Irving ve Cherna Moskowitz Weizmann Bilim Enstitüsü Nano ve Biyo-Nano Görüntüleme Merkezi çalışmalar yapılmıştır. Biz bu protokolü tasarımı ve çalışan ona yardım için Orna Yeger minnettarız.

1. Örnek hazırlama <ol><li> Incelenmek üzere doku ayıkladıktan sonra, mineralize dokuların cihaz yerleştirilmiş ve görüntülü olabilir. Fare femur bir görüntü için aşağıdaki adımları izleyin: <ol><li> C57/Bl6 embriyo 18.5 gün postceutus (E18.5) mortem bacak sonrası çıkarın. </li><li> Epoksi reçine veya başka bir yapıştırıcı kullanarak polistiren pipet ucu (20-200 ul) dar ucuna Seal, ve çalışma tamponu (PBS veya diğer) ucu doldurmak. </li><li> Bacak içine ucu sıkıca oturtun ve parafilm levha ile diğer ucunu mühür. </li><li> Pipet ucu uygun bir tutucu içine yerleştirin ve bölüm 3 protokolü uygulayın. Fare bacak embriyo femur görselleştirmek için, cihaz 40 KV ve 200 uA ayarlanır. 8μ çözünürlük için 4x büyütme ile 1000 projeksiyon görüntüleri elde edilecek. </li></ol></li><li> Sigara mineralize dokuların başlangıçta mevcut olan birçok protokolleri 8,9 birini kullanarak ilgi dokusunun X-ray zayıflama artırmak için sabit ve lekeli olmak için var. Sıçan akciğer ve benzer örnekler için hazırlık protokolü: <ol><li> Çıplak sıçan akciğer küçük hücreli dışı akciğer kanseri (KHDAK) NCI-H460 Orthotopical implantasyon </li><li> Akciğer kanseri nodüller 4 hafta implantasyon saptanabilir </li><li> Sıçan Kurban ve hemen heparin ile karıştırılarak tuzlu su çözeltisi ile demlenmeye </li><li> Bronş dolaşımı leke Microfil (Flowtech), (bileşik çözümü, seyreltici 3 ml ve 0,3 ml sertleştirici 2 ml), seyreltilmiş bir çözüm ile sol ventrikül içine enjekte </li><li> Sıçan akciğer ve kalp Özü </li><li> 50 ml plastik test tüpü içine sıkıca sığdırarak örnek hareketsiz (protokol bölüm 2) </li><li> Tüpün alt etanol batırılmış bir bez koyarak doymuş etanol ortam yaratın </li><li> Tutkal ya da vida tutucu bir enstrüman tüp </li><li> Görüntüleme parametreleri (bölüm 3) ayarı ile devam edin. Rat akciğerlerin tam görüntüleme için kaynak 40KV ve 100 uA olarak belirlenmiştir. 16μ çözüme ulaşmak için bir 0.5x büyütme 2500 projeksiyon görüntüleri elde etmek için vardır. </li></ol></li></ol> 2. Örnek immobilizasyon Yüksek çözünürlükte, ölçüm sırasında numune pozisyonunda herhangi bir değişiklik önlemek için önemlidir. Bunun için, numune boyutuna uygun bir plastik alıcı içine sıkıca sabitlenir. Polistiren pipet uçları, plastik Pasteur pipetler veya bu konuda özel olarak inşa edilmiş plastik tutucular kullanılır. Deneysel gereksinimlerine göre, hava örnek incelenir veya etanol veya tampon çözeltiler dalmış. Tipik immobilizasyon ve enstrüman fare embriyo bacak son konumlandırma Şekil 1 de gösterilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/2688/2688fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1. Mikro CT enstrüman embriyonik fare bacak Final konumlandırma. 3. Satın alma parametrelerinin ayarlanması: x-ray gerilim ve akım, CCD maruz kalma süresi <ol><li> Bir tutucu yerleştirilir, örnek cihazın dönme aşamasında koymak </li><li> Voltaj ve akım keyfi olarak ayarlanmış bir ilk x-ray görüntü alınır. </li><li> Görüntü çok karanlık ise, bir ilk fotonların sayısını artırmak, böylece akımı biraz artar. Bu yeterli değilse, bir x-ray fotonların enerji biraz artırmanız gerekir, yani x-ışını tüpü gerilim. </li><li> Görüntü çok parlak ise, bir ilk sonra akım, voltaj düşmesi gerekiyor. </li><li> Görüntünün parlaklığı binning artabilir. 2 binning 2x2 piksel her matrisin toplamını alır ise 1 binning, görüntüde her pikselin yoğunluğu dikkate alır. Görüntü binning 1 durumda yaklaşık 4 kat daha parlak olacak, ama yarım çözünürlüğe sahip olacak. </li><li> Optimum parlaklık ayarladıktan sonra, bir iyi kontrast arasında bir yan ve başka bir tarafında deneme süresi makul bir uzlaşma için kamera poz süresi optimize etmek için vardır. </li><li> Özellikle düşük emici örnekleri kontrast görüntüler, ağırlıklı olarak düşük enerjili fotonların, foton akısı azaltmak filtreleri kullanarak geliştirilebilir. </li></ol> 4. Örnek konumlandırma <ol><li> Çalışan büyütme seçin. Olası seçenekleri, 0.5x, 4x, 10x, 20x ve 40x. Artan büyütme görüş alanı azalır. </li><li> Optimal çözünürlük ve alan, x-ışını kaynağı ve örnek arasında ve örnek ve dedektör arasındaki mesafeleri ayarlayarak alın. Örnek mesafe kaynak artırılması görüş alanı azalır ve çözünürlüğü artar. Dedektörü mesafe için örnek tam tersi bir etkiye sahiptir. </li></ol> 3D görülebilir alan mevcut olmalıdırtüm açılardan projeksiyon görüntü. Bir farklı açılardan örnek dönen ve dönme ekseni mümkün olduğunca yakın örnek getirerek bunu kontrol etmelisiniz. Bunun için, bir aşağıdaki adımları izlemeniz gerekir: <ol start="3"><li> 0 derece bir görüntü çekmek ve daha sonra örnek -20 derece döndürün. İstenen hacme laterale kaymıştır, bir dönme ekseni yeniden konumunu düzeltmek gerekir. </li><li> Düzeltme yapıldıktan sonra, örnek, başka bir açıda döndürülebilir ve ilgi alanına görüntünün içinde tüm açılardan -90 ila 90 derece kadar pozisyonu, tekrar düzeltildi. </li></ol> 5. Yüksek çözünürlüklü tomogram <ol><li> Ölçüm sırasında, örnek bir seferde küçük bir açı ve her açılı bir projeksiyon görüntüsü döndürülür alınır. Görüntülerin toplam sayısı, her zaman bir tarafta istenen çözünürlük ve başka bir tarafında ölçüm ve dosya boyutu arasında bir uzlaşma. Şekil 2&#39;de görüldüğü gibi, her bir projeksiyon başka bir yere bir örnek tüm dilimleri üst üste ve bu nedenle örnek 3D yapı veremiyoruz içerir. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2688/2688fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2. (A), 45 °, (B) ve 90 ° (C) dönme açısı 0 ° sıçan akciğer projeksiyon görüntüleri . <ol start="2"><li> Sadece en az -90 ve 90 derece arasında projeksiyon görüntüleri aldıktan sonra, bir örnek hacmi yeniden devam edebilirsiniz. İmar, kullanılan yazılım ve projeksiyonlar sayısına bağlı olarak 10 dakika ile 2 saat arasında sürer. Yine, son 3D görüntü kalitesi istenen çözünürlük ve harcamak istiyor ve sonuçta elde edilen dosya boyutu arasında bir uzlaşmadır. </li></ol> 6. Görüntü ölçekli kalibrasyon Yeniden inşa edilen bir görüntü piksel seviyesi (değer) bu görüntü için eşsizdir. Iki farklı görüntü karşılaştırmak için eşsiz bir skalası her görüntünün cezası verilebilir. Bunun için <ol><li> Örnek için aynı deneysel koşullar kullanarak standart bir hayalet ile bir tomografi çalıştırın </li><li> Fantom için elde edilen değerler kullanılarak örnek görüntü ayarlamasını yapınız. En yaygın Hounsfield (veya CT) ölçeği. 4x büyütme (su veya PBS) 15.000 arka plan değeri 0 ile değiştirildi ve kemik için maksimum değeri 35.000, 3000 standart Hounsfield değeri ile değiştirildi. Diğer piksel değerleri, bu sınırları dayalı doğrusal enterpolasyon veya ekstrapolasyon sonuçlandı. </li></ol> 7. Görüntü işleme ve analiz Yüksek çözünürlüklü görüntüleri elde ettikten sonra, bir görüntü analiz yazılımı ile ilgili bilgileri ayıklamak. Kullanılacak yazılım paketi, çok büyük dosyaları (en fazla 20Gb) ile çalışmak üzere tasarlanmış olması gerekir. 8. Temsilcisi Sonuçlar C57/Bl6 fare embriyonik gün 18.5 (E18.5) femur gösterimi - dört gün mineralizasyon süreci başladıktan sonra, Şekil 3 de gösterilmiştir. Yumuşak dokuların bu hazırlık görünmez ise mineral katmanları, (beyaz) açıkça görülebilir. Biz, 4x doğrusal bir büyütme ile 1000 projeksiyon görüntüleri aldı. Son çözünürlüklü 8 mikron. Şekil 1&#39;de gösterildiği gibi volume rendering dikkatli bir analizi, kemik hacim fraksiyonu (mineralize doku tarafından işgal kemik hacmi kesir) 0.18 olduğunu gösterir, ve kemik mineral yoğunluğu 723 mg / cm 3. Bu değerler bize diğer gelişme evrelerini kemikler ile bu yapısını karşılaştırmak için izin verir. <img src="/files/ftp_upload/2688/2688fig3.jpg" alt="Şekil 3"/> Şekil 3 fare femur embriyonun bir 3D görüntü farklı temsilleri. Çapraz (kesit) (A) sagital (medio-lateral) bölümünde (B) ve volume rendering (C) bir anlık gösterilmiştir. Şekil 4 küçük hücreli dışı akciğer kanseri (KHDAK) NCI-H460 orthotopically implante 12 hafta eski bir kadın çıplak sıçan (RNU), akciğerlerin bir 3D görüntü gösterir. 16 mikron nihai bir çözüm sağlanması, 0.5x doğrusal bir büyütme ile 2500 projeksiyon görüntüleri alınmıştır. Görüntü Microfil lekeli kan damarları (çapı 20 mikron kadar) gösterir görüntü analizi implantasyon 4 hafta sonra, birden fazla kanser nodüller oluşmuş olduğunu göstermektedir. Onlar akciğer hacmi (% 17) önemli bir kısmını kaplamaktadır. Pulmoner boyama çoğu tümörler periferik alanlarda bulundu. Da önemlisi, incir 4B gösterildiği gibi, birden fazla kan damarları, ön incelemeye göre kendi hacminin yaklaşık% 3 kapsayan, nodüllerin içinde de mevcuttur. <img src="/files/ftp_upload/2688/2688fig4.jpg" alt="Şekil 4"/> Şekil 4 bir sıçan büyüyen kanser nodülleri 3D görüntüakciğer. Volume rendering (A) ve hacim (B) aracılığıyla bir bölümü bir anlık gösterilmiştir. Kanser nodülleri oklarla işaretlenmiştir. Film 1 Şekil 1&#39;de fare femur Volume rendering <a href="/files/ftp_upload/2688/2688movie1.mpg">film izlemek için buraya tıklayın.</a> Film 2 Şekil 2 sıçan akciğerlerin hacmi render <a href="/files/ftp_upload/2688/2688movie2.mpg">film izlemek için buraya tıklayın.</a> Film 3 akciğerler yoluyla Seri bölümleri. Nodüller dilimleri gri alanlar olarak görünür. <a href="/files/ftp_upload/2688/2688movie3.mpeg">film izlemek için buraya tıklayın.</a>

<ol>
	<li>Schambach, S. J., Bag, S., Schilling, L., Groden, C., Brockmann, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+micro-CT+in+small+animal+imaging.">Application of micro-CT in small animal imaging.</a> Methods. 50, 2-13 (2010).</li><li>Bauer, J. S., Link, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+osteoporosis+imaging.">Advances in osteoporosis imaging.</a> Eur J Radiol. 71, 440-449 (2009).</li><li>Chappard, D., Retailleau-Gaborit, N., Legrand, E., Basle, M. F., Audran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+insight+bone+measurements+by+histomorphometry+and+microCT.">Comparison insight bone measurements by histomorphometry and microCT.</a> J Bone Miner Res. 20, 1177-1184 (2005).</li><li>Muller, R., Van Campenhout, H., Damme, B. V. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphometric+analysis+of+human+bone+biopsies:+a+quantitative+structural+comparison+of+histological+sections+and+micro-computed+tomography.">Morphometric analysis of human bone biopsies: a quantitative structural comparison of histological sections and micro-computed tomography.</a> Bone. 23, 59-66 (1998).</li><li>Mueller, K., Yagel, R., Wheller, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-Aliased+3D+Cone-Beam+Reconstruction+Of+Low-Contrast+Objects+With+Algebraic+Methods.">Anti-Aliased 3D Cone-Beam Reconstruction Of Low-Contrast Objects With Algebraic Methods.</a> IEEE Transactions on Medical Imaging. 18, 519-537 (1999).</li><li>Kachelriess, M., Schaller, S., Kalender, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+single-slice+rebinning+in+cone-beam+spiral+CT.">Advanced single-slice rebinning in cone-beam spiral CT.</a> Med Phys. 27, 754-772 (2000).</li><li>Endo, M., Komatsu, S., Kandatsu, S., Yashiro, T., Baba, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combination-weighted+Feldkamp-based+reconstruction+algorithm+for+cone-beam+CT.">A combination-weighted Feldkamp-based reconstruction algorithm for cone-beam CT.</a> Phys. Med. Biol. 51, 3953-3965 (2006).</li><li>Marxen, M., Thornton, M. M., Chiarot, C. B., Klement, G., Koprivnikar, J., Sled, J. G., Henkelman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroCT+scanner+performance+and+considerations+for+vascular+specimen+imaging.">MicroCT scanner performance and considerations for vascular specimen imaging.</a> Med Phys. 31, 305-313 (2004).</li><li>Plourabou&#233;, F., Cloetens, P., Fonta, C., Steyer, A., Lauwers, F., Marc-Vergnes, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+high-resolution+vascular+network+imaging.">X-ray high-resolution vascular network imaging.</a> J Microsc. 215, 139-148 (2004).</li></ol>

C57/Bl6 fare embriyonik gün 18.5 (E18.5) mineralizasyon süreci başladıktan sonra dört gün. Şekil 3 açıkça görülen bu gelişim aşamasında, gelecekteki kemik, mineralize osteoids birçok katmandan yapılır. Bu noktada, bir mineralize dokulara daha az numune alma gerektiren farklı enstrümanlar ile düşük çözünürlükte görülebilmesi vurgulamak gerekir. Daha yüksek çözünürlük sağlayan yanı sıra, mevcut protokolü (ve mikro CT aleti kullanılır), ölçüm için en iyi geometrik parametreleri seçmek için kullanıcı için en yüksek esnekliği sunmaktadır. Şekil 4 Sonuçlar ortotopik akciğer kanseri hayvan modellerinde, insan küçük hücreli dışı akciğer kanseri, kan damarları ve neovaskülarizasyon alımı neden olduğunu göstermektedir. Akciğer dokusunda kaydıramaz olduğunu düşünün, ne de ölçüm sırasında şeklini değiştirdi. Kullanıcı bir tomografi sırasında bu tür değişiklikleri önlemek için özel önlemler almalısınız. Bazı örnekler için, özellikle yumuşak doku için, bir ölçüm sırasında mükemmel örnek hareketsiz özel tutan cihazlar oluşturmak için vardır. Ne yazık ki tümörlerin bir ortamda yüksek kontrast madde sızıntılarının varlığı, periferik kan damarlarını güvenilir kantifikasyon engelledi. Bir sonucu olarak görüntüleri filmleri 2 ve 3 de net bir şekilde mevcut olduğu, özellikle kenarlarında bazı boyama ajan tarafından kusurludur. Biz bu dökülme engel olamazdı, ama, boyut, şekil ve iç kan damarlarının varlığı da dahil olmak üzere kanser nodülleri hakkında yararlı bilgiler etkilenen değildi. Biz açıkça, en azından burada incelenmiştir bronş dolaşımı için, periferik kan dolaşımı da tümör içindeki bazı perfüzyonu ile tümör perfüzyon mevcut katılır sonucuna olabilir.

Görüntü alımı için Xradia, Concord, ABD tarafından üretilen bir MİKRO XBT-400 microfocussed X-ray tomografi sistemi kullandık. Görüntü işleme ve ImageJ (NIH, ABD), Avizo (VSG, Fransa) ve MicroView (General Electric, ABD) yazılım paketleri kullanılarak analiz edildi. Herhangi bir görüntü analiz yazılımı yerine kullanılabilir

high resolution 3d imaging of ex-vivo biological samples by micro ct

Tahribatsız ses görselleştirme sadece x-ray mikro bilgisayarlı tomografi (μCT) en verimli olduğu tomografi teknikleri ile elde edilebilir. Yüksek çözünürlüklü μCT ex-vivo biyolojik örnekler 1, 2 3D inceleme için çok yönlü ama doğru bir tekniktir (1-2 mikron çözünürlük) . Elektron tomografisi aksine, μCT 4 cm kalınlığında numunelerin incelenmesi sağlar. Bu teknik, histoloji hafta ile karşılaştırıldığında, sadece birkaç saat ölçüm gerektirir. Buna ek olarak, μCT, 2D stereolojik modelleri güvenmeyin böylece tamamlayıcı olabilir ve hatta bazı durumlarda, hem de zaman alıcı ve yıkıcı histolojik yöntemler 3, 4, değiştirebilirsiniz . ΜCT örnek klima ve konumlandırma basittir ve yapısını olumsuz etkileyebilecek yüksek vakum veya düşük sıcaklıklarda gerektirmez. Örnek yerleştirilmiş ve 2B görüntü alınan her açı için sintilatör ve doğru bir CCD kamera içeren bir microfocused x-ray kaynağı ve dedektör arasında 180 ° veya 360 ° döndürülmüş ve daha sonra tüm hacim birini kullanarak yeniden 5-7 farklı algoritmalar. 3D çözünürlük dönme adım azalma ile birlikte artar. Mevcut video protokol hazırlanması, immobilizasyon ve yüksek çözünürlükte görüntüleme ile takip örnek konumlandırma ana adımları göstermektedir.

Watch this Scientific Journal Video about High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT at JoVE.com

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Tahribatsız ses görselleştirme sadece x-ray mikro bilgisayarlı tomografi (BT) en verimli olduğu tomografi teknikleri ile elde edilebilir.

Yüksek Çözünürlüklü 3D Görüntüleme Ex-Vivo Biyolojik örnekler Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

high-resolution-3d-imaging-of-ex-vivo-biological-samples-by-micro-ct

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

18.6K Görüntüleme.  Weizmann Institute of Science. Tahribatsız ses görselleştirme sadece x-ray mikro bilgisayarlı tomografi (BT) en verimli olduğu tomografi teknikleri ile elde edilebilir.

Video: High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution. Traditionally, multiple experiments are run in parallel, with individual samples removed from the study at sequential time points for evaluation by light microscopy. Several intravital techniques have been developed, with confocal, multiphoton, and second harmonic microscopy all demonstrating their ability to be used for imaging in situ 1. With these systems, however, the required infrastructure is complex and expensive, involving scanning laser systems and complex light sources. Here we present a protocol for the design and assembly of a high-resolution microendoscope which can be built in a day using off-the-shelf components for under US$5,000. The platform offers flexibility in terms of image resolution, field-of-view, and operating wavelength, and we describe how these parameters can be easily modified to meet the specific needs of the end user.
We and others have explored the use of the high-resolution microendoscope (HRME) in in vitro cell culture 2-5, in excised 6 and living animal tissues 2,5, and in human tissues in vivo 2,7. Users have reported the use of several different fluorescent contrast agents, including proflavine 2-4, benzoporphyrin-derivative monoacid ring A (BPD-MA) 5, and fluoroscein 6,7, all of which have received full, or investigational approval from the FDA for use in human subjects. High-resolution microendoscopy, in the form described here, may appeal to a wide range of researchers working in the basic and clinical sciences. The technique offers an effective and economical approach which complements traditional benchtop microscopy, by enabling the user to perform high-resolution, longitudinal imaging in situ.

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

In many biological and clinical situations it is advantageous to study cellular processes as they evolve in their native microenvironment. Here we describe the assembly and use of a low-cost fiber-optic microscope which can provide real time imaging in cell culture, animal studies, and clinical patient studies.

Yüksek çözünürlüklü Fiber-optik Mikroendoskopi In situ Hücresel Görüntüleme

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

Biyomühendislik

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Üç boyutlu optik çözünürlük foto akustik Mikroskopi

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Devirli Basınç Biyoreaktör Tasarım Ex vivo</emAort Kalp Vanalar> Eğitim

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Micro-particle Image Velocimetry for Velocity Profile Measurements of Micro Blood Flows

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to give an accurate velocity profile. A protocol is presented for &mu;PIV measurements of blood flows in microchannels. At the scale of the microcirculation, blood cannot be considered a homogeneous fluid, as it is a suspension of flexible particles suspended in plasma, a Newtonian fluid. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate can be derived from these measurements. Several key parameters such as focal depth, particle concentration, and system compliance, are presented in order to ensure accurate, useful data along with examples and representative results for various hematocrits and flow conditions.

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows which are cross-correlated to give an accurate velocity profile. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate, each of which has clinical applications, can be derived from these measurements.

Mikro Kan akış hızı Profil ölçümleri için mikro-parçacık imaj velosimetri

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to ...

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological tissues at the hundreds to tens of microns scale. When performed under ambient conditions, sample pre-treatment becomes unnecessary, thus simplifying the protocol while maintaining the high quality of information obtained. Desorption electrospray ionization (DESI) is a spray-based ambient MSI technique that allows for the direct sampling of surfaces in the open air, even in vivo. When used with a software-controlled sample stage, the sample is rastered underneath the DESI ionization probe, and through the time domain, m/z information is correlated with the chemical species' spatial distribution. The fidelity of the DESI-MSI output depends on the source orientation and positioning with respect to the sample surface and mass spectrometer inlet. Herein, we review how to prepare tissue sections for DESI imaging and additional experimental conditions that directly affect image quality. Specifically, we describe the protocol for the imaging of rat brain tissue sections by DESI-MSI.

Desorption electrospray ionization mass spectrometry (DESI-MS) is an ambient method by which samples, including biological tissues, can be imaged with minimal sample preparation. By rastering the sample below the ionization probe, this spray-based technique provides sufficient spatial resolution to discern molecular features of interest within tissue sections.

Desorpsiyon Elektrosprey İyonizasyon Kütle Spektrometresi ile Biyolojik Dokuların Görüntüleme

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

Tek molekül Floresan Mikroskopi Reseptör Dinamiği Yüksek çözünürlüklü Spatiotemporal Analizi

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

Mika hazırlanması Yüksek Çözünürlüklü Optik Mikroskopi Görüntüleme için lipit tabakalarının Desteklenen

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high resolutions in live animal models. This allows for repeated imaging of the same rodent over time. This feature not only reduces the total number of rodents required in an experimental design and thereby reduces the inter-subject variation that can arise, but also allows researchers to assess longitudinal or life-long responses to an intervention. To acquire high quality images that can be processed and analyzed to more accurately quantify outcomes of bone micro-architecture, users of in vivo &#181;CT scanners must properly anesthetize the rat, and position and restrain the hind limb. To do this, it is imperative that the rat be anesthetized to a level of complete relaxation, and that pedal reflexes are lost. These guidelines may be modified for each individual rat, as the rate of isoflurane metabolism can vary depending on strain and body size. Proper technique for in vivo &#181;CT image acquisition enables accurate and consistent measurement of bone micro-architecture within and across studies.

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

This paper instructs users of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) scanners how to anesthetize, correctly position and restrain the hind limb of a rat for minimal movement during high-resolution imaging of the tibia. The result is high quality images that can be processed to accurately quantify bone micro-architecture.

Uygun konumlandırma ve sıçan Hind riske odaklı yüksek kararlılık düşsel ve kemik mikro mimarisi kullanarak Vivo içinde mikro Bilgisayarlı Tomografi için kısıtlama

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high ...

High Resolution 3D Imaging of the Human Pancreas Neuro-insular Network

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological sections are generally limited to &#60;20 &#181;m as formalin fixed paraffin section on glass slides or &#60;500 &#181;m for free-floating fixed sections. Therefore, extensive efforts are required for serial sectioning and large-scale image reconstruction methods to recreate 3D for samples &#62;500 &#181;m using traditional methods. In addition, light scatters from macromolecules within tissues, particularly lipids, prevents imaging to a depth &#62;150 &#181;m with most confocal microscopes. To reduce light scatter and to allow for deep tissue imaging using simple confocal microscopy, various optical clearing methods have been developed that are relevant for rodent and human tissue samples fixed by immersion. Several methods are related and use protein crosslinking with acrylamide and tissue clearing with sodium dodecyl sulfate (SDS). Other optical clearing techniques used various solvents though each modification had various advantages and disadvantages. Here, an optimized passive optical clearing method is described for studies of the human pancreas innervation and specifically for interrogation of the innervation of human islets.

Here, we present a protocol to image human pancreas sections in three dimensions (3D) using optimized passive clearing methods. This manuscript demonstrates these procedures for passive optical clearing followed by multiple immunofluorescence staining to identify key elements of the autonomic and sensory neural networks innervating human islets.

İnsan pankreas nöro-ada ağının yüksek çözünürlükte 3D görüntüleme

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological ...

High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the effect of applied extracellular tensile strain on cell populations in vitro via biochemical assays, a device has previously been designed which can be fabricated simply and is small enough to fit inside tissue culture incubators, as well as on top of microscope stages. However, the previous design of the polydimethylsiloxane substratum did not allow high-resolution subcellular imaging via oil-immersion objectives. This work describes a redesigned geometry of the polydimethylsiloxane substratum and a customized imaging setup that together can facilitate high-resolution subcellular imaging of live cells while under applied strain. This substratum can be used with the same, earlier designed device and, hence, has the same advantages as listed above, in addition to allowing high-resolution optical imaging. The design of the polydimethylsiloxane substratum can be improved by incorporating a grid which will facilitate tracking the same cell before and after the application of strain. Representative results demonstrate high-resolution time-lapse imaging of fluorescently labeled nuclei within strained cells captured using the method described here. These nuclear dynamics data give insights into the mechanism by which applied tensile strain promotes differentiation of oligodendrocyte progenitor cells.&#160;

Using a previously designed device to apply mechanical strain to adherent cells, this paper describes a redesigned substratum geometry and a customized apparatus for high-resolution single-cell imaging of strained cells with a 100x oil immersion objective.

Tek eksenli çekme gerinim altında canlı hücrelerde nükleer dinamiklerin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the ...