Los autores desean agradecer a S Castorani, Eustis AJ, Gambetta GA, Manuck CM, Nasafi Z, y Zedan A. Este trabajo ha sido financiado por: el Departamento de Agricultura de EE.UU., Servicio de Investigación Agrícola de financiación actual Sistema de Información de Investigación (proyecto de investigación no 5306-21220-004-00, la fuente de luz avanzada con el apoyo del Director de la Oficina de Ciencia, Oficina de Basic. Ciencias de la Energía, del Departamento de Energía de EE.UU. bajo el Contrato No. DE-AC02-05CH11231). Nifa y cultivos especiales en la iniciativa de investigación de subvención a AJM.

Detalles del protocolo descrito a continuación fueron escritos específicamente para el trabajo en la Fuente Avanzada de Luz 8.3.2 línea de luz. Las adaptaciones pueden ser necesarios para el trabajo en otras instalaciones de sincrotrón. Seguridad y capacitación adecuadas radiación es necesaria para el uso de estas instalaciones. 1. Preparación de muestras de las plantas vivas <ol><li> Crecer las plantas en macetas de ~ 10 cm de diámetro, y asegurar que el tallo principal (o porción de la planta que va a escanear) está lo más centrado posible y orientado verticalmente en el bote. Las dimensiones físicas del instrumento HRCT conejera en los límites Advanced Light Source plantas vivas a ~ 1 m de altura. Como consecuencia, la formación de imágenes de plantas vivas se realiza mejor en plántulas / arbolitos cultivados en macetas pequeñas. Dependiendo del experimento, los diferentes tipos de suelo se puede utilizar para controlar el contenido de humedad del suelo (por ejemplo, en experimentos de sequía), y para algunas plantas con tallos flexibles (por ejemplo, vides) más largos brotes puede ser cuidadosamente ma miCKED en el tubo acrílico se describe a continuación (véanse las figuras 1 y 2). </li><li> Montar las macetas con plantas vivas en una medida soporte rígido olla de aluminio. La altura de la placa superior se puede ajustar para adaptarse a una gama de alturas de crisol. La parte superior de la placa está diseñada para alinearse con la parte superior de la superficie del suelo, y las plantas sobresale del centro de la placa de dos partes. El propósito de la titular de la olla es asegurar el tallo de la planta se mantiene firmemente en su lugar para minimizar la vibración o movimiento de la muestra. Minimizar el movimiento de la muestra durante un análisis es esencial. </li><li> Una vez montado en el soporte, medir el potencial de agua o transpiración vástago hoja usando un estilo Scholander cámara de presión o una. Clip porómetro hoja, respectivamente, para determinar el estado fisiológico de la planta antes de la digitalización </li><li> Coloque un cilindro delgado de pared de acrílico sobre la planta y en la parte superior del soporte de fábrica de aluminio y seguro en su lugar con arcilla masilla para estabilizar elmuestra (Figura 2). Cualquier vibración o movimiento del follaje superior será transmitida por el tallo y provocar que el tejido de la planta en el área de escaneado para mover, en última instancia conduce a la distorsión de la imagen. El cilindro se utiliza para contener follaje de la planta y evitar que las hojas de la planta del roce contra otros equipos en la cabina que darían lugar a vibraciones durante una exploración. Envoltura de plástico adicional, toallas de papel, y la cinta se debe utilizar para reducir aún más la vibración y el movimiento de partes de la planta (ver los problemas asociados con el movimiento de la muestra en la Figura 4). Para reducir su absorción de rayos X (que puede disminuir la calidad de la imagen en un tiempo dado de exposición), el cilindro que contiene deben tener como paredes delgadas como sea posible mientras que mantiene la rigidez suficiente para realizar su función. </li><li> Coloque el soporte del crisol de ratón a la etapa de cojinete de aire y bloquearlo (tornillo) en su lugar entre la fuente de rayos X y el sensor de imagen y el equipo de la cámara. Positien el vástago lo más vertical posible y centro en base magnética de mandril para asegurar que la muestra permanece en el campo de visión durante la rotación. </li></ol> 2. Preparación de muestras para tejido fresco, Planta extirpados <ol><li> Material vegetal fresco, típicamente tallos o pecíolos, se pueden escanear después de la eliminación inmediata de una planta viva. Si la intención del experimento es visualizar la totalidad de la red de xilema, el agua dentro de los vasos debe ser evacuado y sustituido por aire. Para ello, montar la muestra en una cámara de presión Scholander estilo y empujar el aire comprimido o nitrógeno a través de la muestra a baja presión (&lt;0,05 MPa) durante aproximadamente 5 min. Especies se diferencian en el tiempo requerido para evacuar la red de vasos. Si la intención es evaluar el grado de formación de embolia en el tejido de la planta fresca, a continuación, las muestras especiales de la planta utilizando una cuchilla de afeitar nueva y hacer los cortes bajo el agua. </li><li> Envolver la muestra en una capa de Parafilm para prevento desecación durante la exploración. </li><li> Montar la muestra en un taladro-mandril fijado a una placa metálica que se atornilla en la etapa de cojinete de aire. Centro y orientar la muestra verticalmente como se describe arriba para asegurar que la muestra permanece en el campo de visión. </li></ol> 3. Preparación de la muestra para los tejidos leñosos secos <ol><li> Para una visualización óptima de la muestra de tejido y contraste de la imagen, es necesario deshidratar lentamente la muestra de tejido leñoso entero. Cortar muestras a aproximadamente 6 cm de longitud. Selección de muestras que son tan recto como sea posible en la región de escaneado objetivo y tienen un diámetro de ≤ 1 cm. </li><li> Colocar la muestra de tejido leñoso en un horno de secado a baja temperatura para secar lentamente la muestra sin causar agrietamiento o escisión del tejido. Este proceso es probable que difieren entre especies y tejidos. Para tallos leñosos, 12 h en un horno de 40 ° C es típicamente suficiente para proporcionar un contraste excelente sin causar cha significativasnges en la estructura física de la madre (ver problemas con el secado rápido demuestra en la Figura 3). </li><li> En algunas situaciones es deseable disponer de un marcador fiduciario dentro de la muestra tal que la disección posterior y la visualización con microscopia electrónica de barrido puede estar orientado a puntos específicos de la imagen HRCT. Para hacer esto, fijar un metal o de perlas de vidrio o de alambre a la parte exterior del vástago usando Parafilm. Otro método es usar una resina de silicona (por ejemplo, RTV-141, Bluestar Silicones, East Brunswick, NJ) que se puede inyectar en un conducto único xilema (ver ejemplos en Brodersen et al 2010). Una vez endurecido, la resina de silicona es claramente visible en la muestra y distingue fácilmente de los otros recipientes llenos de aire. Utilizar este marcador para localizar precisamente las regiones específicas de la muestra. </li><li> Montar la muestra en el portabrocas y el centro como se describe anteriormente. </li></ol> 4. Preparación de la muestra para hoja Tissue para dos dimensiones (2D) radiogramas <ol><li> Para visualizar el contenido del recipiente en hojas casi en tiempo real, las hojas se pueden escanear para producir un radiograma 2D, similar a una radiografía dental. Montar la hoja entre dos láminas de plástico acrílico delgado, y fijar los bordes con clips. A continuación, conecte la muestra montada en un sistema de post-soporte y la posición de la mesa óptica próxima al sistema de formación de imágenes y la fuente de rayos x. </li></ol> 5. El escaneo de la muestra en la Hutch 8.3.2 <ol><li> Decida la ampliación que funcionará mejor para su aplicación. ALS línea de luz 8.3.2 tiene la capacidad de escanear con lentes con aumento de 5x 2x, y 10x. Éstos dan lugar a tamaños de pixel de imagen de 4,5, 2,25 y 0,9 micras, respectivamente. Según la ampliación, la muestra debe ser de tamaño adecuado, como el campo de visión disminuye con el aumento cada vez mayor. Ver detalles de elección de la cámara y la lente y los parámetros de imagen resultante en la Tabla 1.</li></ol><table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="2"> PCO.4000 (4008x2672) </td><td colspan="2"> PCO.Edge (2560x2160) (Optique Pedro) </td></tr><tr><td> Lente </td><td> pixel (micras) </td><td> campo de visión (mm) </td><td> pixel (micras) </td><td> campo de visión (mm) </td></tr><tr><td> 10 veces </td><td> 0,9 </td><td> 3,6 </td><td> 0.65 (0.69) </td><td> 1.7 (1.7) </td></tr><tr><td> 5x (4x) </td><td> 1,8 </td><td> 7,2 </td><td> 1.3 (1.72) </td><td> 3.3 (4.4) </td></tr><tr><td> 2x </td><td> 4,5 </td><td> 18 </td><td> 3.25 (3.44) </td><td> 8.3 (8.8) </td></tr><tr><td> 1x </td><td> 9 </td><td> 36 </td><td> 6,5 (-) </td><td> 16,6 (-) </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Los detalles relativos disponiblecámaras y lentes de ALS 8.3.2. <ol start="2"><li> Establecer la energía de rayos X a 15 keV. Esto se ha demostrado para proporcionar contraste de imagen excelente para la mayoría de aplicaciones de las plantas (ver Brodersen et al. 2010, 2011, 2012A, b). Los tiempos de exposición son generalmente depende del espesor y densidad de la muestra (y por lo tanto el aumento utilizados) oscilan entre 100 y 1.000 ms. Mayores tiempos de exposición (siempre píxeles del detector no son saturados) generalmente conducirá a una mayor relación señal a ruido, pero a costa de tiempos de ciclo mayores. </li><li> Elige un incremento angular que es apropiada para su aplicación. Las muestras se giran 180 ° durante una exploración, y el número de imágenes tomadas durante la rotación puede tener un impacto significativo sobre el tamaño del conjunto de datos, longitud del intervalo de exploración, y la calidad final de la imagen, pero en general hay rendimientos decrecientes en la calidad. Exploraciones habituales se realizan en incrementos de 0,25 °, obteniéndose 721 imágenes por exploración. La disminución de las incrementalt hasta 0,125 ° en resultados mejores imágenes para la visualización de detalles finos, pero los rendimientos de 1.440 imágenes y por lo tanto un conjunto de datos mucho más grande (para una región típica de interés, esto significa ~ 10-30 GB de datos vs GB 5). Sin embargo, la relación señal a ruido es a menudo mejorado y vale la pena tanto el aumento del tiempo de exploración y tamaño de los datos. Tallos secos que probablemente no deformar / encoger durante una exploración puede ser sometido a intervalos más largos (más pequeño incremento angular) sin detrimento. Cuando las plantas de imágenes en vivo, donde los procesos biológicos (por ejemplo, reparación de embolia) tienen lugar en escalas de tiempo cortas, optando por los intervalos de exploración más corto es preferible limitar los posibles efectos nocivos de la radiación de rayos X en este tejido, aunque esto tiene un potencial pérdida de calidad de imagen. Más cortos intervalos de exploración se puede lograr utilizando el ajuste de Tomografía continuo durante el cual la muestra gira continuamente mientras las imágenes son capturadas. </li><li> En cada ciclo, &quot;campo claro&quot; e imágenes &quot;campo oscuro&quot; deben ser corrected. Imágenes brillantes de campo son imágenes sin la muestra en el haz. Estos son a menudo recogidos antes y después de la exploración de la muestra por horizontalmente la traducción de la muestra. Dark Fields son recogidos por el cierre de la radiografía del obturador esta midieron la cantidad de señal de la cámara muestra sin radiografías. </li></ol> 6. Procesamiento de Datos <ol><li> Transfiera los &quot;brutos&quot; 2D. Imágenes TIF, que fueron exportados desde el ordenador a la adquisición de un servidor de archivos, a un equipo de procesamiento de datos. Si el equipo tiene suficiente memoria RAM, los datos se pueden copiar en el llamado &quot;Drive RAM&quot; (una parte de la RAM aparece como una unidad de disco duro en el ordenador). De esta manera, el software no tiene que tener acceso a un disco duro giratorio, que es relativamente lento en comparación con una unidad de estado sólido o memoria flash. Este paso reduce significativamente la cantidad de tiempo requerido para procesar conjuntos de datos. </li><li> Las imágenes se deben convertir a una escala de porcentaje de transmisión. Línea de luz 8.3.2 tiene un ba costumbrenormalización ckground plug-in que puede ser descargado y utilizado con el software disponible gratuitamente paquetes ImageJ o Fiji ( <a href="http://fiji.sc/" target="_blank">http://fiji.sc/</a> ). Se resta el recuento oscuras de las imágenes y normaliza las imágenes de muestra de los campos brillantes para producir imágenes que muestran el porcentaje de transmisión. Cargar imágenes normalizadas en el paquete de software Octopus ( <a href="http://www.inct.be/en/software/octopus" target="_blank">http://www.inct.be/en/software/octopus</a> ) y &quot;reconstruir&quot; el conjunto de datos 3D a partir de 2D las primas. TIF archivos usando los pasos de procesamiento designados (Normalizar imágenes, la eliminación del anillo , sinograma creación, la reconstrucción haz paralelo). Este proceso produce entonces una serie de archivos. TIF transversal (sección transversal) imágenes compuestas por &quot;voxels&quot; (elementos volumétricos píxeles), cada una con unos valores de x, y, z de coordenadas e intensidad que representan el coeficiente de absorción de rayos X lineal. </li></ol> 7. Visualización <ol><li> Visualize la pila de imágenes en uno de una variedad de paquetes de software. Programas de dominio público (por ejemplo, Drishti, <a href="http://anusf.anu.edu.au/Vizlab/drishti/index.shtml" target="_blank">http://anusf.anu.edu.au/Vizlab/drishti/index.shtml</a> ) se puede utilizar para visualizar los volúmenes o individuales o pilas de imágenes (por ejemplo ImageJ o FIJI). Otros paquetes de software se puede utilizar para la visualización 3D. Nuestro grupo de investigación utiliza el paquete de software Avizo ( <a href="http://www.vsg3d.com/avizo/overview" target="_blank">http://www.vsg3d.com/avizo/overview</a> ), pero otros, como Amira ( <a href="http://www.amira.com/ " target="_blank">http://www.amira.com/</a> ) y VGStudioMax ( <a href="http://www.volumegraphics.com/" target="_blank">http://www. volumegraphics.com /</a> ) son también de uso general. </li><li> Cargar datos en la memoria del sistema y mostrar la muestra en virtual transversal, longitudinal, u orientaciones radiales rebanada. Debido a las características 3D de los conjuntos de datos, rebanadas virtuales a través de la sample puede girar en cualquier plano para alinear con las regiones de interés, una mejora significativa sobre la microscopía de luz tradicional de serie (véase Películas 1-3 para ejemplos detallados). </li><li> Para visualizar la muestra según sea necesario en 3D, &quot;segmento&quot; de la muestra usando la variedad de rutinas de semi-automatizados y manuales en Avizo lúmenes para separar los vasos u otras estructuras del tejido circundante. La segmentación se refiere a la definición de límites entre los objetos de interés, separando así la segmentación de ellos o en regiones separadas. Volúmenes de renderizado en 3D es realizada por el software de visualización. Un método para hacer esto es la representación de volumen directa, donde se asume que cada punto en un volumen que emiten y absorben luz, la cantidad y el color de emisión y de absorción se puede definir mediante un &quot;mapa de colores&quot;, y la proyección resultante en una dirección dada es aparece en la pantalla. Alternativamente, un alambre o malla de superficie 3D que representa los límites segmentados está construido para mostrar un modelo 3D de tél estructura de interés. La malla 3D se compone de elementos poligonales, y el número total de elementos afectará tanto a la fidelidad de reproducción de la estructura y el tamaño del archivo de datos asociado (es decir, más elementos conduce a una mayor fidelidad pero mayor tamaño de archivo). Una variedad de módulos de procesamiento de imágenes están disponibles en el software de visualización para controlar las salidas de la representación de volumen, así como de control de brillo de la imagen, el contraste, la transparencia, la reducción de ruido, etc </li></ol> 8. Cuantificación <ol><li> Una vez que la segmentación se ha logrado, es posible cuantificar las estructuras de la planta diana o cambios funcionales en volumen, la longitud, la anchura, la presencia o ausencia de agua, aire, etc Por ejemplo, Brodersen et al. (2010) utilizó el software Avizo para cuantificar el cambio de volumen de las gotitas de agua dentro de los vasos de vid de recarga. Las plantas fueron escaneados cada 30 minutos durante cuatro a ocho horas creando un tiempo-lapse secuencia del buque rellenado. Cada análisis fue reconstruido y se cargan en Avizo, donde las gotitas individuales se midieron con el tiempo como su aumento de volumen. </li></ol>

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	<li>Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Matthews, M. A., Shackel, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+embolism+repair+in+xylem:+in+vivo+visualizations+using+high+resolution+computed+tomography.">The dynamics of embolism repair in xylem: in vivo visualizations using high resolution computed tomography.</a> Plant Physiology. 154, 1088-1095 (2010).</li><li>Brodersen, C. R., Lee, E., Choat, B., Jansen, S., Phillips, R. J., Shackel, K. A., McElrone, A. J., Matthews, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+analysis+of+3D+xylem+networks+using+high+resolution+computed+tomography+(HRCT).">Automated analysis of 3D xylem networks using high resolution computed tomography (HRCT).</a> New Phytologist. 191 (4), 1168-1179 (2011).</li><li>Brodersen, C., Roark, L., Pittermann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiological+implications+of+primary+xylem+organization+in+two+ferns.">The physiological implications of primary xylem organization in two ferns.</a> Plant, Cell &amp; Environment. , (2012).</li><li>Brodersen, C., Choat, B., Chatelet, D., Shackel, K. A., Matthews, M. A., McElrone, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conductive+xylem+bridges+contribute+differentially+to+radial+connectivity+in+grapevine+stems+(Vitis+vinifera+and+V.+arizonica).">Conductive xylem bridges contribute differentially to radial connectivity in grapevine stems (Vitis vinifera and V. arizonica).</a> American Journal of Botany. , (2012).</li><li>McElrone, A. J., Jackson, S., Habdas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydraulic+disruption+and+passive+migration+by+a+bacterial+pathogen+in+oak+tree+xylem.">Hydraulic disruption and passive migration by a bacterial pathogen in oak tree xylem.</a> Journal of Experimental Botany. 59, 2649-2657 (2008).</li><li>McElrone, A. J., Grant, J., Kluepfel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+ethylene-induced+tyloses+in+canopy+hydraulic+failure+of+mature+walnut+trees+afflicted+with+apoplexy+disorder.">The role of ethylene-induced tyloses in canopy hydraulic failure of mature walnut trees afflicted with apoplexy disorder.</a> Tree Physiology. 30, 761-772 (2010).</li><li>Tyree, M., Sperry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vulnerability+of+xylem+to+cavitation+and+embolism.">Vulnerability of xylem to cavitation and embolism.</a> Annual Review of Plant Biology. 40 (1), 19-36 (1989).</li><li>Tyree, M., Zimmermann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Xylem structure and the ascent of sap. , (2002).</li><li>Holbrook, N. M., Zwienieck, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Vascular Transport in Plants. , (2005).</li><li>Mayo, S. C., Chen, F., Evans, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micron-scale+3D+imaging+of+wood+and+plant+microstructure+using+high-resolution+x-ray+phase-contrast+microtomography.">Micron-scale 3D imaging of wood and plant microstructure using high-resolution x-ray phase-contrast microtomography.</a> Journal of Structural Biology. 171, 182-188 (2010).</li><li>Mannes, D., Marone, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+areas+of+synchrotron+radiation+tomographic+microscopy+for+wood+research.">Application areas of synchrotron radiation tomographic microscopy for wood research.</a> Wood Science and Technology. 44, 67-84 (2010).</li><li>Maeda, E., Miyake, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-destructive+tracing+with+an+x-ray+micro+ct+scanner+of+vascular+bundles+in+the+ear+axes+at+the+base+of+the+lower+level+rachis-branches+in+japonica+type+rice+(oryza+sativa.">A non-destructive tracing with an x-ray micro ct scanner of vascular bundles in the ear axes at the base of the lower level rachis-branches in japonica type rice (oryza sativa.</a> Japanese Journal of Crop Science. 78 (3), 382-386 (2009).</li><li>Steppe, K., Cnudde, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+x-ray+computed+microtomography+for+non-invasive+determination+of+wood+anatomical+characteristics.">Use of x-ray computed microtomography for non-invasive determination of wood anatomical characteristics.</a> Journal of Structural Biology. 148 (1), 11-21 (2004).</li><li>Zimmermann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dicotyledonous+wood+structure+(made+apparent+by+sequential+sections).">Dicotyledonous wood structure (made apparent by sequential sections).</a> Encyclopaedia Cinematographica. , (1971).</li><li>Lee, E. F., Brodersen, C. R., McElrone, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+HRCT-derived+xylem+network+reveals+reverse+flow+in+some+vessels.">Analysis of HRCT-derived xylem network reveals reverse flow in some vessels.</a> , (2013).</li><li>McDowell, N. G., Pockman, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+plant+survival+and+mortality+during+drought:+why+do+some+plants+survive+while+others+succumb.">Mechanisms of plant survival and mortality during drought: why do some plants survive while others succumb.</a> New Phytologist. 178, 719-739 (2008).</li><li>McElrone, A. J., Brodersen, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrifuge+technique+consistently+overestimates+vulnerability+to+water-stress+induced+cavitation+in+grapevines+as+confirmed+with+high+resolution+computed+tomography.">Centrifuge technique consistently overestimates vulnerability to water-stress induced cavitation in grapevines as confirmed with high resolution computed tomography.</a> New Phytologist. , (2012).</li><li>Lee, K., Avondo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+plant+development+and+gene+expression+in+three+dimensions+using+optical+projection+tomography.">Visualizing plant development and gene expression in three dimensions using optical projection tomography.</a> Plant Cell. 18, 2145-2156 (2006).</li><li>Truernit, E., Bauby, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+whole-mount+imaging+of+three-dimensional+tissue+organization+and+gene+expression+enables+the+study+of+phloem+development+and+structure+in+Arabidopsis.">High-resolution whole-mount imaging of three-dimensional tissue organization and gene expression enables the study of phloem development and structure in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 20, 1494-1503 (2008).</li><li>Jahnke, S., Menzel, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+MRI-PET+dissects+dynamic+changes+in+plant+structures+and+functions.">Combined MRI-PET dissects dynamic changes in plant structures and functions.</a> The Plant Journal. 59, 634-644 (2009).</li><li>Iyer-Pascuzzi, A. S., Symonova, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+analysis+platform+for+automatic+phenotyping+and+trait+ranking+of+plant+root+systems.">Imaging and analysis platform for automatic phenotyping and trait ranking of plant root systems.</a> , (2010).</li></ol>

No tenemos nada que revelar.

Synchotron TCAR proporciona biólogos de plantas con una potente herramienta no destructiva para explorar el funcionamiento interno del sistema vascular de plantas con un detalle increíble. Esta tecnología se ha utilizado recientemente para identificar las estructuras anatómicas no descritas previamente en el xilema vid diferencialmente que alteran la conectividad de red xilema en diferentes especies de vid (Brodersen et al 2012b, en prensa.) - Esta conectividad puede alterar drásticamente la capac...

El agua es transportada desde las raíces de las plantas a las hojas en un tejido vascular llamado xilema - una red de conductos interconectados, fibras, y las células vivas, metabólicamente activas. Función Transporte de xilema planta se debe mantener para suministrar nutrientes y agua a las hojas para la fotosíntesis, crecimiento y supervivencia en última instancia. Transporte por agua en los conductos del xilema puede ser interrumpido cuando la red xilema se ve comprometida por organismos patógenos. En respuesta a las plantas tales infecciones a menudo producen geles, gomas, y tilosas como un medio para aislar la diseminación de patógenos (por ejemplo McElrone et al 2008; 2010). La sequía también puede limitar el transporte de agua en el xilema. Mientras que las plantas pierden agua durante una sequía prolongada, la tensión se acumula en la savia del xilema. Agua bajo tensión es metaestable (es decir, en un determinado umbral de la tensión aumenta lo suficiente como para cavitar columnas de agua contenidas en los conductos del xilema). Después de la cavitación se produce una burbuja de gas (embolia) pueden formar y llenar las conduit, bloqueando efectivamente el movimiento del agua (Tyree y Sperry, 1989), un fenómeno análogo a la enfermedad de descompresión (es decir, &quot;the bends&quot;) en buzos de aguas profundas. A pesar de la importancia del transporte por el xilema el agua para la función óptima de la planta, como lo demuestra un vasto cuerpo de literatura histórica y contemporánea sobre el tema (Tyree y Zimmermann, 2002;. Holbrook et al, 2005), todavía hay aspectos de las redes de xilema que sigue siendo difícil . Varios grupos de investigación han comenzado a utilizar recientemente alta resolución radiografía computarizada micro-tomografía computarizada (HRCT) para evaluar los detalles más finos de la anatomía de la madera y el tejido vascular (por ejemplo Mayo et al; 2010, 2008; Mannes et al 2010;. Brodersen et al 2010. , 2011, 2012A, b; Maeda y Miyake, 2009; Estepa et al 2004).. HRCT es una técnica no destructiva utiliza para visualizar características en el interior de cuerpos sólidos y para obtener información digital en 3-D de sus propiedades estructurales. TCARdifiere del médico convencional CAT-exploración en su capacidad para resolver detalles tan pequeños como una micra de tamaño, incluso para objetos de alta densidad. Los recientes avances en la tecnología de sincrotrón HRCT han mejorado resolución de imagen y de señal a ruido suficiente para que redes de planta de los vasos y las conexiones intervasculares puede ser visualizado, asigna coordenadas 3D, y se exportan para simulaciones de modelos hidráulicos. Brodersen et al. (2011) recientemente avanzó esta técnica mediante la combinación de reconstrucciones 3D generados por sincrotrón HRCT con un modelo de Fortran que extrae automáticamente los datos de la red de xilema una resolución mucho más alta que nunca fue posible con los métodos tradicionales de serie anatómicas (es decir, corte con un microtomo y captura de imágenes con microscopía de luz, por ejemplo Zimmermann 1971). Este trabajo también ha sido utilizado para optimizar los modelos hidráulicos del sistema de xilema y se identificaron las características únicas de transporte (es decir, flujo inverso en algunos hessels durante los períodos de transpiración pico) (Lee et al., en revisión). Sincrotrón HRCT ahora se puede utilizar para visualizar la funcionalidad de xilema, la susceptibilidad a la cavitación, y la capacidad de las plantas para reparar conductos embolizados. La imposibilidad de re-establecer el flujo en conductos embolizados reduce la capacidad hidráulica, la fotosíntesis límites, y resulta en muerte de la planta en casos extremos (McDowell et al. 2008). Las plantas pueden hacer frente a embolias mediante el desvío de agua alrededor de las obstrucciones a través de pozos de conexión adyacentes conductos funcionales, y por la creciente xilema nueva para reemplazar la capacidad perdida hidráulica. Algunas plantas tienen la capacidad de reparar roturas en las columnas de agua, pero los detalles de este proceso en el xilema bajo tensión se ha mantenido claro por décadas. Brodersen et al. (2010) recientemente visualizar y cuantificar el proceso de recarga en vid en directo mediante TCAR. Recipiente de rellenado éxito depende de afluencia de agua de las células vivas que rodea el xylem conductos, donde las gotas de agua individuales se expandieron a través del tiempo, los vasos llenos, y obligó a la disolución del gas atrapado. La capacidad de las diferentes plantas para reparar comprometidos vasos del xilema y de los mecanismos que controlan estas reparaciones están siendo investigados. Descripción de la instalación de la línea de luz ALS 8.3.2 Nuestro trabajo hasta la fecha ha llevado a cabo en el Hard X-ray Micro-Tomografía línea de luz 8.3.2 en la Fuente Avanzada de Luz en el Laboratorio Nacional Lawrence Berkeley (Berkeley CA, EE.UU.). Las muestras de plantas se colocan en un forrado de plomo conejera situado a 20 m de la fuente de rayos X, generado por un imán superconductor 6 Tesla curva dipolo dentro de la Fuente Avanzada de Luz operativo anillo de electrones almacenamiento a una energía crítica de 11,5 KeV. Un esquema de la estación final se muestra en la figura 1. Los rayos X de entrar en la cabina con un tamaño de haz de 40x ~ 4,6 mm y pasar a través de la muestra que está montado en una etapa giratoria motorizada. Latransmitida rayos X inciden en un contador de centelleo de cristal (dos materiales normalmente utilizados son LuAG o CdWO 4) que convertir los rayos X en luz visible que se transmite a través de las lentes en un CCD para la recogida de imagen. La cámara, centelleador y la óptica están contenidos en una caja de luz que es apretado sobre raíles que permite que la distancia de muestra a centelleador para ser optimizado para formación de imágenes de contraste de fase. Todas las muestras se montan en la etapa 10 cm de diámetro giratorio que a su vez está montado en etapas traslación horizontal y vertical para la colocación de la muestra. Una muestra de la planta de té, con el sistema de la raíz montado en un soporte personalizado construido maceta y el follaje contenida en un tubo de acrílico, se puede ver en la Figura 2. Los tiempos típicos de exposición puede variar desde 0,1 hasta 1 seg usando 10-18 KeV, y duraciones de exploración variará 5 a 40 min dependiendo de los ajustes optimizados para una muestra particular. Para las muestras de altura (típico de las redes de xilema de la planta), exploraciones de datos puede serbaldosas repitiendo la medición con la muestra a diferentes alturas, que se controla automáticamente, permitiendo sin costura de serie de secciones a lo largo de una altura de muestra máxima de ~ 10 cm. Anchura máxima de la muestra cuando la imagen a una resolución de 4,5 m es de ~ 1 cm para las muestras que son casi perfecta en orientación vertical. Generación y procesamiento de datos se completa usando el protocolo enumeran a continuación. Debido a la diferencia en la atenuación de los rayos x entre el aire y el agua, excelente contraste de imagen se puede conseguir en las plantas sin el uso de soluciones de contraste típico de los sistemas médicos de CT. La luz del vaso lleno de aire es fácilmente distinguible de la circundante llena de agua del tejido en las plantas hidratadas.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Material Name/Equipment </td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>See specifics listed above regarding equipment at the Advanced Light Source beamline 8.3.2</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

using high resolution computed tomography to visualize the three dimensional structure and function of plant vasculature

Alta resolución de rayos X de tomografía computarizada (HRCT) es una técnica no destructiva de diagnóstico por imagen con capacidad de resolución inferior a la micra que se utiliza actualmente para evaluar la estructura y la función de red de la planta xilema en tres dimensiones (3D) (por ejemplo Brodersen et al . 2010; 2011; 2012A, b). HRCT formación de imágenes se basa en los mismos principios que los sistemas de TC médica, pero una alta intensidad de sincrotrón de rayos X Fuente de los resultados en una mayor resolución espacial y menor tiempo de adquisición de imagen. Este sentido, demuestran con detalle cómo sincrotrón basada TCAR (realizada en el Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, EE.UU.) en combinación con Avizo software (VSG Inc., Burlington, MA, EE.UU.) se está utilizando para explorar xilema en plantas extirpados tejidos y plantas vivas. Esta nueva herramienta de imagen permite a los usuarios ir más allá del tradicional luz estática, 2D o micrografías electrónicas de estudio y muestras virtuales utilizando las secciones de serie en cualquier plano. Un número infinito de segmentos en cualquier c orientaciónun hacerse en la misma muestra, una característica que es físicamente imposible con los métodos tradicionales de microscopía. Los resultados demuestran que HRCT puede ser aplicado tanto a especies herbáceas y leñosas de las plantas, y una serie de órganos de la planta (es decir, hojas, peciolos, tallos, troncos, raíces). Las cifras presentadas aquí ayudar a demostrar tanto una gama de anatomía vascular representante planta y el tipo de detalles extraídos de bases de datos, incluyendo HRCT exploraciones de secoya (Sequoia sempervirens), nogal (Juglans spp.), Roble (Quercus spp.) Y arce ( Acer spp.) árboles jóvenes a girasol (Helianthus annuus), vid (Vitis spp.) y helechos (Pteridium aquilinum y fimbriata Woodwardia). Muestras extirpados y secado de especies leñosas son más fáciles de detectar y suelen producir las mejores imágenes. Sin embargo, las mejoras recientes (es decir, las exploraciones más rápidas y la estabilización de la muestra) han hecho possible para utilizar esta técnica de visualización en los tejidos verdes (por ejemplo, pecíolos) y en plantas vivas. De vez en cuando un poco de encogimiento de los tejidos vegetales verdes hidratados causará que las imágenes borrosas y los métodos para evitar estos problemas se describen. Estos avances recientes con HRCT proporcionar prometedores nuevos conocimientos sobre la función de la planta vascular.

Synchotron TACAR han aplicado con éxito en una amplia variedad de tejidos y especies vegetales utilizando la línea de luz 8.3.2 (Figura 5), y han proporcionado nuevos conocimientos sobre la estructura y función del xilema en planta de resolución sin precedentes en 3D. Las capacidades de visualización y exploración proporcionados por las reconstrucciones en 3D (como se ilustra en las Figuras 6-8, y 1-3) Películas para permitir la determinación precisa de la ubicación y orientaci...

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Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

Alta resolución de rayos X de tomografía computarizada (HRCT) es una técnica no destructiva de imágenes diagnósticas que se pueden utilizar para estudiar la estructura y función de la vasculatura planta en 3D. Se demuestra cómo HRCT facilita la exploración de redes de xilema a través de una amplia gama de tejidos y especies vegetales.

El uso de alta resolución de tomografía computarizada para visualizar la estructura tridimensional y la función de la Planta Vasculatura

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

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