Çalışma Philadelphia Çocuk Hastanesi bir Enstitüsü Geliştirme Ödülü tarafından desteklenmektedir.

1. Çapraz bağ Kromatin <ol><li> 100x20mm hücre kültürü yemekleri hücreleri büyür. Hücrelerin miktarı, 1 ila hücre tipine bağlı olarak tabak başına 10 milyon hücre arasında olabilir. Yaklaşık 2.000.000 hücre, bir immüno-çökeltme için yeterlidir. </li><li> Zaman sallama ile oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 1 formaldehid ile çapraz bağ hücreleri. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 125 mM Glisin ve inkübe bir nihai konsantrasyon ilave çapraz-bağlama soğutun. </li><li> 1X fosfat hücreleri yıkayın süzün PBS, iki kez Salin (PBS), daha sonra 0.2 ml PBS ilave edin. </li><li> Bir mikrosantrifüj tüpe plastik bir hücre kazıyıcı ile Hasat hücreleri. </li><li> 4 5 dakika için 2.000 devirde hücreleri aşağı Spin ° C </li><li> Süpernatant aspire. Bütün hücre için SDS lizis tamponu içinde tekrar süspansiyon hücreleri (% 1 SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl, pH 8.1) ya da nükleer lizat çıkarılması için bir pelet olarak tutmak. </li><li> Hücreler ° C veya bir immediat devam edebilirsiniz -80 kaydedilebilirsonikasyon ile ely. </li></ol> 2. (Tüm Hücre Lizat için 3,5 Adıma geçin) Çekirdekler hazırlayın <ol><li> 1X Proteinaz İnhibitör her bir deney ile (5 mM BORU pH 8.0, 85 mM KCl,% 0.5 NP-40) Cep Lizis Tampon Ek. </li><li> Yaklaşık 10 kat Hücre Lizis Tampon ile pelet hacmi çözülmüş hücre pelletini tekrar. </li><li> Havan tokmağı ile homojenize Dounce-10 kat daha sonra, 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. </li><li> 4 5 dakika ° C için 4.000 rpm örnek santrifüj, süpernatant atmak ve nükleer pelet kaydedin. </li></ol> 3. Sonikasyon * <ol><li> SDS Lizis Tampon ve Proteinaz İnhibitör ile kullanılmak üzere tampon ek miktarda sıcak. </li><li> SDS Lizis Tamponu içinde yeniden süspanse nükleer pelet (1-10 milyon hücre başına tampon, yaklaşık 0.5 mL) </li><li> 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. </li><li> Mikrosantrifüj tüplerine örnekleri, 0.5 ml alikotları ekleyin. </li><li> Saniye ve 45 30 saniye ile Misonix sonikatör kullanarak ıslak buz üzerinde sonikasyonkapalı 2 bir genlik ayarında. İdeal parçası boyutu için devir sayısı ilk çeşitli döngüsü numaraları (örneğin 2, 4, 8, 12, 16, ve 20 veya daha fazla döngü) denemek belirlenebilir. Sonikatör farklı bir marka, ancak, koşulları değişecektir kullanılabilir. Döngüleri ve ilgili zaman miktarı sayıda deney ve kapalı ideal koşulları belirlemek için gerçekleştirilmelidir. </li><li> Sonication sonuçları kontrol etmek ve, miktar yapmak için her bir örnek 20 ul toplayın. Numunenin geri kalanı -80 ° C&#39;de saklanabilir </li><li> 0.1x TE Tampon 30 ul ekleyerek örnek 20 ul sulandırmak. </li><li> 1 ul RNaz sahip örnek bir tedavi 1 saat 37 ° C&#39;de daha sonra 2 saat boyunca 62 ° C&#39;de inkübe Proteinaz K ve 1 ul ekleyin. </li><li> % 2 agaroz jeli üzerinde, örnek 20 ul çalıştırın. </li><li> Sonra NanoDrop spektrofotometre kullanarak ölçmek QIAquick PCR Arıtma kiti ile örnek kalan tutar arındırın. </li></ol> * Yerli ChI içinP microccocal nükleaz sindirim kesme DNA alternatif olarak kullanılabilir. 4. Blok Agaroz Boncuk * <ol><li> Boncuk zaten engellenirse, 5.1 adıma geçin. </li><li> Protein A veya Protein G agaroz kullanın. 5 asyonlar için (IP), 50% boncuk bulamaç (300 ul boncuk pelet) 600 ul kullanın </li><li> Boncuk yıkamak için, 4 ° C de 1 dakika boyunca 800 rpm&#39;de onları aşağı spin ve süpernatant atın. Ekle biraz fazla 2 ml ChIP seyreltme tamponu (% 0.01 SDS, 1.2 mM EDTA, 167 mM NaCI,% 1.1 Triton X-100, 16.7 mM Tris-HCl, pH 8.1) ve yavaş yavaş ters tüp 10X ile karıştırılır. 4 ° C de 1 dakika boyunca 800 rpm&#39;de tekrar aşağı Spin ve süpernatant atın. Yıkama 2 kez daha tekrarlayın. </li><li> Çözüm engelleme 4 ° C gecede çevirerek boncuk engelleyin. Engelleme çözüm tarifi için Tablo 1&#39;e bakınız. </li></ol> 5. Ön açık Kromatin <ol><li> Çözülme buz üzerinde kromatin sonicated. </li><li> 12.000 rpm f aşağı Spinveya 4 10 dakika ° C daha sonra SDS (beyaz pelet) kaldırmak için hemen buz koymak. </li><li> Süpernatant toplayın, pelet atmak ve gerekirse örnekleri birleştirir. </li><li> Hesaplamaları (IP başına kromatin 1-10 ug) göre deney için gerekli olan miktarda çıkarın. </li><li> Proteinaz inhibitörü ile desteklenmiş ChIP seyreltme Tampon 10X kromatin sulandırmak. </li><li> IP başına bloke boncuk 100 ul ekleyin. </li><li> 1 saat boyunca 4 ° C&#39;de döndürün. </li></ol> 6. Immunoprecipitation <ol><li> 1 dakika boyunca 800 rpm&#39;de örnekleri aşağı Spin ve yeni bir tüp süpernatant aktarın. </li><li> 1 dakika ve başka bir temiz tüpe transferi için 800 rpm süpernatant aşağı doğru döndürün. </li><li> -20 ° C de, giriş kontrol olarak hizmet etmek, süpernatan 20 ul katılım </li><li> Deney yapılacak IP sayısı kısım kromatin. </li><li> Her bir örnek, kromatin 1-10 ug antikor başına 2 ug ekleyin. </li><li> Rotasyonu ile bir gece süreyle 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Her IP örnek bloke boncuk 100 ul ekleyin. </li><li> ° C Dönme, 4 &#39;de 1 saat süreyle inkübe edin. </li><li> Pelet, 1 dakika boyunca 800 rpm&#39;de dönen ve mümkün olduğunca süpernatant kadar atmak ve boncukları. </li><li> Düşük Tuz immün kompleks yıkama tamponu ile bir kez boncuk yıkayın. Her tüpe tampon 1 ml ilave edilir, 5-8 dakika için oda sıcaklığında döndürmek; 1 dakika boyunca 800 rpm&#39;de döndürün sonra supernatant atın. Yüksek Tuz immün kompleks yıkama tamponu ve LiCI, immün kompleks bir kez yıkama tamponu ile yıkayın ve tekrar iki kere 5 yıkama (Tablo 2) toplam TE Tamponu ile. </li></ol> 7. Elüsyon <ol><li> Önceki gün çözülme giriş örnekleri elüsyon ile işlenecek. </li><li> Elüsyon Tampon taze (Tablo 3) olun. </li><li> IP ve giriş kontrol örnekleri artı 1-2 ekstra örnekleri için gerekli yeterli Elüsyon Tampon bir ana karışımı olun. </li><li> Her IP örnek için 100 ul, Seyreltme Tampon maddesi ekleyin ve 15 dakika daha oda sıcaklığında inküberotasyon ile. </li><li> 1 dakika boyunca 800 rpm&#39;de aşağı Spin ve yeni bir tüp süpernatant ekleyin. </li><li> Boncuk her tüpe Elüsyon tamponu, diğer bir 100 ul ekleyin ve rotasyon ile 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Inkübasyondan sonra 15 saniye vorteks, 1 dakika 5.000 rpm&#39;de aşağı spin, daha sonra ilk elüsyon süpernatant ile süpernatant birleştirir. (Hiçbir Süpernatantları boncuk üzerinde orada sol emin olun. Eğer emin değilseniz, 1 dakika 5.000 rpm&#39;de tekrar süpernatant aşağı spin ve yeni bir tüp içinde süpernatant toplamak. </li><li> Giriş kontrol numunelerinin 20 ul Elüsyon Tampon 180 ul ekleyin. </li></ol> 8. Çapraz bağlantı Ters <ol><li> Seyrelticileri ve giriş kontroller için 200 ul 5 M NaCl 8 ul ilave edin. </li><li> 65 ° C gecede de su banyosunda parafilm ve inkübe ile Seal tüpler. </li></ol> 9. DNA Saflaştırma <ol><li> 37 ° C&#39;de 1 saat boyunca, RNaz A 1 ul her bir örnek tedavi ° C </li><li> 4 μ Ekle0.5 M EDTA, 8 ul 1 M Tris-HCl, karışım, l daha sonra 2 saat boyunca 45 ° C&#39;de her bir örnek ve inkübe Proteinaz K 1 ul. </li><li> QIAquick PCR saflaştırma kiti kullanılarak örnekleri arındırın. Numuneler daha sonraki bir tarihte yapılabilir -20 ° C ve PCR check kaydedilebilir. </li></ol> * Alternatif olarak, yonga dereceli manyetik boncuk immüno-çökeltme bölümü için agaroz yerine kullanılabilir. 10. PCR çek <ol><li> PCR kontrolü için, ilgi protein bağlı olduğu bilinen bölgeler için astar kullanın. Ayrıca, negatif kontroller olarak bağlayıcı olmayan bölgeler için primerlerin kullanımı. </li><li> Reaksiyon için reaktifler karıştırılır. 1:100 (Tablo 3) Giriş örnek sulandırmak. </li><li> Reaksiyon çalıştırın. PCR Programı: </li></ol> Adım 1: 94 ° C&#39;de 3 dakika Adım 2: 94 ° C 20 sn 59 ° C 30 sn 72 ° C de 30 sn (En az 30 cycl için Adım 2 tekrarlayınes) Adım 3: 72 ° C&#39;de 2 dakika <ol start="4"><li> % 1 agaroz jel üzerinde örnekleri çalıştırın. </li><li> Zenginleştirme da gerçek zamanlı PCR ile kantitatif tespit edilebilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Odom, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+pancreas+and+liver+gene+expression+by+HNF+transcription+factors.">Control of pancreas and liver gene expression by HNF transcription factors.</a> Science. 303, 1378-1381 (2004).</li><li>Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions.">Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions.</a> Science. 316, 1497-1502 (2007).</li><li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiles+of+STAT1+DNA+association+using+chromatin+immunoprecipitation+and+massively+parallel+sequencing.">Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing.</a> Nature Methods. 4, 651-657 (2007).</li><li>Reich, N. C., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+STAT+nuclear+traffic.">Tracking STAT nuclear traffic.</a> Nat. Rev. Immunol. 6, 602-612 (2006).</li><li>Lodige, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+export+determines+the+cytokine+sensitivity+of+STAT+transcription+factors.">Nuclear export determines the cytokine sensitivity of STAT transcription factors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280, 43087-43099 (2005).</li><li>Schroder, K., Sweet, M. J., Hume, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+integration+between+IFNgamma+and+TLR+signalling+pathways+in+macrophages.">Signal integration between IFNgamma and TLR signalling pathways in macrophages.</a> Immunobiology. 211, 511-524 (2006).</li><li>Vinkemeier, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+the+message+across,+STAT!+Design+principles+of+a+molecular+signaling+circuit.">Getting the message across, STAT! Design principles of a molecular signaling circuit.</a> The Journal of Cell Biology. 167, 197-201 (2004).</li><li>Brierley, M. M., Fish, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stats:+multifaceted+regulators+of+transcription.">Stats: multifaceted regulators of transcription.</a> J. Interferon Cytokine Res. 25, 733-744 (2005).</li><li>Bentley, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+re-sequencing.">Whole-genome re-sequencing.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 16, 545-552 (2006).</li><li>Grant, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+of+transcription+factor+7-like+2+(TCF7L2)+gene+confers+risk+of+type+2+diabetes.">Variant of transcription factor 7-like 2 (TCF7L2) gene confers risk of type 2 diabetes.</a> Nature Genetics. 38, 320-323 (2006).</li><li>Sladek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+association+study+identifies+novel+risk+loci+for+type+2+diabetes.">A genome-wide association study identifies novel risk loci for type 2 diabetes.</a> Nature. 445, 881-885 (2007).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wellcome+Trust+Case+Control+Consortium.+Genome-wide+association+study+of+14,000+cases+of+seven+common+diseases+and+3,000+shared+controls.">Wellcome Trust Case Control Consortium. Genome-wide association study of 14,000 cases of seven common diseases and 3,000 shared controls.</a> Nature. 447, 661-678 (2007).</li><li>Saxena, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+association+analysis+identifies+loci+for+type+2+diabetes+and+triglyceride+levels.">Genome-wide association analysis identifies loci for type 2 diabetes and triglyceride levels.</a> Science. 316, 1331-1336 (2007).</li><li>Zeggini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+genome-wide+association+signals+in+UK+samples+reveals+risk+loci+for+type+2+diabetes.">Replication of genome-wide association signals in UK samples reveals risk loci for type 2 diabetes.</a> Science. 316, 1336-1341 (2007).</li><li>Scott, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+association+study+of+type+2+diabetes+in+Finns+detects+multiple+susceptibility+variants.">A genome-wide association study of type 2 diabetes in Finns detects multiple susceptibility variants.</a> Science. 316, 1341-1345 (2007).</li><li>Steinthorsdottir, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+variant+in+CDKAL1+influences+insulin+response+and+risk+of+type+2+diabetes.">A variant in CDKAL1 influences insulin response and risk of type 2 diabetes.</a> Nature Genetics. 39, 770-775 (2007).</li><li>Salonen, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+2+Diabetes+Whole-Genome+Association+Study+in+Four+Populations:+The+DiaGen+Consortium.">Type 2 Diabetes Whole-Genome Association Study in Four Populations: The DiaGen Consortium.</a> American Journal of Human Genetics. 81, 338-345 (2007).</li><li>Zeggini, E., McCarthy, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCF7L2:+the+biggest+story+in+diabetes+genetics+since+HLA.">TCF7L2: the biggest story in diabetes genetics since HLA.</a> Diabetologia. 50, 1-4 (2007).</li><li>Weedon, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+TCF7L2.">The importance of TCF7L2.</a> Diabet. Med. 24, 1062-1066 (2007).</li><li>Hattersley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prime+suspect:+the+TCF7L2+gene+and+type+2+diabetes+risk.">Prime suspect: the TCF7L2 gene and type 2 diabetes risk.</a> The Journal of Clinical Investigation. 117, 2077-2079 (2007).</li><li>Yochum, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+analysis+of+chromatin+occupancy+identifies+beta-catenin+target+genes+in+colorectal+carcinoma+cells.">Serial analysis of chromatin occupancy identifies beta-catenin target genes in colorectal carcinoma cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3324-3329 (2007).</li><li>Duval, A., Busson-Leconiat, M., Berger, R., Hamelin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assignment+of+the+TCF-4+gene+(TCF7L2)+to+human+chromosome+band+10q25.3.">Assignment of the TCF-4 gene (TCF7L2) to human chromosome band 10q25.3.</a> Cytogenet. Cell Genet. 88, 264-265 (2000).</li><li>Pomerantz, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+8q24+cancer+risk+variant+rs6983267+shows+long-range+interaction+with+MYC+in+colorectal+cancer.">The 8q24 cancer risk variant rs6983267 shows long-range interaction with MYC in colorectal cancer.</a> Nature Genetics. 41, 882-884 (2009).</li><li>Tuupanen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+common+colorectal+cancer+predisposition+SNP+rs6983267+at+chromosome+8q24+confers+potential+to+enhanced+Wnt+signaling.">The common colorectal cancer predisposition SNP rs6983267 at chromosome 8q24 confers potential to enhanced Wnt signaling.</a> Nature Genetics. 41, 885-890 (2009).</li><li>Zhao, J., Schug, J., Li, M., Kaestner, K. H., Grant, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-associated+loci+are+significantly+over-represented+among+genes+bound+by+transcription+factor+7-like+2+(TCF7L2)+in+vivo.">Disease-associated loci are significantly over-represented among genes bound by transcription factor 7-like 2 (TCF7L2) in vivo.</a> Diabetologia. 53, 2340-2346 (2010).</li><li>Benjamini, Y., Yekutieli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+trait+Loci+analysis+using+the+false+discovery+rate.">Quantitative trait Loci analysis using the false discovery rate.</a> Genetics. 171, 783-790 (2005).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Çok yakın zamanda diğer transkripsiyon faktörleri 2,3 ile gösterilmiştir gibi, şimdi ChIP-seq kullanarak protein-DNA etkileşimleri dernek bir genom profil yürütmek mümkündür. Başarılı bir sıralama sonuç için önemli bir yüksek kaliteli kromatin immunoprecipitation DNA örneğinin nesil. DNA şablonu oluşturulur ve yeterli zenginleştirilmiş tespit edildikten sonra, tek bir daha sonraki dizi analizi için kütüphanesi hazırlanmasında alabilir. Örneğin, bi...

Uzun yıllar boyunca, özellikle bir protein genom genişliğinde, transkripsiyon faktörü sınıfta olanlar tarafından bağlı ve düzenlenen genlerin kümesini tanımlamak için karşılanmamış bir ihtiyaç olmuştur. Odom ve ark. 1 sistematik insan karaciğer ve pankreas adacık olarak önceden belirlenmiş transkripsiyonel düzenleyiciler tarafından işgal genleri tanımlamak için organizatörü mikroarrayler ile birlikte kromatin immunoprecipitation (ChIP) kullanılır. Daha sonra, Johnson ve ark. 2 kapsamlı tüm memeli genomları arasında protein-DNA etkileşimleri map için doğrudan ultra yüksek verimli DNA dizi (ChIP-seq) dayalı büyük ölçekli kromatin immunoprecipitation testi geliştirdi. Bir test durumu olarak, in vivo insan genomu 1946 yerlere nöron-kısıtlayıcı susturucu faktörü (NRSF) bağlama eşleştirilir. Veriler i hem kolaylaştırdı bağlayıcı konumunun keskin çözünürlük (+ 50 baz çifti), görüntülenirmotif ve NRSF bağlayıcı motifleri ilişkin tanımlamaların çözüm. Bu ChIP-seq veri aynı zamanda yüksek duyarlılık ve özgüllük ve istatistiksel güven (p &lt;10 -4), yeni aday etkileşimleri çıkarım için önemli olan özellikleri vardı. Robertson ve ark. 3 Ayrıca STAT1 hedefleri harita için ChIP-seq kullanılan interferon-γ (IFN-γ) ile uyarılmış ve in vivo insan HeLa S3 hücreleri uyarılmamış. ChIP-seq tarafından, 15,1 ve 12,9 milyon benzersiz eşleştirilir dizisi okur, ve en az 0.001 bir tahmini yanlış keşif oranı kullanılarak, sırasıyla, uyarılmış ve uyarılmamış hücrelerde 41.582 ve 11.004 varsayılan STAT1 bağlayıcı bölgeleri belirledi. STAT1, interferon-duyarlı bağlanma bölgeleri 4-8 içerdiği bilinmektedir 34 lokus, yonga-DİZ 24 (% 71) bulundu. ChIP-seq hedefler bilinen STAT1 bağlayıcı motifleri benzer dizileri zenginleştirildi. Mevcut iki ChIP-PCR verileri ile karşılaştırmalar önerilen ayarlarBu ChIP-seq duyarlılık% 70 ve% 92 ve özgüllük en az% 95 arasında oldu. Ayrıca, ChIP-seq derinlemesine sıralama ile artar düşük analitik karmaşıklık ve duyarlılık hem de sunduğu açıktı. Bu, &quot;yeni nesil&quot; genom dizileme teknolojileri 9 eski teknolojileri üzerinde oluşturulan etkin bir maliyet olabilir dizisi miktarında artış büyüklüğü 1-2 emir sağlamak gibi. ChIP-seq yöntemleri bu nedenle doğrudan memeli protein-DNA etkileşmeleri 3 etkin profil için tam genom kapsama alanı sağlar. 2006 yılında, transkripsiyon faktörü 2 7-benzeri (TCF7L2) tip 2 diyabetli gen varyantları güçlü bir ilişki 10 keşfedildi. Diğer araştırmacılar zaten bağımsız Doğa 11,12 yayınlanan tip 2 diyabet ilk genom çapında ilişki çalışmalar, ilginç, farklı etnik Bu bulgu çoğaltılmış ve var </sbaşka bir yerde&gt;, Bilim 13-15 ve 16,17 kadar, en güçlü dernek TCF7L2 ile gerçekten oldu, bu şimdi 18-20 bugüne kadar tip 2 diyabet en önemli genetik bulgu olarak kabul edilir. Buna ek olarak, kanser riski TCF7L2 21,22 ile bağlantılı olmuştur; kolorektal karsinom da dahil olmak üzere kanser, bir dizi genom genişliğinde ilişki çalışmalarla ortaya 8q24 eğrisi, bir aşırı akış bağlı olduğu gösterilmiştir Gerçekten, bu bağlantıyı daha da belirginleşir TCF7L2-bağlama öğesi MYC 23,24 olan transkripsiyon sürüş. Bu nedenle, bu anahtar transkripsiyon faktörü düzenlenir aşağı genlerin belirlenmesinde büyük ilgi var. Metodolojinin örnek olarak TCF7L2 ile deneyimlere dayanarak, bu kağıt kaliteli ChIP DNA örneğinin oluşturmak için nasıl özetliyor. Çip, yüksek resol oluşturmak amacıyla sekanslanmasını için, kolorektal karsinoma hücre hattı ihtiva eden, HCT116 gerçekleştirilmiştirKarmaşık özelliklerin patogenezinde anahtar rolü için daha fazla fikir elde etmek için bir çaba içinde TCF7L2 25 ile bağlı genlerin ution haritası.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>28104 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EZ-ChIP Kit </td>
 <td>Millipore </td>
 <td>17-371 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GoTaq Hot Start Polymerase </td>
 <td>Promega</td>
 <td>M5001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Misonix Sonicator</td>
 <td>Qsonica </td>
 <td>XL-2000 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>
 NanoDrop 1000 Spectrophotometer </td>
 <td>
 Thermo-Scientific</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Positive control primer sequences (TCF7L2-1) 
 Forward- 5'-TCGCCCTGTCAATAATCTCC-3' 
 Reverse- 5'-GCTCACCTCCTGTATCTTCG-3' 
 Negative control primer sequences (CTRL-1) 
 Forward-5'-ATGTGGTGTGGCTGTGATGGGAAC-3'
 
 Reverse- 5'-CGAGCAATCGGTAAATAGGTCTGG-3'</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

generation of high quality chromatin immunoprecipitation dna template for high-throughput sequencing (chip-seq)

Kromatin immunoprecipitation (ChIP) birleştiren ve güçlü paralel sıralama in vivo transkripsiyon faktörleri ile bağlı memeli DNA dizilerinin repertuar belirlemek için kullanılabilir nerede ChIP-sıralama (ChIP-seq) yöntemleri doğrudan, tam genom kapsama alanı sunuyor. &quot;Yeni nesil&quot; genom dizileme teknolojileri olabilir dizisi miktarında artış büyüklüğü 1-2 siparişleri sağlamak maliyet-etkin böylece doğrudan memeli etkin profil için tam genom kapsama sağlamak için ChIP-seq yöntemleri için izin eski teknolojileri üzerinde oluşturulan protein-DNA etkileşmeleri. Başarılı ChIP-seq yaklaşımlar için, bir yüksek kaliteli ChIP DNA örneğinin en iyi sıralama sonuçları elde etmek için üretmek gerekir. Açıklama en güçlü tip 2 diyabet, yani transkripsiyon faktörü transkripsiyon faktörü 2 7-benzeri (TCF7L2 patogenezinde rol genin protein ürünü ile deneyimine alınmaktadır.) Bu faktör, aynı zamanda çeşitli kanser ile ilişkili bulunmuştur. Boş patogenezinde anahtar rolü daha fazla fikir veren, TCF7L2 bağlı genleri belirlemek için sıralama ile yüksek çözünürlüklü harita oluşturmak için, kolorektal karsinom hücre hattı, HCT116 elde edilen yüksek kaliteli ChIP DNA örneğinin oluşturmak için nasıl Karmaşık özelliklerin.

Kromatin sonicated edilmiş ve RNaz ve proteinaz ile tedavi edildikten sonra,% 2 agaroz jel üzerinde çalışan örnekleri istenilen boyutta DNA büyük bir kısmı bir karalama sunmalıdır. Birkaç farklı devir test edilir ise, boyut olarak bir kademeli azalma devir sayısı arttıkça (Şekil 2) olarak görülmelidir. Protokolün immunoprecipitation bölümü tamamladıktan sonra zenginleştirme ya PCR veya gerçek zamanlı PCR ile kontrol edilebilir. Bir agaroz jel üz...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq at JoVE.com

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

Kromatin immunoprecipitation ve ultra-yüksek verimli sıralama (ChIP-seq) kombinasyonu belirli bir doku ya da hücre hattı protein-DNA etkileşimleri belirlemek ve eşleyebilirsiniz. Boş bir örnek olarak transkripsiyon faktörü TCF7L2 ile deneyim kullanıyorsanız sonraki sıralama için yüksek kaliteli ChIP şablonu oluşturmak için nasıl.

Yüksek verim Sıralama için Yüksek Kalite Kromatin Immunoprecipitation DNA Şablon üretimi (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

generation-high-quality-chromatin-immunoprecipitation-dna-template

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

24.3K Görüntüleme.  Children's Hospital of Philadelphia Research Institute. Kromatin immunoprecipitation ve ultra-yüksek verimli sıralama (ChIP-seq) kombinasyonu belirli bir doku ya da hücre hattı protein-DNA etkileşimleri belirlemek ve eşleyebilirsiniz. Boş bir örnek olarak transkripsiyon faktörü TCF7L2 ile deneyim kullanıyorsanız sonraki sıralama için yüksek kaliteli ChIP şablonu oluşturmak için nasıl.

Video: Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide resolution. This technique captures miRNAs by attaching 3&#8217; and 5&#8217; oligonucleotide adapters to miRNA molecules and allows de novo miRNA discovery. Coupling with powerful next-generation sequencing platforms, miR-Seq has been instrumental in the study of miRNA biology. However, significant biases introduced by oligonucleotide ligation steps have prevented miR-Seq from being employed as an accurate quantitation tool. Previous studies demonstrate that biases in current miR-Seq methods often lead to inaccurate miRNA quantification with errors up to 1,000-fold for some miRNAs1,2. To resolve these biases imparted by RNA ligation, we have developed a small RNA ligation method that results in ligation efficiencies of over 95% for both 3&#8217; and 5&#8242; ligation steps. Benchmarking this improved library construction method using equimolar or differentially mixed synthetic miRNAs, consistently yields reads numbers with less than two-fold deviation from the expected value. Furthermore, this high-efficiency miR-Seq method permits accurate genome-wide miRNA profiling from in vivo total RNA samples2.

MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.

Yüksek Verim Dizilimine tarafından MicroRNA ölçümü için Küçük RNA molekülleri, yüksek Verimli ligasyonu

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Biyoloji

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

DNA Metilasyon Analizi nesil Dizilimine tarafından hedef

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Post-transkripsiyonel ayarlı genlerin kimyasal Modülatörler için yüksek verimli tarama

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin immunoprecipitation is a powerful technique for the identification of DNA binding sites of Arabidopsis proteins in vivo. This procedure includes chromatin cross-linking and fragmentation, immunoprecipitation with selective antibodies against the protein of interest, and qPCR analysis of bound DNA. We describe a simple ChIP assay optimized for Arabidopsis plants.

Arabidopsis Protein-DNA Etkileşimleri Tespiti için Kromatin Immunoprecipitation Deneyi<em&gt; İn Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is an alternative approach to chromatin immunoprecipitation (ChIP). An expressed fusion protein consisting of the protein of interest and the E. coli DNA adenine methyltransferase can methylate the adenine base in GATC motifs near the sites of protein-DNA interactions. Adenine-methylated DNA fragments can then be specifically amplified and detected. The original DamID assay detects the genomic locations of methylated DNA fragments by hybridization to DNA microarrays, which is limited by the availability of microarrays and the density of predetermined probes. In this paper, we report the detailed protocol of integrating high throughput DNA sequencing into DamID (DamID-seq). The large number of short reads generated from DamID-seq enables detecting and localizing protein-DNA interactions genome-wide with high precision and sensitivity. We have used the DamID-seq assay to study genome-nuclear lamina (NL) interactions in mammalian cells, and have noticed that DamID-seq provides a high resolution and a wide dynamic range in detecting genome-NL interactions. The DamID-seq approach enables probing NL associations within gene structures and allows comparing genome-NL interaction maps with other functional genomic data, such as ChIP-seq and RNA-seq.

We describe herein an assay by coupling DNA adenine methyltransferase identification (DamID) to high throughput sequencing (DamID-seq). This improved method provides a higher resolution and a wider dynamic range, and allows analyzing DamID-seq data in conjunction with other high throughput sequencing data such as ChIP-seq, RNA-seq, etc.

DamID seq: Adenin-metillenmiş DNA Fragments Yüksek Verimli Dizileme tarafından Protein-DNA Etkileşimleri genom Haritalama

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Retroviral Entegrasyon Siteleri Amplifikasyon, Yeni Nesil Sıralama ve Genomik DNA Haritalama

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.

Using DNA assembly, multiple CRISPR vectors can be constructed in parallel in a single cloning reaction, making the construction of large numbers of CRISPR vectors a simple task. Tomato hairy roots are an excellent model system to validate CRISPR vectors and generate mutant materials.

Domates Tüylü Roots Üretimi ile yüksek verim CRISPR Vektör İnşaat ve DNA Değişiklikler Karakterizasyonu

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

A Protocol for Functional Assessment of Whole-Protein Saturation Mutagenesis Libraries Utilizing High-Throughput Sequencing

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel sequencing technology have opened up the possibility of assessing the functional or fitness effects of large numbers of mutations simultaneously. Here, we present a protocol for experimentally determining the effects of all possible single amino acid mutations in a protein of interest utilizing high-throughput sequencing technology, using the 263 amino acid antibiotic resistance enzyme TEM-1 &#946;-lactamase as an example. In this approach, a whole-protein saturation mutagenesis library is constructed by site-directed mutagenic PCR, randomizing each position individually to all possible amino acids. The library is then transformed into bacteria, and selected for the ability to confer resistance to &#946;-lactam antibiotics. The fitness effect of each mutation is then determined by deep sequencing of the library before and after selection. Importantly, this protocol introduces methods which maximize sequencing read depth and permit the simultaneous selection of the entire mutation library, by mixing adjacent positions into groups of length accommodated by high-throughput sequencing read length and utilizing orthogonal primers to barcode each group. Representative results using this protocol are provided by assessing the fitness effects of all single amino acid mutations in TEM-1 at a clinically relevant dosage of ampicillin. The method should be easily extendable to other proteins for which a high-throughput selection assay is in place.

We present a protocol for the functional assessment of comprehensive single-site saturation mutagenesis libraries of proteins utilizing high-throughput sequencing. Importantly, this approach uses orthogonal primer pairs to multiplex library construction and sequencing. Representative results using TEM-1 &#946;-lactamase selected at a clinically relevant dosage of ampicillin are provided.

Yüksek verimlilik sıralaması kullanılması Tüm-Protein Doygunluk Mutagenez Kütüphaneleri Fonksiyonel Değerlendirme Protokolü

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel ...

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable of measuring SSDC in many single DNA molecules simultaneously. Bead-tethered substrate DNAs, each containing a single copy of the target sequence, are prepared in a microfluidic flow channel. An external magnet applies a weak force to the paramagnetic beads. The integrity of up to 1,000 individual DNAs can be monitored by visualizing the microbeads under darkfield imaging using a wide-field, low magnification objective. Injecting of a restriction endonuclease, NdeI, initiates the cleavage reaction. Video microscopy is used to record the exact moment of each DNA cleavage by observing the frame in which the associated bead moves up and out of the focal plane of the objective. Frame-by-frame bead counting quantifies the reaction, and an exponential fit determines the reaction rate. This method allows collection of quantitative and statistically significant data on single molecule SSDC reactions in a single experiment.

A highly parallel method for measuring the site-specific cleavage of DNA at the single molecule level is described. This protocol demonstrates the technique using the restriction endonuclease NdeI. The method can easily be modified to study any process that results in site-specific DNA cleavage.

Siteye Özgü DNA Bölünmesi için Paralel Yüksek İş Kinetik Test

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...

Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, host characteristics, and broader ecosystem functions. With this rapid increase in breadth and depth of sequencing capabilities have come methods to extract, amplify, analyze, and interpret environmental DNA successfully with maximum efficiency. Unfortunately, performing DNA extractions quickly can come at the cost of increasing the risk of contamination among samples. In particular, high-throughput extractions that are based on samples contained in a 96-well plate offer a relatively quick method, compared to single-tube extractions, but also increase opportunities for well-to-well cross-contamination. To minimize the risk of cross-contamination among samples, while retaining the benefits of high-throughput extraction techniques, we developed a new method for loading environmental samples into 96-well plates. We used pierceable PCR sealing films to cover each plate while loading samples and added samples first to PCR tubes before moving them into wells; together, these practices reduce the risk of sample drift and unintended double loading of wells. The method outlined in this paper provides researchers with an approach to maximize available high-throughput extraction techniques while reducing the risk of cross-contamination inherent to 96-well plates. We provide a detailed step by step outline of how to move from sample collection to DNA extraction while minimizing the risk of unwanted cross-contamination.

Current methods for loading 96-well plates for DNA extractions can be prone to contamination. We detail a new method for loading 96-well plates that reduces risk of cross-contamination among wells. Our method will help other researchers capitalize on the efficiency of high-throughput DNA extraction techniques and minimize risk of contamination.

Yüksek İşlemli DNA Çıkarma Plakalarının Yüklenmesinde Modifiye Yöntemler Kontaminasyon Potansiyelini Azaltır

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, ...