Fareden izole kahverengi lipid dokusunda hem ester hem de ester dışı proteinlerin etkili ChIP dizilimi yapmak için kullanılan ölçülü. Tekniğin en büyük avantajı, protokolün lipid dokusundan kromatin ilişkili kompleksin etkin immünopresipitasyonu için optimize edilmiş olmasıdır. Kesiden önce, ötenazili fareyi %70 etanol ile püskürtün.
Fareyi sırtı yukarı bakacak şekilde yerleştirin, ardından boyun boyunca bir kesik yapın. Daha sonra, omuzlar arasında doğrudan deri altında bat bulunan ve dikkatle beyaz yağ ince tabaka kaldırın. Oda sıcaklığında 150 RPM'de 15 dakika boyunca %1 formaldehit içeren 10 mililitre PBS'deki her BAT pedini çapraz bağlantı.
15 dakika sonra, BAT'e 2,5 molar glisin ekleyerek çapraz bağlanmayı söndürün ve bu da 125 milimos'luk son konsantrasyonla sonuçlanır. Oda sıcaklığında 150 RPM döndürülerek, beş dakika boyunca bir shaker üzerine yerleştirin. Daha sonra, BAT pedini 500 mikrolitre hipotonik lysis tamponuna aktarın ve her BAT pedi için iki paslanmaz çelik boncuk ekleyin.
Sonra, bir boncuk bazlı doku homogenizer doku parçalamak için kullanın. Maksimum güçte beş dakika ile başlayın. Gerekirse, doku homojenize ve tek hücreler ayrılana kadar süreyi uzatın.
Numuneyi yeni bir tüpe aktarın ve 16,000 G'de 10 dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüj edin. 10 dakika sonra, yeni bir tüp içine supernatant aktarın ve buz üzerinde hücre pelet tutmak. Yüzen hücrelerin kaybını önlemek için 16, 000 G'de 10 dakika boyunca 4 santigrat derecede süpernatantsan.
Daha sonra, son supernatant atın ve bir kez proteaz inhibitörü ile SDS lysis tampon 300 mikrolitre birlikte her iki hücre pelet yeniden askıya. 10 dakika boyunca buzda kuluçkaya yat. Daha sonra, 200 ila 500 baz çifti uzunluğunda DNA parçaları üretmek için lysates sonicate.
Sonication sonra, 16, 000 G dört derece santigrat 10 dakika santrifüj tarafından enkaz kaldırın. İmmünoenpresit gerçekleştirmek için, ChIP girişi olarak kromatin çözeltisinin %1'ini bir kenara koyun ve girdileri bir gecede dört santigrat derecede tutun. Daha sonra, kromatin çözeltisi bir mililitre ChIP antikor ekleyin ve aynı türün karşılık gelen pre-immün IgG veya normal IgG ile paralel immünopresideasyon gerçekleştirin.
Alternatif olarak, hiçbir antikor kontrolü için kromatin çözeltisi bir mililitre kaydedin. Rotasyonla birlikte bir gecede dört santigrat derecede kuluçkaya yat. Bağışıklık kompleksleri toplamak için, protein 50 mikrolitre ekleyin A agarose 50% bulamaç bağışıklık kompleksleri ve 150 RPM rotasyon ile dört derece santigrat bir saat kuluçka.
Bir saat sonra, dört santigrat derece 1000 kez G bir dakika için santrifüj ile boncuk pelet. 0,45 mikrometre PVDF santrifüj filtre sütunlarında boncukların sıralı yıkamalarını, ilk olarak 500 mikrolitre düşük tuz yıkama tamponu ile sütunlarda boncukları aktararak sıkılığı artıran tamponlarla gerçekleştirin. Daha sonra, 2500 G.At üç dakika boyunca sütunlarda boncuk pelet akış-through atın.
Düşük tuz yıkama prosedürlerine göre yüksek tuz yıkama tamponu ile yıkamayı tekrarlayın. Daha sonra, lityum klorür ve son olarak bir kez TE ile prosedürleri tekrarlayın. Yıpranlar tamamlandıktan sonra, sütunlarda peletli boncuklara 300 mikrolitre elüsyon tamponu ekleyerek bağışıklık komplekslerini aşındırın. 400 RPM'de bir çalkalayıcıda 30 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.
Daha sonra, taze bir tüp içinde 2500 G üç dakika boyunca sütunaşağı dönerek elute toplamak. Bir gecede 65 santigrat derecede toplanan elute ve girdileri kuluçkaya yatırarak çapraz bağlantıları tersine çevirin. DNA'yı kurtarmak için, 300 mikrolitre fenol kloroform IAA'yı bire bir oranında ve girdap taki10 saniye boyunca elute ve girişlere ekleyin.
Sonra, 21,000 G'de 4 santigrat derecede 20 dakika boyunca aşağı dön. Pelet tutun ve supernatant atın. Bir mililitre soğuk %70 etanol ile peletyı yıkayın.
Sonra 21,000 G'de dört santigrat derecede beş dakika boyunca aşağı dön. Supernatant atın ve hava pelet kuru. Daha fazla işlem için 70 mikrolitre DNAE içermeyen su peletyeniden askıya.
Burada Wildtype veya GPS2-A nakavt fareler izole BAT kullanarak ChIP Q PCR bir örnektir. GPS2'nin farklı hücre hatlarındaki nükleer kodlanmış mitokondriyal genlerin ekspresyonu için gerekli olduğu tespit edildiğinden, GPS2'nin işe alınması iki özel nükleer kodlanmış mitokondriyal gen üzerinde test edilmiştir. NDUFV1 ve TOMM20 yarasa farelerden yüksek mitokondri zenginleştirilmiş bir doku örnekleri olarak.
GPS2 organizatörü doluluk GPS2-A nakavt fareler ve vahşi tip harf arkadaşları karşılaştırıldı. GPS2-A nakavt farelerden BAT'deki seçici hedef genler için GPS2 bağlanmasında beklenen bir azalma gözlendi. Burada açıklanan protokol kullanılarak, RNA polimeraz iki ve baskıcı histon işareti, H3K9ME3 artan bir bağlama, VAHŞI tip harf arkadaşları ile karşılaştırıldığında GPS2-A nakavt fareler den BAT kaydedildi.
Bu sonuçlar seçilen nükleer kodlanmış mitokondriyal genler GPS2 işe onaylamak ve GPS2 H3K9ME3 birikimini önlemek için gerekli olduğunu göstermektedir ve böylece hedef organizatörler üzerinde kutup iki transkripsiyonel aktivite duraklama için gerekli. Burada açıklanan protokol, özellikle kahverengi yağ dokusu için optimize edilmiş olsa bile, diğer murine ve insan dokusundan ChIP yapmak için değerli bir aracı temsil eder. Fenokloroform ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın.
Bu nedenle, bu reaktif kullanırken her zaman duman kaputu altında çalışmak son derece önemlidir.
