We thank Susanne Fenz for discussing the possibility of reconstituting proteins by agarose swelling, Feng Ching Tsai for current measurements, and present and former members of the Bassereau group for support and assistance. The project was funded by the Agence Nationale de la Recherche (grant BLAN-0057-01), by the European Commission (NoE SoftComp), by the Universit&#233; Pierre et Marie Curie (grant from the FED21, Dynamique des Syst&#232;mes Complexes). M.G. was supported by an Institut Curie International PhD Fellowship, S.A. by a fellowship from the Fondation pour la Recherche M&#233;dicale, G.E.S.T. by a Marie Curie Incoming International Fellowship from the European Commission and a grant from the Universit&#233; Pierre et Marie Curie. The publication fees were covered by the Labex &#8216;CelTisPhyBio&#8217; (ANR-11-LABX0038).

1. Çözüm hazırlanması <ol><li> 5 mM KCI, 1 mM HEPES (pH 7.4) veya tris (pH 7.5) ve 2 mM trehaloz içeren &quot;SUV tamponu&quot; 5 ml hazırlayın. 0.2 um&#39;lik bir şırınga filtresi ile filtre tampon ve -20 ° C&#39;de muhafaza edilebilir, 1 ml&#39;lik porsiyonlar halinde böler. NOT: reaktif ve aletler için ek ayrıntılar malzemeleri listesinde verilmiştir. </li><li> Film rehidrasyon sırasında GUV içini dolduracak Şef &#39;Büyüme Tampon&#39; 40 ml hazırlayın. &#39;Düşük bir tuzu büyümesi için, 5 mM KCI, 1 mM HEPES (pH 7.4) ya da 1 mM TRIS (pH 7.5) ve ~ 400 mM sukroz birleştirir. Bir fizyolojik tuz &quot;büyüme için, 100 mM KCI, 5 mM HEPES (pH 7.4) veya 5 mM Tris (pH 7.5), ve yaklaşık 200 mM sukroz birleştirir. </li><li> 100 mM KCI, 5 mM HEPES (pH 7.4) veya 5 mM Tris (pH 7.5), ve yaklaşık 200 mM glukoz birleştirerek deney odası içinde dış çözüm &#39;Gözlem Tamponu&#39; 40 ml hazırlayın. NOT: Bu tamponlar sadece exa vardırörnek olarak şunlar verilebilir. Diğer deneyler için tamponlar adapte tartışma bakın. </li><li> Bir Osmometer ile büyüme ve gözlem tamponlarının osmolarities ölçün. GUVs lize ya da gözlem odasına büyüme odasına transfer katlanmayacak olmayacak şekilde% 1 içinde eşleştirmek için sakaroz veya glukoz ilave et. Not: sükroz, 1 mM (13.7, 40 ml başına mg), glikoz (40 ml başına 7.2 mg) ilave edildikten bu konsantrasyon aralığında, içinde yaklaşık 1 mOsm sureti ile osmolaritenin arttırır. </li><li> 0.2 um&#39;lik bir filtre ile büyüme ve gözlem tamponlar filtre edin ve bakteriyel büyümeyi inhibe etmek için 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> GUVs, sopa yaymak ve kayma olmayacak şekilde deney odası yüzeyleri pasifleştirilmesi için gerekli bir 5 mg / ml p-kasein çözelti oluşturmak için 20 mM TRIS (pH 7.5) tampon maddesi içinde 10 ml p-kazein 50 mg eritin. Beta-kazeın tamamen 0.5 mi alikotlar içinde, filtre (0.2 um) o (4 ° C&#39;de birkaç saat kadar) içinde çözülür sonra hızlı dondurulmuş ve saklanabildiğiDaha sonra kullanılmak üzere -20 ° C&#39;de (4 ° C&#39;de saklandı çözülmüş alikolar tipik olarak 1 hafta için kullanılabilir). </li></ol> 2. SUV Hazırlık <ol><li> Hazırlayın ve daha önce yayınlanmış detaylı protokolü 28 aşağıdaki proteo-SUV hacimde dondurma. KvAP floresan (kütlece) 01:10 lipid oranının bir protein DPhPC SUV içine yeniden Alexa-488 maleimid (10 mg / ml) ile etiketlenmiş kullanın. Not: Yabani-tür KvAP hücre içi C-terminali (amino asit 247) yer alır monomer için bir sistein ihtiva eder. </li><li> Floresan, Lipid-tek SUV: NOT: nitril eldiven ve koruyucu gözlük takan bir davlumbaz altında kloroform tutun. Kloroform onları çözülür gibi herhangi bir plastik kullanmaktan kaçının. Kloroform çözeltileri Teflon kapaklı ile amber cam viyaller içinde depolanmış ve cam şırınga kullanılarak aktarılabilir. Öncesi ve lipidler pipetle sonra kloroform ile en az 5 ila 10 kat, tüm cam durulama özen gösterin. <ol><li> 100 ul hazırlayınTexas Red-DPHE çözeltisinin 8.2 ul (1 mg / ml ile DPhPC çözeltisi 100 ul kloroform (10 mg / ml) ile karıştırmak suretiyle kırmızı flöresanlı lipid, Teksas Kırmızısı-DHPE, 0.5 mol% ihtiva eden, 10 mg / ml DPhPC SUV 1.5 ml amber cam şişe içinde) metanol. </li><li> Şişe döndürülerek kimyasal başlığı içinde bir azot akışı altında lipitleri kurutun. Film kuru göründüğünde, kalan solventin çıkması için 3 saat vakum altında lipit yerleştirin. </li><li> Lipidler SUV tampon 100 ul ekleyin ve vorteks şiddetle hiçbir lipit flakon duvarlarına yapışmış kalana kadar ve çözüm eşit süt olduğunu. </li><li> SUV oluşturmak üzere, lipid çözeltisi sonikasyon. Ultrason çoğu hareketi neden kadar flakon konumunu ayarlayın ve flakon içine akış ve gereksiz çözüm ısıtmak için değil umurumda almak. Zaman olası çözüm saydam hale gelene kadar devam edin sonikasyon, ya da, şeffaf (uç sonication için 2-5 dakika, ~ banyo sonication için 20 dakika). </li><li> Aliquot SUV (örneğin 10 ul veya 20 ul) ve dondurma (-20 ° C) daha sonra kullanmak. NOT: Yağlar, özellikle doymamış lipidler, kolayca arıza. Argon altında, 20 ° C (veya 80 ° C) mağazası lipit çözeltiler ve 6 ay içinde kullanın. Lipid yıkım ürünleri İnce Tabaka Kromatografisi ile tespit edilebilir. </li></ol></li></ol> Electroformation 3. GUV Büyüme <ol><li> Electroformation odasını hazırlayın. <ol><li> Odası temizlenmiş değilse, pencereleri kaldırmak tüm dolgu macunu ve yağ silin, teller ayıklamak ve durulayın ve su ve dönüşümlü etanol (≥70%) kullanarak bir dokuya sahip odasına fırçalayın. </li><li> Iyi teller Rub aseton teller ve odasına daldırın ve 5 dakika sonikasyon. Bir doku tekrar aseton kullanarak her şeyi silin. 5 dakika boyunca etanol ve sonikasyon odasına koyun. </li><li> Deliklerden kabloları takarak odasına monte, ve döndürmek ve ar emin olmak için teller silinE temiz. Damıtılmış su içinde odasına koyun, 5 dakika boyunca ultrasonik titremeye maruz bırakılır ve bir azot ya da hava akımı ile bölme kurutun. </li></ol></li><li> SUV tamponu içinde 3 mg / ml SUV süspansiyonu 30 ul hazırlayın. , Protein ihtiva eden GUVs meydana proteolitik-SUV 8 ul birleştirmek için (DPhPC 10 mg / ml KvAP 01:10), flüoresan SUV 2 ul (10 mg / ml DPhPC,% 0.5 mol TexasRed-DPHE) ve SUV 20 ul 12.5 ve 0.1 mol% &#39;si TexasRed-DHPE: 1 lipid (kütle) oranında bir nihai protein için bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde tampon eklendi. Şiddetle çözüm karıştırın. <ol><li> Alternatif olarak, sadece flüoresan SUV 10 ul birleştirme, lipid sadece SUV ile protokolü uygulama (10 mg / DPhPC ve% 0.5 mol TexasRed-DPHE mi), 20 | il SUV tamponu ile yıkandı. </li></ol></li><li> SUV Çözüm yatırın. <ol><li> Teller üzerinde SUV çözümün küçük (&lt;0.2 ul) damlacıkları yatırmak için 2 ul pipet veya 5 ul cam şırınga kullanın. Yaklaşık çözeltisi 1 ul boyunca damla bir dizi meydana getirmek üzere gerekli olanTel 1 cm. Damla yeterince küçük ve yeterince onlar dokunmak veya sigorta olmadığını aralıklı emin olun. </li><li> Yatırılan SUV açık havada 30 dakika ~ için kurumasını bekleyin. Tüm damla yerleşti zaman lipit mevduat mikroskop ile gözlemlemek kolay, böylece, tel döndürün. NOT: SUV yeterince kuru değil yoksa büyüme tampon eklendiğinde protein zarar verebilir çok kurutma sırasında, onlar sadece, teller kapalı yıkayabilirsiniz. Hava nem kurutma oranı, kuruma süresi ve / veya hava nemi etkiler nedeniyle optimum sonuçlar 30 ayarlanabilir. teller üzerinde lipid filmi mikroskop altında görünür olmalıdır. </li></ol></li><li> Odasına birleştirin. <ol><li> Oda Bottom Seal: Bir boşluk olmadan yapışır, böylece bölme alt mühür karşı üç kuyu etrafında odasının tabanına vakum gres sürün ve nazikçe bir 40 mm x 22 mm lamel basın bir şırınga kullanın. Odasının kenarlarına (teller çıkış) ile Sealmacun sızdırmazlık. Üç kuyu özetleyen odasının üstünde vakum gres sürün. </li><li> Her kuyu üstüne dolana kadar yavaşça büyüme tampon ekleyin. Bu elektrotlar kapalı lipit filmi şerit gibi kuyularda herhangi bir çözüm hızlı hareket kaçının. </li><li> Alt lamel çıkarmak için özen, gres üzerine hafifçe üst kapak slayt basarak odasına kapatın. Üst kapak kayma kenarlarında tampon herhangi bir damla kaldırmak için bir doku kullanın. NOT: Bu lipit film, teller üzerinde kalmıştır onaylamak için mikroskop altında odasını incelemek için iyi bir zaman. </li></ol></li><li> İki timsah klipleri kullanarak telleri sinyal jeneratörü bağlayın. Düşük / yüksek tuz tamponu için kare (Vrms) ortalama frekans (düşük / yüksek tuz tamponu için 10 Hz / 500 Hz sinüs dalga) ayarlayın ve ölçmek ve 0.7 / 0.35 V kök teller arasındaki gerilimi ayarlamak için bir multimetre kullanın. Işıktan florofor korumak için alüminyum folyo ile bölmesi kapağı. T bırakınO GUVs düşük tuz tamponu için 2 ila 3 saat, ve yüksek tuz tamponu için 12 saat veya O / N için büyümeye. </li><li> Jeneratörden odasına ayırın ve dikkatlice GUV büyümesini değerlendirmek için bir ters mikroskop üzerine yerleştirin. Erken teller GUVs ayırmak olabilir kuyularda yavaş, istikrarlı hareketleri veya sıvı akışını kullanın. NOT: her yerde tellerin alt yarısında GUVs epifluoresan ile görülebilir ise tel kenarlarında GUVs, faz kontrast (40X uzun çalışma mesafesi objektif) genellikle görebilir. Hiçbir GUVs görünür ise, üst yüzeye bakmak için teller döndürmeyi deneyin. GUVs birkaç gün boyunca bir büyüme odasında 4 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol> Jel-destekli Şişme tarafından 4. GUV Büyüme <ol><li> Saf 10 ml su ile agaroz 100 mg karıştırılmasıyla bir% 1 agaroz çözeltisi 10 ml hazırlayın. O ~ 20 sn için 480 W mikrodalga yerleştirerek kaynar kadar ısıtın. Agaroz tamamen eriyene emin olmak için karıştırın. NOT: Çözelti4 ° C&#39;de saklandı ve gerektiğinde yeniden ısıtılabilir. </li><li> Plazma-temiz (hava plazma) agaroz çözüm üzerinde güzel yayılır böylece 1 dakika için bir kapak-slayt. Plazma temizleme etkisi çabuk giyer sonraki 15 dakika içinde kapak-slaytlar kullanın. </li><li> Bütün yüzeyi ıslatır çözelti, böylece, her 22 x 22 mm, 2 slayt sıcak agaroz çözeltisi 200 ul uygulanır. Dikey slayt eğin ve aşırı sıvı kaldırmak ve slayt üzerinde agaroz sadece ince bir tabaka pürüzsüz bırakmak için bir dokuya alt kenarı dokunun. </li><li> 60 ° C&#39;de bir sıcak plaka ya da fırın slayt yerleştirin ve en az 30 dakika kurumaya bırakın. Agaroz filmi gözle zor görülür. Slaytlar RT soğumaya sonra, hemen bunları kullanmak veya 4 ° C&#39;de kapalı bir kapta kadar bir hafta saklayabilirsiniz. </li><li> Standart 3,5 cm Petri kabındaki agaroz kaplı lamel yerleştirin. </li><li> Bölüm 3.2&#39;de SUV çözelti hazırlanır ve uygulanır ~ SUV çözeltisi (3 mg / ml lipid) içinde 15 ul~ Agaroz yüzeyine 30 çok küçük damla yavaşça. Çok agaroz katmanı deforme etmemeye dikkat edin. </li><li> Yaklaşık 10-15 dakika boyunca hafif bir azot akımı altında slayt yerleştirin ve damlacıklar, kuru olarak gözle tampon buharlaşma takip edin. </li><li> En kısa sürede SUV kurutulmuş gibi, slayt yüzeyini kapsayacak şekilde büyüme tampon ekleyin. Küçük 3,5 cm Petri kabı kullanımı tampon ~ 1 ml için. </li><li> Şişme, 30 dakika daha devam ~ ve daha sonra faz-kontrast veya farklılık belirleyici kontrast (DIC), bir ters mikroskop kullanılarak odasında GUVs büyümesini incelemek için izin verir. NOT: Epifloresans gözlem, jel ve agaroz otomatik floresanstaki fluorophores güçlü bir arka plan zordur. </li></ol> 5. Hasat ve Gözlem GUVs <ol><li> Gözlem odasını (örneğin, küçük Petri veya cam lamel) GUVs batmıyor, böylece yayıldı ve oda altta patlama pasifleştiren. Cham Kapakber beta-kazeın çözeltisi ile alt, 5 dakika boyunca inkübe hava ya da bir azot akımı ile kuru saf su ile kazein solüsyonu çalkalamak ve son gözlem tampon eklemek (örneğin, ~ küçük bir petri 5 mm derinlik). </li><li> GUVs Hasat. Açılış büyük (~ 2 mm çapında) yani 100 ul pipet uçları sonuna kesin ve kolayca GUVs yok edebilir pipetleme kesme stres gibi yavaş yavaş talip. <ol><li> Elektro-oluşturulmuş GUVs için, yavaşça üst lamel kaldırarak büyüme odasına açın. GUVs ayırmak için tel boyunca pipet hareket ederken ~ her tel ve aspirat üzerinde doğrudan 50 ul pipet yerleştirin. NOT: Bu tel &quot;diğer tarafında&quot; GUVs toplamak için tel döndürmek için yardımcı olabilir. </li><li> &quot;Jel destekli şişme&quot; GUVs için, ilk GUVs lamel yüzeyinden ayırmak yardımcı olmak için birkaç kez petri yan dokunun. S ise 50 ul sadece lamel ve aspirat üzerinde pipet yerleştiringeri yüzeyi üzerinde ucu ulling. Doğrudan kadar 1 hafta boyunca 4 ° C&#39;de 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde bir gözlem odasına veya saklamak için hasat GUVs aktarın. </li></ol></li><li> , Bir ters mikroskop gözlem odasına yerleştirin gözlem odasına GUVs ekleyebilir ve GUVs odası altındaki yerleşmek için bir kaç dakika bekleyin. </li><li> Hızla pürüzsüz, küresel (&#39;kusur ücretsiz&#39;) &quot;GUV adayları&quot; bulmak için faz kontrast veya DIC ile odasına Anketi. Içinde yuvalanmış herhangi birini içeren küçük lipozomlar dışlamak için Epifloresans her &quot;GUV aday&quot; inceleyin. Son olarak, lipit floresan yoğunluğu tek bir zar (yani, tek katmanlı) ile homojen ve uyumlu olduğunu kontrol edin. NOT: faz kontrast ya da DIC görüntüler tek katmanlı görünür yüzden bazı bilamellar (ya da çok-tabakalı) kesecikler içinde zarlar çözülmesi için birbirine çok yakındır. Bununla birlikte, bu nesneleri, fiili unilame ayırt edilebilirİki kez (veya daha fazla) parlak lipit floresan tarafından llar GUVs. </li></ol> 6. Patch-sıkma GUVs <ol><li> Pipet çektirmesi için önerilen programı kullanarak standart borosilikat kılcal cam bir 1-2 mikron ucu çapı ile yama pipetler olun. NOT: yangın parlatma gibi özel tedaviler gerekli değildir, ve pipetler bir kapalı bir kutuda muhafaza edilir, eğer bunlar çekme sonucu birkaç gün sonra da kullanılabilir. </li><li> GUVs, uygun odası yüzeyleri üzerine yayıldı ve kopma yok olmasını sağlamak için bir beta-kazeın çözeltisi (5 mg / ml) ile inkübe edilerek bölmeyi pasifleştiren. 5 dakika sonra kazein durulayın. </li><li> , Toprak elektrot yerleştirin gözlem tamponu ile odasını doldurmak, adım 5.2 ve 5.3 açıklandığı gibi GUV süspansiyonu 10 ul transferi ve GUVs altındaki yerleşmek için bir kaç dakika bekleyin. </li><li> Solüsyon (gözlem tampon ya da başka bir iso-ozmotik çözelti) ile taze bir yama pipet doldurun veyama-kelepçe amplifikatör headstage üzerine monte edin. </li><li> Odasından aracılığıyla arama bölümünde 5.4 açıklandığı gibi bir &quot;hatasız&quot; Şef bulun ve floresan proteini içerdiğini kontrol etmek. </li><li> Sabit pozitif basınç uygulayın (&gt; 100 Pa, ya da kabaca 1 cm manometre H 2 O) temiz iç yama pipet tutmak ve odasına yama pipet eklemek için. , Görüş alanı içine yama pipet getir / ölçmek ofset ve direnç pipet gerilimini telafi ve ucu temiz olduğunu teyit floresan aydınlatma altında pipet incelemek için test darbeleri uygulayın. </li><li> GUV doğru yama pipet getir, ve gerekirse, aynı anda &quot;run away&quot; patron yapmaz yama pipet dışarıya doğru akışı, böylece pozitif basıncı azaltmak. Yama pipet GUV yakın olduğunda, yama pipet karşı patron çekmek için (5 cm H 2 O kadar) negatif basınç uygulayın. Olarak direnç Monitor &quot;; GUV membran dil &quot;yama pipet ve gigaseal formları girer. </li><li> Bir gigaseal formu olmasaydı, odasından yama pipet kaldırmak ve 6.4 adıma dönün. Membran yama gigaseal kurdu, ancak GUV pipet bağlı kalırsa, GUV sıyrılmış patlama patron odası dibine, ya da kısaca çözümün dışına pipet hareket ettirerek yama tüketim. </li><li> Iç-dış zar yama GUV çıkarıldı ve gigaseal stabil olmuştur, test darbeleri kapatmak ve Şekil 13&#39;te gösterilen gibi bir voltaj protokolü uygulanır. NOT: Şekil 13 Geçerli yama-elektrot akan &quot;olumlu&quot; olduğu bir iç-out yama için standart elektrofizyolojik kuralı izler ve V = V banyosu - V pipet. Negatif potansiyelde yama tutarak (örneğin, V = -100 mV) dinlenme durumunda ~ 30 sn yerleri KvAP için adımlar ise (10Daha olumlu potansiyeller (örneğin, V = 100 mV) sonra iletken (yani, açık) aktif devletler içine sürebilirsin 5 sn 0 msn). </li><li> Bir membran yama üzerinde ölçümler bittikten sonra, bir zap veya basınç darbesi ile yama kırmak ve yama elektrot ofset gerilimi sürüklendi olmadığını kontrol ediniz. Odasından yama pipet çıkarın ve 6.4 adıma dönmek. </li></ol>

<ol>
	<li>Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bottom-Up+Synthetic+Biology:+Engineering+in+a+Tinkerer&#8217;s+World.">Bottom-Up Synthetic Biology: Engineering in a Tinkerer&#8217;s World.</a> Science. 333 (6047), 1252-1254 (2011).</li><li>Aimon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Shape+Modulates+Transmembrane+Protein+Distribution.">Membrane Shape Modulates Transmembrane Protein Distribution.</a> Developmental Cell. 28 (2), 212-218 (2014).</li><li>Roux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+curvature+controls+dynamin+polymerization.">Membrane curvature controls dynamin polymerization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (9), 4141-4146 (2010).</li><li>Domanov, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobility+in+geometrically+confined+membranes.">Mobility in geometrically confined membranes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (31), 12605 (2011).</li><li>Sorre, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curvature-driven+lipid+sorting+needs+proximity+to+a+demixing+point+and+is+aided+by+proteins.">Curvature-driven lipid sorting needs proximity to a demixing point and is aided by proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (14), 5622-5626 (2009).</li><li>Faris, M. D. E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Tension+Lowering+Induced+by+Protein+Activity.">Membrane Tension Lowering Induced by Protein Activity.</a> Physical Review Letters. 102 (3), 038102 (2009).</li><li>Streicher, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+reconstituted+in+GUVs:+A+biomimetic+system+to+study+initial+steps+of+cell+spreading.">Integrin reconstituted in GUVs: A biomimetic system to study initial steps of cell spreading.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1788 (10), 2291-2300 (2009).</li><li>Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+Vesicles:+Preparations+and+Applications.">Giant Vesicles: Preparations and Applications.</a> ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).</li><li>Liu, A. P., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+under+construction:+in+vitro+reconstitution+of+cellular+function.">Biology under construction: in vitro reconstitution of cellular function.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).</li><li>Sens, P., Johannes, L., Bassereau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+approaches+to+protein-induced+membrane+deformations+in+trafficking.">Biophysical approaches to protein-induced membrane deformations in trafficking.</a> Current Opinion in Cell Biology. 20 (4), 476-482 (2008).</li><li>Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Unilamellar+Vesicles+Using+an+Inverted+Emulsion.">Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion.</a> Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).</li><li>Stachowiak, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unilamellar+vesicle+formation+and+encapsulation+by+microfluidic+jetting.">Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4697-4702 (2008).</li><li>Reeves, J. P., Dowben, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+properties+of+thin-walled+phospholipid+vesicles.">Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles.</a> Journal of Cellular Physiology. 73 (1), 49-60 (1969).</li><li>Angelova, M. I., Sol&#233;au, S., M&#233;l&#233;ard, P., Faucon, F., Bothorel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+giant+vesicles+by+external+AC+electric+fields.+Kinetics+and+applications.">Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Kinetics and applications.</a> Trends in Colloid and Interface Science VI. 89, 161-176 (1992).</li><li>Bagatolli, L. A., Pott, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+Unilamellar+Vesicle+Electroformation.">Giant Unilamellar Vesicle Electroformation.</a> Methods in Enzymology. 465, 161-176 (2009).</li><li>Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Films+of+Agarose+Enable+Rapid+Formation+of+Giant+Liposomes+in.">Films of Agarose Enable Rapid Formation of Giant Liposomes in.</a> Solutions of Physiologic Ionic Strength. Journal of the American Chemical Society. 131 (5), 1810-1819 (2009).</li><li>Campillo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unexpected+Membrane+Dynamics+Unveiled+by+Membrane+Nanotube+Extrusion.">Unexpected Membrane Dynamics Unveiled by Membrane Nanotube Extrusion.</a> Biophysical Journal. 104 (6), 1248-1256 (2013).</li><li>Kwok, R., Evans, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermoelasticity+of+large+lecithin+bilayer+vesicles.">Thermoelasticity of large lecithin bilayer vesicles.</a> Biophysical Journal. 35 (3), 637-652 (1981).</li><li>Mathivet, L., Cribier, S., Devaux, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shape+change+and+physical+properties+of+giant+phospholipid+vesicles+prepared+in+the+presence+of+an+AC+electric+field.">Shape change and physical properties of giant phospholipid vesicles prepared in the presence of an AC electric field.</a> Biophysical Journal. 70 (3), 1112-1121 (1996).</li><li>Weinberger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel-Assisted+Formation+of+Giant+Unilamellar+Vesicles.">Gel-Assisted Formation of Giant Unilamellar Vesicles.</a> Biophysical Journal. 105 (1), 154-164 (2013).</li><li>Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detergent-mediated+incorporation+of+transmembrane+proteins+in+giant+unilamellar+vesicles+with+controlled+physiological+contents.">Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (18), 7276-7281 (2013).</li><li>Kahya, N., Pecheur, E. I., de Boeij, W. P., Wiersma, D. A., Hoekstra, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+giant+unilamellar+vesicles+via+peptide-induced+fusion.">Reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles via peptide-induced fusion.</a> Biophysical Journal. 81 (3), 1464-1474 (2001).</li><li>Doeven, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution,+lateral+mobility+and+function+of+membrane+proteins+incorporated+into+giant+unilamellar+vesicles.">Distribution, lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles.</a> Biophysical Journal. 88 (2), 1134-1142 (2005).</li><li>Girard, P., Prost, J., Bassereau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+or+Active+Fluctuations+in+Membranes+Containing+Proteins.">Passive or Active Fluctuations in Membranes Containing Proteins.</a> Physical Review Letters. 94 (8), 088102 (2005).</li><li>Betaneli, V., Petrov, E. P., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Lipids+in+VDAC+Oligomerization.">The Role of Lipids in VDAC Oligomerization.</a> Biophysical Journal. 102 (3), 523-531 (2012).</li><li>Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+an+archaebacterial+voltage-dependent+K++channel.">Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel.</a> Nature. 422 (6928), 180-185 (2003).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+structure+of+a+voltage-dependent+K++channel.">X-ray structure of a voltage-dependent K+ channel.</a> Nature. 423 (6935), 33-41 (2003).</li><li>Aimon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Reconstitution+of+a+Voltage-Gated+Potassium+Channel+in+Giant+Unilamellar+Vesicles.">Functional Reconstitution of a Voltage-Gated Potassium Channel in Giant Unilamellar Vesicles.</a> PLoS ONE. 6 (10), e25529 (2011).</li><li>Lee, S., Zheng, H., Shi, L., Jiang, Q. -. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+a+Kv+Channel+into+Lipid+Membranes+for+Structural+and+Functional+Studies.">Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), (2013).</li><li>Baykal-Caglar, E., Hassan-Zadeh, E., Saremi, B., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+giant+unilamellar+vesicles+from+damp+lipid+film+for+better+lipid+compositional+uniformity.">Preparation of giant unilamellar vesicles from damp lipid film for better lipid compositional uniformity.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1818 (11), 2598-2604 (2012).</li><li>Suchyna, T. M., Markin, V. S., Sachs, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysics+and+Structure+of+the+Patch+and+the+Gigaseal.">Biophysics and Structure of the Patch and the Gigaseal.</a> Biophysical Journal. 97 (3), 738-747 (2009).</li><li>Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ion Channels of Excitable Membranes. , (2001).</li><li>Finol-Urdaneta, R. K., McArthur, J. R., Juranka, P. F., French, R. J., Morris, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+KvAP+unitary+conductance+and+gating+by+1-alkanols+and+other+surface+active+agents.">Modulation of KvAP unitary conductance and gating by 1-alkanols and other surface active agents.</a> Biophysical journal. 98 (5), 762-772 (2010).</li><li>Schmidt, D., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+K++channel+gating+and+voltage+sensor+toxin+sensitivity+depend+on+the+mechanical+state+of+the+lipid+membrane.">Voltage-dependent K+ channel gating and voltage sensor toxin sensitivity depend on the mechanical state of the lipid membrane.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (49), 19276-19281 (2008).</li><li>Quemeneur, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shape+matters+in+protein+mobility+within+membranes.">Shape matters in protein mobility within membranes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2014).</li><li>Parc, A. L., Leonil, J., Chanat, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;S1-casein,+which+is+essential+for+efficient+ER-to-Golgi+casein+transport,+is+also+present+in+a+tightly+membrane-associated+form.">&#945;S1-casein, which is essential for efficient ER-to-Golgi casein transport, is also present in a tightly membrane-associated form.</a> BMC Cell Biology. 11 (1), 1-15 (2010).</li><li>Garten, M., Toombes, G. E. S., Aimon, S., Bassereau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+Voltage+Dependent+Proteins+with+Giant+Unilamellar+Vesicles+in+a+&#8220;Whole+Cell&#8221;+Configuration.">Studying Voltage Dependent Proteins with Giant Unilamellar Vesicles in a &#8220;Whole Cell&#8221; Configuration.</a> Biophysical Journal. 104 (2), 466a (2013).</li><li>Crowe, L. M., Reid, D. S., Crowe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+trehalose+special+for+preserving+dry+biomaterials.">Is trehalose special for preserving dry biomaterials.</a> Biophysical Journal. 71 (4), 2087-2093 (1996).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Biomimetic model sistemler, protein ve membran özellikleri ve etkileşimler üzerinde çalışmak için önemli bir araçtır. BLMs veya desteklenen lipid zarlar gibi diğer sulandırılmış sistemlerle karşılaştırıldığında, GUV sistemlerini önemli membran bileşimi, gerilim ve geometri kontrolü yanı sıra gerçekten olmanın petrol-ücretsiz dahil olmak üzere mevcut birçok fırsatlar tabanlı. Bununla birlikte, GUVs içine, örneğin KvAP transmembran proteinleri içeren lipid sadece GUVs için bilinen p...

Canlı sistemleri yöneten fiziksel ilkeleri incelerken, aşağıdan yukarıya yaklaşımlar bir Deneyciler sistemi kompozisyon ve kolayca hücre tabanlı sistemler 1 manipüle olmayan diğer parametreleri kontrol etmenizi sağlar. 10 - bunlar mikroskop çalışmaları ve mikromanüplasyon 8 için uygun olarak 7 - membran bazlı işlemler için, Dev tek katmanlı veziküller (GUVs, çap ~ 1-100 um) çok yararlı biomimetik sistemi 2 olduğu kanıtlanmıştır. GUVs üretmek için birçok farklı protokoller olmakla birlikte, en fazla iki kategoriye ayrılır - 16 - bazlı emülsiyon, bir lipit filme 13 rehidrasyon dayalı 11,12 ve teknikleri yaklaşır. Emülsiyon bazlı yöntemlerde, GUV membran iç ve dış bildiriler su / yağ ara yüzlerinde lipit mono tabakaları arka arkaya monte edilir. Bu yaklaşım ile çözülebilir proteinlerin kapsüllenmesinde için idealdirGUVs olarak ve asimetrik yaprakçık lipit bileşimiyle GUVs oluşturulması için. Bununla birlikte, emülsiyonlar meydana GUVs zarın mekanik özellikleri 17 değiştirmek çözücünün izlerini tutabilen ve bu yaklaşım, trans-membran proteini yeniden için özellikle çok uygundur değildir. Film rehidrasyon yöntemleri (dehidratasyon), kurutma zarların çoklu katmanlı yığını oluşturmak için birçok lipit karışımları neden olduğu gerçeğine dayanır. Bu yığın daha sonra sulu bir tampon maddesi ile temas içinde yerleştirilir, yığındaki membranlar aralarında ve yığın yüzeyinde ayrı çözücü akışı hareket eder, ayrı ayrı membranlar GUVs 13,18 (aynı zamanda, gerçek bir hayvanat bahçesi oluşturmak üzere ayırabilirisiniz Diğer lipidik nesneler). Bununla birlikte, daha iyi bir tampon ve lipid bileşimleri için, bu klasik &quot;kendiliğinden şişme&quot; yöntemi hatasız GUVs nispeten düşük bir verime sahiptir. Hatasız GUVs verimini artırmak için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir &quot;electroformation olduğunuBir alternatif akım (AC) alanı film rehidrasyon esnasında uygulandığı 221 ;,. Mekanizma henüz tam olarak anlaşılamamış olsa da, &quot;electroformation&quot; Muhteşem GUV verimleri verebilir (&gt; olumlu koşullarda% 90), düşük tuz konsantrasyonu tamponlar için (&lt;5 mM) 14,19, ve hatta (~ 100 mM) fizyolojik tamponlar çalışabilir kullanarak bir yüksek frekans (10 Hz karşı 500 Hz), AC alanı ve platin elektrotları 15. Hatasız GUVs verimini artırmak için alternatif bir yaklaşım, lipid çözeltisi (örneğin, cam, PTFE), alt-tabakalar, klasik &quot;bir anda şişme kullanılan pasif değil, bir polimerik jel alt-tabaka üzerine biriktirilmektedir,&quot; jel destekli şişme &quot;bir &quot;. Elde edilen yağ / jel ince tabaka rehidrate zaman, GUVs bile hızlı bir fizyolojik tampon 16,20 için oluşabilir. Tüm bu yöntemler, örneğin zara bağlı olayları incelemek için kullanılabilir lipid tek GUVs üretebilirçözünür proteinler ve zarlar arasındaki etkileşimi kapsamaktadır. Bununla birlikte, GUVs bir trans-membran proteini birleştirmek için önemli değişiklikler proteinin yeniden oluşturma işlemi boyunca işlevsel bir durumda kalmasını sağlamak için gereklidir. Organik çözücüler (örneğin kloroform, sikloheksan) lipidlerin çözeltileri lipit film üretmek için idealdir birlikte, hidrofobik zar-ötesi domeni bir lipid iki-tabaka içinde gömülü ya da bir deterjan misel içine alındığında, trans-membran proteinleri tipik olarak, sadece kararlı olan ( Örneğin, protein saflaştırma sırasında). Bu nedenle, bir yeniden başlangıç ​​malzemesi tipik olarak deterjan çıkarılmasıyla oluşan doğal membran, bir deterjan çözeltisi içinde saflaştırılmış proteini ya da küçük tek lamelli protein içeren veziküller (proteolitik-SUV) ve / veya çok-lamelli veziküller (proteolitik-MLV&#39;ler) &#39;dir lipidlerin mevcudiyeti. GUVs içine bu zar proteinleri dahil çoğu yöntemleri üç kategoriye ayrılır. Doğrudan insertioN: deterjan içinde süspansiyon haline trans-membran proteini önceden oluşturulmuş, lipid sadece hafif deterjan çözündürülmüş GUVs ile karıştırılır ve daha sonra deterjan Biobeads 21 kullanılarak kaldırılır. Kavramsal olarak basit olmakla birlikte, bu yöntem çok yüksek bir deterjan konsantrasyonunun bir konsantrasyon proteini açığa veya agregat neden olabilir çok düşük ise GUVs eritmesi olarak, deterjan konsantrasyonunun hassas kontrolünü gerektirir. GUV / Proteo SUV Füzyon: proteolitik-SUV Protein, önceden oluşturulmuş, lipid sadece GUVs ile birleştirilir ve füzyon özel füzyojenik peptidler 22 veya deterjan 21 ile kolaylaştırılır. Tipik füzyon ölçüde düşük protein yoğunluğu ile GUVs lider kısıtlıdır. Dehidrasyon / Rehidrasyon: bir protein ihtiva eden lipid filmi kısmi bir proteolitik-SUV dehidrasyon (ya da proteolitik-MLV) çözeltisi ve GUVs oluşturduğu sonra saf bir lipit film için büyütülür. bariz zorluk kısmi dehydrati sırasında protein korumak25 - Adım 23, ancak yöntemi başarılı bir şekilde GUVs 7,23 içine örneğin bakteriyorodopsin, Kalsiyum-ATPaz, integrin ve SSVD&#39;de trans-membran proteinleri oluşturmak için kullanılan edilmiştir. Bu makalede, hiper-termofilik Archaea, Aeropyrum pernix voltaj kapılı potasyum kanal KvAP içeren GUVs için dehidratasyon / rehidrasyon protokollerini tasvir eder. KvAP ökaryotik voltaja bağımlı potasyum kanalları 26 homoloji derecesi yüksek ve bilinen bir kristal yapıya sahip olan 27 , gerilim yolluk mekanizması okuyan için iyi bir modeli yapma. Proteolitik-SUV üretimi, daha önce detaylı bir şekilde tarif edilmiş ve bu yazının 26,28,29 bir parçası değildir edilmiştir. Önemli olarak, KvAP proteolitik-SUV da uzun bir süre (&gt; 1 yıl), -80 ° C&#39;de küçük (örneğin, 10 ul) bölümler halinde saklanabilir gibi her GUV hazırlanması için imal edilmesi gerekmez. Electroformationya da jel destekli şişme sonra KvAP proteolitik-SUV&#39;lerden GUVs büyütmek için kullanılan (ya da proteolitik-MLV&#39;ler) olabilir. electroformation protokolü için temel aşamalar, Şekil 1 &#39;de tasvir edilmiştir. Protein içeren SUV solüsyonu damlalar (Şekil 2&#39;de gösterilmiştir) platin tellerden birikirler. SUV süspansiyonun kısmi dehidrasyon SUV füzyon yoluyla bir lipit, protein film tabakasının oluşmasına neden olur. Rehidrasyon esnasında, bir AC alanı GUVs delamine oluşturmak üzere, lipid tabakaları yardımcı olmak için elektrotlara uygulanır. &quot;Düşük tuz&quot; kullanılırken 10 Hz alanı iyi çalışıyor (&lt;5 mM) rehidrasyon tampon 28 ve GUVs birkaç saat sürebilir büyümeye. Buna karşılık, fizyolojik tamponlar düşük gerilim, 500 Hz AC alanı ile iyi çalışır, ancak gerektirir (tuz ~ 100 mM içeren) bir uzun (~ 12 saat) dönemi 15 şişlik. Bu yöntem İTO 24 slaytlar kullanarak bir önceki protokol dayalı, ama özel bir odası cont kullanırŞekil 2&#39;de görüldüğü gibi iki platin tel, geri kalan (basit tasarım detayları ve önerileriniz için tartışma bakın, odaları doğaçlama). Şekil 3, jel destekli şişme yöntemi göstermektedir. Protokol, fizyolojik tuz konsantrasyonlarına sahip tampon maddeler ile iyi çalışır hızlı ve daha homojen olan bir protein dağılımı GUVs üretir. Ancak, izole, görünüşe göre hatasız GUVs verimi (yani, GUV membran üniforma optik uzunluk-ölçeklerde ve herhangi bir nesne içine değil) bu yama-kelepçe ve mikro-manipülasyon deneyler için yeterli sayıda sağlamasına rağmen, düşük . Bu yöntem, lipid sadece GUVs 16 üretmek electroformation yöntemine göre daha az özel ekipman gerektirir agaroz jel kullanılarak bir protokole dayanmaktadır. floresan mikroskobu ile GUVs karakterizasyonu standart yama-kelepçe set-up kullanarak prosedürler yanı sıra, açıklanan&quot;inside-out&quot; in KvAP aktivitesini ölçmek membran yamaları çıkarıldı. Büyüyen protein ihtiva eden GUVs lipid tek GUVs daha zor olabilir. Özellikle, son GUV verimi membran yığını oluşturmak için tam olarak nasıl SUV çözümü yatırılır ve susuz üzerinde hassas güvenebilirsiniz. GUVs herhangi bir önceki deneyim, bir kimse için, ilk membran film, organik bir çözücü lipitleri biriktirilmesiyle oluşturulduğu bilinen bir protokol 15,16 aşağıdaki lipid tek GUVs büyümeye yardımcı olabilir. Geleneksel protokol iyi çalışıyor sonra, SUV biriktirme ve kısmi dehidratasyon sonra yeni bir lipit kompozisyonu için protokol ayarlarken de çok yararlı olan lipit sadece SUV&#39;lar kullanılarak hakim olabilir. GUVs lipid tek SUV ile ilgili güvenilir büyüdüklerinde, bu proteolitik-SUV protein ihtiva eden GUVs üretmek için sadece küçük bir adım daha sonra.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="599">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Name of the 
			Material/Equipment</td>
			<td style="width:132px;">Company</td>
			<td style="width:155px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:149px;">Comments/ Description</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td dir="LTR" height="60" style="height:60px;width:163px;">DPhPC (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)</td>
			<td style="width:132px;">Avanti Polar Lipids&#160;</td>
			<td>850356P</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td dir="LTR" height="60" style="height:60px;width:163px;">Egg PC L-&#945;-phosphatidylcholine (Egg, Chicken)&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Avanti Polar Lipids&#160;</td>
			<td>840051P</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Egg PA L-&#945;-phosphatidic acid (Egg, Chicken)</td>
			<td style="width:132px;">Avanti Polar Lipids&#160;</td>
			<td>840101P</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td dir="LTR" height="60" style="height:60px;width:163px;">18:1 (&#916;9-Cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td style="width:132px;">Avanti Polar Lipids&#160;</td>
			<td>850375P</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">cholesterol (ovine wool, &#62;98%)&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Avanti Polar Lipids&#160;</td>
			<td>700000P</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">TRed-DHPE</td>
			<td style="width:132px;">Invirtogen</td>
			<td>T-1395MP</td>
			<td style="width:149px;">labeled lipid</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">BPTR-Ceramide</td>
			<td style="width:132px;">Invirtogen</td>
			<td>D-7540&#160;</td>
			<td style="width:149px;">labeled lipid</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Choloroform</td>
			<td style="width:132px;">VWR</td>
			<td>22711.290</td>
			<td style="width:149px;">AnalaR Normapur</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Acetone</td>
			<td style="width:132px;">VWR</td>
			<td>20066.296</td>
			<td style="width:149px;">AnalaR Normapur</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Ethanol</td>
			<td style="width:132px;">VWR</td>
			<td>20821.330</td>
			<td style="width:149px;">AnalaR Normapur</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Kimwipe</td>
			<td style="width:132px;">Kimtech</td>
			<td>7552</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Hamilton syringes&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Hamilton Bonaduz AG</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">diverse</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Amber vials and teflon cups</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>SU860083 and SU860076</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Parafilm</td>
			<td style="width:132px;">VWR</td>
			<td>291-1214</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:132px;">eppendorf</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">diverse</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Agarose</td>
			<td style="width:132px;">Euromex</td>
			<td style="width:155px;">LM3 (1670-B, Tg 25.7C, Tm 64C)</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Sucrose</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>84097-1kg</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Glucose&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>G8270-1kg</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Trehalose</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>T9531-25G</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">KCl</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>P9333-1kg</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Hepes</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>H3375-100G</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">TRIS</td>
			<td style="width:132px;">Euromex</td>
			<td>EU0011-A</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Osmometer</td>
			<td style="width:132px;">Wescor</td>
			<td>Vapro</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">pH meter</td>
			<td style="width:132px;">Schott instruments</td>
			<td>Lab850</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Sonicator</td>
			<td style="width:132px;">Elmasonic</td>
			<td>S 180 H</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Syringe filter 0.2&#181;m</td>
			<td style="width:132px;">Sartorius steim</td>
			<td>Minisart 16532</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Function generator</td>
			<td style="width:132px;">TTi</td>
			<td>TG315</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Platinum wires</td>
			<td style="width:132px;">Goodfellow</td>
			<td>LS413074</td>
			<td style="width:149px;">99.99+%, d=0.5mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Polytetrafluoroethylene</td>
			<td style="width:132px;">Goodfellow</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Dow Corning &#39;high vacuum grease&#39;</td>
			<td style="width:132px;">VWR</td>
			<td>1597418</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">sealing paste</td>
			<td style="width:132px;">Vitrex medical A/S, Denmark</td>
			<td>REF 140014</td>
			<td style="width:149px;">Sigillum Wax</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Cover slides 22x40 mm No1,5</td>
			<td style="width:132px;">VWR&#160;</td>
			<td>631-0136</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Cover slides 22x22 mm No1,5</td>
			<td style="width:132px;">VWR&#160;</td>
			<td>631-0125</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">plasma cleaner</td>
			<td style="width:132px;">Harrick</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td style="width:149px;">airplasma, setting &#39;high&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">petri dishes</td>
			<td style="width:132px;">Falcon BD</td>
			<td>REF 353001</td>
			<td style="width:149px;">3.5 cmx1cm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">patch clamp amplifier</td>
			<td style="width:132px;">Axon instruments</td>
			<td>Multiclamp700B</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">DAQ Card</td>
			<td style="width:132px;">National Instruments</td>
			<td>PCI-6221</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Labview</td>
			<td style="width:132px;">National Instruments</td>
			<td>version 8.6</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td dir="LTR" height="60" style="height:60px;width:163px;">Glass pipettes boro silicate OD 1mm ID 0.58mm</td>
			<td style="width:132px;">Harvard Apparatus</td>
			<td>GC100-15</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Electrode holder</td>
			<td style="width:132px;">Warner Instruments&#160;</td>
			<td>Q45W-T10P</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:132px;">Sutter&#160;</td>
			<td>MP-285</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">pipette puller</td>
			<td style="width:132px;">Sutter&#160;</td>
			<td>P-2000&#160;</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Camera</td>
			<td style="width:132px;">ProSilica&#160;</td>
			<td>GC1380</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Zeiss microscope</td>
			<td style="width:132px;">Zeiss</td>
			<td>Axiovert 135</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td dir="LTR" height="60" style="height:60px;width:163px;">Objective</td>
			<td style="width:132px;">Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">40x long working distance, Phase contrast</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Objective&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">100x Plan-Apochromat NA 1.3</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Filterset GFP (for Alexa-488)</td>
			<td style="width:132px;">Horiba</td>
			<td>XF100-3</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Filterset Cy3 (for TexasRed)</td>
			<td style="width:132px;">Horiba</td>
			<td>XF101-2</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">beta-casein</td>
			<td style="width:132px;">Sigma&#160;</td>
			<td>C6905-1G</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">confocal microscope</td>
			<td style="width:132px;">Nikon Eclipse TE 2000-E</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">D-Eclipse C1 confocal head</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Objective</td>
			<td style="width:132px;">Nikon</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">Plan Fluor 100&#215; NA1.3</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td dir="LTR" height="60" style="height:60px;width:163px;">matlab</td>
			<td style="width:132px;">Mathworks</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">for image processing and analysis of the current traces</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of a transmembrane protein, the voltage-gated ion channel, kvap, into giant unilamellar vesicles for microscopy and patch clamp studies

Dev lamelli kesecikler (GUVs) membran ilişkili olayları incelemek için popüler bir biomimetic sistemi vardır. Ancak, genel olarak GUVs fonksiyonel transmembran proteinleri içeren GUVs oluşturmak üzere tadil edilmesi gerekmektedir büyümeye protokolleridir. Electroformation ve jel destekli şişme - - voltaj-kapılı potasyum kanalı, KvAP içeren GUVs oluşturmak için Bu makalede, iki dehidrasyon-rehidrasyon yöntemleri açıklanmaktadır. Her iki yöntemde de, protein ihtiva eden küçük tek lamelli vesiküller bir çözeltisi daha sonra bir rehidrasyon tamponu içinde şişmeye bırakıldı membran bir yığın oluşturmak üzere kısmen dehidre edilmiştir. AC alanı film rehidrasyon esnasında uygulanabilir ve böylece electroformation yöntemi için, film, platin elektrot üzerine bırakılır. Bunun tersine, jel destekli şişme yöntem filmi rehidrasyon geliştirmek üzere bir agaroz jel alt tabakayı kullanır. Her iki yöntem de (örneğin, 5 mM) ile, düşük ve fizyolojik (örneğin, 100 mM) tuzu konsantrasyonlarında GUVs üretebilir. Elde GUVs floresan mikroskobu ile karakterize edilir ve yeniden kanalların fonksiyonu iç-dış yama-kelepçe yapılandırmayı kullanarak ölçtü. Alternatif elektrik alanı (electroformation) mevcudiyetinde şişen hatasız GUVs yüksek bir verim sağladığını birlikte, jel destekli şişme yöntem daha homojen bir protein dağılımı sağlar ve herhangi bir özel ekipman gerektirir.

GUVs büyümesi hızlı bir şekilde bir mikroskop altında bir büyüme odası incelenerek değerlendirilebilir. Electroformation için GUVs Şekil 4&#39;te gösterildiği gibi, platin teli boyunca demet büyürler. Jel destekli şişme sırasında GUVs hızla büyümeye ve (Şekil 5), birbirine kaynaşmasına küresel yapılar olarak görünür. Hata içermeyen GUVs bilgilerin daha kolay tanımlanabildiği ve bir gözlem odasına transfer edildikten sonra ...

Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies at JoVE

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

electroformation ve jel destekli şişme - dev tek tabakalı veziküller (GUVs) içine transmembran protein, KvAP, şifreden iki dehidrasyon-rehidrasyon yöntemleri için gösterilmiştir. Her iki yöntemde de, protein içeren küçük tek lamelli kesecikler, sonra, flüoresans mikroskopisi ve yama klempi elektrofizyoloji ile incelenebilir GUVs oluşturmak üzere bir araya birleştirilir.

Bir transmembran proteinin yeniden oluşturulması, Mikroskop ve yama kelepçe Çalışmaları Dev tek-katmanlı keseler içine Voltaj kapılı iyon kanalı, KvAP,

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

reconstitution-transmembrane-protein-voltage-gated-ion-channel-kvap

Research

JoVE Journal

Biology

18.9K Görüntüleme.  Université Pierre et Marie Curie.  electroformation ve jel destekli şişme - dev tek tabakalı veziküller (GUVs) içine transmembran protein, KvAP, şifreden iki dehidrasyon-rehidrasyon yöntemleri için gösterilmiştir. Her iki yöntemde de, protein içeren küçük tek lamelli kesecikler, sonra, flüoresans mikroskopisi ve yama klempi elektrofizyoloji ile incelenebilir GUVs oluşturmak üzere bir araya birleştirilir. 

Video: Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. Electrical recordings from the presynaptic terminal allow the measurement of action potentials, calcium channel currents, vesicle fusion (exocytosis) and subsequent membrane uptake (endocytosis). The fusion of vesicles containing neurotransmitter causes the vesicle membrane to be added to the cell membrane of the calyx. This increase in the amount of cell membrane is measured as an increase in capacitance. The subsequent reduction in capacitance indicates endocytosis, the process of membrane uptake or removal from the calyx membrane. Endocytosis, is necessary to maintain the structure of the calyx and it is also necessary to form vesicles that will be filled with neurotransmitter for future exocytosis events. Capacitance recordings at the calyx of Held have made it possible to directly and rapidly measure vesicular release and subsequent endocytosis in a mammalian CNS nerve terminal. In addition, the corresponding postsynaptic activity can be simultaneously measured by using paired recordings. Thus a complete picture of the presynaptic and postsynaptic electrical activity at a central nervous system synapse is achievable using this preparation. Here, the methods for slice preparation, morphological features for identification of calyces of Held, basic patch clamping techniques, and examples of capacitance recordings to measure exocytosis and endocytosis are presented.

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal.

Kaliks Patch Kelepçe Kapasitans Kayıtlar Yöntemleri

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

Biyoloji

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Xenopus Oosit ifade İyon Kanalları Patch Kelepçe Kaydı

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording. We first developed this method for fabricating pipettes suitable for recording from small (&lt;3 m) neuronal cell bodies. The basic principal is similar to glass-blowing and combines air pressure and heat to modify the shape of patch pipettes prepared by a conventional micropipette puller. It can be applied to so-called soft (soda lime) and hard (borosilicate) glasses. Generally speaking, pressure polishing can reduce pipette resistance by 25% without decreasing the diameter of the tip opening (Goodman and Lockery, 2000). It can be applied to virtually any type of glass and requires only the addition of a high-pressure valve and fitting to a microforge. This technique is essential for recording from ultrasmall cells (&lt;5 m) and can also improve single-channel recording by minimizing pipette resistance. The blunt shape is also useful for perforated-patch clamp recording since this tip shape results in a larger membrane bleb available for perforation.

This is a guide to modifying the shape of glass micropipettes. Specifically, by using heat and air pressure the taper is widened without increasing the tip opening, leading to lower pipette resistance. This is critical to obtain low noise recordings of small cells but is useful in many applications.

Geliştirilmiş Patch-kelepçe kayıt için Basınç-parlatma Pipetler

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording.  We first developed this method for fabricating pipettes suitable for ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

İyon Kanalları ve Fonksiyonel Analiz Mutagenez Heterologously Memeli Hücreleri cinsinden ifade edilir

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

İyon Kanalları incelenmesi için yama Kelepçe ve Perfüzyon Teknikleri cinsinden ifade edilir Xenopus Oosit

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) is a ubiquitous research strategy. HEK-293T cells must be plated onto glass coverslips at low enough density so that they are not in contact with each other in order to allow for electrophysiological recording without confounding effects due to contact with adjacent cells. Transfected channels must also express with high efficiency at the plasma membrane for whole-cell patch clamp recording of detectable currents above noise levels. Heterologous ion channels often require long incubation periods at 28&deg;C after transfection in order to achieve adequate membrane expression, but there are increasing losses of cell-coverslip adhesion and membrane stability at this temperature. To circumvent this problem, we developed an optimized strategy to transfect and plate HEK-293T cells. This method requires that cells be transfected at a relatively high confluency, and incubated at 28&deg;C for varying incubation periods post-transfection to allow for adequate ion channel protein expression. Transfected cells are then plated onto glass coverslips and incubated at 37&deg;C for several hours, which allows for rigid cell attachment to the coverslips and membrane restabilization. Cells can be recorded shortly after plating, or can be transferred to 28&deg;C for further incubation. We find that the initial incubation at 28&deg;C, after transfection but before plating, is key for the efficient expression of heterologous ion channels that normally do not express well at the plasma membrane. Positively transfected, cultured cells are identified by co-expressed eGFP or eGFP expressed from a bicistronic vector (e.g. pIRES2-EGFP) containing the recombinant ion channel cDNA just upstream of an internal ribosome entry site and an eGFP coding sequence. Whole-cell patch clamp recording requires specialized equipment, plus the crafting of polished recording electrodes and L-shaped ground electrodes from borosilicate glass. Drug delivery to study the pharmacology of ion channels can be achieved by directly micropipetting drugs into the recording dish, or by using microperfusion or gravity flow systems that produce uninterrupted streams of drug solution over recorded cells.

Reliable method for highly efficient in vitro expression and subsequent electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T).

İfade ve HEK-293T Hücreler Rekombinant Gerilim Gated İyon Kanalları Elektrofizyolojik Kayıt için optimize edilmiş Transfeksiyon Strateji

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1. Many of these are referred to as cell-penetrating peptides, which are frequently noted for their potential as drug delivery vectors1-3. Moreover, there is increasing interest in antimicrobial peptides that operate via non-membrane lytic mechanisms4,5, particularly those that cross bacterial membranes without causing cell lysis and kill cells by interfering with intracellular processes6,7. In fact, authors have increasingly pointed out the relationship between cell-penetrating and antimicrobial peptides1,8. A firm understanding of the process of membrane translocation and the relationship between peptide structure and its ability to translocate requires effective, reproducible assays for translocation. Several groups have proposed methods to measure translocation into large unilamellar lipid vesicles (LUVs)9-13. LUVs serve as useful models for bacterial and eukaryotic cell membranes and are frequently used in peptide fluorescent studies14,15. Here, we describe our application of the method first developed by Matsuzaki and co-workers to consider antimicrobial peptides, such as magainin and buforin II16,17. In addition to providing our protocol for this method, we also present a straightforward approach to data analysis that quantifies translocation ability using this assay. The advantages of this translocation assay compared to others are that it has the potential to provide information about the rate of membrane translocation and does not require the addition of a fluorescent label, which can alter peptide properties18, to tryptophan-containing peptides. Briefly, translocation ability into lipid vesicles is measured as a function of the Foster Resonance Energy Transfer (FRET) between native tryptophan residues and dansyl phosphatidylethanolamine when proteins are associated with the external LUV membrane (Figure 1). Cell-penetrating peptides are cleaved as they encounter uninhibited trypsin encapsulated with the LUVs, leading to disassociation from the LUV membrane and a drop in FRET signal. The drop in FRET signal observed for a translocating peptide is significantly greater than that observed for the same peptide when the LUVs contain both trypsin and trypsin inhibitor, or when a peptide that does not spontaneously cross lipid membranes is exposed to trypsin-containing LUVs. This change in fluorescence provides a direct quantification of peptide translocation over time.

This protocol details a method for the quantitative measure of peptide translocation into large unilamellar lipid vesicles. This method also provides information about the rate of membrane translocation and can be used to identify peptides that efficiently and spontaneously cross lipid bilayers.

Büyük Unilamellar Veziküller Ölçme Peptid Translokasyon

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

Patch Clamp Elektrofizyoloji ve Basınç kasılmaların kâğıda çizilmesi kullanarak arteriyel düz kas KV7 Potasyum Kanal Fonksiyon Exploring

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify and explore the function of these important proteins. However, classical preparations, such as planar bilayers, limit the manipulations and experiments that can be performed on the reconstituted channel and its membrane environment. The more cell-like structure of giant liposomes permits traditional patch-clamp experiments without sacrificing control of the lipid environment.
Electroformation is an efficient mean to produce giant liposomes &gt;10 &mu;m in diameter which relies on the application of alternating voltage to a thin, ordered lipid film deposited on an electrode surface. However, since the classical protocol calls for the lipids to be deposited from organic solvents, it is not compatible with less robust membrane proteins like ion channels and must be modified. Recently, protocols have been developed to electroform giant liposomes from partially dehydrated small liposomes, which we have adapted to protein-containing liposomes in our laboratory.
We present here the background, equipment, techniques, and pitfalls of electroformation of giant liposomes from small liposome dispersions. We begin with the classic protocol, which should be mastered first before attempting the more challenging protocols that follow. We demonstrate the process of controlled partial dehydration of small liposomes using vapor equilibrium with saturated salt solutions. Finally, we demonstrate the process of electroformation itself. We will describe simple, inexpensive equipment that can be made in-house to produce high-quality liposomes, and describe visual inspection of the preparation at each stage to ensure the best results.

Reconstituting functional membrane proteins into giant liposomes of defined composition is a powerful approach when combined with patch-clamp electrophysiology. However, conventional giant liposome production may be incompatible with protein stability. We describe protocols for producing giant liposomes from pure lipids or small liposomes containing ion channels.

Görüntüleme ve Patch-Kelepçe Elektrofizyoloji için dev Liposome Hazırlık

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify ...

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined lipid composition. We are studying the lipid-dependent gating effects in a prototype voltage-gated potassium (Kv) channel, and have worked out detailed procedures to reconstitute the channels into different membrane systems. Our reconstitution procedures take consideration of both detergent-induced fusion of vesicles and the fusion of protein/detergent micelles with the lipid/detergent mixed micelles as well as the importance of reaching an equilibrium distribution of lipids among the protein/detergent/lipid and the detergent/lipid mixed micelles. Our data suggested that the insertion of the channels in the lipid vesicles is relatively random in orientations, and the reconstitution efficiency is so high that no detectable protein aggregates were seen in fractionation experiments. We have utilized the reconstituted channels to determine the conformational states of the channels in different lipids, record electrical activities of a small number of channels incorporated in planar lipid bilayers, screen for conformation-specific ligands from a phage-displayed peptide library, and support the growth of 2D crystals of the channels in membranes. The reconstitution procedures described here may be adapted for studying other membrane proteins in lipid bilayers, especially for the investigation of the lipid effects on the eukaryotic voltage-gated ion channels.

Procedures for complete reconstitution of a prototype voltage-gated potassium channel into lipid membranes are described. The reconstituted channels are suitable for biochemical assays, electrical recordings, ligand screening and electron crystallographic studies. These methods may have general applications to the structural and functional studies of other membrane proteins.

Yapısal ve İşlevsel Araştırmalar için Lipid Membranlar bir Kv Kanal Sulandırma

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...