فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور نيلسون ديردري للتعليقات مفيدة وللقراءة نقدية للمخطوطة. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح DE019244، DE019197، وDE021841 لML، F32DE02098001 إلى SJS، وRR015464 C06 إلى الجامعة في ألباني، جامعة ولاية نيويورك.

ويتضمن البروتوكول أربع خطوات رئيسية، كما هو مبين في الشكل 1. يتم وصف كل الخطوات بالتفصيل الكامل. يجب أن يتم تنفيذ البناء وتنقية الفيروسية اتش في وقت سابق للحصاد الجهاز للاستخدام في تنبيغ الوراثية من اساسيات تشريح الظهارية. يجب اتباع جميع احتياطات السلامة القياسية BSL-2 عند التعامل مع الفيروسات الغدية. 1. الغدة تحت الفك الماوس الجنينية (SMG) حصاد وتسليخ مجهري <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء التوقيت-إناث الفئران الحوامل (سلالة الأباعد CD-1 أو ICR) باستخدام CO 2 الخدر، تليها خلع عنق الرحم وخيوط حصاد أجنة الفئران الجنينية في يوم 13 (E13، 3-5 براعم الظهارية) الإجراءات التالية التي وافقت عليها IACUC المؤسسية اللجنة. تم تعيينه يوم اكتشاف المكونات المهبلية كما E0. ويمكن أيضا أن تحصد الغدد اللعابية ومثقف في مرحلة E12 عندما يكون هناك برعم واحد الابتدائية وساق مع الشقوق بدأت للتولبدء. SMGs قبل هذه المرحلة تتطلب ظروف مختلفة عن تلك الثقافة وأشارت هنا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل السلاسل الجنين في معقمة 10 أطباق سم زراعة الأنسجة مليئة 25 مل من متوسطة F12 DMEM / هام ل(F12) تفتقر الحمراء الفينول (لايف تكنولوجيز) وتستكمل مع 100 U / البنسلين مل، و 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين (القلم بكتيريا، الحياة تكنولوجيز). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مشرط معقم (# 11 ريش) وملقط (# 5، أدوات العلوم الجميلة، 11252-20)، إزالة الأجنة من الحويصلات في طبق منفصل 10 سم تحتوي على 25 مل من DMEM/F12 + القلم بكتيريا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع رؤوس الجنين مع قطع الزاوية أسفل الفك السفلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل أقل mandibles من رؤساء تحت المجهر ستيريو مع وجود قاعدة تشريح الضوء المرسل (نيكون SMZ645 أو ما يعادلها) باستخدام قطع تحت الفك العلوي. وضع الأنسجة على رأس قطعة اضافية من الزجاج وليس مباشرة على الزجاج المكون لقاعدة المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع أقل mandibles إلى 3 مل من DMEM/F12 + القلم بكتيريا في طبق العقيمة 35 ملم زراعة الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع شريحة الفك السفلي على المسرح المجهر تشريح بحيث اللسان على الجزء السفلي من شريحة ولكن يشير نحو موقف الساعة 12:00. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام جانب واحد من اثنين من ملقط عبرت في حركة سكيسورينغ، وإزالة وتجاهل الثالثة أقل 1/3 من شريحة الفك السفلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل شريحة 90 درجة إلى اليمين (اليد اليمنى إذا) و، وذلك باستخدام قطع سكيسورينغ مع ملقط، وقطع الجزء العلوي من شريحة الفك السفلي (بدون قطع اللسان) في منتصف الطريق إلى شريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قشر الأنسجة الزائدة بعيدا وإزالته لفضح SMGs تحتها. وسوف يكون هناك واحد على كل جانب بالقرب من قاعدة اللسان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام زوج واحد من الملقط باستمرار إلى الأنسجة عن طريق اللسان، استخدم ملقط أخرى لندف SMG بعيدا عن اللسان. تكرار للغدة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الغدد اللعابية في microdissected 3 مل من DMEM/F12 + القلم بكتيريا جديدة في الأنسجة المعقمة 35 ملمثقافة الطبق. ملاحظة: يمكن زرعها أكبر الغدد تحت الفك السفلي (3-5 براعم الظهارية) جنبا إلى جنب مع الغدة تحت اللسان إتصال أصغر (1 برعم) على حالها من خلال تخطي إلى الخطوة 4 وتنفيذ الخطوات 4.1، 4.3، و 4.4، كما هو موضح سابقا 2،8. </li></ol> 2. SMG طلائي فصل رديم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المكان 5 (أو أكثر) الغدد اللعابية في زجاجة ذات قاع، 50 مم القطر microwell طبق (ماتيك شركة، P50G-1.5-14-F) تحتوي على 200 ميكرولتر من محلول هانك الملح المتوازن (HBSS تفتقر كا + + أو Mg + +، تقنيات الحياة) التي تحتوي على 0.4٪ (V / V) dispase (تقنيات الحياة، القط. رقم 17105-041) واحتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحضانة، وذلك باستخدام ماصة معقمة 200 ميكرولتر تلميح، نضح بعناية الحل من دون إزعاج dispase الغدد. إضافة 200 ميكرولتر من الفور DMEM/F12 وسائل الإعلام التي تحتوي على 5٪ (W / V) BSA (DMEM/F12-BSA، قبل تعقيمها 0،22 ميكرون مع فلتر) لتحييد dispase. </li> &lt;لى&gt; تحت المجهر تشريح، وذلك باستخدام زوج من ملقط مع نصائح غرامة (# 5 Dumostar، أدوات العلوم الجميلة، 11295-20)، فصل بلطف اللحمة المتوسطة خففت من جميع أنحاء براعم SMG الظهارية والقنوات، مع الحرص على ترك سليمة ظهارة . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل الرطب وعقيمة 200 ميكرولتر ماصة الحافة مع وسائل الإعلام وDMEM/F12-BSA ماصة بلطف من اساسيات الظهارية في طبق جديد 50 مم القطر microwell تحتوي على 200 ميكرولتر من DMEM/F12 + القلم بكتيريا. استخدام عالية الجودة تلميح ماصة ميكرولتر 200 مع حافة ناعمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الصحن الذي يحتوي على قطع اللحمة المتوسطة، ونبذ أي نوع من الأنسجة غير الوسيطة بما في ذلك الغدد تحت اللسان وأي فصل براعم الغدة تحت الفك. </li></ol> 3. الغدانية العدوى من الأساسيات طلائي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل وسائل الإعلام 200 ميكرولتر من عدوى فيروسية إضعاف اتش الاهتمام DMEM/F12 + بكتيريا من ركلة جزاء في أنبوب microcentrifuge بحيث عيار من الحل الناتج هو 1x10 8 -10 9 PFUs. القد عيار الأمثل المطلوب لفيروسات مختلفة تختلف. من المهم أن استخدام كلوريد السيزيوم (CSCL)-تنقية الاستعدادات لكفاءة امتصاص الفيروسية الأمثل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وسائل الإعلام من الطبق يحتوي على اساسيات 5 الظهارية. بسرعة إضافة 200 ميكرولتر من وسائل الإعلام العدوى، والحفاظ على اساسيات الرطب في جميع الأوقات. اتخاذ الاحتياطات اللازمة عند التعامل مع الفيروس والتخلص من نصائح الماصة الملوثة. تطهير الأسطح أي ملوثة بالفيروس مع حل التبييض 10٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل اساسيات الظهارية بعيدا عن بعضها البعض مع ملقط لمنعهم من الالتصاق معا، والسماح لهم لتسوية في الجزء السفلي من اللوحة. احتضان اساسيات في وسائل الإعلام الفيروسية ل1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. خلال الحضانة، فصل اساسيات، إذا انتقلوا قريبة من بعضها البعض. سوف هزاز المفرط أو حركة يسمح للغدد لتتجمع معا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحضانة، وإزالة بلطف وسائل الإعلام التي تحتوي على فيروسات والتخلص بشكل مناسب، مع الحرص على عدم تعطيل Rudiments. أضف 200 ميكرولتر من DMEM/F12 + القلم بكتيريا. تكرار غسل هذا على الأقل مرتين أخريين واستبدال مع 200 ميكرولتر من وسائل الإعلام DMEM/F12 القلم بكتيريا +. هذه يغسل حاسمة لإزالة أي فيروس التي لم يتم بقوة لتولي الظهارة ومنع العدوى من اللحمة المتوسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان اساسيات الظهارية مع 200 مل من DMEM/F12 تحتوي على 2٪ (V / V) Matrigel (BD العلوم البيولوجية، 356231) لمدة 20 دقيقة. نجد أن هذه الحضانة قصيرة في Matrigel يقلل من الانحدار من الشقوق الموجودة الثقافة خلال الفترة الأولية، ولكن يمكن الاستغناء هذه الخطوة مع المطلوب إذا لم يتم التعرض لMatrigel. </li></ol> 4. فيفو السابقين من الثقافة SMGs معاد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع كل رديم، في وقت واحد، وذلك باستخدام ما قبل الرطب تلميح ماصة ميكرولتر 200، على رأس (قطع صغيرة) حقق 13 مم، 0.1 ميكرومتر Nuclepore المسار، إحفر غشاء (WHATMAN) تطفو أكثر من 200 ميكرولتر من وسائل الإعلام الثقافة ( 5 اساسيات / فلتر) في لوحة microwell الزجاجي. ثقافة وسائل الإعلامهو: DMEM/F12 + القلم بكتيريا يحتوي على 50 ميكروغرام / مل و 150 ترانسفيرين حمض الاسكوربيك ميكروغرام / لتر، كما هو موضح سابقا 2،8. ومن المعروف ترانسفيرين لتحفيز البقاء والمتفرعة من التشكل الغدد اللعابية والجهاز إإكسبلنتس أخرى 9. وقد تبين من حامض الاسكوربيك بالإضافة إلى تحفيز SMG المتفرعة 10 ومن المعروف أن يكون بمثابة العامل المساعد في التفاعلات الهيدروكسيل العديد من المسارات الأيضية (مثل الهيدروكسيل البرولين خلال تشكيل الكولاجين الألياف 11) وتحفز أيضا إنتاج فبرونيكتين وlaminin في إإكسبلنتس جهاز آخر 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الكثير من وسائل الإعلام على رأس مرشح ممكن بعد إضافة كل رديم الظهارية. قد الكثير من وسائل الإعلام على رأس تصفية تسبب تصفية لإغراق، في حين أن أقل وسائل الاعلام يجعل وضع اساسيات واللحمة المتوسطة أسهل بكثير. يمكن إزالة الزائدة وسائل الإعلام سواء مع طرف ماصة أو باستخدام ملقط لقبضة وسائل الإعلام بين النصائح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع اللحمة المتوسطة المكان جيئة وذهابا المستمدة03:57 م الغدد على رأس و / أو حول كل رديم الظهارية. إزالة أي وسائط الإضافية التي تقوم بتطويق الغدد لتجنب حركة اللحمة المتوسطة بعيدا عن اساسيات. اللحمة المتوسطة المستمدة من أكثر الغدد ليست مفيدة ولكن أقل يمكن أن يكون ضارا لنمو رديم الظهارية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان SMGs معاد في حاضنة مرطب (95٪ الهواء / 5٪ CO 2) في C ° 37 لمدة 48 -72 ساعة، كما هو مطلوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على brightfield و / أو الصور الفلورسنت الغدد الحية في ساعة 0 (الرغبة)، 2 ساعة بعد إعادة التركيب وبعد ذلك على مدار 24 ساعة كل على ضوء المجهر المقلوب، وتستقيم، أو ستيريو مزودة كاميرا رقمية باستخدام التكبير 4X الهدف أو 5X ل التقاط الغدة بأكملها معاد في إطار واحد وجهة نظر. صور من الغدة اللعابية عرض أفضل النقيض باستخدام الإعداد brightfield أو الحلبة المرحلة المناسبة وضعت الطريقة في جزء مسار الضوء (وهو أمر غير ممكن على كامل الآلي المجاهر). معيار المقابل المرحلة ليسر اللازمة منذ الغدة سميكا ويخلق التباين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نقطة زمنية المطلوب، يمكن أن تكون ثابتة SMGs معاد لمدة 20 دقيقة مع الحل مثبت مصنوع من بارافورمالدهيد 2٪ (PFA) في برنامج تلفزيوني 1X تحتوي على 5٪ (W / V) السكروز (للحفاظ على بنية الخلية الداخلية أفضل عن طريق الحفاظ على الخلايا في دولة متسق الضغط التناضحي). على عكس PFA 4٪ سوف، PFA 2٪ الحفاظ على كمية كبيرة من الإشارة GFP إذا تمت إزالة تماما بعد التثبيت مثبت. ويمكن تخزين الغدد لمدة تصل إلى 1 أسبوع في برنامج تلفزيوني 1X في الظلام في 4 درجات مئوية حتى يتم تنفيذ كامل جبل كيمياء سيتولوجية مناعية والتصوير مبائر، كما ورد سابقا 3،6،13-15. من الناحية المثالية، ينبغي أن يتم تنفيذ كيمياء سيتولوجية مناعية والتصوير قريبا بعد التثبيت للحصول على صور ذات نوعية أفضل. ويمكن أيضا أن الغدد lysed في العازلة RIPA لSDS-PAGE تليها الغربية النشاف تحليل. </li></ol>

<ol>
	<li>Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+gland+development.">Salivary gland development.</a> Seminars in cell &amp; developmental biology. 18, 237-244 (2007).</li><li>Sakai, T., Onodera, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+organ+culture.">Embryonic organ culture.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 19, Unit 19 (2008).</li><li>Patel, V. N., Rebustini, I. T., Hoffman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+gland+branching+morphogenesis.">Salivary gland branching morphogenesis.</a> Differentiation. 74, 349-364 (2006).</li><li>Sequeira, S. J., Larsen, M., DeVine, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+and+growth+factors+in+salivary+gland+development.">Extracellular matrix and growth factors in salivary gland development.</a> Frontiers of oral biology. 14, 48-77 (2010).</li><li>Zheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+detection+of+E1-containing+adenovirus+in+saliva+after+the+delivery+of+a+first-generation+adenoviral+vector+to+human+parotid+gland.">Transient detection of E1-containing adenovirus in saliva after the delivery of a first-generation adenoviral vector to human parotid gland.</a> J. Gene Med. 12, 3-10 (2010).</li><li>Larsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+PI+3-kinase+and+PIP3+in+submandibular+gland+branching+morphogenesis.">Role of PI 3-kinase and PIP3 in submandibular gland branching morphogenesis.</a> Developmental biology. 255, 178-191 (2003).</li><li>Hoffman, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiles+of+mouse+submandibular+gland+development:+FGFR1+regulates+branching+morphogenesis+in+vitro+through+BMP-+and+FGF-dependent+mechanisms.">Gene expression profiles of mouse submandibular gland development: FGFR1 regulates branching morphogenesis in vitro through BMP- and FGF-dependent mechanisms.</a> Development. 129, 5767-5778 (2002).</li><li>Rebustini, I. T., Hoffman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECM+and+FGF-dependent+assay+of+embryonic+SMG+epithelial+morphogenesis:+investigating+growth+factor/matrix+regulation+of+gene+expression+during+submandibular+gland+development.">ECM and FGF-dependent assay of embryonic SMG epithelial morphogenesis: investigating growth factor/matrix regulation of gene expression during submandibular gland development.</a> Methods Mol. Biol. 522, 319-330 (2009).</li><li>Partanen, A. M., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transferrin+and+tooth+morphogenesis:+retention+of+transferrin+by+mouse+embryonic+teeth+in+organ+culture.">Transferrin and tooth morphogenesis: retention of transferrin by mouse embryonic teeth in organ culture.</a> Differentiation. 34, 25-31 (1987).</li><li>Naka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+branching+morphogenesis+of+fetal+mouse+submandibular+gland+by+sodium+ascorbate+and+epigallocatechin+gallate.">Modulation of branching morphogenesis of fetal mouse submandibular gland by sodium ascorbate and epigallocatechin gallate.</a> In Vivo. 19, 883-888 (2005).</li><li>Bornstein, P., Traub, W., Neurath, H., Hill, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemistry+and+biology+of+collagen.">The chemistry and biology of collagen.</a> The Proteins. 4, 412-632 (1979).</li><li>Zhou, L., Higginbotham, E. J., Yue, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+ascorbic+acid+on+levels+of+fibronectin,+laminin+and+collagen+type+1+in+bovine+trabecular+meshwork+in+organ+culture.">Effects of ascorbic acid on levels of fibronectin, laminin and collagen type 1 in bovine trabecular meshwork in organ culture.</a> Curr. Eye Res. 17, 211-217 (1998).</li><li>Daley, W. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK1-directed+basement+membrane+positioning+coordinates+epithelial+tissue+polarity.">ROCK1-directed basement membrane positioning coordinates epithelial tissue polarity.</a> Development. 139, 411-422 (2012).</li><li>Daley, W. P., Gulfo, K. M., Sequeira, S. J., Larsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+mechanochemical+checkpoint+and+negative+feedback+loop+regulating+branching+morphogenesis.">Identification of a mechanochemical checkpoint and negative feedback loop regulating branching morphogenesis.</a> Developmental biology. 336, 169-182 (2009).</li><li>Sequeira, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+focal+adhesion+complex+formation+and+salivary+gland+epithelial+cell+organization+by+nanofibrous+PLGA+scaffolds.">The regulation of focal adhesion complex formation and salivary gland epithelial cell organization by nanofibrous PLGA scaffolds.</a> Biomaterials. 33, 3175-3186 (2012).</li><li>Nogawa, H., Mizuno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+control+over+elongating+and+branching+morphogenesis+in+salivary+gland+development.">Mesenchymal control over elongating and branching morphogenesis in salivary gland development.</a> Journal of embryology and. 66, 209-221 (1981).</li><li>Sakai, T., Larsen, M., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+requirement+in+branching+morphogenesis.">Fibronectin requirement in branching morphogenesis.</a> Nature. 423, 876-881 (2003).</li><li>Daley, W. P., Kohn, J. M., Larsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+focal+adhesion+protein-based+mechanochemical+checkpoint+regulates+cleft+progression+during+branching+morphogenesis.">A focal adhesion protein-based mechanochemical checkpoint regulates cleft progression during branching morphogenesis.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 2069-2083 (2011).</li><li>Knox, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parasympathetic+innervation+maintains+epithelial+progenitor+cells+during+salivary+organogenesis.">Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis.</a> Science. 329, 1645-1647 (2010).</li><li>Larsen, M., Wei, C., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+fibronectin+dynamics+during+branching+morphogenesis.">Cell and fibronectin dynamics during branching morphogenesis.</a> J. Cell Sci. 119, 3376-3384 (2006).</li><li>Wei, C., Larsen, M., Hoffman, M. P., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+and+branching+morphogenesis+of+primary+salivary+epithelial+cells.">Self-organization and branching morphogenesis of primary salivary epithelial cells.</a> Tissue Eng. 13, 721-735 (2007).</li><li>Zheng, C., Baum, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+viral+and+mammalian+promoters+for+use+in+gene+delivery+to+salivary+glands.">Evaluation of viral and mammalian promoters for use in gene delivery to salivary glands.</a> Mol. Ther. 12, 528-536 (2005).</li><li>Hsu, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+gene+transfer+to+developing+mouse+salivary+glands.">Viral gene transfer to developing mouse salivary glands.</a> J. Dent. Res. 91, 197-202 (2012).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

نشرت لأول مرة خارج الجسم تقنية إعادة التركيب الظهارية الوسيطة-الغدد اللعابية تحت الفك السفلي لعام 1981 16. في هذا البروتوكول، ونحن على توسيع الأسلوب الأصلي، وذلك باستخدام عدوى الفيروسة الغدانية للتلاعب الظهارية التعبير الجيني الخلية في سياق غدة معاد. علينا ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> DMEM / هام لF12 متوسطة دون الحمراء الفينول </td><td> الحياة تكنولوجيز </td><td> 21041-025 </td><td></td></tr><tr><td> البنسلين والستربتوميسين </td><td> الحياة تكنولوجيز </td><td> 15070-163 </td><td> 10X الأسهم </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> الحياة تكنولوجيز </td><td> 17105-041 </td><td> تجميد مأخوذة استخدام مرة واحدة في 20C- </td></tr><tr><td> BSA </td><td> سيجما </td><td> A2934-100G </td><td> V كسر، الذيفان الداخلي منخفضة </td></tr><tr><td> الغدة X-GFP </td><td> BD العلوم البيولوجية </td><td> 8138-1 </td><td> يجب أن يكون عيار عالية (1x10 10 PFU / مل). CSCL الفيروسات تنقية أكثر فعالية من العمود تنقية الفيروسات في هذا الاختبار. </td></tr><tr><td> 16٪ لامتصاص العرق </td><td&gt; العلوم المجهر الإلكتروني </td><td> 15710 </td><td> المخفف إلى 2٪ في برنامج تلفزيوني مع السكروز 5٪ (W / V) </td></tr><tr><td> 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) </td><td> الحياة تكنولوجيز </td><td> 70011-044 </td><td> أعدت من المخزون 10X </td></tr><tr><td> هانك محلول الملح المتوازن </td><td> الحياة تكنولوجيز </td><td> 14175095 </td><td> لا الكالسيوم، المغنيسيوم لا، لا الفينول الأحمر </td></tr><tr><td> ترانسفيرين </td><td> سيجما </td><td> T8158 </td><td> 25 ملغ / مل محلول المخزون في DMEM/F12 سائل الإعلام. تجميد تستخدم مرة واحدة مأخوذة في 20C- </td></tr><tr><td> L-حمض الأسكوربيك (فيتامين C) </td><td> سيجما </td><td> A4403 </td><td> 75 ملغ / مل محلول المخزون في DMEM/F12 مأخوذة تستخدم مرة واحدة في media.Freeze-20C </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> الجدول 1. قائمة الكواشف اللازمة لSMG بروتوكول إعادة التركيب. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></TD&gt; <td></td></tr><tr><td> 10 سم أطباق بلاستيكية معقمة </td><td> كورنينج </td><td> 430167 </td><td> ويمكن أيضا لوحات غير زراعة الأنسجة المعاملة استخدامها. </td></tr><tr><td> ستيريو المجهر تشريح مع قاعدة الضوء المرسل </td><td> نيكون </td><td> SMZ645 </td><td> ويمكن استخدام أي تشريح ستيريو المجهر يحتوي على قاعدة الضوء المرسل. </td></tr><tr><td> 35 مم زراعة الأنسجة أطباق </td><td> صقر </td><td> 353001 </td><td> ويمكن أيضا لوحات غير زراعة الأنسجة المعاملة استخدامها. </td></tr><tr><td> 50 مم قطر الأطباق microwell </td><td> شركة ماتيك </td><td> P50-G-1.5-14F </td><td></td></tr><tr><td> مرشحات Nuclepore غشاء المسار، إحفر </td><td> WHATMAN </td><td> 110405 </td><td> 13 مم، 0.1 مم حجم المسام </td></tr><tr><td> Widefield مضان المجهر </td><td> كارل زايس، الولايات المتحدة الأمريكية </td><td> المراقب محوري Z1 </td><td> أي المجهر مضان (تستقيم، طويمكن استخدام nverted أو ستيريو المجهر تشريح) لمراقبة التعبير GFP في تضخم منخفضة مع كاميرا رقمية المرفقة. </td></tr><tr><td> مبائر المجهر </td><td> لايكا مايكروسيستمز </td><td> TCS SP5 </td><td> المجهر مبائر من الضروري أن نرى هياكل الخلية تفصيلا. ويمكن استخدام أي المجهر متحد البؤر. </td></tr><tr><td> التوقيت-إناث الفئران الحوامل، سلالة CD-1 أو ICR </td><td> مختبرات نهر تشارلز </td><td></td><td> ويتم حصاد الأجنة في يوم 13 (يوم من اكتشاف مع المكونات تسمى اليوم 0). </td></tr><tr><td> مشرط شفرة رقم 11 </td><td> أدوات العلوم الجميلة </td><td> 10011-00 </td><td></td></tr><tr><td> مشرط مقبض # 3 </td><td> أدوات العلوم الجميلة </td><td> 10003-12 </td><td></td></tr><tr><td> دومون # 5 سبائك INOX ملقط، 0.05mm 0.02mm X </td><td> أدوات العلوم الجميلة </td><td> 11252-20 </td><td> مثالية للحصاد الغدد من أجنة </td></tr><tr><td&gt; دومون # 5 سبائك dumostar ملقط، 0.05mm 0.01mm X </td><td> أدوات العلوم الجميلة </td><td> 11295-20 </td><td> مطلوب نصائح لإزالة غرامة اللحمة المتوسطة من ظهارة. ويمكن أيضا أن تستخدم الإبر التنغستن. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> الجدول 2. المعدات المستخدمة في بروتوكول إس إم جي إعادة التركيب. </td></tr></tbody></table>

genetic modification and recombination of salivary gland organ cultures

المتفرعة التشكل يحدث خلال تطوير العديد من الأجهزة، وتحت الفك السفلي الماوس الجنينية الغدة (SMG) هو النموذج الكلاسيكي لدراسة التشكل المتفرعة. في SMG النامية، وهذه العملية تنطوي على خطوات متكررة من برعم الظهارية وتشكيل لاصق، لإعطاء نهاية المطاف إلى نشوء شبكة متفرعة معقدة من القنوات وعنيبات، التي تعمل على إنتاج وتعديل / نقل اللعاب، على التوالي، في تجويف الفم 1 - 3. الغشاء القاعدي الظهارية المرتبطة وجوانب المقصورة الوسيطة، بما في ذلك خلايا اللحمة المتوسطة، وعوامل النمو المصفوفة خارج الخلية، التي تنتجها هذه الخلايا، حاسمة بالنسبة لآلية المتفرعة، على الرغم من كيفية تنسيق الأحداث الخلوية والجزيئية تبقى غير مفهومة 4 . دراسة الآليات الجزيئية القيادة السلف التشكل الظهارية فهمنا لآليات التنموية ورؤية ثاقبة regener ممكننهج الطب اطر النسبية. وتعطلت مثل هذه الدراسات نظرا لعدم وجود طرق فعالة للتلاعب الجيني للظهارة اللعابية. حاليا، يمثل تنبيغ الغدانية الأسلوب الأكثر فعالية لاستهداف الخلايا الظهارية في الغدد في الجسم الحي الكبار 5. ومع ذلك، في إإكسبلنتس الجنينية، اللحمة المتوسطة كثيفة والغشاء القاعدي الخلايا الظهارية المحيطة يعوق الوصول الفيروسية للخلايا الظهارية. إذا تمت إزالة اللحمة المتوسطة، يمكن تقاس باستخدام الظهارة الفيروسات الغدية، واساسيات الظهارية يمكن استئناف المتفرعة التشكل في وجود أو Matrigel laminin 111 6،7. اللحمة المتوسطة خالية النمو رديم الظهارية يتطلب أيضا مكملات إضافية مع عوامل النمو للذوبان ولا ألخص بشكل كامل التشكل المتفرعة كما يحدث في الغدد سليمة 8. نحن هنا وصف الأسلوب الذي يسهل تنبيغ الغدانية من الخلايا الظهارية وثقافة بالنقل هpithelium مع اللحمة المتوسطة المرتبطة بها. بعد تسليخ مجهري للSMGs الجنينية، إزالة اللحمة المتوسطة، والعدوى الفيروسية من ظهارة مع اتش GFP التي تحتوي على، وتبين لنا أن يعيد توحيد ظهارة تلقائيا، مع اللحمة المتوسطة غير مصاب، تلخص سليمة هيكل غدي SMG والمتفرعة التشكل. ويمكن للسكان المعدلة وراثيا الخلايا الظهارية رصدها بسهولة باستخدام معيار أساليب مضان المجهري، إذا fluorescently-الموسومة تستخدم بنيات الغدانية. طريقة إعادة التركيب الأنسجة الموصوفة هنا هو حاليا الأسلوب الأكثر فعالية ويمكن الوصول إليها عن ترنسفكأيشن من الخلايا الظهارية مع ناقل البرية من نوع أو متحولة ضمن بناء الأنسجة 3D المعقدة التي لا تتطلب جيل من الحيوانات المعدلة وراثيا.

ويرد تدفق الخطوات التجريبية الرئيسية في الشكل 1. وتظهر مثال لSMG سليمة، وهي معزولة رديم الظهارية، واللحمة المتوسطة المناظر له في الشكل 2. صور من Brightfield SMGs معاد، التي لا تزال تخضع المتفرعة التشكل عندما تظهر مثقف فيفو السابقين لصحيفة المشار إليها، ...

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures at JoVE.com

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

وهناك تقنية لمعالجة وراثيا داخل الخلايا الظهارية كله<em&gt; خارج الجسم</emيوصف&gt; الجنينية الماوس مثقف الغدد تحت الفك السفلي (SMGs) باستخدام نقل الجينات الفيروسية. هذه الطريقة يستفيد من قدرة فطرية من SMG ظهارة واللحمة المتوسطة لإعادة تجميع تلقائيا بعد الانفصال وإصابة اساسيات الظهارية مع ناقلات الغدانية.

تعديل وإعادة التركيب الوراثي للاللعابية الثقافات الجهاز الغدة

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

genetic-modification-recombination-salivary-gland-organ

Research

JoVE Journal

Biology

12.8K Views.  University at Albany, SUNY. وهناك تقنية لمعالجة وراثيا داخل الخلايا الظهارية كله خارج الجسم الجنينية الماوس مثقف الغدد تحت الفك السفلي (SMGs) باستخدام نقل الجينات الفيروسية. هذه الطريقة يستفيد من قدرة فطرية من SMG ظهارة واللحمة المتوسطة لإعادة تجميع تلقائيا بعد الانفصال وإصابة ا...

Video: Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol demonstrates dissection techniques for removal of the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes. 



The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for vector pathogens like Plasmodium falciparum and the dengue virus. This video demonstrates the dissection techniques for removing the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes.

تشريح الغدد اللعابية والمعي المتوسط ​​من AE. بعوض البعوض

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

PDMS Device Fabrication and Surface Modification

PDMS تصنيع الأجهزة وتعديل السطح

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

طريقة لثقافة الفرخ المبكر فيفو السابقين الأجنة (الثقافة الجديدة)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

الجامعة جبل مزدوجة في الموقع التهجين لافراخ الدجاج في وقت مبكر

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play a key role in the development of a functionally competent T-cell pool. However, the complexity of T-cell development in the thymus in vivo can limit analysis of individual cellular components and particular stages of development. In vitro culture systems provide a readily accessible means to study multiple complex cellular processes. Thymus organ culture systems represent a widely used approach to study intrathymic development of T-cells under defined conditions in vitro. Here we describe a system in which mouse embryonic thymus lobes can be depleted of endogenous haemopoeitic elements by prior organ culture in 2-deoxyguanosine, a compound that is selectively toxic to haemopoeitic cells. As well as providing a readily accessible source of thymic stromal cells to investigate the role of thymic microenvironments in the development and selection of T-cells, this technique also underpins further experimental approaches that include the reconstitution of alymphoid thymus lobes in vitro with defined haemopoietic elements, the transplantation of alymphoid thymuses into recipient mice, and the formation of reaggregate thymus organ cultures. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).

This video demonstrates the dissection and removal of the fetal thymus as well the preparation of ex vivo cultures of 2-dGuo-treated thymus.

إعداد 2 - dGuo المعاملة الثقافات الجهاز الغدة الصعترية

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of saliva into the oral cavity. Serous and mucous acinar cells are the protein and mucous producing factories of the gland respectively, and represent the origin of saliva production. Once synthesised, the various enzymatic and other proteinaceous components of saliva are secreted through a series of ductal cells bearing epithelial-type morphology, until the eventual expulsion of the saliva through one major duct into the cavity of the mouth. The composition of saliva is also modified by the ductal cells during this process.
In the manifestation of diseases such as Sj&ouml;gren's syndrome, and in some clinical situations such as radiotherapy treatment for head and neck cancers, saliva production by the glands is dramatically reduced 1,2. The resulting xerostomia, a subjective feeling of dry mouth, affects not only the ability of the patient to swallow and speak, but also encourages the development of dental caries and can be socially debilitating for the sufferer.
The restoration of saliva production in the above-mentioned clinical conditions therefore represents an unmet clinical need, and as such several studies have demonstrated the regenerative capacity of the salivary glands 3-5. Further to the isolation of stem cell-like populations of cells from various tissues within the mouse and human bodies 6-8, we have shown using the described method that stem cells isolated from mouse salivary glands can be used to rescue saliva production in irradiated salivary glands 9,10. This discovery paves the way for the development of stem cell-based therapies for the treatment of xerostomic conditions in humans, and also for the exploration of the salivary gland as a microenvironment containing cells with multipotent self-renewing capabilities.

An optimized protocol for the isolation of stem cells from the mouse salivary gland is described. The method employs enzymatic and mechanical digestion, and permits isolation of salispheres containing cells with characteristics of stem cells.

عزل الخلايا الجذعية ماوس اللعابية الغدة

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene regulation is complex, but essentially involves modifications to the DNA itself or the proteins with which DNA associates. The predominant epigenetic modification of DNA in mammalian genomes is methylation of cytosine nucleotides (5-MeC). DNA methylation provides instruction to gene expression machinery as to where and when the gene should be expressed. The primary target sequence for DNA methylation in mammals is 5'-CpG-3' dinucleotides (Figure 1). CpG dinucleotides are not uniformly distributed throughout the genome, but are concentrated in regions of repetitive genomic sequences and CpG "islands" commonly associated with gene promoters (Figure 1). DNA methylation patterns are established early in development, modulated during tissue specific differentiation and disrupted in many disease states including cancer. To understand the biological role of DNA methylation and its role in human disease, precise, efficient and reproducible methods are required to detect and quantify individual 5-MeCs.
This protocol for bisulphite conversion is the "gold standard" for DNA methylation analysis and facilitates identification and quantification of DNA methylation at single nucleotide resolution. The chemistry of cytosine deamination by sodium bisulphite involves three steps (Figure 2). (1) Sulphonation: The addition of bisulphite to the 5-6 double bond of cytosine (2) Hydrolic Deamination: hydrolytic deamination of the resulting cytosine-bisulphite derivative to give a uracil-bisulphite derivative (3) Alkali Desulphonation: Removal of the sulphonate group by an alkali treatment, to give uracil. Bisulphite preferentially deaminates cytosine to uracil in single stranded DNA, whereas 5-MeC, is refractory to bisulphite-mediated deamination. Upon PCR amplification, uracil is amplified as thymine while 5-MeC residues remain as cytosines, allowing methylated CpGs to be distinguished from unmethylated CpGs by presence of a cytosine "C" versus thymine "T" residue during sequencing.
DNA modification by bisulphite conversion is a well-established protocol that can be exploited for many methods of DNA methylation analysis. Since the detection of 5-MeC by bisulphite conversion was first demonstrated by Frommer et al.1 and Clark et al.2, methods based around bisulphite conversion of genomic DNA account for the majority of new data on DNA methylation. Different methods of post PCR analysis may be utilized, depending on the degree of specificity and resolution of methylation required. Cloning and sequencing is still the most readily available method that can give single nucleotide resolution for methylation across the DNA molecule.

The gold standard for DNA methylation analysis is genomic sequencing of bisulphite converted DNA. This method takes advantage of the increased sensitivity of cytosine compared with 5-methylcytosine (5-MeC) to bisulphite deamination under acidic conditions. Unmethylated cytosines can be distinguished from methylated cytosines after PCR amplification of the target genomic DNA.

الحامض النووي : Bisulphite تعديل وتحليل

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

الثقافات البديلة لافرة القوة البشرية الجذعية إنتاج الخلية، الصيانة، والتحليل الوراثي

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

DNA Electroporation لل، عزل والتصوير من Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Genetic Modification of Cyanobacteria by Conjugation Using the CyanoGate Modular Cloning Toolkit

Cyanobacteria are a diverse group of prokaryotic photosynthetic organisms that can be genetically modified for the renewable production of useful industrial commodities. Recent advances in synthetic biology have led to development of several cloning toolkits such as CyanoGate, a standardized modular cloning system for building plasmid vectors for subsequent transformation or conjugal transfer into cyanobacteria. Here we outline a detailed method for assembling a self-replicating vector (e.g., carrying a fluorescent marker expression cassette) and conjugal transfer of the vector into the cyanobacterial strains Synechocystis sp. PCC 6803 or Synechococcus elongatus UTEX 2973. In addition, we outline how to characterize the performance of a genetic part (e.g., a promoter) using a plate reader or flow cytometry.

Here, we present a protocol describing how to i) assemble a self-replicating vector using the CyanoGate modular cloning toolkit, ii) introduce the vector into a cyanobacterial host by conjugation, and iii) characterize transgenic cyanobacteria strains using a plate reader or flow cytometry.