Bu yöntem, genomlarla birlikte hücre tipine özgü bir şekilde ne kadar renk modifikasyonlarının düzenlendiği gibi epigenetik alanındaki anahtar soruların yanıtalmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, kromatini hedeflenen hücrelerden izole edip tipik çingene akıntısını takip edebilesek. Yani bu yöntem nöron spesifik trimincil, lysinc 4, opisoncilly içine anlayışlar sağlayabilir.
Ayrıca diğer histon modifikasyonu, diğer hücre tipleri ve daha sonra diğer model organizmalar uygulanabilir. Prosedürü gösteren Mari Mito, laboratuvarımdan bir teknisyen. Başlamak için, küçük parçalar halinde ilgi doku incelemek için ince bahar makas kullanın.
Sıvı nitrojen dolu temiz bir kap için doku parçaları ekleyin. Daha sonra, sıvı nitrojen dolu iki mililitre tüpler doku parçaları aktarın. Tüpleri eksi 80 derecede beş dakika saklayın ve kapağı açık olarak sıvı nitrojeni buharlaştırın.
Doku örneklerini içeren tüpleri soğutulmuş metal buz rafına yerleştirin. Sonra, 1.5 mililitrelik bir tüp içine metal bir mermi yerleştirin ve sıvı nitrojen ile soğutun. Soğutulmuş metal mermiyi numune tüplerinden birine yerleştirin.
Kapağı kapatın ve tüpü kriyojenik öğütücünün tüp tutucusu içine yerleştirin. Hemen, bir dakika için sıvı nitrojen monte tüp tutucu daldırma. Donmuş tüp tutucuyu kriyojenik öğütücünün dış kasetine takın.
Ve 30 saniye, 60 kez şiddetle sallayın. Bundan sonra, kriyojenik öğütücü sökmek, metal mermi kaldırın. Ve tüpü önceden soğutulmuş bir numune soğutucusuna yerleştirin.
Soğutucuyu 20 derecede 15 dakika saklayın. Daha sonra, tüp ve pipet karıştırmak için% 1 formaldehit 900 mikrolitre ekleyin. Süspansiyonu 900 mikrolitre %1 formaldehit içeren yeni bir iki mililitrelik tüpe aktarın.
Daha sonra, 23 santigrat derecede hafif bir dönüş ile 10 dakika süspansiyon düzeltmek. Fiksasyon reaksiyonunu durdurmak için, tüpe 2,5 molar glisin 100 mikrolitre ekleyin. Ve santrifüj 3,000 kat yerçekimi için dört santigrat derecede beş dakika.
Bundan sonra, süper supernatant atın. Karıştırmak için tüp ve girdap için PBS bir mililitre ekleyin. Santrifüj 3,000 kat yerçekimi nde beş dakika boyunca dört santigrat derecede.
Bu yıkama adımLarını iki kez daha tekrarlayın. Daha sonra, karıştırmak için pelet ve pipet için lysis tampon bir 500 mikrolitre ekleyin. Tüpü 5 dakika boyunca 3,000 kat yerçekimini 4 santigrat derecede niçin santrifüj edin ve süpernatant'ı atın.
Karıştırmak için pelet ve girdap bir mililitre lysis tampon iki ekleyin. Daha sonra, süspansiyonu 3,000 kat yerçekiminde beş dakika santrifüj edin ve süpernatant'ı atın. Bundan sonra, karıştırmak için pelet ve pipet proteaz inhibitörü kokteyl ile radyo immünopremasyon asssay tampon 800 mikrolitre ekleyin.
Süspansiyonu 3,000 kat yerçekiminde beş dakika santrifüj edin ve süpernatant'ı atın. Daha sonra, pelet proteaz inhibitörü kokteyl ile RIPA tampon 500 mikrolitre ekleyin. Daha sonra, süspansiyonu 3,000 kat yerçekiminde beş dakika santrifüj edin ve süpernatant'ı atın.
Proteaz inhibitörü kokteyli ile bir mililitre RIPA tampon ekleyin. Proteaz inhibitörü kokteyli ile RIPA tamponu ekledikten hemen sonra, bir sonicator tüpü ne lysate aktarın. Ve tüpü ultrasonatöre yerleştirin.
Metin protokolünde belirtilen ayarları kullanarak kromatini yayı. Daha sonra, 1.5 mililitre protein düşük bağlayıcı tüp örnek aktarın. Ve 20,000 kat daha fazla yer çekiminde dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin.
Örnekten süpernatant toplayın ve yeni bir protein düşük bağlayıcı tüp aktarın. Bu protokolde tandem kromatin immünopresipitasyon dizilimi tanıtıldı ve gösterilmiştir. İşlem sırasında DNA'nın kalitesi birden fazla adımda test edildi.
Sonication hemen sonra, yığılmış DNA izole edildi ve mikroakışkan elektroforez makinesi ile test edildi. Afinite saflaştırma yapmak için anti-FLAG antikor ve anti-H3K3me3 antikor kullanılarak DNA kalitesi tekrar kontrol edildi. H2B-FLAG'de DNA'nın immün arınma özgüllüğü negatif kontrol örnekleri ile doğrulandı.
Önemsiz miktarda DNA tespit edildiği yer. Protokolün devamında, sıralama kitaplığı kalitesi doğrulandı. Başarılı ChIP ve T-ChIP, GAPDH geninin promotör bölgesini hedefleyen astarlar kullanılarak zenginleştirme analizi ile kanıtlanmıştır.
Üç nöron geni boyunca temsili yeniden dağılımlar elde edildi. Ve tüm beyin T-ChIP arama nöron T-ChIP arama tarafından genlerin beş asal ucunda okuma zenginleştirme gözlenmiştir. Bir stabilite sonra, bu teknik farelerde nöronlarda yaygın olarak hücre tipi özel histon modifikasyonu keşfetmek için epigenetik alanda araştırmacılar için önünü açıyor.
Formaldehit ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi yaparken her zaman lastik giysi ve gözlük takmak gibi önlemler alınması gerektiğini unutmayın.
