Yazarlar yararlı yorumlar ve elyazmasının eleştirel okuma için Dr Deirdre Nelson teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Albany Üniversitesi, SUNY NIH hibe DE019244, DE019197 ve DE021841 ML, F32DE02098001 SJS, ve C06 RR015464 tarafından finanse edildi.

Protokol olarak Şekil 1 &#39;de gösterilen dört ana adımı içerir. Tüm adımlar tam detaylı olarak açıklanmıştır. Adenovirüs yapı viral ve arıtma parçalanmış epitel esasların genetik iletiminde kullanım için organ toplama önce yapılmalıdır. Adenovirüsler ile çalışırken tüm standart BSL-2 güvenlik önlemlerine uyulmalıdır. 1. Fare Embriyonik Submandibular tükrük bezi (SMG) Hasat ve Mikrodisseksiyon <ol><li> Embriyonik gün 13 de fare embriyo servikal dislokasyon ve hasat dizeleri (E13, 3-5 epitel tomurcukları) kurumsal IACUC tarafından onaylanan aşağıdaki prosedürleri takip CO 2 narkoz kullanarak zamanlanmış gebe dişi farelerde (outbred zorlanma CD-1 veya ICR), Euthanize komitesi. Vajinal fişi keşif günü E0 olarak belirlenmiştir. Yarıkların sadece başlangıç ​​ile tek bir primer tomurcuk ve sap olduğunda Tükürük bezleri de E12 aşamada hasat ve kültüre edilebilirbaşlatmak için. Önce bu aşamaya SMGs burada belirtilenlerden daha farklı bir kültür koşulları gerektirir. </li><li> Fenol kırmızısı (Life Technologies) ve 100 U / ml penisilin ile desteklenmiş ve 100 mg / ml streptomisin (pen-strep eksik DMEM / Ham &#39;s F12 Orta (F12) 25 ml ile dolu steril 10 cm doku kültür kaplarına embriyo dizeleri aktarın, Life Technologies). </li><li> Steril bir neşter (# 11 bıçak) ve forseps (# 5, Güzel Bilim Araçları 11252-20) kullanarak DMEM/F12 + kalem-strep 25 ml içeren ayrı 10 cm çanak içine Keselerden embriyolar çıkarın. </li><li> Sadece alt çene altında bir açılı kesim ile embriyo kafaları Sever. </li><li> Üst çene altındaki bir kesim kullanarak iletilen ışık tabanı (Nikon SMZ645 veya eşdeğeri) ile bir stereo mikroskop altında başları alt çene kemiklerini ayırın. Cam bir ilave parça üzerinde yerine doğrudan doğruya mikroskop baz cam bileşeni dokular yerleştirin. </li><li> DM, 3 ml içine alt altçeneleri toplayınEM/F12 + steril bir 35 mm doku kültürü çanak kalem strep. </li><li> Dil dilimin altında ama 0:00 pozisyonunda doğru bakacak şekilde diseksiyon mikroskop sahnede bir mandibula dilim yerleştirin. </li><li> Bir makaslama hareketi iki çarpı forseps bir tarafı kullanarak, kaldırmak ve mandibula dilim 1/3 alt rd atın. </li><li> Forseps ile makaslama kesme kullanarak dilim 90 sağa ° (sağ elini ise) ve çevirin, yarım dilim içine mandibula dilimin üst kısmı (dil kesmeden) kesti. </li><li> Peel aşırı uzak doku ve altında SMGs açığa çıkarın. Dil tabanının yakınında, her iki yandaki olacaktır. </li><li> Diliyle dokusu aşağı tutmak için forseps bir çift kullanarak, dilinden SMG uzak kızdırmak için diğer forseps kullanabilir. Diğer bezi için tekrarlayın. </li><li> Yeni bir steril 35 mm doku içine DMEM/F12 + kalem-strep 3 ml içine microdissected tükürük bezleri toplayınkültür çanak. Not: Bağlı küçük dilaltı bezi (1 tomurcuk) ile birlikte büyük submandibular bezler (3-5 epitel tomurcukları) 4. adıma atlama ve adımları 4.1, 4.3 performans ve 4.4 bozulmamış kültüre edilebilir, daha önce 2,8 nitelendirdi. </li></ol> 2. Epitel yitiren organ Ayırma SMG <ol><li> Sıra 5 (veya daha fazla) Hank&#39;in dengeli tuz çözeltisi 200 ul (HBSS Ca eksik içeren bir cam tabanlı, 50 mm çaplı mikro çanağı (Mattek Corporation, P50G-1.5-14-F) içine tükürük bezleri + + ve Mg + +, Life Technologies) ihtiva eden% 0.4 (v / v) dispase (Life Technologies, Cat. no. 17105-041) ve 37 &#39;de 15 dakika inkübe ° C. </li><li> Inkübasyondan sonra, steril bir 200 ul pipet kullanarak, dikkatli bezleri bozmadan dispase çözüm aspire. Hemen BSA (DMEM/F12-BSA, bir 0.22 um filtre ile önceden sterilize) dispase nötralize etmek için% 5 (w / v) içeren DMEM/F12 ortamı 200 ul ilave edin. </li> &lt;li&gt; bir diseksiyon mikroskobu altında, ince ipuçları (# 5 Dumostar, Güzel Bilim Araçları 11295-20) ile forseps bir çift kullanarak, yavaşça epitel dokunmadığınızdan özen SMG epitel tomurcukları ve kanalların etrafında gevşetti mezenşimi ayırmak . </li><li> Pre-ıslak steril bir 200 ul pipet DMEM/F12-BSA medya ile ucu hafifçe DMEM/F12 200 ul + kalem-strep içeren yeni bir 50 mm çaplı mikro yemeğin içine epitel esasları üzerinden Pipeti. Pürüzsüz bir kenar ile yüksek kalitede 200 ul pipet kullanın. </li><li> Mezenşimi parçaları içeren çanak olarak, sublingual bezler ve herhangi bir müstakil submandibular bez tomurcukları da dahil olmak üzere herhangi bir non-mezenkimal doku atın. </li></ol> 3. Epitel Esaslar adenoviral enfeksiyonu <ol><li> Elde edilen solüsyon bir titre 1x10 8 -10 9 PFUs böylece bir mikrosantrifüj tüpü içinde DMEM/F12 + kalem-Strep ilgi adenovirüs seyreltilmesi ile viral enfeksiyon medya 200 ul edin.başka virüsler için gereken optimum titresi değişebilir. Bu, sezyum klorür (CsCl)-saflaştırılmış optimum etkinlik alımı için viral preparatları kullanmak için önemlidir. </li><li> Beş epitel esasları içeren çanak ortamı çıkarın. Hızla her zaman esasları ıslak tutulması, enfeksiyon medyanın 200 ul ekleyin. Virüs taşıma ve kontamine pipet ipuçları atılmasının gerekli önlemleri alın. % 10 çamaşır suyu çözeltisi ile herhangi bir virüs bulaşmış yüzeyler dezenfekte edin. </li><li> Birbirine yapışmasını önlemek ve onları plakanın alt yerleşmek için izin vermek için forseps ile uzak birbirinden epitelyal esasları taşıyın. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca ortam içinde viral esaslar inkübe edin. Onlar birbirine yakın taşırsanız inkübasyon sırasında, esasları ayırın. Aşırı sallanan veya hareket bezlerinin bir araya gelme sağlayacaktır. </li><li> Inkübasyondan sonra, yavaşça viral içeren ortamı çıkarın ve uygun atın, r bozmaya özenudiments. DMEM/F12 + kalem strep 200 ul ekleyin. Bu yıkama en az iki kez daha tekrarlayın ve DMEM/F12 + kalem strep medyanın 200 ul ile değiştirin. Bunlar yıkar güçlü epitel bağlı olmayan herhangi bir virüs kaldırmak için ve mezenşimi enfeksiyonu önlemek için kritik öneme sahiptir. </li><li> DMEM/F12, 200 ml% 2 içeren epitelyal esaslar inkübe (v / v), 20 dakika boyunca Matrigel (BD Biosciences, 356.231). Biz, Matrigel içinde bu kısa inkübasyon ilk kültür periyodu boyunca mevcut yarıkların regresyon en aza indirir bulmak, ancak bu adım Matrigel maruz arzu edilmediği takdirde ile vazgeçilebilir. </li></ol> Rekombine SMGs 4. Ex vivo Kültür <ol><li> Bir dişli (küçük bir kesim) üstüne, bir ön-ıslak 200 ul pipet kullanarak her yitiren organ, bir defada tek bir koyun 13 mm, 0,1 mikron kültür ortamı 200 ul (üzerinde yüzen Nuclepore İz-Etch membran filtreden (Whatman) cam zeminli bir mikro plaka 5 esasları / filtre). Kültür besiyerişudur: DMEM/F12 + kalem-strep 50 ug / ml transferin ve 150 ug / ml askorbik asit, daha önce tarif 2.8 içeren. Transferrin sağkalım uyardığı bilinmektedir ve tükürük bezi ve diğer organ eksplantları 9 morfolojilerinden dal. Askorbik asit ilavesi SMG dallanma uyardığı gösterilmiştir. 10 bu metabolik yolların (örneğin kollajen lif oluşumu sırasında 11 prolin hidroksilasyon gibi) birçok hidroksilasyon reaksiyonlarında bir kofaktör olarak hareket etmek ve aynı zamanda bilinen diğer organ eksplantlar olarak fibronektin ve laminin üretimini uyarır 12. </li><li> Her epitel yitiren organ ekledikten sonra mümkün olduğunca filtrenin üstüne kadar medya olarak çıkarın. Filtrenin üstünde çok fazla medya az medya esasları yerleştirme yapar iken, filtre batmaya neden olabilir ve çok daha kolay mezenşimin olabilir. Aşırı medya bir pipet ucu ile ya da uçları arasındaki medya bir pens ile ya da çıkarılabilir. </li><li> Sıra mezenşimi adet fro türetilmiştirüst ve / veya her epitel yitiren organ çevresindeki m 3-4 bezleri. Uzaklıkta esasları gelen mezenşimi hareketi önlemek için bezleri çevreleyen herhangi bir ekstra ortamları çıkarın. Daha bezlerinden kaynaklanan mezenşimin yararlı değildir, ancak daha az epitel yitiren organ büyümesi için zararlı olabilir. </li><li> İstendiğinde, 48 -72 saat boyunca 37 ° C&#39;de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi (% 95 hava /% 5 CO2) içinde rekombine SMGs inkübe edin. </li><li> Aydınlık ve / veya floresan 0 saat canlı bezlerinin görüntüleri (istenirse), rekombinasyon sonra 2 saat ve bir 4X veya 5X büyütme objektif kullanarak dijital kamera ile donatılmış bir, ters dik, ya da stereo mikroskopta bundan sonra her 24 saat Edinme görünümü tek bir çerçeve içinde tüm rekombine bezi yakalamak. Tükürük bezi Görüntüler ışık yolu (ki tam otomatik mikroskoplar üzerine yazdırmak mümkün değildir) yarısına kadar yerleştirilmiş aydınlık ayarı veya uygun faz halkasını kullanarak en iyi kontrast gösterir. Standart faz kontrast hayırgerekli t bezi kalın ve yana kontrast oluşturur. </li><li> Istenen zaman noktalarında, rekombine SMGs% 5 (w / v) sakaroz (daha iyisi hücreler tutarak iç hücre yapısını muhafaza ihtiva eden 1X PBS içinde% 2&#39;lik paraformaldehid (PFA) yapılmış sabitleştirici solüsyonu ile 20 dakika boyunca sabit olabilir Bir isosmotic devlet). Sabitleştirici tamamen tespit sonrası çıkartılırsa,% 4 aksine PFA,% 2 PFA GFP sinyali önemli miktarda muhafaza edecektir. Bezler 4 karanlıkta 1X PBS içinde 1 hafta kadar süreyle saklanabilir ° C bütün montaj immünsitokimya ve konfokal görüntüleme yapılana kadar, önceden 3,6,13-15 bildirdi. İdeal immünsitokimya ve görüntüleme en iyi kalitede görüntü elde etmek için fiksasyon kısa bir süre sonra yapılmalıdır. Bezler da Western blot analizi ile SDS-PAGE için RIPA tamponu içinde lize edilebilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+gland+development.">Salivary gland development.</a> Seminars in cell &amp; developmental biology. 18, 237-244 (2007).</li><li>Sakai, T., Onodera, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+organ+culture.">Embryonic organ culture.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 19, Unit 19 (2008).</li><li>Patel, V. N., Rebustini, I. T., Hoffman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+gland+branching+morphogenesis.">Salivary gland branching morphogenesis.</a> Differentiation. 74, 349-364 (2006).</li><li>Sequeira, S. J., Larsen, M., DeVine, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+and+growth+factors+in+salivary+gland+development.">Extracellular matrix and growth factors in salivary gland development.</a> Frontiers of oral biology. 14, 48-77 (2010).</li><li>Zheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+detection+of+E1-containing+adenovirus+in+saliva+after+the+delivery+of+a+first-generation+adenoviral+vector+to+human+parotid+gland.">Transient detection of E1-containing adenovirus in saliva after the delivery of a first-generation adenoviral vector to human parotid gland.</a> J. Gene Med. 12, 3-10 (2010).</li><li>Larsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+PI+3-kinase+and+PIP3+in+submandibular+gland+branching+morphogenesis.">Role of PI 3-kinase and PIP3 in submandibular gland branching morphogenesis.</a> Developmental biology. 255, 178-191 (2003).</li><li>Hoffman, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiles+of+mouse+submandibular+gland+development:+FGFR1+regulates+branching+morphogenesis+in+vitro+through+BMP-+and+FGF-dependent+mechanisms.">Gene expression profiles of mouse submandibular gland development: FGFR1 regulates branching morphogenesis in vitro through BMP- and FGF-dependent mechanisms.</a> Development. 129, 5767-5778 (2002).</li><li>Rebustini, I. T., Hoffman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECM+and+FGF-dependent+assay+of+embryonic+SMG+epithelial+morphogenesis:+investigating+growth+factor/matrix+regulation+of+gene+expression+during+submandibular+gland+development.">ECM and FGF-dependent assay of embryonic SMG epithelial morphogenesis: investigating growth factor/matrix regulation of gene expression during submandibular gland development.</a> Methods Mol. Biol. 522, 319-330 (2009).</li><li>Partanen, A. M., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transferrin+and+tooth+morphogenesis:+retention+of+transferrin+by+mouse+embryonic+teeth+in+organ+culture.">Transferrin and tooth morphogenesis: retention of transferrin by mouse embryonic teeth in organ culture.</a> Differentiation. 34, 25-31 (1987).</li><li>Naka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+branching+morphogenesis+of+fetal+mouse+submandibular+gland+by+sodium+ascorbate+and+epigallocatechin+gallate.">Modulation of branching morphogenesis of fetal mouse submandibular gland by sodium ascorbate and epigallocatechin gallate.</a> In Vivo. 19, 883-888 (2005).</li><li>Bornstein, P., Traub, W., Neurath, H., Hill, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemistry+and+biology+of+collagen.">The chemistry and biology of collagen.</a> The Proteins. 4, 412-632 (1979).</li><li>Zhou, L., Higginbotham, E. J., Yue, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+ascorbic+acid+on+levels+of+fibronectin,+laminin+and+collagen+type+1+in+bovine+trabecular+meshwork+in+organ+culture.">Effects of ascorbic acid on levels of fibronectin, laminin and collagen type 1 in bovine trabecular meshwork in organ culture.</a> Curr. Eye Res. 17, 211-217 (1998).</li><li>Daley, W. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK1-directed+basement+membrane+positioning+coordinates+epithelial+tissue+polarity.">ROCK1-directed basement membrane positioning coordinates epithelial tissue polarity.</a> Development. 139, 411-422 (2012).</li><li>Daley, W. P., Gulfo, K. M., Sequeira, S. J., Larsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+mechanochemical+checkpoint+and+negative+feedback+loop+regulating+branching+morphogenesis.">Identification of a mechanochemical checkpoint and negative feedback loop regulating branching morphogenesis.</a> Developmental biology. 336, 169-182 (2009).</li><li>Sequeira, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+focal+adhesion+complex+formation+and+salivary+gland+epithelial+cell+organization+by+nanofibrous+PLGA+scaffolds.">The regulation of focal adhesion complex formation and salivary gland epithelial cell organization by nanofibrous PLGA scaffolds.</a> Biomaterials. 33, 3175-3186 (2012).</li><li>Nogawa, H., Mizuno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+control+over+elongating+and+branching+morphogenesis+in+salivary+gland+development.">Mesenchymal control over elongating and branching morphogenesis in salivary gland development.</a> Journal of embryology and. 66, 209-221 (1981).</li><li>Sakai, T., Larsen, M., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+requirement+in+branching+morphogenesis.">Fibronectin requirement in branching morphogenesis.</a> Nature. 423, 876-881 (2003).</li><li>Daley, W. P., Kohn, J. M., Larsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+focal+adhesion+protein-based+mechanochemical+checkpoint+regulates+cleft+progression+during+branching+morphogenesis.">A focal adhesion protein-based mechanochemical checkpoint regulates cleft progression during branching morphogenesis.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 2069-2083 (2011).</li><li>Knox, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parasympathetic+innervation+maintains+epithelial+progenitor+cells+during+salivary+organogenesis.">Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis.</a> Science. 329, 1645-1647 (2010).</li><li>Larsen, M., Wei, C., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+fibronectin+dynamics+during+branching+morphogenesis.">Cell and fibronectin dynamics during branching morphogenesis.</a> J. Cell Sci. 119, 3376-3384 (2006).</li><li>Wei, C., Larsen, M., Hoffman, M. P., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+and+branching+morphogenesis+of+primary+salivary+epithelial+cells.">Self-organization and branching morphogenesis of primary salivary epithelial cells.</a> Tissue Eng. 13, 721-735 (2007).</li><li>Zheng, C., Baum, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+viral+and+mammalian+promoters+for+use+in+gene+delivery+to+salivary+glands.">Evaluation of viral and mammalian promoters for use in gene delivery to salivary glands.</a> Mol. Ther. 12, 528-536 (2005).</li><li>Hsu, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+gene+transfer+to+developing+mouse+salivary+glands.">Viral gene transfer to developing mouse salivary glands.</a> J. Dent. Res. 91, 197-202 (2012).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Ex vivo epitelyal-mezenkimal rekombinasyon tekniği ilk kez 1981 16 submandibular tükürük bezleri için yayınlandı. Bu protokol, biz bir rekombine bezinin kapsamında epitel hücre gen ekspresyonu işlemek için adenoviral infeksiyonun kullanarak, orijinal yöntem geliştirmektedir. Biz enfekte hücrelerin yüzdesi viral promotör özellikleri, viral titresi ve viral saflık bağlıdır ise epitel hücrelerinin yüzdesi, adenovirüs ile enfekte olduğunu göstermektedir. Biz bu verimli transdük...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Fenol kırmızısı olmadan DMEM / Ham &#39;s F12 Orta </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 21041-025 </td><td></td></tr><tr><td> Penisilin ve Streptomisin </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 15070-163 </td><td> 10X stok </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 17105-041 </td><td> Tek kullanımlık alikotları dondurun at-20C </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A2934-100G </td><td> Fraksiyon V, düşük endotoksin </td></tr><tr><td> Adeno-X-GFP </td><td> BD Biosciences </td><td> 8138-1 </td><td> Yüksek titrede (1x10 10 pfu / ml) olmalı. CsCl saflaştırılmış virüs bu tahlil içinde virüsler kolon saflaştırılmış daha etkili olduğu görülmüştür. </td></tr><tr><td> % 16 paraformaldehit </td><td&gt; Elektron Mikroskobu Bilimleri </td><td> 15710 </td><td> % 5 sakkaroz (w / v) ile PBS içinde% 2 ile seyreltildi </td></tr><tr><td> 1X fosfat-tamponlu salin (PBS) </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 70011-044 </td><td> 10X stok hazırlandı </td></tr><tr><td> Hank Dengeli Tuz Çözeltisi </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 14175095 </td><td> Hiçbir Kalsiyum, Magnezyum hayır, hayır Fenol Kırmızısı </td></tr><tr><td> Transferrin </td><td> Sigma </td><td> T8158 </td><td> 25 mg / ml DMEM/F12 ortamı içinde stok çözeltisi. Tek kullanımlık alikotları at-20C dondurun </td></tr><tr><td> L-Askorbik asit (C vitamini) </td><td> Sigma </td><td> A4403 </td><td> DMEM/F12 media.Freeze tek kullanımlık alikotları 75 mg / ml stok çözelti-20C </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tablo 1. Rekombinasyon protokol SMG için gerekli ayıraçlar listesi. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td&gt; <td></td></tr><tr><td> 10 cm steril plastik tabaklar </td><td> Corning </td><td> 430167 </td><td> Non-doku kültür plakaları ile tedavi de kullanılabilir. </td></tr><tr><td> Iletilen ışık tabanı ile Stereo diseksiyon mikroskobu </td><td> Nikon </td><td> SMZ645 </td><td> Herhangi bir stereo mikroskop kesme bir geçen ışık tabana sahip olduğu da kullanılabilir. </td></tr><tr><td> 35 mm doku kültür tabaklarında </td><td> Şahin </td><td> 353001 </td><td> Non-doku kültür plakaları ile tedavi de kullanılabilir. </td></tr><tr><td> 50 mm çaplı mikro yemekler </td><td> Mattek Corporation, </td><td> P50-G-1.5-14F </td><td></td></tr><tr><td> Nuclepore Parça-Etch membran filtreleri </td><td> Whatman </td><td> 110405 </td><td> 13 mm çapında, 0.1 mm gözenek boyutu </td></tr><tr><td> Geniş açılı, flöresanlı bir mikroskop </td><td> Carl Zeiss, ABD </td><td> Axio Gözlemci Z1 </td><td> Herhangi bir floresan mikroskop (dik, i) nverted veya mikroskop diseksiyon stereo bağlı bir dijital fotoğraf makinesi ile düşük büyütmede GFP ifade izlemek için kullanılabilir. </td></tr><tr><td> Konfokal mikroskop </td><td> Leica Microsystems </td><td> TCS SP5 </td><td> Konfokal mikroskopi detaylı hücre yapıları görmek için gereklidir. Herhangi bir konfokal mikroskop kullanılır. </td></tr><tr><td> Zamanlı-Hamile dişi farelerde, gerginlik CD-1 veya ICR </td><td> Charles River Laboratuvarları </td><td></td><td> Embriyolar gün 13 (gün 0 olarak belirlenmiş fiş keşif gün) hasat edilir. </td></tr><tr><td> Neşter bıçağı # 11 </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 10011-00 </td><td></td></tr><tr><td> Bisturi sapı # 3 </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 10003-12 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont # 5 forseps inox alaşım, 0.05mm X 0.02mm </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11252-20 </td><td> Embriyolardan bezleri hasat için ideal </td></tr><tr><td&gt; Dumont # 5 forseps dumostar alaşım, 0.05mm X 0.01mm </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11295-20 </td><td> İnce ipuçları epitel mezenşim çıkarılması için gereklidir. Tungsten iğneler de kullanılabilir. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tablo 2. Ekipman rekombinasyon protokolü SMG kullanılır. </td></tr></tbody></table>

genetic modification and recombination of salivary gland organ cultures

Morfolojilerinden Dallanma birçok organların gelişim sırasında meydana gelen, ve embriyonik fare submandibular bez (SMG) morfolojilerinden dallanma çalışma için klasik bir modeldir. - Sonuçta oral kavite 1 içine, sırasıyla, tükürük üretirler ve değiştirmek / taşıma hizmet asinüs ve kanalların karmaşık dallı ağı, yol vermek, epitelyal tomurcuk ve kanal oluşumu adımları iteratif geliştirme SMG, bu süreci içerir 3. Nasıl hücresel ve moleküler olaylar henüz tam olarak anlaşılamamıştır koordine olmasına rağmen epitel ilişkili bazal membran ve bu hücreler tarafından üretilen mezenşimi hücreler, büyüme faktörleri ve ekstraselüler matriks dahil mezenkimal bölmesi, yönlerini, dallanma mekanizması için kritik olan 4 . Moleküler mekanizmaların çalışmada epitelyal morfolojilerinden gelişmeler gelişim mekanizmalarına anlayışımızı sürüş ve olası Rejenere içgörü sağlarative tıp yaklaşımları. Bu tür çalışmalar tükrük epitelin genetik manipülasyonu için etkili yöntemlerin eksikliği nedeniyle sekteye edilmiştir. Şu anda, adenoviral transdüksiyon vivo 5 yetişkin bezlerinin epitel hücrelerini hedef için en etkili yöntem temsil eder. Ancak, embriyonik eksplantlar, yoğun mezenşimi ve epitel hücreleri çevreleyen bazal membran epitel hücreleri viral erişimi engellemektedir. Mezenşim çıkarılırsa, epitelyum adenovirüsler kullanılarak transfekte edilebilir ve epitel esaslar Matrigel ya da laminin-111 6,7 varlığında, morfojenezi dallanma devam edebilir. Mesenchyme serbest epitelyal yitiren organ büyüme de çözünür büyüme faktörleri ile ek takviyesi gerektirir ve bozulmamış bezleri 8 oluşuyor gibi tamamen dallanma morfolojilerinden özetlemek değil. Burada transfekte e epitel hücreleri ve kültür adenoviral iletimi kolaylaştıran bir yöntem tanımlamakilişkili mezenşimi ile pithelium. Embriyonik SMGs, mezenşimi çıkarılması ve bir GFP içeren adenovirüs ile epitel viral enfeksiyon mikrodisseksiyon ardından, epitel kendiliğinden sağlam SMG glandüler yapısı recapitulating ve morfonogenezi dallanma, bulaşmamış mezenşimi ile yeniden birleştirilmesi kastedilmektedir olduğunu göstermektedir. Genetiği değiştirilmiş epitel hücre popülasyonu kolayca floresan etiketli varsa adenoviral yapıları kullanılır, standart floresan mikroskobu yöntemleri kullanılarak izlenebilir. Burada açıklanan yöntem, şu anda doku rekombinasyon transgenik hayvanların üretimi gerektirmeyen bir kompleks 3B doku yapısı içinde, bir vahşi-tip ya da mutant vektör ile epitel hücrelerinin transfeksiyonu için en etkili ve ulaşılabilir bir yöntemdir.

Büyük deneysel adımların akış Şekil 1 &#39;de özetlenmiştir. Bozulmamış bir SMG, izole edilmiş bir epitel yitiren organ, ve karşılık gelen mezenşim bir örneği, Şekil 2&#39;de gösterilmiştir. Belirtilen zaman için ex vivo kültive, Şekil 3 &#39;de gösterilmiştir zaman morfojenezi dallanma geçmesi devam rekombine SMGs, bir aydınlık görüntüler. Epitel GFP ifade eden, 48 saat süreyle yetiştirilir Rekombine bezi <str...

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures at JoVE.com

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Genetik bütünü içinde epitel hücreleri manipüle etmek için bir tekniktir<em&gt; Ex vivo</emViral gen transferi kullanarak&gt; kültürlü embriyonik fare submandibular bezler (SMGs) tarif edilir. Bu yöntem, epitel ve kendiliğinden adenoviral vektörlerin epitelyal esasları ayrılması ve enfeksiyon sonrası rekombinasyona mezenşimi SMG arasında doğuştan gelen bir yetenek yararlanır.

Tükürük Bezi Organ Kültürleri Genetik Modifikasyon ve Rekombinasyon

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

genetic-modification-recombination-salivary-gland-organ

Research

JoVE Journal

Biology

12.8K Görüntüleme.  University at Albany, SUNY. Genetik bütünü içinde epitel hücreleri manipüle etmek için bir tekniktir Ex vivo kültürlü embriyonik fare submandibular bezler (SMGs) tarif edilir. Bu yöntem, epitel ve kendiliğinden adenoviral vektörlerin epitelyal esasları ayrılması ve enfeksiyon sonrası rekombinasyona mezenşimi SMG arasında doğuştan gelen bir yetenek yararlanır.

Video: Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol demonstrates dissection techniques for removal of the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes. 



The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for vector pathogens like Plasmodium falciparum and the dengue virus. This video demonstrates the dissection techniques for removing the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes.

Ae midgut ve Tükürük Bezlerinin Diseksiyon. aegypti Sivrisinekler

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Biyoloji

PDMS Device Fabrication and Surface Modification

PDMS Cihaz İmalat ve Yüzey Modifikasyonu

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Erken Civciv Embriyolar ex vivo (Kültür) Kültür Yöntemi

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Erken Civciv Embriyolar in situ Hibridizasyon Çift Tüm Dağı

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play a key role in the development of a functionally competent T-cell pool. However, the complexity of T-cell development in the thymus in vivo can limit analysis of individual cellular components and particular stages of development. In vitro culture systems provide a readily accessible means to study multiple complex cellular processes. Thymus organ culture systems represent a widely used approach to study intrathymic development of T-cells under defined conditions in vitro. Here we describe a system in which mouse embryonic thymus lobes can be depleted of endogenous haemopoeitic elements by prior organ culture in 2-deoxyguanosine, a compound that is selectively toxic to haemopoeitic cells. As well as providing a readily accessible source of thymic stromal cells to investigate the role of thymic microenvironments in the development and selection of T-cells, this technique also underpins further experimental approaches that include the reconstitution of alymphoid thymus lobes in vitro with defined haemopoietic elements, the transplantation of alymphoid thymuses into recipient mice, and the formation of reaggregate thymus organ cultures. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).

This video demonstrates the dissection and removal of the fetal thymus as well the preparation of ex vivo cultures of 2-dGuo-treated thymus.

2-dGuo Boyalı Thymus Organ Kültürleri hazırlanması

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of saliva into the oral cavity. Serous and mucous acinar cells are the protein and mucous producing factories of the gland respectively, and represent the origin of saliva production. Once synthesised, the various enzymatic and other proteinaceous components of saliva are secreted through a series of ductal cells bearing epithelial-type morphology, until the eventual expulsion of the saliva through one major duct into the cavity of the mouth. The composition of saliva is also modified by the ductal cells during this process.
In the manifestation of diseases such as Sj&ouml;gren's syndrome, and in some clinical situations such as radiotherapy treatment for head and neck cancers, saliva production by the glands is dramatically reduced 1,2. The resulting xerostomia, a subjective feeling of dry mouth, affects not only the ability of the patient to swallow and speak, but also encourages the development of dental caries and can be socially debilitating for the sufferer.
The restoration of saliva production in the above-mentioned clinical conditions therefore represents an unmet clinical need, and as such several studies have demonstrated the regenerative capacity of the salivary glands 3-5. Further to the isolation of stem cell-like populations of cells from various tissues within the mouse and human bodies 6-8, we have shown using the described method that stem cells isolated from mouse salivary glands can be used to rescue saliva production in irradiated salivary glands 9,10. This discovery paves the way for the development of stem cell-based therapies for the treatment of xerostomic conditions in humans, and also for the exploration of the salivary gland as a microenvironment containing cells with multipotent self-renewing capabilities.

An optimized protocol for the isolation of stem cells from the mouse salivary gland is described. The method employs enzymatic and mechanical digestion, and permits isolation of salispheres containing cells with characteristics of stem cells.

Fare Tükürük Bezi Kök Hücre İzolasyonu

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene regulation is complex, but essentially involves modifications to the DNA itself or the proteins with which DNA associates. The predominant epigenetic modification of DNA in mammalian genomes is methylation of cytosine nucleotides (5-MeC). DNA methylation provides instruction to gene expression machinery as to where and when the gene should be expressed. The primary target sequence for DNA methylation in mammals is 5'-CpG-3' dinucleotides (Figure 1). CpG dinucleotides are not uniformly distributed throughout the genome, but are concentrated in regions of repetitive genomic sequences and CpG "islands" commonly associated with gene promoters (Figure 1). DNA methylation patterns are established early in development, modulated during tissue specific differentiation and disrupted in many disease states including cancer. To understand the biological role of DNA methylation and its role in human disease, precise, efficient and reproducible methods are required to detect and quantify individual 5-MeCs.
This protocol for bisulphite conversion is the "gold standard" for DNA methylation analysis and facilitates identification and quantification of DNA methylation at single nucleotide resolution. The chemistry of cytosine deamination by sodium bisulphite involves three steps (Figure 2). (1) Sulphonation: The addition of bisulphite to the 5-6 double bond of cytosine (2) Hydrolic Deamination: hydrolytic deamination of the resulting cytosine-bisulphite derivative to give a uracil-bisulphite derivative (3) Alkali Desulphonation: Removal of the sulphonate group by an alkali treatment, to give uracil. Bisulphite preferentially deaminates cytosine to uracil in single stranded DNA, whereas 5-MeC, is refractory to bisulphite-mediated deamination. Upon PCR amplification, uracil is amplified as thymine while 5-MeC residues remain as cytosines, allowing methylated CpGs to be distinguished from unmethylated CpGs by presence of a cytosine "C" versus thymine "T" residue during sequencing.
DNA modification by bisulphite conversion is a well-established protocol that can be exploited for many methods of DNA methylation analysis. Since the detection of 5-MeC by bisulphite conversion was first demonstrated by Frommer et al.1 and Clark et al.2, methods based around bisulphite conversion of genomic DNA account for the majority of new data on DNA methylation. Different methods of post PCR analysis may be utilized, depending on the degree of specificity and resolution of methylation required. Cloning and sequencing is still the most readily available method that can give single nucleotide resolution for methylation across the DNA molecule.

The gold standard for DNA methylation analysis is genomic sequencing of bisulphite converted DNA. This method takes advantage of the increased sensitivity of cytosine compared with 5-methylcytosine (5-MeC) to bisulphite deamination under acidic conditions. Unmethylated cytosines can be distinguished from methylated cytosines after PCR amplification of the target genomic DNA.

DNA Metilasyonu: bisülfit modifikasyonu ve Analiz

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

İnsan Pluripotent için alternatif Kültürleri Hücre Üretim, Bakım ve Genetik Analizi Kök

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

DNA Elektroporasyon, Myofibers İzolasyon ve Görüntüleme

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Genetic Modification of Cyanobacteria by Conjugation Using the CyanoGate Modular Cloning Toolkit

Cyanobacteria are a diverse group of prokaryotic photosynthetic organisms that can be genetically modified for the renewable production of useful industrial commodities. Recent advances in synthetic biology have led to development of several cloning toolkits such as CyanoGate, a standardized modular cloning system for building plasmid vectors for subsequent transformation or conjugal transfer into cyanobacteria. Here we outline a detailed method for assembling a self-replicating vector (e.g., carrying a fluorescent marker expression cassette) and conjugal transfer of the vector into the cyanobacterial strains Synechocystis sp. PCC 6803 or Synechococcus elongatus UTEX 2973. In addition, we outline how to characterize the performance of a genetic part (e.g., a promoter) using a plate reader or flow cytometry.

Here, we present a protocol describing how to i) assemble a self-replicating vector using the CyanoGate modular cloning toolkit, ii) introduce the vector into a cyanobacterial host by conjugation, and iii) characterize transgenic cyanobacteria strains using a plate reader or flow cytometry.