of zebrafish embryos at different stages of development gave students the ability to observe how these anatomical structures changed over ontogeny. In addition, some ace/fgf8a mutants displayed improper heart looping, and defects in somite and brain development. The students in this lab observed the normal development of various organ systems using both external anatomy as well as gene expression patterns. They also identified and described embryos displaying improper anatomical development and gene expression (i.e., putative mutants).
For instructors at institutions that do not already own the necessary equipment or where funds for lab and curricular innovation are limited, the financial cost of the reagents and apparatus may be a factor to consider, as will the time and effort required on the part of the instructor regardless of the setting. Nevertheless, we contend that the use of WISH in this type of classroom laboratory setting can provide an important link between developmental genetics and anatomy. As technology advances and the ability to study organismal development at the molecular level becomes easier, cheaper, and increasingly popular, many evolutionary biologists, ecologists, and physiologists are turning to research strategies in the field of molecular biology. Using WISH in a Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom is one example of how molecules and anatomy can converge within a single course. This gives upper level college students the opportunity to practice modern biological research techniques, leading to a more diversified education and the promotion of future interdisciplinary scientific research.

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology course in addition to vertebrate dissections. This gave students the opportunity to study gene expression patterns as well as gross anatomy, linking the study of molecular and organismal biology within one course.

Tüm Dağı In situ Moleküler Biyoloji ve organizma Biyoloji Link Hibridizasyon

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

Tüm Dağı<em&gt; In situ</emE11.5 fare embriyolarına E8.5 ve&gt; Hibridizasyon

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

Floresans tarafından viral RNA tespit edilmesi<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

RNA Floresan tarafından Tek hücreli Gen Transkripsiyon Analizi<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

Floresan ile birlikte Kromozom çoğaltılıyor Zamanlama<em&gt; Yerinde</em&gt; Hibridizasyon

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

RNA<em&gt; Yerinde</emTüm Dağı Embriyolar ve Hücre histolojisi&gt; Hibridizasyon Deniz Elasmobranchs İçin Uyarlanmış

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

Yüksek Çözünürlüklü Tüm Dağı<em&gt; Yerinde</emGen İfade ve Fonksiyon Eğitim için Zebra balığı Embriyolar içinde&gt; Hibridizasyon

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

Aktif Kaspaz 3 Algılama Tüm montaj immünofloresans tarafından Zebra balığı Embriyolar Apaptozun Analizi

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...