Yazarlar S Castorani, AJ Eustis, GA Gambetta, CM Manuck, Z Nesefî, ve A Zedan teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma tarafından finanse edildi: Tarım-Tarımsal Araştırma Servisi Güncel Araştırma Bilgi Sistemi fon ABD (araştırma projesi yok 5306-21220-004-00; Gelişmiş Işık Kaynağı Direktörü Bilim Dairesi, Temel Office tarafından desteklenmektedir. Enerji Bilimler ABD Enerji Bakanlığı Sözleşme kapsamındaki No DE-AC02-05CH11231). ve AJM için Nifa Özel bitkileri araştırma girişimi hibe.

Aşağıda açıklanan Protokol ayrıntıları Gelişmiş Işık Kaynağı 8.3.2 beamline çalışmak için özel olarak yazılmıştır. Uyarlamalar Diğer sinkrotron tesislerinde çalışmaları için gerekli olabilir. Uygun güvenlik ve radyasyondan eğitimi bu tesislerin kullanımı için gereklidir. 1. Canlı Bitkiler için Numune Hazırlama <ol><li> ~ 10 cm çaplı tencere bitkiler büyümek ve ana kök (veya taranacak bitki bölümü) olarak tencereye dikey mümkün ve odaklı olarak ortalanır olduğundan emin olun. Gelişmiş Işık Kaynağı limitleri YRBT enstrüman kafesi fiziksel boyutları yüksekliği ~ 1 m bitkiler yaşar. Bunun bir sonucu olarak, canlı bitkilerin görüntüleme en fideleri / küçük saksılarda yetiştirilen fidanlar gerçekleştirilir. Deney bağlı olarak, farklı toprak tipi toprak nem içeriği (kuraklık deneylerde gibi) kontrol etmek için kullanılabilir, ve esnek sürgünler (örneğin bağ) ile bazı bitkiler için daha uzun olabilir, sürgün dikkatlice tuakrilik tüp içine cked (Şekil 1 ve 2 &#39;ye bakınız) aşağıda tanımlanmıştır. </li><li> Ismarlama bir rijit alüminyum tencerede tutucu canlı saksı bitkileri monte edin. Üst plaka yükseklik kap yükseklikleri aralığına uyum sağlaması için ayarlanabilir. Plakasının üst toprak yüzeyinin üst ve iki kısım plaka merkezine bitki çıkıntı ile hizalamak için tasarlanmıştır. Pota tutucu amacı bitki kök titreşim veya örnek hareket aza indirmek için sıkıca tutulur sağlamaktır. Tarama sırasında örnek hareket aza indirmek önemlidir. </li><li> Bir kez tutucuya monte edilmiş, bir Scholander tarzı basınç odası veya klipsli Tarama öncesinde bitkinin fizyolojik durumunu belirlemek için sırasıyla yaprak porometer,. Kullanılarak kök su potansiyeli veya yaprak transpirasyon ölçmek </li><li> Bitki üzerinde ve alüminyum fabrikasının sahibinin üstüne ince duvarlı akrilik silindiri yerleştirin ve stabilize etmek için kil macun ile yerine sabitleyinörnek (Şekil 2). Üst yeşillik Herhangi titreşim veya hareketinin kök aşağı iletilen ve taranan alanda bitki doku sonuçta görüntü bozulmasına yol açan, hareket etmesine neden olacaktır. Silindir Bitki yaprakları içeren bir tarama sırasında titreşimler neden olacaktır kafesi ekipman diğer parçaları sürtünmekten bitki yaprakları önlemek için kullanılır. Ek plastik wrap, kağıt havlu ve bant daha (Şekil 4 örnek hareketiyle ilişkili sorunlar bakınız) bitki parçaları titreşim ve hareketleri en aza indirmek için kullanılmalıdır. Işlevi gerçekleştirmek için yeterli sertliğe sürdürürken x-ışını soğurma (belirli bir pozlama zamanda görüntü kalitesini düşürebilir olan) azaltmak için, içeren silindir mümkün olduğunca ince duvarlar gibi olmalıdır. </li><li> Hava yataklı aşamasına özel pota tutucu takın ve x-ray kaynağı ve görüntü sensörü ve kamera ekipmanları arasında yer içine (vida) kilitleyin. Positiörnek rotasyon esnasında görüş alanında kalmasını sağlamak için manyetik ayna tabanı mevcuttur ve merkezi olarak dikey gövde üzerinde. </li></ol> 2. Taze, Eksize Bitki Doku için Numune Hazırlama <ol><li> Taze bitki materyali, genellikle sapları veya sapı, canlı bir bitkiden derhal kaldırılmasından sonra taranabilir. Deneyin amacı damarları içinde ksilem ağ, su tüm görselleştirmek için ise tahliye olur ve hava ile değiştirilmesi gerekir. Bunu yapmak için, bir Scholander tarzı basınç odasında numune monte ve yaklaşık 5 dakika boyunca düşük basınç (&lt;0.05 MPa) örneklem yoluyla basınçlı hava veya azot itin. Türlere damar ağı boşaltılması için gerekli zaman da farklı olacaktır. Niyet taze bir jilet kullanarak bitki ardından taze bitki dokusunda emboli oluşumu ölçüde, tüketim örnekleri değerlendirmek ve su altında kesim yapmak demektir. </li><li> Pr Parafilm bir tabakadaki örnek sarıntarama sırasında olay kurutulma. </li><li> Hava yataklı aşamasında içine vidalanan bir metal plakaya sabitlenmiş bir matkap-chuck içinde örnek monte edin. Merkezi yönlendirmek ve dikey olarak örnek sağlamak için yukarıda tarif edilen örnek görüş alanı içinde kalır. </li></ol> 3. Kurutulmuş Woody Dokular için Numune Hazırlama <ol><li> Optimal doku örneği görüntüleme ve görüntü kontrastı için, yavaş yavaş Tüm odunsu doku örneği kurutmak için gereklidir. Yaklaşık uzunluğu 6 cm örnekleri kesin. Hedeflenmiş tarama bölgesi olarak düz mümkün numunelerde seçin ve ≤ 1 cm çapındadır. </li><li> Yavaş yavaş dokusunun herhangi bir çatlama ya da bölme neden olmadan örnek kurutmak için düşük bir sıcaklıkta bir kurutma fırını içine odunsu doku numunesi yerleştirin. Bu süreç türleri ve dokular arasındaki farklılık muhtemeldir. Odunsu saplar için, 40 ° C fırın içinde 12 saat, genellikle önemli cha neden olmadan mükemmel kontrast sağlamak için yeterlidirkök fiziksel yapısında nges (Şekil 3&#39;te gösterilmiştir hızlı kuruma ile ilgili sorunları görmek). </li><li> Bazı durumlarda, taramalı elektron mikroskobu ile daha sonraki disseksiyon ve görüntüleme YRBT görüntü belirli noktalara yönelik olabilir; bu numune içinde bir itibari işaretleyici sahip olmak arzu edilmektedir. Bunu yapmak için, tutturmak bir metal veya cam boncuk veya Parafilm kullanarak kök dışına tel. Başka bir yöntem, bir silikon reçinesi (örneğin, RTV-141, Bluestar&#39;ı silikonlar, Edison, NJ) (Brodersen ve diğerleri, 2010 yılında bkz. örnekler), tek bir ksilem kanal içine enjekte edilebilir. Kullanılmasıdır Bir kere sertleşti, silikon reçine örnek açıkça görülebilen ve kolayca diğer hava dolu gemiler ayırt olduğunu. Tam örnek belirli bölgelerine bulmak için bu işaretleyici. </li><li> Yukarıda tarif edildiği gibi mandren ve merkezi örnek monte edin. </li></ol> 4. Yaprak Tissu için Numune Hazırlamaİki Boyutlu (2D) Röntgen için e <ol><li> Neredeyse gerçek zamanlı olarak yapraklarda damar içeriğini görselleştirmek için, yapraklar bir diş röntgen benzer bir 2D grafisi, üretmek için taranabilir. Ince akrilik plastik iki yaprak arasında yaprak takın ve klipleri ile kenarları sabitleyin. Sonra bir post-tutucu sistem ve pozisyon görüntüleme sistemi ve x-ışını kaynağının yanında optik breadboard için monte örneği ekleyin. </li></ol> 5. 8.3.2 Hutch Örnek Tarama <ol><li> Uygulamanız için en iyi çalışacak büyütme karar verin. ALS beamline 8.3.2 2x, 5x ve 10x büyütme ile lensler ile taramak için yeteneğine sahiptir. Sırasıyla görüntü piksel 4,5 boyutları, 2,25 ve 0,9 mikron, bu sonuç. Görüş alanında artan büyütme ile azaldıkça büyütme bağlı, örnek, uygun büyüklükte olmalıdır. Kamera ve lens seçimi için ayrıntıları ve Tablo 1&#39;de çıkan görüntü parametrelerini bakın.</li></ol><table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="2"> PCO.4000 (4008x2672) </td><td colspan="2"> PCO.Edge (2560x2160) (Optique Peter) </td></tr><tr><td> Lens </td><td> piksel (mikron) </td><td> görüş alanı (mm) </td><td> piksel (mikron) </td><td> görüş alanı (mm) </td></tr><tr><td> 10x </td><td> 0.9 </td><td> 3.6 </td><td> 0.65 (0.69) </td><td> 1.7 (1.7) </td></tr><tr><td> 5x (4x) </td><td> 1.8 </td><td> 7.2 </td><td> 1.3 (1.72) </td><td> 3.3 (4.4) </td></tr><tr><td> 2x </td><td> 4.5 </td><td> 18 </td><td> 3.25 (3.44) </td><td> 8.3 (8.8) </td></tr><tr><td> 1x </td><td> 9 </td><td> 36 </td><td> 6,5 (-) </td><td> 16.6 (-) </td></tr></tbody></table> Mevcut ilişkin Tablo 1. Ayrıntılarıkameralar ve ALS 8.3.2 de lensler. <ol start="2"><li> X-ışını enerjisi 15 keV ayarlayın. Bu (Brodersen ve ark. 2010, 2011, 2012a, b bakınız) bir çok bitki uygulamaları için mükemmel bir görüntü kontrast sağlamak için gösterilmiştir. Pozlama kez genel olarak 100 ile 1000 milisaniye arasında numunenin kalınlığı ve yoğunluğu (ve dolayısıyla büyütme kullanılan) aralığına bağlıdır. Uzun pozlama süreleri (sürece dedektör piksel doymuş değil gibi) genellikle gürültü oranı yüksek sinyal yol, ancak artan kez tarama pahasına olacaktır. </li><li> Uygulamanız için uygun olan bir açısal artış seçin. Numuneler bir tarama sırasında 180 ° döndürülür ve dönüşü sırasında çekilen görüntü sayısı tarama aralığının dataset, uzunluk, ve nihai görüntü kalitesi boyutu üzerinde önemli bir etkisi olabilir, ancak genellikle kalite döner bir azalma söz konusu. Tipik taramalarda tarama başına 721 görüntüler elde 0.25 ° aralıklarla yapılmaktadır. Artımsal Azalanince ayrıntıları görselleştirmek için daha iyi görüntüler 0.125 ° sonuçlarına t, ama böylece verimi 1.440 görüntüler ve çok daha büyük bir veri kümesi (faiz tipik bir bölge için, bu demektir ~ verilerin 10-30 GB vs 5 GB). Ancak, gürültü oranı sinyal çoğu geliştirilmiş ve artan tarama süresi ve veri boyutu hem değer alır. Tarama sırasında deforme / küçültmek için olası Kuru sapları zarar vermeden uzun aralıklarla (küçük açısal artış) tabi olabilir. Biyolojik prosesler (örneğin emboli onarım) kısa zaman ölçeklerinde gerçekleşecek görüntüleme canlı bitkiler, daha kısa tarama aralıkları yürüttüğünü zaman bu x-ışını radyasyon potansiyel yıkıcı etkilerini sınırlamak amacıyla tercih edilir doku rağmen bu bir potansiyel kaybı geliyor görüntü kalitesi. Daha kısa aralıklarla tarama görüntüleri yakalanan sırasında numune sürekli döner bu süre boyunca sürekli Tomografi ayarı kullanılarak elde edilebilir. </li><li> Her bir tarama için, &quot;parlak alan&quot; ve &quot;karanlık alan&quot; görüntüler correcte olmalıdırd. Aydınlık alan görüntüler ışın örnek olmadan görüntüleri vardır. Bunlar genellikle yatay olarak örnek çevirerek numune tarama önce ve sonra toplanır. Koyu alanlar bu enstantene kameraya x-ışınları ile gösterir sinyal miktarını ölçülen x-ışını kapatarak toplanır. </li></ol> 6. Veri İşleme <ol><li> Bir veri işleme bilgisayar satın bilgisayardan dosya sunucusuna ihraç edildi &quot;ham&quot; 2D. TIF görüntülerini, aktarın. Bilgisayar yeterli RAM varsa, verileri bir sözde &quot;RAM Drive&quot; (RAM bir kısmı bilgisayarda bir sabit sürücü olarak görünür) kopyalanabilir. Bu şekilde yazılımın bir katı hal sürücü veya flash bellek ile karşılaştırıldığında nispeten yavaş bir dönen sabit disk, erişmek zorunda değildir. Bu adım önemli veri setlerini işlemek için gereken süreyi azaltır. </li><li> Görüntüleri bir yüzde iletim ölçekli dönüştürülmesi gerekir. Beamline 8.3.2 özel bir ba varckground normalleşme plug-in serbestçe kullanılabilir yazılım paketleri ImageJ veya Fiji (ile indirilebilir ve kullanılabilir <a href="http://fiji.sc/" target="_blank">http://fiji.sc/</a> ). Bu görüntülerden karanlık sayıları çıkarır ve yüzde iletim göstermek görüntüleri elde etmek için parlak alanlar tarafından örnek resimler normalleştirir. Ahtapot yazılım paketi (içine normalize görüntüleri yükleyin <a href="http://www.inct.be/en/software/octopus" target="_blank">http://www.inct.be/en/software/octopus</a> ) ve (Ring kaldırılması görüntüleri Normale belirlenen işlem adımları kullanarak 2D ham. TIF dosyalarını 3D dataset &quot;yeniden&quot; , Sinogram oluşturma, Paralel ışın rekonstrüksiyon). Bu süreç daha sonra. TIF enine (kesit) &quot;vokseller&quot; (hacimsel piksel elemanları), x-ışını doğrusal absorpsiyon katsayısı temsil eden bir x, y, z koordinat ve yoğunluk değerleri ile her oluşan görüntüleri bir dizi verir. </li></ol> 7. Görüntüleme <ol><li> Visualiyazılım paketleri çeşitli biri görüntülerin yığın ze. SORULAR (örn. Drishti, <a href="http://anusf.anu.edu.au/Vizlab/drishti/index.shtml" target="_blank">http://anusf.anu.edu.au/Vizlab/drishti/index.shtml</a> ) birimler ya da bireysel veya görüntü yığınlarının (örneğin ImageJ veya FIJI) görselleştirmek için kullanılabilir. Diğer yazılım paketleri 3D görselleştirilmesi için de kullanılabilir. Bizim araştırma grubu Avizo yazılım paketi (kullanır <a href="http://www.vsg3d.com/avizo/overview" target="_blank">http://www.vsg3d.com/avizo/overview</a> ), ancak böyle Amira (diğerleri gibi <a href="http://www.amira.com/ " target="_blank">http://www.amira.com/</a> ) ve VGStudioMax ( <a href="http://www.volumegraphics.com/" target="_blank">http://www. volumegraphics.com /</a> ) da yaygın olarak kullanılmaktadır. </li><li> Sistem belleğine veri setleri yükleyin ve boyuna sanal enine, veya radyal dilim yönlerde örnek görüntüler. Çünkü dataset, sanal dilim 3D özelliklerinin sampl yoluylae ilgi bölgeleri, geleneksel seri ışık mikroskobu (ayrıntılı örnekler için 1-3 Filmler bakın) üzerinde önemli bir gelişme ile hizalamak için herhangi bir düzlemde döndürülebilir. </li><li> 3D gerektiği gibi örnek görselleştirmek için, &quot;segment&quot; çevreleyen dokudan Lümen ya da diğer yapıların ayırmak için Avizo yarı-otomatik ve manuel rutinleri kullanarak çeşitli örnek. Segmentasyon nedenle ayrılması veya ayrı bölgede içine segmentlere, ilgi nesneler arasındaki sınırları tanımlayan ifade eder. 3D Rendering hacimleri görselleştirme yazılım tarafından yapılır. Bunu yapmak için bir yöntem, bir hacim içinde her bir nokta ışık yayma ve emme varsayılmıştır doğrudan ses işleme olur; emisyon ve emilim miktarı ve renk belirli bir yönde bir &quot;renk haritası&quot;, ve sonuçta ortaya çıkan projeksiyon kullanılarak tanımlanır edilebilir ekranda görüntülenir. Alternatif olarak, parçalı sınırları temsil eden bir tel kafes veya 3D mesh yüzey t 3D modeli göstermek için inşa edilmiştirilgi o yapısı. 3D mesh poligonal öğelerden oluşur ve elemanlarının toplam sayısı yapısı üreme sadakat ve ilişkili veri dosyasının boyutu (daha fazla eleman yani yüksek sadakat ancak daha büyük dosya boyutuna yol açar) hem de etkileyecektir. Görüntü işleme modülleri çeşitli görüntü parlaklığı, kontrastı, şeffaflık, gürültü azaltma, vb volume rendering çıkışların yanı sıra denetim kontrol görselleştirme yazılımı içinde mevcuttur </li></ol> 8. Niceleme <ol><li> Segment sağlandıktan sonra, bu örneğin, su, hava, vb hacim, uzunluk, genişlik varlığında veya yokluğunda, hedef bitki yapıları ya da işlevsel değişiklikler ölçmek mümkündür, Brodersen ve diğ. (2010) ölçmek için kullanılan yazılım Avizo dedikodu doldurma damarlarının içine su damlacıkları hacmi değişimi. Bitkiler bir zaman-la oluşturarak dört ile sekiz saat boyunca her 30 dakikada tarandıGeminin pse dizisi dolumu. Her tarama hacimleri arttıkça bireysel damlacıklar zamanla ölçüldü Avizo, içine yeniden ve yüklendi. </li></ol>

<ol>
	<li>Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Matthews, M. A., Shackel, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+embolism+repair+in+xylem:+in+vivo+visualizations+using+high+resolution+computed+tomography.">The dynamics of embolism repair in xylem: in vivo visualizations using high resolution computed tomography.</a> Plant Physiology. 154, 1088-1095 (2010).</li><li>Brodersen, C. R., Lee, E., Choat, B., Jansen, S., Phillips, R. J., Shackel, K. A., McElrone, A. J., Matthews, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+analysis+of+3D+xylem+networks+using+high+resolution+computed+tomography+(HRCT).">Automated analysis of 3D xylem networks using high resolution computed tomography (HRCT).</a> New Phytologist. 191 (4), 1168-1179 (2011).</li><li>Brodersen, C., Roark, L., Pittermann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiological+implications+of+primary+xylem+organization+in+two+ferns.">The physiological implications of primary xylem organization in two ferns.</a> Plant, Cell &amp; Environment. , (2012).</li><li>Brodersen, C., Choat, B., Chatelet, D., Shackel, K. A., Matthews, M. A., McElrone, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conductive+xylem+bridges+contribute+differentially+to+radial+connectivity+in+grapevine+stems+(Vitis+vinifera+and+V.+arizonica).">Conductive xylem bridges contribute differentially to radial connectivity in grapevine stems (Vitis vinifera and V. arizonica).</a> American Journal of Botany. , (2012).</li><li>McElrone, A. J., Jackson, S., Habdas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydraulic+disruption+and+passive+migration+by+a+bacterial+pathogen+in+oak+tree+xylem.">Hydraulic disruption and passive migration by a bacterial pathogen in oak tree xylem.</a> Journal of Experimental Botany. 59, 2649-2657 (2008).</li><li>McElrone, A. J., Grant, J., Kluepfel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+ethylene-induced+tyloses+in+canopy+hydraulic+failure+of+mature+walnut+trees+afflicted+with+apoplexy+disorder.">The role of ethylene-induced tyloses in canopy hydraulic failure of mature walnut trees afflicted with apoplexy disorder.</a> Tree Physiology. 30, 761-772 (2010).</li><li>Tyree, M., Sperry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vulnerability+of+xylem+to+cavitation+and+embolism.">Vulnerability of xylem to cavitation and embolism.</a> Annual Review of Plant Biology. 40 (1), 19-36 (1989).</li><li>Tyree, M., Zimmermann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Xylem structure and the ascent of sap. , (2002).</li><li>Holbrook, N. M., Zwienieck, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Vascular Transport in Plants. , (2005).</li><li>Mayo, S. C., Chen, F., Evans, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micron-scale+3D+imaging+of+wood+and+plant+microstructure+using+high-resolution+x-ray+phase-contrast+microtomography.">Micron-scale 3D imaging of wood and plant microstructure using high-resolution x-ray phase-contrast microtomography.</a> Journal of Structural Biology. 171, 182-188 (2010).</li><li>Mannes, D., Marone, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+areas+of+synchrotron+radiation+tomographic+microscopy+for+wood+research.">Application areas of synchrotron radiation tomographic microscopy for wood research.</a> Wood Science and Technology. 44, 67-84 (2010).</li><li>Maeda, E., Miyake, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-destructive+tracing+with+an+x-ray+micro+ct+scanner+of+vascular+bundles+in+the+ear+axes+at+the+base+of+the+lower+level+rachis-branches+in+japonica+type+rice+(oryza+sativa.">A non-destructive tracing with an x-ray micro ct scanner of vascular bundles in the ear axes at the base of the lower level rachis-branches in japonica type rice (oryza sativa.</a> Japanese Journal of Crop Science. 78 (3), 382-386 (2009).</li><li>Steppe, K., Cnudde, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+x-ray+computed+microtomography+for+non-invasive+determination+of+wood+anatomical+characteristics.">Use of x-ray computed microtomography for non-invasive determination of wood anatomical characteristics.</a> Journal of Structural Biology. 148 (1), 11-21 (2004).</li><li>Zimmermann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dicotyledonous+wood+structure+(made+apparent+by+sequential+sections).">Dicotyledonous wood structure (made apparent by sequential sections).</a> Encyclopaedia Cinematographica. , (1971).</li><li>Lee, E. F., Brodersen, C. R., McElrone, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+HRCT-derived+xylem+network+reveals+reverse+flow+in+some+vessels.">Analysis of HRCT-derived xylem network reveals reverse flow in some vessels.</a> , (2013).</li><li>McDowell, N. G., Pockman, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+plant+survival+and+mortality+during+drought:+why+do+some+plants+survive+while+others+succumb.">Mechanisms of plant survival and mortality during drought: why do some plants survive while others succumb.</a> New Phytologist. 178, 719-739 (2008).</li><li>McElrone, A. J., Brodersen, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrifuge+technique+consistently+overestimates+vulnerability+to+water-stress+induced+cavitation+in+grapevines+as+confirmed+with+high+resolution+computed+tomography.">Centrifuge technique consistently overestimates vulnerability to water-stress induced cavitation in grapevines as confirmed with high resolution computed tomography.</a> New Phytologist. , (2012).</li><li>Lee, K., Avondo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+plant+development+and+gene+expression+in+three+dimensions+using+optical+projection+tomography.">Visualizing plant development and gene expression in three dimensions using optical projection tomography.</a> Plant Cell. 18, 2145-2156 (2006).</li><li>Truernit, E., Bauby, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+whole-mount+imaging+of+three-dimensional+tissue+organization+and+gene+expression+enables+the+study+of+phloem+development+and+structure+in+Arabidopsis.">High-resolution whole-mount imaging of three-dimensional tissue organization and gene expression enables the study of phloem development and structure in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 20, 1494-1503 (2008).</li><li>Jahnke, S., Menzel, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+MRI-PET+dissects+dynamic+changes+in+plant+structures+and+functions.">Combined MRI-PET dissects dynamic changes in plant structures and functions.</a> The Plant Journal. 59, 634-644 (2009).</li><li>Iyer-Pascuzzi, A. S., Symonova, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+analysis+platform+for+automatic+phenotyping+and+trait+ranking+of+plant+root+systems.">Imaging and analysis platform for automatic phenotyping and trait ranking of plant root systems.</a> , (2010).</li></ol>

Biz ifşa etmek başka bir şey var.

Synchotron YRBT inanılmaz ayrıntılı bitki damar iç işleyişini keşfetmek için güçlü, tahribatsız aracı ile bitki biyologlar sağlar. Bu bağlantı ölçüde yaymak vasküler patojenler ve emboli yeteneğini değiştirebilir - Bu teknoloji, farklı açılardan farklı asma türlerinin (. Basınında Brodersen ark 2012b,) olarak ksilem ağ bağlantısı değiştirmek dedikodu ksilem önceden tanımlanmamış anatomik yapıları tanımlamak için son zamanlarda kullanılmaya başlanmıştır ...

Birbirine bağlı kanallar, fiberler ve yaşam, metabolik olarak aktif hücrelerden oluşan bir ağ - Su bitki köklerinden ksilem denilen bir vasküler doku yapraklara taşınır. Bitki ksilem Ulaştırma işlevi fotosentez için yaprakları, büyüme ve sonuçta yaşam için besin ve su temin korunması gerekir. Ksilem ağ patojen organizmalar tarafından tehlikeye olduğunda Ksilem kanallarında Su taşıma bozulabilmektedir. Bu tür enfeksiyonların bitkiler yanıt olarak sık sık (iken, 2010 örneğin McElrone ark 2008) patojenin yayılma yalıtmak için bir araç olarak jöleler, sakızlar ve tyloses üretmek. Kuraklık stresi de ksilem su taşıma sınırlayabilirsiniz. Bitkiler uzun süreli kuraklık sırasında su kaybetmek gibi, gerginlik ksilem özsuyu oluşturur. Gerilim altında Su (yani belli bir eşikte gerginlik ksilem kanallarında bulunan su sütunları kavitasyon için yeterince büyük olur) metastabilite. Kavitasyon oluşur, sonra bir gaz kabarcığı (emboli) koşul oluşturmak ve doldurmakuit, etkili engelleme su hareketi (Tyree ve Sperry 1989), derin deniz dalgıç vurgun (yani &quot;kıvıran&quot;) benzer bir fenomen. Bu konuda (. Tyree &amp; Zimmermann, 2002; Holbrook ve ark, 2005) tarihsel ve çağdaş edebiyatının bir büyük beden gösterdiği optimum bitki işlev için ksilem su taşıma önemine rağmen, halen mevcuttur ksilem ağların yönleri hala vardır . Çeşitli araştırma gruplarının son zamanlarda ince odun anatomisi ayrıntıları ve vasküler doku (örneğin Mayo ark değerlendirmek için yüksek çözünürlüklü x-ışını bilgisayarlı mikro tomografi (YRBT) kullanarak başladık; 2010, 2008; Mannes ark 2010;. Brodersen ark 2010. , 2011, 2012a, b; Maeda ve Miyake, 2009; Bozkır ve ark 2004).. YRBT katı nesne iç özellikleri görselleştirmek ve 3-D yapısal özellikleri üzerine sayısal bilgi elde etmek için kullanılan bir dönüşlü bir tekniktir. YRBThatta yüksek yoğunluklu nesneler için, boyutu bir mikrona kadar küçük ayrıntıları çözmek için onun yetenek geleneksel tıbbi CAT-tarama farklıdır. Sinkrotron YRBT teknolojisindeki son gelişmeler, yeterince böylece bitkinin damar ağları ve intervessel bağlantıların görülebilmesi gürültü oranı görüntü çözünürlüğü ve sinyal geliştirilmiş 3D koordinatları atanır ve hidrolik model simülasyonları için ihraç var. Brodersen ark. (2011) son zamanlarda otomatik geleneksel anatomik şekli (seri yani bir mikrotom ile kesit ile her zamankinden mümkün olandan çok daha yüksek çözünürlükte ksilem ağ veri ayıklayan bir Fortran modeli ile sinkrotron YRBT tarafından üretilen 3D rekonstrüksiyon birleştirerek bu tekniği ileri ışık mikroskobu ile görüntü yakalama, örneğin Zimmermann 1971). Bu çalışma aynı zamanda ksilem sisteminin hidrolik modelleri optimize etmek için kullanılır ve taşıma benzersiz özellikleri (bazı ve yani ters akım tespit edilmiştirtepe terleme dönemlerinde ssels) (Lee ve ark., inceleme). Sinkrotron YRBT şimdi ksilem işlevselliği, kavitasyon yatkınlık ve embolize kanallar onarmak için bitki yeteneğini görselleştirmek için kullanılabilir. Embolize kanallarında yeniden kurmak akışı uyulmaması hidrolik kapasitesi, sınırları fotosentez, ve aşırı durumlarda bitki ölümüne yol açar (McDowell ve ark. 2008) azaltır. Bitkiler, komşu fonksiyonel borular bağlanırken çukurları ile tıkanmalar çevresindeki su aktarma tarafından ve kayıp hidrolik kapasite yerine yeni ksilem büyüyerek embolisi ile başa çıkabilir. Bazı bitkiler su sütunları bozulmaları tamir yeteneğine sahip, ancak gerilim altında ksilem bu sürecin detayları yıllardır belirsiz kalmıştır. Brodersen ark. (2010) son zamanlarda görüntülendi ve YRBT kullanarak canlı grapevines dolum süreci sayılabilir. Dolumu Başarılı damar XYL çevredeki yaşayan hücrelerin su akını bağlıydıOnları tek tek su damlacıkları zamanla genişledi kanalları, dolu kap ve sürüklenen gaz dağılmasına zorladı. Bu onarımlar kontrol tehlikeye ksilem damarları ve mekanizmaları tamir Farklı bitkilerin kapasite şu anda araştırılmaktadır. ALS tesis beamline 8.3.2 Açıklaması Bugüne kadar yaptığımız çalışmalar Lawrence Berkeley Ulusal Laboratuvarı (Berkeley CA ABD) İleri Işık Source Sabit X-ray Mikro Tomografi beamline 8.3.2 üzerinde yürütülmüştür. Bitki örnekleri 11.5 KeV bir kritik enerji kısmındaki Gelişmiş Işık Kaynağı elektron deposunun halka işletim içindeki dipol 6 Tesla süperiletken bend mıknatıs tarafından üretilen x-ray kaynağı bir kurşun astarlı baraka bulunan 20 m, yerleştirilir. Uç istasyonunun şematik Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. X-ışınları 40x bir ışın boyutu ~ 4.6 mm hutch girin ve motorlu döner sahne üzerine monte edilmiş numune geçer.iletilen x-ışınları resim koleksiyonu için ccd üzerine lensler yoluyla geçirilen görünür ışık için x-ışınları dönüştürmek kristal sintilatör (sık kullanılan iki malzeme Luag ya CdWO 4 olan) çarpar. Kamera, sintilatör ve optik örnek-to-sintilatör mesafe faz kontrast görüntüleme için optimize edilmesini sağlar raylar üzerinde bir ışık geçirmeyen kutusunda bulunan. Tüm numuneler, bu da numune konumlandırma için yatay ve dikey çeviri aşamaları üzerine monte edilmiş 10 cm çapında döner sahne üzerine monte edilir. Özel yapılmış bir bitki pota tutucu ve bir akrilik tüp içinde bulunan yeşillik monte kök sistemi ile bir canlı bir bitkinin örnek, Şekil 2&#39;de görülebilir. Tipik pozlama süreleri sn 10-18 KeV kullanılarak 0,1-1&#39;den uzanabilir ve tarama süreleri belirli bir örnek için optimize ayarlarına bağlı olarak 5-40 dakika arasında değişmektedir. Uzun boylu numuneler için (bitki ksilem ağların tipik), veri taramaları olabilir~ 10 cm maksimum örnek yüksekliği boyunca kesintisiz seri kesitler sağlayarak, otomatik olarak kontrol edilir, farklı yüksekliklerde numune ile ölçüm tekrarlayarak döşeli. 4,5 mikron çözünürlükte görüntüleme dikey olarak neredeyse mükemmel örnekleri için ~ 1 cm maksimum örnek genişliği. Veri oluşturma ve işleme aşağıda listelenen protokolü kullanılarak tamamlanır. Çünkü hava ve su arasında x-ışını zayıflama fark, mükemmel görüntü kontrast tıbbi BT sistem tipik kontrast çözeltilerinin kullanımı olmaksızın bitki elde edilebilir. Hava dolu damar lümeni sulu bitkiler çevreleyen su dolu dokusundan kolaylıkla ayırt edilebilir.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Material Name/Equipment </td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>See specifics listed above regarding equipment at the Advanced Light Source beamline 8.3.2</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

using high resolution computed tomography to visualize the three dimensional structure and function of plant vasculature

Yüksek çözünürlüklü x-ışını bilgisayarlı tomografi (YRBT) şimdi (örneğin Brodersen ark üç boyutlu (3D) bitki ksilem ağ yapısı ve fonksiyonu değerlendirmek için kullanılan alt-mikron çözünürlük kapasitesi olan tahribatsız tanısal görüntüleme tekniğidir . 2010; 2011; 2012a, b). YRBT görüntüleme tıbbi BT sistemleri ile aynı prensipleri, ancak daha yüksek uzaysal çözünürlüğü yüksek yoğunluklu Sinkrotron X-ışını kaynağı sonuçlarına dayanan ve görüntü alma süresi azalmıştır. Burada, Avizo yazılımı (VSG A.Ş., Burlington, ABD MA) ile birlikte YRBT (Gelişmiş Işık Kaynağı-LBNL Berkeley, CA, USA yapılan) bitki ksilem keşfetmek için nasıl kullanıldığını sinkrotron tabanlı ayrıntılı göstermek doku ve canlı bitkiler çıkarıldı. Bu yeni görüntüleme aracı, kullanıcıların geleneksel statik, 2D ışık veya elektron mikroskop ve herhangi bir düzlemde sanal seri bölümleri kullanarak çalışma örnekleri ötesine taşımak için izin verir. Herhangi bir yönelim c dilimleri sonsuz sayıdaBir aynı örnek, geleneksel mikroskop yöntemleri kullanarak fiziksel olarak imkansız bir özellik üzerinde yapılabilir. Sonuçlar YRBT otsu ve odunsu bitki türleri ve bitki organları bir dizi (örneğin yaprak, yaprak sapı, gövde, gövdeler, kökler) hem de uygulanabilir olduğunu göstermektedir. Burada sunulan rakamlar temsili bitki vasküler anatominin bir dizi ve sahil sekoya (Sequoia sempervirens), ceviz (Juglans spp.), Meşe (Quercus spp.) Ve akça (tarar dahil YRBT gerçekleştirmede, çıkarılan ayrıntı türü hem göstermeye yardımcı Acer spp.) ağaç ayçiçeği (Helianthus annuus), üzüm (Vitis spp.), eğrelti otları ve (Pteridium aquilinum ve Woodwardia fimbriata) fidan. Odunsu türler eksize ve kurutulmuş örnekleri taramak ve genellikle iyi görüntüyü elde etmek için en kolay olanlardır. Ancak, son gelişmeler (yani daha hızlı taramalar ve örnek stabilizasyonu) bunu poss yaptıkyeşil dokularda (örneğin petioles) ve yaşayan bitkiler bu görselleştirme tekniği kullanmak ible. Vesilesiyle sulu yeşil bitki dokularının bazı büzülme bu konular açıklanmıştır önlemek için bulanıklık ve yöntemleri görüntüleri neden olur. YRBT ile bu son gelişmeler bitki vasküler fonksiyon içine umut verici yeni bakış açıları sağlayacaktır.

Synchotron YRBT taramaları başarıyla bitki doku ve beamline 8.3.2 (Şekil 5) kullanarak türlerin geniş bir yelpazede üzerinde uygulanan edilmiştir ve 3D görülmemiş çözünürlükte bitkinin ksilem yapısı ve fonksiyonu yeni bir anlayış getirmiştir. 3D rekonstrüksiyon tarafından sağlanan görselleştirme ve keşif yetenekleri (Şekiller 6-8 gösterildiği; 1-3 ve Filmler) eksize örnekleri hem ksilem ağlarla yapıların konumu ve yönelimi kesin olarak belirlenmesi iç...

Watch this Scientific Journal Video about Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature at JoVE.com

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature | Biology | Video

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

Yüksek çözünürlüklü x-ışını bilgisayarlı tomografi (YRBT) 3D bitki damar yapısını ve işlevini incelemek için kullanılabilecek bir tahribatsız tanısal görüntüleme tekniğidir. Biz bitki dokuları ve türlerin geniş bir yelpazesinde ksilem ağlarının keşif nasıl kolaylaştırdığını YRBT göstermektedir.

Bitki damarları ve Üç Boyutlu Yapı ve Fonksiyon Visualize&#39;a Yüksek Çözünürlüklü Bilgisayarlı Tomografi Kullanımı

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

using-high-resolution-computed-tomography-to-visualize-three

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Plant Biology

Plant Structure, Growth, and Nutrition

SCIENTISTS IN ACTION

20.9K Görüntüleme.  U.S. Department of Agriculture. Yüksek çözünürlüklü x-ışını bilgisayarlı tomografi (YRBT) 3D bitki damar yapısını ve işlevini incelemek için kullanılabilecek bir tahribatsız tanısal görüntüleme tekniğidir. Biz bitki dokuları ve türlerin geniş bir yelpazesinde ksilem ağlarının keşif nasıl kolaylaştırdığını YRBT göstermektedir.

Video: Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

Hi-C: genomların Üç boyutlu Mimari Eğitim Bir Yöntem.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Biyoloji

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

Saf Yabanitip ve Mutant CFTR Protein Fonksiyonel Sulandırma ve Kanal Aktivite Ölçümleri

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

Kristalin Selüloz Birikimin Yüksek Çözünürlüklü Niceleme<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Kökler Doku spesifik Hücre Duvarı Değişiklikler Monitör

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in biological samples (intact and permeabilized cells, tissues or isolated mitochondria). The high-resolution oxygraph device is equipped with two chambers and uses polarographic oxygen sensors to measure oxygen concentration and calculate oxygen consumption within each chamber. Oxygen consumption rates are calculated using software and expressed as picomoles per second per number of cells. Each high-resolution oxygraph chamber contains a stopper with injection ports, which makes it ideal for substrate-uncoupler-inhibitor titrations or detergent titration protocols for determining effective and optimum concentrations for plasma membrane permeabilization. The technique can be applied to measure respiration in a wide range of cell types and also provides information on mitochondrial quality and integrity, and maximal mitochondrial respiratory electron transport system capacity.

High-resolution respirometry is used to determine mitochondrial oxygen consumption. This is a straightforward technique to determine mitochondrial respiratory chain complexes&#39; (I-IV) respiratory rates, maximal mitochondrial electron transport system capacity, and mitochondrial outer membrane integrity.

Yüksek çözünürlüklü Solunum permeabilize ve bozulmamış Hücreleri Mitokondrial fonksiyonu değerlendirmek için

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role in the body by controlling blood glucose levels through insulin secretion in response to elevated glucose concentrations. Insulin secretion is controlled by glucose metabolism and mitochondrial respiration. Therefore, measuring intact beta cell respiration is essential to be able to improve beta cell function as a treatment for diabetes. Using intact 832/13 INS-1 derived beta cells we can measure the effect of increasing glucose concentration on cellular respiration. This protocol allows us to measure beta cell respiration in the presence or absence of various compounds, allowing one to determine the effect of given compounds on intact cell respiration. Here we demonstrate the effect of two naturally occurring compounds, monomeric epicatechin and curcumin, on beta cell respiration under the presence of low (2.5 mM) or high glucose (16.7 mM) conditions. This technique can be used to determine the effect of various compounds on intact beta cell respiration in the presence of differing glucose concentrations.

The goal of this protocol is to measure the effect of glucose-mediated changes to mitochondrial respiration in the presence of natural compounds on intact 832/13 beta cells using high-resolution respirometry.

Doğal bileşikler varlığında olduğu gibi Beta hücrelerinin mitokondriyal işlev ölçmek için yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.

Zebra balığı adacıkları tek hücreli çözünürlük kalsiyum Imaging'i kullanma Beta hücre fonksiyonu Analizi

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development and function as well as disease. Fluorescence microscopy has played a major role in characterizing their cellular composition in detail and demonstrating their similarity to the tissue they originate from. In this article, we present a comprehensive protocol for high-resolution 3D imaging of whole organoids upon immunofluorescent labeling. This method is widely applicable for imaging of organoids differing in origin, size and shape. Thus far we have applied the method to airway, colon, kidney, and liver organoids derived from healthy human tissue, as well as human breast tumor organoids and mouse mammary gland organoids. We use an optical clearing agent, FUnGI, which enables the acquisition of whole 3D organoids with the opportunity for single-cell quantification of markers. This three-day protocol from organoid harvesting to image analysis is optimized for 3D imaging using confocal microscopy.

The entire 3D structure and cellular content of organoids, as well as their phenotypic resemblance to the original tissue can be captured using the single-cell resolution 3D imaging protocol described here. This protocol can be applied to a wide range of organoids varying in origin, size and shape.

Bozulmamış Organoidlerin Tek Hücreli Çözünürlükte Üç Boyutlu Görüntülemesi

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

Assessment of Global Ocular Structure Following Spaceflight Using a Micro-Computed Tomography (Micro-CT) Imaging Method

Reports show that prolonged exposure to a spaceflight environment produces morphologic and functional ophthalmic changes in astronauts during and after an International Space Station (ISS) mission. However, the underlying mechanisms of these spaceflight-induced changes are currently unknown. The purpose of the present study was to determine the impact of the spaceflight environment on ocular structures by evaluating the thickness of the mouse retina, the retinal pigment epithelium (RPE), the choroid and the sclera layer using micro-CT imaging. Ten-week-old C57BL/6 male mice were housed aboard the ISS for a 35-day mission and then returned to Earth alive for tissue analysis. For comparison, ground control (GC) mice on Earth were maintained in identical environmental conditions and hardware. Ocular tissue samples were collected for micro-CT analysis within 38(&#177;4) hours after splashdown. The images of the cross-section of the retina, the RPE, the choroid, and the sclera layer of the fixed eye was recorded in an axial and sagittal view using a micro-CT imaging acquisition method. The micro-CT analysis showed that the cross-section areas of the retina, RPE, and choroid layer thickness were changed in spaceflight samples compared to GC, with spaceflight samples showing significantly thinner cross-sections and layers compared to controls. The findings from this study indicate that micro-CT evaluation is a sensitive and reliable method to characterize ocular structure changes. These results are expected to improve the understanding of the impact of environmental stress on global ocular structures.

Assessment of Global Ocular Structure Following Spaceflight Using a Micro-Computed Tomography Micro-CT Imaging Method

We present a protocol using high-resolution micro-computed tomography imaging to determine whether spaceflight induced damage on ocular structures. The protocol shows the micro-CT-derived measurement of ex vivo rodent ocular structures. We demonstrate the ability to assess ocular morphological changes following spaceflight using a non-destructive tridimensional technique to evaluate ocular damage.

Mikro Bilgisayarlı Tomografi (Mikro-BT) Görüntüleme Yöntemi Ile Uzay Uçuşu Sonrası Küresel Oküler Yapının Değerlendirilmesi

Reports show that prolonged exposure to a spaceflight environment produces morphologic and functional ophthalmic changes in astronauts during and after an ...

Neutron Radiography and Computed Tomography of Biological Systems at the Oak Ridge National Laboratory's High Flux Isotope Reactor

Neutrons have historically been used for a broad range of biological applications employing techniques such as small-angle neutron scattering, neutron spin echo, diffraction, and inelastic scattering. Unlike neutron scattering techniques that obtain information in reciprocal space, attenuation-based neutron imaging measures a signal in real space that is resolved on the order of tens of micrometers. The principle of neutron imaging follows the Beer-Lambert law and is based on the measurement of the bulk neutron attenuation through a sample. Greater attenuation is exhibited by some light elements (most notably, hydrogen), which are major components of biological samples. Contrast agents such as deuterium, gadolinium, or lithium compounds can be used to enhance contrast in a similar fashion as it is done in medical imaging, including techniques such as optical imaging, magnetic resonance imaging, X-ray, and positron emission tomography. For biological systems, neutron radiography and computed tomography have increasingly been used to investigate the complexity of the underground plant root network, its interaction with soils, and the dynamics of water flux in situ. Moreover, efforts to understand contrast details in animal samples, such as soft tissues and bones, have been explored. This manuscript focuses on the advances in neutron bioimaging such as sample preparation, instrumentation, data acquisition strategy, and data analysis using the High Flux Isotope Reactor CG-1D neutron imaging beamline. The aforementioned capabilities will be illustrated using a selection of examples in plant physiology&#160;(herbaceous plant/root/soil system)&#160;and biomedical applications&#160;(rat femur and mouse lung).

Neutron Radiography and Computed Tomography of Biological Systems at the Oak Ridge National Laboratory&#039;s High Flux Isotope Reactor

This manuscript describes a protocol for neutron radiography and computed tomography of biological samples using a High Flux Isotope Reactor (HFIR) CG-1D beamline to measure a metal implant in a rat femur, a mouse lung, and an herbaceous plant root/soil system.

Oak Ridge Ulusal Laboratuvarı'nın Yüksek Akı İzotop Reaktöründe Nötron Radyografisi ve Biyolojik Sistemlerin Bilgisayarlı Tomografisi

Neutrons have historically been used for a broad range of biological applications employing techniques such as small-angle neutron scattering, neutron ...

Construction of a Realistic, Whole-Body, Three-Dimensional Equine Skeletal Model using Computed Tomography Data

Therapies based upon whole-body biomechanical assessments are successful for injury prevention and rehabilitation in human athletes. Similar approaches have rarely been used to study equine athletic injury. Degenerative osteoarthritis caused by mechanical stress can originate from chronic postural dysfunction, which, because the primary dysfunction is often distant from the site of tissue injury, is best identified through modeling whole-body biomechanics. To characterize whole-body equine kinematics, a realistic skeletal model of a horse was created from equine computed tomography (CT) data that can be used for functional anatomical and biomechanical modeling. Equine CT data were reconstructed into individual three-dimensional (3D) data sets (i.e., bones) using 3D visualization software and assembled into a complete 3D skeletal model. The model was then rigged and animated using 3D animation and modeling software. The resulting 3D skeletal model can be used to characterize equine postures associated with degenerative tissue changes as well as to identify postures that reduce mechanical stress at the sites of tissue injury. In addition, when animated into 4D, the model can be used to demonstrate unhealthy and healthy skeletal movements and can be used to develop preventative and rehabilitative individualized therapies for horses with degenerative lamenesses. Although the model will soon be available for download, it is currently in a format that requires access to the 3D animation and modeling software, which has quite a learning curve for new users. This protocol will guide users in (1) developing such a model for any organism of interest and (2) using this specific equine model for their own research questions.

The purpose of this protocol is to describe the method of creation of a realistic, whole-body, skeletal model of a horse that can be used for functional anatomical and biomechanical modeling to characterize whole-body mechanics.

Bilgisayarlı Tomografi Verileri Kullanılarak Gerçekçi, Tüm Vücut, Üç Boyutlu At İskelet Modelinin Yapımı

Therapies based upon whole-body biomechanical assessments are successful for injury prevention and rehabilitation in human athletes. Similar approaches ...