Biz electroformation cihazı oluşturmak için Bryan Venema ve Eric Martinson teşekkür ederim. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Genel Tıp Ulusal Bilimler Enstitüleri hibe (SEG için R01GM100718) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Göz Enstitüsü (SEG için R01EY017564) tarafından finanse edildi.

1. Organik Solventler gelen Lipidler birikimi: Klasik Protokolü <ol><li> . -20 ° C veya -80 ° C &#39;de depolama lipidler çıkarın; rt&#39;ye Dikkat: Lipidlerin çok higroskopiktir ve çok sayıda oksijen duyarlıdır. Kuru Argon veya azot gaz lipidler Kapak ve tüm adımları hava maruz kalma en aza indirmek. </li><li> Gerekirse, mg / ml 1-10 de kloroform veya sikloheksanda lipidler askıya; üreticinin belirtilen konsantrasyonları sadece DİKKAT genellikle anma olduğuna dikkat:. Organik çözücü kullanırken uygun eldiven ve diğer kişisel koruyucu ekipman kullanın. Birçok malzeme hala bu çözücülere geçirgen ve sadece geçici koruma sağlamak gibi çözücü, onlara dökülen olmadığını hızlı bir şekilde KKD çıkarın. </li><li> Etanol ile iki 25 x 37.5 mm ITO kaplı cam slaytlar her iki temizleyin </li><li> Istenen molar oranları elde etmek için lipidler karıştırın. Her 1 cm için İTO alanı 2 dudak ile kaplı olması slaytlarid, karışım ~ lipidlerin 15-20 mg. . Hem 25 x 37.5 mm slayt tamamen kaplanacak olsaydı Örneğin, biz genellikle 10 mg / ml lipid karışımı Not 30 ul kullanabilirsiniz: Texas floresan görüntüleme için Kırmızı-DPPE ve için aşağıya bakınız hakkında uyardı 0.1 mol% ekleyin floresan boyalar. </li><li> Cam slaytların İTO kaplı yan bir ohmmetre veya multimetre ile yüzey direnci ölçerek yukarı baktığından emin olun. </li><li> . Bir çözücü dayanıklı şırınga Dikkat içine lipidler aspire: Hayır yapıştırıcılar veya PTFE dışında plastik, organik çözücü başvurmalısınız. </li><li> Şırınga iğnesi oldukça İTO yüzeyine dokunmadan ile, yavaş yavaş slayt sağına soluna iğne hareket lipid geçerlidir. Cam yüzey üzerinde bir &quot;gökkuşağı parlaklık&quot; arayan, eşit olarak kaplanmalıdır. </li><li> Herhangi bir iz çözücünün çıkması için 0.5-1 saat boyunca, &lt;1 torr (1 mm Hg) vakum altında hızlı bir şekilde Saydamlarınızı. Inert gaz ile vakum bırakın. </li><li> Bir ile, bir silikon conta uygulayınher iki tarafta silikon vakum yağ ince bir tabaka. Sürgünün bir ucunda açık ortaya bir slayt, en az 5 mm bırakın. </li><li> Bölüm 4 hemen geçin. </li></ol> 2. Kontrollü Dehidrasyon için küçük Liposome Hazırlık <ol><li> Adım 1.1 &#39;de 1.4 lipid karışım hazırlayın. </li><li> 10-15 mm çaplı kültür tüpü bir Argon akımı ya da azot gazı kullanarak lipidler kurutun. Lipidler az miktarda için, ≤ 0.5 mg, ortaya çıkan film, doğrudan kalan solvent kaldırmak için 0.5-1 saat vakum altında yerleştirdikten sonra sulu olabilir; 2.5 adıma geçin. Lipid büyük miktarlarda bile, vakum altında yoğun bir jelin organik solvent tuzağına düşebilmektedirler ve daha iyi liyofilizasyon ile hazırlanır; adımları 2.3-4 bkz. </li><li> , Sikloheksan içinde kuru lipid filmi Askıda bir tapa ile Argon ve contalı kapak, en az 1 saat boyunca -80 ° C &#39;de soğuk bir blok ve dondurucuda tüp yerleştirin. </li><li> Bir vakum sisteminde soğuk blok ve lipid örnek yerleştirin100 mTorr ulaşma yeteneğine. Vakum uygulayın, bu çözücü sublimes kapalı olarak yaklaşık 1 mmHg &#39;de &quot;durak&quot; olacak. Bir kez çözücü tamamen (~ 1 saat) kaldırılır vakum bu seviyenin altına düşecek. Inert gaz ile vakum serbest bırakın ve hemen tüp veya hidrat mühür. </li><li> Lipidler vakum altında iken, gazını hidrasyon tampon vakum kullanılarak ve 15-17 serpilerek. </li><li> Nihai konsantrasyon yaklaşık 1-10 mg / ml &#39;de gazı alınmış tamponu kullanılarak lipidlerin hidratı. Yavaş yavaş hidrat için lipidler izin verin. Sonra 30 dakika-1 saat, kalan kümeleri kırmak için girdap. Tam hidrasyon için izin vermek için ek bir 0.5-1 saat bekleyin. Aşağıdaki adımda tam su kaybını önlemek için, bu tür 200 mm&#39;ye kadar, sorbitol veya sukroz gibi, bir osmoticant kullanın. </li><li> Ekstrüzyon ile 100-200 nm çapında lipozomlar hazırlayın. Ayrıntılar için üreticinin ekstrüzyon protokolü. Tampon ~ 25 mM iyonik kuvvet, ya da özel electroformation gerilim protokolleri daha az Bölüm 4 gerekli olacak olması gerektiğini unutmayın. </li></ol> 3.Küçük Lipozomlar Kontrollü Dehidrasyon tarafından Lipidlerin birikimi <ol><li> Dikkat: Bizim protokol lipidler birçok saat boyunca, doymuş tuz çözeltileri ile buhar denge içinde yerleştirilmesini gerektirir. Önemle bir torpido gözü veya benzeri muhafaza kullanarak, bir inert gaz atmosferinde protokol performans tavsiye ederiz. </li><li> Dikkat: proteinleri içeren örnekleri hazırlamak ise, tam dehidratasyonu önlemek. Hidrat sıcak su kabı ile herhangi bir muhafaza içinde atmosfer, ya da bir sonikatör tabanlı nemlendirici. En az% 30 nispi nem olmadığından emin olmak için, bir higrometre kullanın. Toplam su kaybını önlemek için ek bir önlem olarak küçük bir lipozom tamponu içinde sorbitol veya sukroz kullanın. </li><li> Uygun bir nisbi rutubet doymuş bir tuz çözeltisi hazırlayın. Hedef nem vezikül hazırlık ozmolarite bağlıdır. Düşük osmolaritesi vezikül hazırlıklarında yeterli susuz olabilir iken fizyolojik osmolaritesi ile hazırlıkları için, 30-45% RH kullanımı75-90% RH (Tablo 1 Ayrıca bakınız) ile denge. </li><li> Bir iç raf bir sıkı yapışmalı kapta doymuş tuz solüsyonu ve aşırı tuz koyun. Çok iyi yoğurt ve granola iş için ticari gıda kapları. Doldurduktan sonra raf değiştirin ve emin sıvı raf altında 5-10 mm olduğundan emin olun. </li><li> Bölüm 1&#39;deki gibi temiz ITO kaplı slaytlar. Iletken olan tarafı belirlemek ve örnek adı ile iletken olmayan tarafı etiketlemek için multimetre kullanın. </li><li> Hafifçe yağ bir veya daha fazla delik ile silikon (USP VI) conta (lar) arasında her iki taraf. </li><li> Bankta slaytlar iletken tarafı yukarı yerleştirin ve electroformation aparatı bağlanmak için bir ucunda maruz slayt en az 5 mm olduğundan emin yapma, lipid uygulanacak her slayt için silikon conta (lar) uygulanacaktır. Iyi bir sızdırmazlık sağlamak için conta pürüzsüz. </li><li> ~ 1-2 mg / ml için düşük tuz isosmotic tampon vezikül hazırlık sulandırmak. Biz daha yüksek concentr bulmakations kötü sonuçlar üretir. </li><li> 1-10 ul damla slayt lipid uygulayın. Küçük damla genellikle daha iyi sonuçlar üretir. </li><li> Doymuş tuz çözeltisi üzerinde iç rafta slayt yerleştirin ve sıkıca konteyner mühür. O / N ile 3 saat için oda sıcaklığında bırakın Kabın 4 ° C sıcaklıkta yerleştirilebilir, ancak bazı tuzları, RH sıcaklık ve bu soğuk sıkı sıkıya bağlıdır dikkat dengelenme süresi artar. </li><li> Ortaya çıkan film, ona hafif bir gökkuşağı parlaklık olabilir, ama her durumda yaklaşık kurutulmuş görünmelidir. Yüksek ozmotik başlangıç ​​çözümleri bir lipid filmi tamamen kurumasını imkansız olabilir, bu olumsuz sonuçları etkilemez. </li></ol> 4. Dev lipozomlar Electroformation <ol><li> Özellikle lipid filmi, kurutulmuş lipozom oluşan bu, kolayca yerinden edilir. Dikkatlice hidrat her bir contanın kenarında bir 27 G şırınga iğnesi yerleştirilmesi ve yavaş yavaş tampon uygulayarak. Tamponlar yapabilirsinizsuyu, ≤ 200 mM sukroz, ≤ 1 M sorbitol ve ≤ 5 mM HEPES. 10&#39;dan fazla mM tuz solüsyonu alternatif electroformation gerilim protokolleri gerektirebilir. ~% 10 de aşırı dolmasına her conta. </li><li> Not: bir kez lipidler sulu olan, lipid filmler hemen tabakalara ayırmak başlar bu yana, kalan adımları arasından hızla devam edin. Electroformation hemen başlarsa verim ve boyut maksimize edilir. </li><li> Tek bir hareketle, conta en üstüne, ikinci bir İTO slayt, iletken yüz uygulayın. Conta alanı dışında ve ilk çıkıntı karşı çıkıntı en az 5 mm olduğundan emin olun. Iyi bir sızdırmazlık sağlamak için hafifçe bastırın. </li><li> Etanol kullanarak iki çıkıntılar temizleyin ve conta bakan tarafı da multimetre ile iletken olduğundan emin olun. </li><li> Istenirse oda daha parafilm veya hafif çekme yay klipleri ile güvence altına alınabilir. </li><li> , &quot;EMI gask alüminyum veya bakır çubuklar güvence altına alarak bir gerilim kaynağına electroformation odası bağlayıniki slaytların iletken yüzeylere et köpük &quot;ya da iletken yapışkanlı bant. Biz EMI conta köpük kullanın. bir jig ve kelepçe için planlar Şekil 5&#39;te gösterilmiştir. </li><li> Hiçbir elektrik kişiler arasında kısa ve temas multimetre kullanarak, İTO yüzeylere doğru bağladığınız olduğunu doğrulayın. </li><li> ° C, en az 10 ° C ila 42 ° C arasında erime sıcaklığı zinciri üzerinde 52 ısı, DPPC örneğin, bölme 10 ° C ila lipidlerin herhangi bir en yüksek erime sıcaklığının üzerinde mevcut ısı </li><li> Düşük tuz tamponlar için, 60-90 dakika süreyle 10 Hz sinüs dalgası, iki İTO kaplı yüzey arasında her milimetre boşluk için ~ 0.7 V rms, geçerlidir. Yüksek tuz tampon için, diğer gerilim protokolleri (bkz. referanslar) kullanılmalıdır. </li></ol> 5. Görüntüleme ve Sorun Giderme <ol><li> Resim Rodamin veya Texas Kırmızı boyalar için bir filtre küp ile donatılmış ters bir mikroskop kullanarak lipozom. Lipozom, küresel olmalıdırağırlıklı olarak gözle unilamellar ve bu lipozom asılı &quot;dizeleri&quot; olarak arızaları. </li><li> Lipozomlar çok küçük ise, daha az yağ kullanır. </li><li> Birçok kusur ya da birkaç lipozomlar vardır, bu jel faz lipidler bağlı olabilir. Electroformation sıcaklığı yükselterek düşünün. </li><li> Az ya da hiç dev lipozomlar susuz küçük lipozomlar tüm oluşan halinde, lipozom tampon ozmotik gücü azaltmak veya electroformation tampon ozmotik gücünü artırmak. Konsantre interstisyel tampon çözeltisi içine bir tamponun kalkış biriken lipid filmi arasında delaminasyona yol açabilir. </li><li> Vezikül verim, kalite, ya da boyutu zayıf ve electroformation veya lipozom tampon tuzları veya pH tamponları dahil ise, alternatif electroformation gerilim protokolleri düşünün. Örneğin, Pott, et al. 11, 90 dakika boyunca bekletilmesi, 50-1,300 Vss / m 30 dakikadan fazla olan voltajı yükselterek, 500 Hz sinüs kullanarak üç adımlı bir protokol tavsiyen 30-60 dakika boyunca 50 Hz frekans azalan. Platin ya da titanyum elektrotlar, bu durumda gerekli olabilir, ancak bu büyük ölçüde protokol değiştirmez. </li></ol>

<ol>
	<li>Dimova, R., Aranda, S., Bezlyepkina, N., Nikolov, V., Riske, K. A., Lipowsky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+giant+vesicles.+Probing+the+membrane+nanoregime+via+optical+microscopy.">A practical guide to giant vesicles. Probing the membrane nanoregime via optical microscopy.</a> Journal of Physics-Condensed Matter. 18 (28), S1151-S1176 (2006).</li><li>Luisi, P. L., Walde, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Giant Vesicles. , (2000).</li><li>Riquelme, G., Lopez, E., Garcia-Segura, L. M., Ferragut, J. A., Gonzalez-Ros, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+liposomes:+a+model+system+in+which+to+obtain+patch-clamp+recordings+of+ionic+channels.">Giant liposomes: a model system in which to obtain patch-clamp recordings of ionic channels.</a> Biochemistry. 29 (51), 11215-11222 (1990).</li><li>Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+vesicles:+preparations+and+applications.">Giant vesicles: preparations and applications.</a> Chembiochem. 11 (7), 848-865 (2010).</li><li>Aimon, S., Manzi, J., Schmidt, D., Poveda Larrosa, J. A., Bassereau, P., Toombes, G. E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+reconstitution+of+a+voltage-gated+potassium+channel+in+giant+unilamellar+vesicles.">Functional reconstitution of a voltage-gated potassium channel in giant unilamellar vesicles.</a> PLoS. One. 6 (10), e25529 (2011).</li><li>Girard, P., Pecreaux, J., Lenoir, G., Falson, P., Rigaud, J. L., Bassereau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+reconstitution+of+membrane+proteins+into+giant+unilamellar+vesicles.">A new method for the reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles.</a> Biophys. J. 87 (1), 419-429 (2004).</li><li>Manley, S., Gordon, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+giant+unilamellar+vesicles+via+hydration+of+a+lipid+film.">Making giant unilamellar vesicles via hydration of a lipid film.</a> Curr. Protoc. Cell. Biol. 24, 1-13 (2008).</li><li>Rodriguez, N., Pincet, F., Cribier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+vesicles+formed+by+gentle+hydration+and+electroformation:+a+comparison+by+fluorescence+microscopy.">Giant vesicles formed by gentle hydration and electroformation: a comparison by fluorescence microscopy.</a> Colloids. Surf. B. Biointerfaces. 42 (2), 125-130 (2005).</li><li>Angelova, M. I., Soleau, S., Meleard, P., Faucon, J. F., Bothorel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+giant+vesicles+by+external+AC+electric+fields.+Kinetics+and+applications.">Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Kinetics and applications.</a> Progressin Colloid &amp; Polymer Science. 89, 127-131 (1992).</li><li>Politano, T. J., Froude, V. E., Jing, B., Zhu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AC-electric+field+dependent+electroformation+of+giant+lipid+vesicles.">AC-electric field dependent electroformation of giant lipid vesicles.</a> Colloids. Surf. B. Biointerfaces. 79 (1), 75-82 (2010).</li><li>Pott, T., Bouvrais, H., M&#233;l&#233;ard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+unilamellar+vesicle+formation+under+physiologically+relevant+conditions.">Giant unilamellar vesicle formation under physiologically relevant conditions.</a> Chem. Phys. Lip. 154 (2), 115-119 (2008).</li><li>Sens, P., Isambert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Undulation+Instability+of+Lipid+Membranes+under+an+Electric+Field.">Undulation Instability of Lipid Membranes under an Electric Field.</a> Phys. Rev. Lett. 88 (12), (2002).</li><li>Green, N. G., Ramos, A., Gonz&#225;lez, A., Morgan, H., Castellanos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+flow+induced+by+nonuniform+ac+electric+fields+in+electrolytes+on+microelectrodes.+I.+Experimental+measurements.">Fluid flow induced by nonuniform ac electric fields in electrolytes on microelectrodes. I. Experimental measurements.</a> Phys. Rev. E. 61 (4), 4011-4018 (2000).</li><li>Baykal-Caglar, E., Hassan-Zadeh, E., Saremi, B., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+giant+unilamellar+vesicles+from+damp+lipid+film+for+better+lipid+compositional+uniformity.">Preparation of giant unilamellar vesicles from damp lipid film for better lipid compositional uniformity.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1818 (11), 2598-2604 (2012).</li><li>Bakalyar, S. R., Bradley, M. P. T., Honganen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+dissolved+gases+in+high+-performance+liquid+chromatography.">The role of dissolved gases in high -performance liquid chromatography.</a> J. Chromatogr. A. 158, 277-293 (1978).</li><li>Brown, J. N., Hewins, M., Van Der Linden, J. H. M., Lynch, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solvent+degassing+and+other+factors+affecting+liquid+chromatographic+detector+stability.">Solvent degassing and other factors affecting liquid chromatographic detector stability.</a> J. Chromatogr. A. 204, 115-122 (1981).</li><li>Dolan, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobile+Phase+Degassing-Why,+When,+and+How.">Mobile Phase Degassing-Why, When, and How.</a> LC-GC. 17 (10), 909-912 (1999).</li><li>Cheng, H., Jiang, X., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+lipid+homeostasis+of+mouse+dorsal+root+ganglia+induced+by+apolipoprotein+E+deficiency:+a+shotgun+lipidomics+study.">Alterations in lipid homeostasis of mouse dorsal root ganglia induced by apolipoprotein E deficiency: a shotgun lipidomics study.</a> J. Neurochem. 101 (1), 57-76 (2007).</li><li>Greenspan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humidity+fixed+points+of+binary+saturated+aqueous+solutions.">Humidity fixed points of binary saturated aqueous solutions.</a> J. Res. Natl. Bur. Stand. 81 (1), 89-96 (1977).</li><li>Rockland, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saturated+Salt+Solutions+for+Static+Control+of+Relative+Humidity+between+5+&#176;+and+40+&#176;C.">Saturated Salt Solutions for Static Control of Relative Humidity between 5 &#176; and 40 &#176;C.</a> Anal. Chem. 32 (10), 1375-1376 (1960).</li><li>Washburn, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> International Critical Tables of Numerical Data, Physics, Chemistry and Technology (1st Electronic Edition). , 216-249 (2003).</li><li>Estes, D. J., Mayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+liposomes+in+physiological+buffer+using+electroformation+in+a+flow+chamber.">Giant liposomes in physiological buffer using electroformation in a flow chamber.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1712 (2), 152-160 (2005).</li><li>Ayuyan, A. G., Cohen, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Peroxides+Promote+Large+Rafts:+Effects+of+Excitation+of+Probes+in+Fluorescence+Microscopy+and+Electrochemical+Reactions+during+Vesicle+Formation.">Lipid Peroxides Promote Large Rafts: Effects of Excitation of Probes in Fluorescence Microscopy and Electrochemical Reactions during Vesicle Formation.</a> Biophys. J. 91 (6), 2172-2183 (2006).</li><li>Morales-Penningston, N. F., Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GUV+preparation+and+imaging:+minimizing+artifacts.">GUV preparation and imaging: minimizing artifacts.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1798 (7), 1324-1332 (2010).</li><li>Grit, M., de Smidt, J. H., Struijke, A., Crommelin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrolysis+of+phosphatidylcholine+in+aqueous+liposome+dispersions.">Hydrolysis of phosphatidylcholine in aqueous liposome dispersions.</a> Int. J. Pharm. 50 (1), 1-6 (1989).</li><li>Zhou, Y., Berry, C. K., Storer, P. A., Raphael, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxidation+of+polyunsaturated+phosphatidyl-choline+lipids+during+electroformation.">Peroxidation of polyunsaturated phosphatidyl-choline lipids during electroformation.</a> Biomaterials. 28 (6), 1298-1306 (2007).</li><li>Farkas, E. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+polarization+imaging+of+steady-state+molecular+order+in+ternary+lipid+vesicles+for+the+purpose+of+lipid+phase+assignment.">Multiphoton polarization imaging of steady-state molecular order in ternary lipid vesicles for the purpose of lipid phase assignment.</a> J. Phys. Chem. B. 114 (47), 15512-15522 (2010).</li><li>Hauser, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+ultrasonic+irradiation+on+the+chemical+structure+of+egg+lecithin.">The effect of ultrasonic irradiation on the chemical structure of egg lecithin.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 45 (4), 1049-1055 (1971).</li><li>Hauser, H., Cevc, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+vesicles.">Phospholipid vesicles.</a> Phospholipids Handbook. , (1993).</li><li>Veatch, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electro-formation+and+fluorescence+microscopy+of+giant+vesicles+with+coexisting+liquid+phases.">Electro-formation and fluorescence microscopy of giant vesicles with coexisting liquid phases.</a> Meth. Mol. Biol. 398, 59-72 (2007).</li><li>Kim, R. S., LaBella, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+analytical+methods+for+monitoring+autoxidation+profiles+of+authentic+lipids.">Comparison of analytical methods for monitoring autoxidation profiles of authentic lipids.</a> J. Lipid. Res. 28 (9), 1110-1117 (1987).</li><li>Veatch, S. L., Leung, S. S. W., Hancock, R. E. W., Thewalt, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+probes+alter+miscibility+phase+boundaries+in+ternary+vesicles.">Fluorescent probes alter miscibility phase boundaries in ternary vesicles.</a> J. Phys. Chem. B. 111 (3), 502-504 (2007).</li><li>Juhasz, J., Davis, J. H., Sharom, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+probe+partitioning+in+GUVs+of+binary+phospholipid+mixtures:+implications+for+interpreting+phase+behavior.">Fluorescent probe partitioning in GUVs of binary phospholipid mixtures: implications for interpreting phase behavior.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1818 (1), 19-26 (2012).</li><li>Herold, C., Chwastek, G., Schwille, P., Petrov, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+electroformation+of+supergiant+unilamellar+vesicles+containing+cationic+lipids+on+ITO-coated+electrodes.">Efficient electroformation of supergiant unilamellar vesicles containing cationic lipids on ITO-coated electrodes.</a> Langmuir. 28 (13), 5518-5521 (2012).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Dev lipozomlar Electroformation çeşitli lipitler, preparatları ve tamponlar ile uyumlu esnek bir yöntem haline gelmiştir. Lipit birikmesini sürecin dikkatle kontrol başarısı için çok önemlidir. Biz küçük lipozom preparatları basit bir süreçten lipidlerin kontrollü birikimi yapmak için basit araçlar sunduk. Nispi nem ilk lipozomlar uygun dehidrasyon için kritik olan, ve en iyi değeri lipozom süspansiyonu, katıların başlangıç ​​konsantrasyonuna bağlı olarak değişecektir. Düşük bağ?...

Dev lipozomlar (genellikle dev unilamellar veziküller veya GUVs denir) öncelikle çift katlı deformasyon, yanal faz bir arada (&quot;sal&quot;), membran füzyon, vb 1-4 çalışmaları da dahil olmak üzere çift katlı lipit katmanını fiziği ve fiziksel kimya, incelemek için kullanılmıştır. Kolayca çevredeki sulu tampon farklı yapılabilir, sulu bir iç çevreleyen zarın küresel kabuk: Bir ağır hücre-benzeri bir yapıya sahiptir. Onlar, tanımı gereği, çapı ≈ 1-100 mikron, böylece ışık mikroskobu çeşitli yaklaşımlar kullanılarak görüntülenebilir vardır. Bunlar genellikle yumuşak iken, bunların özellikleri kolay kullanım için manipüle edilebilir, böylece ozmotik eğimleri veya mekanik olarak uygulanan gerilim ile gergin yapılabilir. Özellikle, lipozomun bir &quot;sertlik&quot; elektrofizyoloji &quot;lipozom-bağlı&quot; ya da eksize yamalar oluşturmak için o basit kontrol etmektedir. Geçmişte, iyon kanalı sulandırma büyük ölçüde düzlemsel bir lipit b gerçekleştirildiilayers. Şimdi, dev lipozomlar gelen yamalar oluşturmak ve geleneksel elektrofizyoloji için geliştirilen araçların önemli titreme (floresan mikroskobu, mikropipet aspirasyon, hızlı perfüzyon ve sıcaklık kontrolü, vb) kullanma yeteneği sulandırma çalışmaları 5,6 için dev lipozomlar giderek daha cazip hale getirmektedir. Dev lipozomlar birçok strateji tarafından yapılmıştır. Kurutulmuş bir lipid filmi 4,7,8 sulandırılır Aslında, dev lipozomlar bir şişme işlemi ile kendiliğinden oluşturur. Daha hızlı daha büyük hazırlamak arzusu, daha düzgün lipozomlar electroformation 1,9 aralarında baş diğer yaklaşımlar, araştırmacılar yol açtı. Electroformation de kurutulmuş bir lipid filmi hidrasyonu dayanır, ancak lipid filmi arasında salınımlı bir elektrik alanının uygulanması yoluyla işlemini hızlandırır. Alan veya su ile ayrılmış, iki elektrot, platin teller ya veya İndiyum-Kalay-Oksit (ITO) kaplı cam slaytlar ile uygulanırtampon ve hangi üzerine lipidler yatırılır. Lipozomlar şişme hızlandırarak, daha büyük bir lipozomlann daha yüksek bir verim elde eder. Böylece, electroformation dev lipozomlar 4 üretmek için varsayılan yöntem haline gelmiştir. Electroformation mekanizması tam olarak anlaşılamamıştır ve protokollerin çoğu (örneğin 10,11) deneysel olarak geliştirilmiştir. Yine de, teori ve bazı ampirik sonuçları dikkate alınarak beklemek ne hakkında biraz bilgi edinebilirsiniz. Bu yaygın electroformation biriken lipid filmi 10,11 yığılmış bağımsız lipid iki tabakanın arasında bulunan bir tampon arasında elektro-ozmotik akış sürerek olduğuna inanılır. Çift katlı lipit katmanını termal dalgalanmalara Elektrostatik bağlantısı da muhtemelen 12 ilgilenmektedir. Bu hipotez niteliksel 10,12 kullanılabilir elektrik alan frekans ve güç için üst sınır tahmin. Özellikle de, bu yüksek iletkenliği olan çözümler tahmin edilmektedir ( <em&gt; yani fizyolojik tuz çözeltileri) lipozom electroformation 12 başlatabilir elektrohidrodinamik kuvvetleri azaltır. Elektro-akış oranları genellikle artan tuz konsantrasyonu ile azalır ve sık sık bir elektrik alanı salınım frekansı (örneğin, farklı bir geometriye, Green ve ark. 13 de olsa) zirve edilir. Böylece, daha yüksek alan güçlü ve yüksek frekanslarda sınırları 10 içinde, yüksek iletkenlik çözüm için makul. Bununla birlikte, membran proteinleri daha sonra, ince bir lipid filmi terk etmek için buharlaştırılarak organik çözücü içinde, yani, electroswelling işlem için elektrotlar üzerine lipid yatırma olağan yöntem ile uyumlu olması muhtemeldir. Bu zorluk etrafında iki temel yol vardır: dev lipozom oluşumundan sonra proteinler dahil etmek, ya da lipid yatırılır nasıl adapte. Yaklaşımımız lipid ve reconsti yatırmak diğerleri 5,11 üzerine inşaküçük veya büyük &quot;proteoliposomes&quot; bir süspansiyon araya membran proteini TÜTED. Biz (Collins ve Gordon, yorumda) başka bir yerde protein ve lipid saflaştırılmış proteoliposomes üretme uzun ve daha zorlu süreci tanımlamak. Burada, herhangi bir proteinin yokluğunda protokol açıklar, ancak protein dahil edildiğinde bu aynıdır, biz iyon kanalı TRPV1 içeren proteoliposomes GUVs dönüştürülmüş ve patch-clamp elektrofizyoloji için kullanılabilir olduğunu gösteren sonuçlar bulunmaktadır. Her electroformation yaklaşımda, lipit birikmesini işlemi sırasında lipid örnek görsel inceleme başarısı için çok önemlidir. Yaklaşımımız iyon kanalı sulandırma için özel bir uygulama ilerisi için uygun olabilir. Öncelikle bu protokolü geliştirildi ve şimdi, aynı zamanda lipid electroformation için elektrotlar üzerinde biriken edildiği şekilde ortaya çıkan GUVs en kompozisyon heterojen nasıl etkilediğini gösterilmiştir beri süre içinde. BaykAl-Çağlar ve ark. 14 dikkatle kurutulmuş lipozom oluşan GUVs çeşitli fosfolipidleri ve kolesterol karışımlarından oluşan GUVs karışabilirliklerine geçiş sıcaklığında bir 2.5 kat daha küçük bir varyasyonu olmadığını gösterdi. Bunların çalışma lipid kanşımından lipidler, özellikle de kolesterol, Mayıs çökelti biriken lipid filmi bileşiminde büyük mekansal değişimi ile sonuçlanan, organik çözücü tevdi var olduğunu gösterir. Bu lipit membran faz davranışları çalışmaları için önemlidir, aynı zamanda iyon kanalı fonksiyonu kantitatif deneyler için kritik olabilir. Baykal-Çağlar ve ark. &#39;In protokol benzer ama kendi ile aynı değildir, ve okuyucular gibi iyi çalışmak için teşvik edilmektedir. Bu protokol, (genel bakış, Şekil 1 &#39;e bakınız) kullanılabilir birçok biridir. Prensip electroformation başarı olarak lipit karışımı, hidrasyon, sıcaklık, diğer solütler (özellikle iyonlar), ve bağlıdıroluşumunda kullanılan ders voltaj ve frekans. Electroformation daha iyi anlaşılır hale geldikçe, daha bizim protokol rafine bekliyoruz. Son olarak, dev lipozomlar elektro dik bir öğrenme eğrisi çoğu zaman. Biz lipozomal süspansiyonlar (Bölüm 2-5) den lipidler yatırmak öğrenme önce mastering geleneksel protokolü (Bölüm 1 ve 4, ve, gerekirse, Bölüm 5) öneririz.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Multimeter</td>
			<td>Agilent Technologies, <a href="http://www.agilent.com" target="_blank">www.agilent.com</a></td>
			<td>U1232A or similar</td>
			<td>Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Fluke</td>
			<td>117 or 177</td>
			<td>Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function Generator</td>
			<td>Agilent Technologies, <a href="http://www.agilent.com" target="_blank">www.agilent.com</a></td>
			<td>33210A or similar</td>
			<td>Most function generators work for simple protocols. This programmable model is useful for advanced electroformation protocols. Make sure the generator can drive 10 V peak-to-peak into a 50 &Omega; load</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITO coated glass slides</td>
			<td>Delta Technologies, Loveland, CO <a href="http://www.delta-technologies.com" target="_blank">www.delta-technologies.com</a></td>
			<td>CB-90IN-S107 or similar</td>
			<td>Break these in half to make two slides, 25 mm x 37 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Omega Engineering Stamford, CT <a href="http://www.omega.com" target="_blank">www.omega.com</a></td>
			<td>CNi3233 or similar</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygrometer</td>
			<td>Extech, Nashua, NH, <a href="http://www.extech.com" target="_blank">www.extech.com</a></td>
			<td>445815</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone rubber sheet</td>
			<td>McMaster-Carr Elmhurst, IL <a href="http://www.mcmaster.com" target="_blank">www.mcmaster.com</a></td>
			<td><a href="http://www.mcmaster.com/#87315K64" target="_blank">87315K64</a></td>
			<td>Use USP Grade VI silicone for its high purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMI gasket</td>
			<td>Laird Technologies <a href="http://www.lairdtech.com" target="_blank">www.lairdtech.com</a></td>
			<td>4202-PA-51H-01800 or similar</td>
			<td>Distributed by Mouser <a href="http://www.mouser.com" target="_blank">www.mouser.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TxR-DHPE</td>
			<td>Life Technologies, Carlsbad, CA <a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank">www.lifetechnologies.com</a></td>
			<td>T1395MP</td>
			<td>Other fluorescently labeled lipids are available, but TxR-DHPE is one of the brightest and most photostable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL <a href="http://www.avantilipids.com" target="_blank">www.avantilipids.com</a></td>
			<td>850457P or 850457C</td>
			<td>Lipids can be ordered as powders (P) or in chloroform (C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPS</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840034P/C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8667</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

giant liposome preparation for imaging and patch-clamp electrophysiology

Elektrofizyolojik kayıt için kimyasal yapısı lipid membranlar içine iyon kanallarının sulandırma bu önemli proteinlerin işlevini tanımlamak ve keşfetmek için güçlü bir teknik olmuştur. Ancak, düzlemsel bilayers gibi klasik preparatlar, sulandırılmış kanal ve membran ortamında yapılabilir manipülasyonlar ve deneyler sınırlar. Dev lipozomlar daha fazla hücre-benzeri bir yapı lipid ortam kontrolü ödün vermeden geleneksel patch-clamp deneyleri izin verir. Electroformation bir elektrot yüzeyinde biriken ince, sipariş edilen lipit filme gerilim alternatif uygulama dayanır çapı dev lipozomlar&gt; 10 um üretmek için etkili bir ortalamasıdır. Klasik protokol organik çözücüler yatırılır lipidler çağrısında beri Ancak, iyon kanalları gibi daha az güçlü membran proteinleri ile uyumlu değildir ve değiştirilmesi gerekir. Son zamanlarda, protocols bizim laboratuarda protein içeren lipozomlara adapte kısmen kurutulmuş küçük lipozomlar arasından dev lipozomlar Electroform için geliştirilmiştir. Burada arka plan, ekipman, teknikleri, ve küçük lipozom dağılımları gelen dev lipozomlar electroformation tuzaklar mevcut. Biz takip daha zorlu protokolleri başlamadan önce ilk hakim olmalıdır klasik protokol ile başlar. Biz doymuş tuz çözeltileri ile buhar denge kullanarak küçük lipozomlar kontrollü kısmi dehidrasyon süreci göstermektedir. Son olarak, electroformation kendisinin işlemi göstermektedir. Biz yüksek kaliteli lipozomlar üretmek ve en iyi sonuçları elde etmek için her aşamada hazırlık görsel denetim tanımlamak için in-house yapılabilir basit ve ucuz ekipman anlatacağız.

Bizim örneklerde, yaklaşık 55 mol% POPC (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glisero-fosfokolin),% 15 mol POP (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glisero-fosfoserin karışımından lipozomların hazırlanması , 30% mol kolesterol ve% 0.1 mol Teksas 1,2-dipalmitoil-sn-fosfoetanolamin (DPPE-TxR) Kırmızı-etiketli. Bu bileşim, 18 Dorsal kök ganglion lipidlerin yaklaşık Örnek olarak seçildi. Biz% 15 mol olacaktır dikkat Lipid (buradan çıkar) (örneğin Walde ve ark. 4)</...

Watch this Scientific Journal Video about Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology at JoVE.com

Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

Yama-kelepçe elektrofizyoloji ile kombine edildiğinde tanımlanan kompozisyon dev lipozomlar içine fonksiyonel membran proteinleri yeniden kurgulamak güçlü bir yaklaşımdır. Ancak, geleneksel dev lipozom üretim protein istikrar ile uyumsuz olabilir. Biz saf lipidler veya iyon kanalları içeren küçük lipozomlar gelen dev lipozomlar üretmek için protokolleri tarif.

Görüntüleme ve Patch-Kelepçe Elektrofizyoloji için dev Liposome Hazırlık

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify ...

giant-liposome-preparation-for-imaging-patch-clamp

Research

JoVE Journal

Biology

22.0K Görüntüleme.  University of Washington. Yama-kelepçe elektrofizyoloji ile kombine edildiğinde tanımlanan kompozisyon dev lipozomlar içine fonksiyonel membran proteinleri yeniden kurgulamak güçlü bir yaklaşımdır. Ancak, geleneksel dev lipozom üretim protein istikrar ile uyumsuz olabilir. Biz saf lipidler veya iyon kanalları içeren küçük lipozomlar gelen dev lipozomlar üretmek için protokolleri tarif.

Video: Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. Electrical recordings from the presynaptic terminal allow the measurement of action potentials, calcium channel currents, vesicle fusion (exocytosis) and subsequent membrane uptake (endocytosis). The fusion of vesicles containing neurotransmitter causes the vesicle membrane to be added to the cell membrane of the calyx. This increase in the amount of cell membrane is measured as an increase in capacitance. The subsequent reduction in capacitance indicates endocytosis, the process of membrane uptake or removal from the calyx membrane. Endocytosis, is necessary to maintain the structure of the calyx and it is also necessary to form vesicles that will be filled with neurotransmitter for future exocytosis events. Capacitance recordings at the calyx of Held have made it possible to directly and rapidly measure vesicular release and subsequent endocytosis in a mammalian CNS nerve terminal. In addition, the corresponding postsynaptic activity can be simultaneously measured by using paired recordings. Thus a complete picture of the presynaptic and postsynaptic electrical activity at a central nervous system synapse is achievable using this preparation. Here, the methods for slice preparation, morphological features for identification of calyces of Held, basic patch clamping techniques, and examples of capacitance recordings to measure exocytosis and endocytosis are presented.

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal.

Kaliks Patch Kelepçe Kapasitans Kayıtlar Yöntemleri

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

Biyoloji

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Xenopus Oosit ifade İyon Kanalları Patch Kelepçe Kaydı

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording. We first developed this method for fabricating pipettes suitable for recording from small (&lt;3 m) neuronal cell bodies. The basic principal is similar to glass-blowing and combines air pressure and heat to modify the shape of patch pipettes prepared by a conventional micropipette puller. It can be applied to so-called soft (soda lime) and hard (borosilicate) glasses. Generally speaking, pressure polishing can reduce pipette resistance by 25% without decreasing the diameter of the tip opening (Goodman and Lockery, 2000). It can be applied to virtually any type of glass and requires only the addition of a high-pressure valve and fitting to a microforge. This technique is essential for recording from ultrasmall cells (&lt;5 m) and can also improve single-channel recording by minimizing pipette resistance. The blunt shape is also useful for perforated-patch clamp recording since this tip shape results in a larger membrane bleb available for perforation.

This is a guide to modifying the shape of glass micropipettes. Specifically, by using heat and air pressure the taper is widened without increasing the tip opening, leading to lower pipette resistance. This is critical to obtain low noise recordings of small cells but is useful in many applications.

Geliştirilmiş Patch-kelepçe kayıt için Basınç-parlatma Pipetler

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording.  We first developed this method for fabricating pipettes suitable for ...

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can be used for many different studies, such as the characterization of membrane-active peptides, the reconstitution of ion channels or investigations on how changes in lipid bilayer properties alter the function of bilayer-spanning channels.  Here, we show how to form a planar bilayer and how to isolate small patches from the bilayer, and in a second video  will also demonstrate a procedure for using gramicidin channels to determine changes in lipid bilayer elastic properties.   We also demonstrate the individual steps needed to prepare the bilayer chamber, the electrodes and how to test that the bilayer is suitable for single-channel measurements.

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. Here, we demonstrate the individual steps needed to prepare the bilayer chamber, the electrodes and how to test that the bilayer is suitable for single-channel measurements.

Elektrofizyoloji Deneyler Yapay Bilayers hazırlanması

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can ...

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

Omurilik Elektrofizyoloji

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

İyon Kanalları incelenmesi için yama Kelepçe ve Perfüzyon Teknikleri cinsinden ifade edilir Xenopus Oosit

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

Patch Clamp Elektrofizyoloji ve Basınç kasılmaların kâğıda çizilmesi kullanarak arteriyel düz kas KV7 Potasyum Kanal Fonksiyon Exploring

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated sensor chip and a phosphatidylcholine monolayer on top. This assembly is mounted into a cuvette system containing the reference electrode, a chlorinated silver wire.
After adsorption of membrane fragments or proteoliposomes containing the membrane protein of interest, a fast solution exchange is used to induce the transport activity of the membrane protein. In the single solution exchange protocol two solutions, one non-activating and one activating solution, are needed. The flow is controlled by pressurized air and a valve and tubing system within a faraday cage.
The kinetics of the electrogenic transport activity is obtained via capacitive coupling between the SSM and the proteoliposomes or membrane fragments. The method, therefore, yields only transient currents. The peak current represents the stationary transport activity. The time dependent transporter currents can be reconstructed by circuit analysis.
This method is especially suited for prokaryotic transporters or eukaryotic transporters from intracellular membranes, which cannot be investigated by patch clamp or voltage clamp methods.

Here we present an electrophysiological method based on solid supported membranes with focus on its applications for the characterization of electrogenic membrane transporters.

Elektrofizyoloji Tabanlı Katı Desteklenen Membran Giriş

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ring-supported hydrophilized PTFE membrane to provide structural support to both living and fixed tissue during immunohistochemical processing, which allows for the use of a variety of protocols that would otherwise cause damage to the tissue. First, this is demonstrated with bolus loading of fluorescent markers into living retinal tissue. This method allows for quick visualization of targeted structures, while the membrane support maintains tissue integrity during the injection and allows for easy transfer of the preparation for further imaging or processing.
Second, a procedure for antibody staining in tissue fixed with carbodiimide is described. Though paraformaldehyde fixation is more common, carbodiimide fixation provides a superior substrate for the visualization of synaptic proteins. A limitation of carbodiimide is that the resulting fixed tissue is relatively fragile; however, this is overcome with the use of the supporting membrane. Retinal tissue is used to demonstrate these techniques, but they may be applied to any fragile tissue.

The protocol described here is for structural assessment of a wholemount retinal preparation. This includes descriptions of tissue dissection, mounting onto a hydrophilized polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane insert, bolus loading with fluorescent markers, and a comparison of fixation with carbodiimide and paraformaldehyde for immunohistochemical analysis of cellular and synaptic components.

Görüntüleme ve İmmünhistokimyanın için Retina Wholemount Hazırlık için optimize edilmiş Protokolü

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

Tek kanallı bir hücre-bağlı Patch-clamp kayıt

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...