Biz 2Photon mikroskop kanallarının ilk kurulum kendi yardım için özellikle James Jonkman de, prenses Margaret hastanede Gelişmiş Optik Mikroskopi Tesisi teşekkür etmek istiyorum. Yazarlar Radyasyon Yanıt (STTARR) programı ve bağlı fon kuruluşlarının uzay-zamansal Hedefleme ve Amplifikasyon kabul etmek istiyorum. Biz VEGFTrap plazmid temin ve el yazması düzeltme ve geri bildirim için Dr Peter Tonge, Dr.Iacovos Michael ve Dr.Andras Nagy teşekkür ederim. BTRC de personel sürekli destek ve tartışma değerli olmuştur ve onun bilimsel girişi için Dr.Abhijit Guha anmak istiyorum. Çalışma CIHR ve NIH hibe tarafından finanse edildi.

TÜM HAYVAN İŞ BİR HAYVAN BAKIM ALTINDA GERÇEKLEŞTİRİLEN VE KULLANIM KURULU TÜM İLGİLİ İLKELER, KURALLAR VE MEVZUAT KURUMLAR UYGUN PROTOKOL ONAYLI VE İDAM EDİLMİŞTİR. Sorun giderme referans Tablo 2 için. 1. Kemik İliği Sulandırma (İsteğe bağlı) Şekil 1 (30 dakika hazırlık, fare başına 5 dakika) Tüm cerrahi otoklav steril ekipmanları ile sıkı aseptik teknik kullanılarak yapılmalıdır. Bir donör fare sulandırmak üç ana fareler olacak. <ol><li> Gammacell 40 &#39;exactor&#39; ışınlama en merkezi içinde, baş korumak için kurşun ile Anesteziyoloji alıcı NODscid fare ve konumu,. </li><li> 2.5 Gy total vücut ışınlaması (TBI) ile NODscid fareler ışın tedavisi. </li></ol> KRİTİK ADIM: TBI optimizasyonu nedeniyle yeterli konak immün ce için gereken doz değişimi için gerekli olabilirfarklı fare suşları ll tükenmesi. Duraklama noktası: Ana fareler önceden ışınlanmış olabilir ama aydınlatarak 24 saat içinde kullanılmalıdır. <ol start="3"><li> Kurumsal hayvan bakımı komitesi kurallarına göre donör fareler Euthanize. Arka ayaklarında temizleyin ve kemikler (Şekil 1ai, 1aii) tüm aşırı doku sıyırma, hem tibia ve femur çıkarın. </li></ol> KRİTİK ADIM: Fibula kemikleri çok dar lümen nedeniyle kullanım için uygun değildir. <ol start="4"><li> Dört çıkarılan kemiklerin her iki uçtan uç plakaları çıkarın ve görünümü (Şekil 1aiii) beyaz kadar bir 22 G iğne ve 1 ml steril PBS kullanarak onları yıkayın. Başvuru Tablosu 2. </li><li> De çıkarılan kemik iliği (BM) süspansiyon karıştırın ve üç 27 G tüberkülin iğne içine 300 ul çizin. Çıkarılan BM yaklaşık 2 x 10 7 hücre içeren ve gerektiği3 ana fareler reconstitutions için yeterlidir. Başvuru Tablosu 2. </li><li> Adım 1.1 (Şekil 1b) üç daha önce ışınlanmış NODscid farelerin lateral kuyruk ven içine süspansiyon enjekte edilir. Başvuru Tablosu 2. </li></ol> DİKKAT: BM sterilite kontrol etmek için biz enfeksiyon kontrol etmek için 24 saat boyunca kalan BM ve kültür kaplama tavsiye enjekte. Bu noktada ölüm başlıca nedeni yeni sulandırılmış farelerde enfeksiyondur. 2. Kafa içi Pencere Üretimi - Şekil 2 (fare başına 30 dakika) Tüm cerrahi (Şekil 2A) hayvanları sıcak tutmak için otoklav steril ekipman ve bir ısı lambası altında sıkı aseptik teknik kullanılarak yapılmalıdır. <ol><li> IACUC onaylı anestezi, 0.5 Avertin IP enjeksiyon ile Anesteziyoloji alıcı NODscid fareler kafa korumak için kurşun mg / g ve pozisyon, ortasına içGammacell 40 &#39;exactor&#39; ışınlama. Kafa derisi saç kaldırmak. Ayrıca kornea su kaybını önlemek için göz yaşartıcı jel uygulayın. </li><li> Sonra Betadine çözüm ve alkol ile ilk temiz kafa derisi, sonra sadece gözleri yukarıda kulak orta noktası bir kesi yapmak. Kafatası ve kafatası yüzeyinin yerlerinden (Şekil 2BI) açığa, kafa derisi 3 mm ya ilk kesi yan çıkarın. </li><li> % 2 lidokain enjekte edilerek periost Elevate: epinefrin çözüm ve kafatası yüzeyi (Şekil 2Bii) uzak incelemek. </li><li> 2.7 mm trefin matkap kullanarak, lambda ve bregma arasında doğru yarımkürenin korteks üzerinde kafatası bir 2.7 mm daire zayıflatmak. Matkap (Şekil 2Biii) ile kemik nüfuz YAPMAYIN. Başvuru Tablosu 2. </li></ol> KRİTİK ADIM: matkap kafatası yoluyla giderse beyin yüzeyi ek tra ile etkileyen sonuçlar zarar görüruma. Buna ek olarak aşırı kanama oluşturulan bir açık pencere önlenmesi ortaya çıkar. <ol start="5"><li> Diseksiyon cımbız ve diş kanca ve kasıtlı ama kontrollü güç (Şekil 2Biii) kullanarak zayıflamış kemik flep çıkarın. </li><li> Tümör patoloji bakarak (İsteğe bağlı), adım 2.5 oluşturulan pencerenin merkezine seçilen tümör hücre hatları (floresan muhabiri gen ile) enjekte edilir. <ol><li> Bir stereotaktik çerçeve içine hücre süspansiyonu ve yük iğne ile 10 ul 30 G Hamilton şırınga yükleyin. KRİTİK ADIM: Hücre numarası gerekli büyüme kullanımı ve zaman çizelgesi tümör hücreleri için optimize edilmesi gerekir. U87 kültürler için biz fare başına 10 ul 2 x 10 5 hücre kullanın. </li><li> Dijital stereotaktik çerçeve üzerine fare yüklemek oluşturulan pencerenin merkez noktası için iğne hizalayın. </li><li> Sadece kortikal yüzey dokunur ve dijital koordinatları sıfırlamak Alt iğne kadar. </li><li> Düşüker kortikal doku içine 3.2 mm iğne ve derin 3 mm enjekte. </li><li> Iğne geri çekin yavaş yavaş daha sonra çerçeveden fare çıkarın. KRİTİK ADIM: 1 dk süresi boyunca çözüm enjekte edilir ve geri azaltılmış akışını sağlamak için pozisyon verildikten enjeksiyon iğnesi bırakın. KRİTİK ADIM: küçük kanama karşılaşılırsa yüzeysel kanamayı durdurmak için 1-5 dakika steril tuzlu su ile yıkayınız. Sonraki adımlarla devam edin. </li></ol></li><li> Beyin dokusu sulu tutmak için steril PBS bir damla ile beyin yüzey nemlendirilmelidir. </li><li> Üretilen 2.7 mm pencere etrafında tam mühür beyin yüzeyine 3 mm lamel yüzer. Başvuru Tablosu 2. </li><li> Kuru çevreleyen kafatası sonra kafatası kemik ve yerine lamel reseal kafa derisi doku için tüm maruz kafatasına Vetbond geçerli bone. Camın altına sızabilir ve görüntüleme potansiyelini azaltmak gibi bir aşırı UYGULANAMAMAKTADIR. </li><li> Mix taze diş akrilik tozu ve çözelti, yaklaşık% 30 (w / v) ve Vetbond üst üzerine uygulanır. Sıkı bir sızdırmazlık sağlamak için hafifçe cam lamel kenarına (Şekil 2Biv) üzerine akrilik üst üste. Başvuru Tablosu 2. </li></ol> DİKKAT: Diş eldiven ve prosedürleri boyunca maske kullanmanızı tavsiye ederiz böylece akrilik son derece tehlikelidir. KRİTİK ADIM: Diş akrilik iyi bir sızdırmazlık sağlamak ve fazla azaltmak için döküm sırasında esnek kalması gerekiyor. Pencerede akrilik oluşturmak görüntüleri bulanıklık olacaktır. <ol start="11"><li> Fareler sıcak bir kafese kurtarmak için izin verin. </li></ol> 3. Stereotaktik Radyasyon (İsteğe bağlı) - Şekil 3 (fare başına 25 dk) Varyasyonlar kullanılan ve gibi optimizasyon gerekecektir farklı ışınlama var olacaktır. Biz özel tasarlanmış ışınlama kullanılır. <ol><li> Fareler uyuşturan0.5-1 litre O 2 dk, ve stereotaktik ışınlama içinde özel baş süzgeç üzerine yer (Şekil 3Al) ile işlem boyunca 1.5-2% takip indüksiyon için% 4 İsofluranın kullanarak. </li><li> X-ışını tüpü, 2 mm alüminyum filtre ile 40 kVp ve 0.05 mA çalışan ile 360 ​​° koni ışın BT edinin. Bu Dorsal ventral yönde merkezi sağlanması sağ hemisfer için radyasyon isocentre yönlendiren, sahne hareketi rehberlik görüntü kullanın. </li><li> Hemisferik kolimatör, 8 mm x 11 mm blok yerleştirin. </li></ol> KRİTİK ADIM: Kolimatörleri çok farklı kurulumları için dizayn edilebilir ve böylece beynin farklı bölgelerinde eklemek veya çıkartmak için geliştirilebilir. 8 mm x 11 mm beynin bir hemisferik alanı tanımlar. <ol start="4"><li> Daha fazla beyin, anat yerleştirilmesi geliştirmek için kolimatör ile üst (AP) ve alt (PA) hem tek BT ​​dik görüntü eldeomical kemik yapıları tekrarlanabilirlik için kullanılabilir. </li><li> Değişimi, 0.93 mm bakır tedavisi için alüminyum filtre filtre ve X-ışını tüpü bir AP yönde bir üst 225 kVp ve 13 mA&#39;da çalışan istenen radyasyon dozunun yarısı yönetmek. </li><li> Alt konumuna portal dönün ve X-ışın tüpü 225 kVp ve 13 mA formu PA yönde altındaki çalışan ile tekrar radyasyon dozunun ikinci yarısında yönetmek. </li></ol> KRİTİK ADIM: Bu üst ve beyin dokusu ile oda sıcaklığına gradyan azaltmak için alt hem de ikinci ışın tedavisi için gerekli olan, aynı zamanda beyin merkezine isocentre uyum ile yardımcı olur. 4 vivo İki Foton Lazer Mikroskopi -. Şekil 3 (oturum başına 1-3 saat) Varyasyonlar kullanılan ve gibi optimizasyon gerekecektir farklı mikroskoplar var olacaktır. Biz bir Carl Zeiss LSM510 META Lazer Tarama Confoc kullanılanal Mikroskop. <ol><li> IACUC onaylı anestezi, alkol sprey kullanarak 0.5 mg / g ve temiz pencere Avertin IP enjeksiyon ile fareler uyuşturan. </li><li><ol class="ualpha"><li> (İsteğe bağlı) önce görüntüleme için kuyruk damar içine önce görüntüleme etiketli vasküler boya 5-10 dakika, enjekte edilir. Alexa647-Dextran 0.35 mg 0.2 mg / g kullanılan / g veya APC-CD31 kullanılan. Tablo 2 bakınız. </li><li> (İsteğe bağlı) tümör tanımlamak için, görüntüleme önce 7.7 mg / kg, 5 dakika arasında bir dozda, kuyruk veni yolu ile Floresin enjekte edilir. Başvuru Tablosu 2. </li></ol></li><li> Üretilen kimerik fare kullanılan florokrom ile tayin edildiği gibi konfokal mikroskop Ayar kanalları bulunmaktadır. Tablo 1, bu modelde tanımlanan kanal göstermektedir. </li><li> Hareketli mikroskop sahneye fare ters çevirin ve şekillendirilen hamuru. (Şekil 3Aii) Başvuru Tablosu 2 pozisyonda kafa stabilize. </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; KRİTİK ADIM: ICW lazer noktasına dik olması ve bu gibi görüntüleme en iyi olduğundan emin olmak için yatay yerleştirilmelidir gerekir. <ol start="5"><li> İlk kanal Lazer açın ve ICW ortasına konumlandırmak için kullanın. </li><li> 5x objektif kullanın ve daha yüksek çözünürlüklü görüntüler için bir harita olarak kullanmak için tüm pencerenin bir görüntü alır. </li><li> Görüntüleme en iyi görüntü kalitesini elde etmek için 10X ve 20X &#39;uzun menzilli&#39; lens kullanılarak yapılmalıdır. </li></ol> KRİTİK ADIM: 2PLM üzerine Kanallar ve hedefleri onlar doğru florokrom vurgulamak için ön fare modellerin görüntüleme in vitro mühendislik hücreleri kullanılarak ayarlanmalıdır. <table border="1"><tbody><tr><td> Florokrom </td><td> CFP </td><td> GFP / Fluorescein / FITC </td><td> mCherry / RFP / DsRed </td><td> APC / Alexa647 </td><td> SHG Otofloresans </td></tr><tr><td> Uyarma lazer </td><td> 458 nm </td><td> 488 nm </td><td> 543 nm </td><td> 633 nm </td><td> Chameleon lazer 820 nm </td></tr><tr><td> Toplama Filtresi </td><td> 480-520 nm </td><td> 500-550 nm </td><td> 565-615 nm </td><td> 650-710 nm </td><td> 390-465 nm </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Kullanıcı florokrom tertibat. Fazlası modeli mevcut olan her bir kanal için kullanılan lazer eksitasyon ve emisyon spektrumlarına toplayıcı görmek.

<ol>
	<li>Kienast, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+reveals+the+single+steps+of+brain+metastasis+formation.">Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation.</a> Nature Medicine. 16, 116-122 (2010).</li><li>Holtmaat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term,+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat. Protoc. 4, 1128-1144 (2009).</li><li>Hansen-Algenstaedt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+observation+reveals+time-course-dependent+characteristics+of+tumour+vascularisation.">Long-term observation reveals time-course-dependent characteristics of tumour vascularisation.</a> Eur. J. Cancer. 41, 1073-1085 (2005).</li><li>Kherlopian, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+imaging+techniques+for+systems+biology.">A review of imaging techniques for systems biology.</a> BMC Systems Biology. 2, 74 (2008).</li><li>Kedrin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+metastatic+behavior+through+a+mammary+imaging+window.">Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window.</a> Nature Methods. 5, 1019-1021 (2008).</li><li>Perentes, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+extracellular+matrix+remodeling+by+tumor-associated+fibroblasts.">In vivo imaging of extracellular matrix remodeling by tumor-associated fibroblasts.</a> Nature Methods. 6, 143-145 (2009).</li><li>Brown, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+collagen+and+its+modulation+in+tumors+in+vivo+using+second-harmonic+generation.">Dynamic imaging of collagen and its modulation in tumors in vivo using second-harmonic generation.</a> Nature Medicine. 9, 796-800 (2003).</li><li>Marker, D. F., Tremblay, M. -. E., Lu, S. -. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Thin-skull+Window+Technique+for+Chronic+Two-photon+In+vivo+Imaging+of+Murine+Microglia+in+Models+of+Neuroinflammation.">A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation.</a> J. Vis. Exp. (43), e2059 (2010).</li><li>Drew, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+optical+access+through+a+polished+and+reinforced+thinned+skull.">Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull.</a> Nature Methods. 7, 981-984 (2010).</li><li>Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice.">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nature Protocols. 5, 201-208 (2010).</li><li>Burrell, K., Hill, R. P., Zadeh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+in-vivo+analysis+of+normal+brain+response+to+cranial+irradiation.">High-resolution in-vivo analysis of normal brain response to cranial irradiation.</a> PLoS ONE. 7, e38366 (2012).</li><li>Tate, M. C., Aghi, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+angiogenesis+and+invasion+in+glioma.">Biology of angiogenesis and invasion in glioma.</a> NURT. 6, 447-457 (2009).</li><li>Aghi, M., Chiocca, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+bone+marrow-derived+cells+to+blood+vessels+in+ischemic+tissues+and+tumors.">Contribution of bone marrow-derived cells to blood vessels in ischemic tissues and tumors.</a> Mol. Ther. 12, 994-1005 (2005).</li><li>Nussenbaum, F., Herman, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis:+insights+and+innovations.">Tumor angiogenesis: insights and innovations.</a> J. Oncol. 2010, 132641 (2010).</li><li>Zhang, H. -. r. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+endothelial+progenitor+cells+into+the+neovasculature+of+malignant+glioma+xenograft.">Incorporation of endothelial progenitor cells into the neovasculature of malignant glioma xenograft.</a> J. Neuroonco. 93, 165-174 (2009).</li><li>Blouw, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hypoxic+response+of+tumors+is+dependent+on+their+microenvironment.">The hypoxic response of tumors is dependent on their microenvironment.</a> Cancer Cell. 4, 133-146 (2003).</li><li>Du, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIF1alpha+induces+the+recruitment+of+bone+marrow-derived+vascular+modulatory+cells+to+regulate+tumor+angiogenesis+and+invasion.">HIF1alpha induces the recruitment of bone marrow-derived vascular modulatory cells to regulate tumor angiogenesis and invasion.</a> Cancer Cell. 13, 206-220 (2008).</li><li>Rajantie, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+bone+marrow-derived+cells+recruited+during+angiogenesis+comprise+precursors+for+periendothelial+vascular+mural+cells.">Adult bone marrow-derived cells recruited during angiogenesis comprise precursors for periendothelial vascular mural cells.</a> Blood. 104, 2084-2086 (2004).</li><li>Shin de Patil, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=marrow-derived+lin(-)c-kit(+)Sca-1++stem+cells+do+not+contribute+to+vasculogenesis+in+Lewis+lung+carcinoma.">marrow-derived lin(-)c-kit(+)Sca-1+ stem cells do not contribute to vasculogenesis in Lewis lung carcinoma.</a> Neoplasia. 7, 234-240 (2005).</li><li>Purhonen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow-derived+circulating+endothelial+precursors+do+not+contribute+to+vascular+endothelium+and+are+not+needed+for+tumor+growth.">Bone marrow-derived circulating endothelial precursors do not contribute to vascular endothelium and are not needed for tumor growth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6620-6625 (2008).</li><li>Aghi, M., Cohen, K. S., Klein, R. J., Scadden, D. T., Chiocca, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+stromal-derived+factor-1+recruits+vascular+progenitors+to+mitotic+neovasculature,+where+microenvironment+influences+their+differentiated+phenotypes.">Tumor stromal-derived factor-1 recruits vascular progenitors to mitotic neovasculature, where microenvironment influences their differentiated phenotypes.</a> Cancer Research. 66, 9054-9064 (2006).</li><li>Burrell, K., Zadeh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Mechanisms of Tumor Angiogenesis. , (2012).</li><li>Thorball, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FITC-dextran+tracers+in+microcirculatory+and+permeability+studies+using+combined+fluorescence+stereo+microscopy,+fluorescence+light+microscopy+and+electron+microscopy.">FITC-dextran tracers in microcirculatory and permeability studies using combined fluorescence stereo microscopy, fluorescence light microscopy and electron microscopy.</a> Histochemistry. 71, 209-233 (1981).</li><li>Tolentino, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiography+of+fluoresceinated+anti-vascular+endothelial+growth+factor+antibody+and+dextrans+in+experimental+choroidal+neovascularization.">Angiography of fluoresceinated anti-vascular endothelial growth factor antibody and dextrans in experimental choroidal neovascularization.</a> Arch. Ophthalmol. 118, 78-84 (2000).</li><li>Holash, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-Trap:+a+VEGF+blocker+with+potent+antitumor+effects.">VEGF-Trap: a VEGF blocker with potent antitumor effects.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11393-11398 (2002).</li><li>Shinoda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-guided+resection+of+glioblastoma+multiforme+by+using+high-dose+fluorescein+sodium.">Fluorescence-guided resection of glioblastoma multiforme by using high-dose fluorescein sodium.</a> , 1-7 (2003).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Tüm görüntüleri açıklanan üç kanal şu ​​ana kadar bir çok sayıda hücre tipleri ve etkileşimleri bakmak için araçlar paha biçilmez bir dizi diğer modelleri ve yaprakları araştırmacıların ilgi üç işaretleri için değiştirilebilir. Planlama bütün belirteçler ve hücre tipi başarılı bir şekilde ayrı kanal bir raportör molekülü floresan entegre etmiş sağlamak için gereklidir. Burada kullanılan standart üç kanal ek olarak biz de dördüncü bir CFP kanal (Şekil 4A) ve SHG tabanlı kolajen kanal 7 (Şekil 4B) entegre başardık. Bu in vivo ve ek olarak hücresel etkileşimleri bakarak olasılığı uzanır sağlar Kullanıcı diğer belirteçler için iki kanal koruyarak belirli hücre-hücre etkileşimleri çalışmak için karıştırma nüfus üstlenecek. Örneğin, kendi intratum karşılaştırarak bir ilgi ile 1:3 oranında tümör hücrelerinin (TTT) ve kanser kök hücreleri (OBP) baktımOral etkileşimleri (Şekil 4A). Biz karışık nüfusun 7 gün sonrası implantasyon oranı onadı ve her iki hücre popülasyonlarının hala görülebilir görülmektedir. CFP kanal + hücreleri aslında GFP + olduğu olanlardan CFP doğru tanımlayan ve sonrası görüntü işleme gerektirir eksitasyon ve emisyon spektrumlarına hem de GFP gibi kanal ile örtüşme nedeniyle teknik sorunları içerir. Mesaj görüntüleme işleme Zeiss LSM yazılım doğrudan sayede inşa 2-foton mikroskop üzerinde yapılabilir, GFP görüntü (Şekil 4A) geride olan gerçek OBP hücrelerinde sonuçlanan OBP görüntü çıkarılır. Oranı çıkarma için öncül eşit parlak görüntüler bağlıdır ve GFP lazer (488 nm) iken OBP ve GFP hücreleri hem floresanlama CFP lazer (458 nm) nedeniyle OBP hücreleri floresan için çok yüksek. CFP ek olarak biz de SHG bakmak için daha önce yayınlanmış kurulumları kullanmak mümkün olmuşturdüzeyleri ve bu nedenle damar çevreleyen bazal membran, (Şekil 4B) oluşturan kolajen lifleri betimliyor. Bu modelin bir diğer uyum çapı 2 mm kadar küçük doku bölümleri ışın tedavisi için stereotaktik rehberliğinde radyasyon kullanma yeteneğine sahip özel inşa küçük bir hayvan ışınlama avantaj aldı. Işımasıyla pencere hedefleyerek sahip temel dokusu üzerindeki etkisini radyasyon bakmak mümkündür. Biz son zamanlarda etkisi radyasyon bakarak bir çalışma yayınladı damar için BMDCs istihdamı ile ilgili olarak normal beyin dokusu üzerindeki sonrası radyasyon doku değişiklikleri rollerini de özellikle bakarak. Biz BMDCs istihdamı zaman ve normal doku 11&#39;de bağımlı doz hem de oldu bulundu. Bu ilacın sağlayan tedavi teslim ve entegrasyon mekanizmaları incelemek için mümkün olduğu bir floresan işaretleyici ile etiketlenmiş. Sırasındaaraştırma biz VEGFTrap üretimi, üretim 25 yerel alan tüm VEGF sinyal bloke bir anti-anjiyogenik ilaç izlemek mümkün olmuştur. VEGFtrap üretim, BMDC etkileşim ve aynı anda damar (Şekil 4Cii): genetik EGFP bir IRES ile birleştiğinde VEGFtrap gen (Şekil 4ci) ifade için tümör hücreleri değiştirerek ve TTT &#39;donör&#39; BM kullanarak biz görüntü EGFP başardık. Bu modeli ve kanalları çok yönlülük gösterdi. Bu tek hücreli çözüm vaadi nedeniyle ilacın kinetik bakmak da mümkündür. Fluoresein (GFP +) maksimal rezeksiyon 26 sağlandığından emin olmak için cerrahi sırasında tümör tanımlamak için kullanılır. Intravenöz iken görüntüleme enjekte edilerek bu tarif tümör hücrelerinin kendilerini içine Floresein en aktif alımı yoluyla değil oluşur göstermek mümkündür, ancak bunun yerine ilacın koleksiyonu ile t stromal alanı içineFluorescein (Şekil 4D) ve enjeksiyonu takiben co-lokalizasyon 10 dakika eksikliği görülen ime,. Genel olarak bizim strateji dinamik hücresel etkileşimlerin çalışmaya avantajlıdır benzersiz deneysel bir platform, elde etmek için yeni ve mevcut teknikleri birleştirir. Bu strateji intrakranial, tedaviye yanıt olarak BMDC, tümör ve normal beyin kanlanması yüksek çözünürlüklü tek hücreli dinamik evrim incelenmesi için çok değerli bir yaklaşım olduğu kanıtlanmıştır. Intravital görüntüleme BMDC alımları, göç ve farklılaşma intrakranial beyin tümör damar hem de diğer araştırma alanlara adapte olabilen birçok başka dinamik süreçlerin moleküler düzenleyiciler daha iyi anlaşılmasını sağlayabilir. Diğer tedavi stratejileri ile birlikte düzenlemeye BMDC inhibe olası faktörleri kombinatoryal tedavilerin hassas zamanlamasının belirlenmesi yardımcı olabilir. Ayrıca, bu strateji, birçok gelecek pr uyarlanabilirin vivo intravital boyama boyalar değil sadece kullanan değil, aynı zamanda küçük molekül inhibitörleri ve floresan araştırmacılar sıra kinetik de boyuna bakmak gibi daha hedefli tedavi dağılımı ve göç yollarını izlemek için izin etiketlenir nanopartiküller ojects.

Çeşitli patolojilerin tepki olarak beyinde ortaya çıkan yapısal değişiklikler ve biyolojik ve terapötik müdahalelerin daha iyi anlaşılması, tedavi stratejilerinin geliştirilmesi için önemlidir. Ancak, özellikle kafa içi patolojiler ile ilgili, bu yapısal ve biyolojik değişiklikler eğitim mevcut zorluklardan biri, doku erişilememesi ve zamansal evrimi ve in vivo ortamda bir değişim dinamik ilerleme incelemek için yetersizliğidir. &quot;Pencere&quot; teknoloji üretimi daha önce 5-7 tümör gelişimi ile yumuşak doku değişiklikleri inceleyerek başarılı kanıtlamıştır. ICW modellerinin geliştirilmesi daha teknik zorlu, altta yatan beyin dokusunda enfeksiyon kışkırtmak üzerinde zarar vermeden kafatası kemiği kaldırmak için gerekliliği nedeniyle olduğunu kanıtlamaktadır. Önceki kağıtları yüksek çözünürlüklü net im üretmek için, ancak doku 8-10 görselleştirmek için kafatası inceltmek için çalıştılarkafatası kemik yaşları tam çıkarılması 11. gereklidir. Uzun süreli görüntüleme (30 gün +) ancak son zamanlarda görüntüleme 1,11 ile uygun bir seçenek haline gelmiştir tekrarlayın, daha önce kısa zaman dilimlerinde 5 incelenmiştir. Son on yıl içinde önemli bir hedef tümörlerin tedavisi için yeni terapötik hedefler sağlamak için, tümör oluşumu ve ilerleme yanıt olarak, özellikle, neo-damar sistemi aşağıdaki patolojik uyaranların kökenli aydınlatmak için olmuştur. Çok tartışma tümör gelişimi ya da aşağıdaki radyasyon sırasında beyinde yeni damar kaynağı etrafında kalır. Geleneksel olarak vaskülarizasyon anjiyojenez, yeni damarlar önceden var olan gemiler 12 filizlenmesi ikinci oluşturan bir işlem boyunca ortaya olarak kabul edilmiştir. Daha yeni çalışmalar, ancak, vaskülogenez ve önceden tahmin embriyonik süreç patolojik damar oluşumu, daha önemli bir rol oynuyor olabilir düşündürmektedir. Vasculogenesis da daha sonra doğrudan yeni damar endotel 12-14 oluşumuna katılan kemik iliğinden yetişkin angioblast meslektaşları istihdamı içerir. Biriken deliller endotel öncü hücreler onkojenik aracılar 15-17 yanıt olarak de novo damar oluşumu başlatmak için kemik iliğinden seferber olduğunu gösterir. Ancak bu çalışmalar patolojik uyarıcı ve tedaviye 18-21 yanıt türüne değişen yüzde katkı ile damar endotel bu kemik iliğinden elde edilen hücrelerin doğrudan katkı (BMDCs) için çelişkili kanıt. Bu nedenle, tümör damar içine ve tedaviye yanıt olarak BMDC entegrasyon sürecinin tekrar uzun süreli çalışma için yüksek çözünürlüklü intravital görüntüleme izin tekrarlanabilir deneysel yöntemler kurulması ölçülemez. Standart histolojik teknikler dinamik bulu sağlamak için başarısızformasyonu yeni damar oluşmasına neden olabilir ve bu yüzden kesin hücre etkileşiminin mekanizmaları göstermek olamaz hücrelerinin uzun süreli hayatta kalma, farklılaşma ve entegrasyon belirlemek için gereklidir. Biz intrakranial iyonizan radyasyon ve tümör büyümesini hem de takip BMDC işe değişen derecelerde, ancak bir işe alım, patoloji özel konum ve değil tüm tümöral doku 11,22 bir işgal olduğunu bizim deneysel yaklaşım kullanarak göstermiştir. Biz işe tek bir hayvan 11,22 tekrar tekrar görüntüleme gösterdiği bir zaman duyarlı bir yol izler göstermiştir. Floresan etiketli tümör hücreleri doğrudan kendi endotel oluşturmak için tümör hücre transdiferansiasyon olasılığını vurgulamak için endotel hücreleri için içi hayati CD31 antikoru ile görüntülü ve takip edilebilir sayede Benzer şekilde, in vivo görüntüleme de tümör hücresi taklit içine değerli bilgiler sağlayabilir. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Modelin çok yönlülük hücresel ve biyolojik süreci değişen çalışma için kombinasyonları kapsamlı bir dizi sağlayan, görüntü 4 floresan kanal yeteneği ile geliştirilmiştir. Biz aynı anda zaman içinde tekrar tekrar tek bir alanda, intravitally görüntü CFP (mavi), GFP (yeşil), Kiraz / RFP (kırmızı) ve Alexa647/APC (uzak-kırmızı) edebiliyoruz. Araştırmacılar genetik olarak özel ilgi yapısal değişiklikleri vurgulamak için kanallarının yanı sıra satın alma boyalar ve antikorların her biri için fluorochromes ifade hücreleri değiştirebilirsiniz. Yaygın çalışmalarda kullanılan boyaların ve antikor Bugüne kadar CD31 ve dekstran dahil olan her iki vurgulamak Bu amaçla uzak-kırmızı kanalı kullanılmaktadır, ancak her ikisi de diğer kullanım için uygun olan mikro-damar ve doku 1,11,23,24 meydana gelen değişikliklerin, kanalları bahsetti. Benzer şekilde, Sytox apoptoz alanları vurgular Portakal, ve bu şirket Visen gelenler gibi işaretleri dahil olmak üzere diğer boyalar, SPE olmuşturcifically in vivo kullanım için tasarlanmıştır. Bahsedilen dört yaygın olarak kullanılan floresan kanalları, bundan başka, ikinci harmonik üretimi (SHG) kanal eklenebilir ve damar çevreleyen bazal membran görselleştirme, görüntü modelinin 7 endojen kollajen lifleri için optimize edilmiştir. Bizim modelin uyum, hem de yukarıda bahsedilen hücre-hücre etkileşimleri göstermek için, ilaç-hücre etkileşimleri incelemek mümkün olmuştur. Biz AMD3100, bir SDF-1 inhibitörü ve BMDC işe 11 dahil ağları sinyal rolü gibi ilaç inhibitörleri baktım. Aynı şekilde biz genetik bir GFP molekülüne bir IRES ile birlikte VEGFTrap, bir VEGF inhibitörü 25, ifade etmek U87 glioma xenografts hücreleri tasarladık. TTT + BM kullanarak biz VEGF damar için BMDCs istihdamı üzerindeki rolünü çalışmak edebiliyoruz. En son biz mec bakarak ilaç kinetik çalışma modeli kullanmış olmasıBir hücresel düzeyde tümör sınırlarını belirleyen ilaç Floresein 26, arkasında hanism. Aracılığıyla bir özel inşa biz tedavi için tümör ve BMDCs hem de yanıtı değerlendirmek için stereotaktik teslim radyasyon entegre mümkün olmuştur evin küçük hayvan ışınlayıcı içinde. Bizim yeni intravital görüntüleme yöntemi araştırmacıların kullanımı sayesinde doku değişiklikleri birçok fonksiyonel ve biyolojik özelliklerinin aydınlatılması yardım, çeşitli patolojiler ve sistemlerinde meydana gelen tek hücreli gerçek zamanlı değişiklikleri anlamak olacaktır.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NODSCID mice</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>001303</td>
			<td>8 week old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B5/EGFP Mice</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>003516</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACTB/DsRED mice</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>005441</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tear Gel</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>T296/2</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Lidocaine-Epinephrine</td>
			<td>Bimeda MTC</td>
			<td>25SP</td>
			<td>Use neat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Self curing acrylic kit</td>
			<td>Bosworth</td>
			<td>166260</td>
			<td>Use ~30% (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10K MW Dextran-Alexa647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D22914</td>
			<td>Use @ 0.6 mg/kg in Saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-APC</td>
			<td>BDPharmingen</td>
			<td>551262</td>
			<td>Use @ 0.3 mg/kg in Saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AK-fluor (Fluorescein) 10%</td>
			<td>AKORN inc.</td>
			<td>NDC 17478-253-10</td>
			<td>Use @ 7.7 mg/kg in Saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine solution</td>
			<td>Purdue Products</td>
			<td>NDC 67618-150</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Tweezers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-402</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Dissection Scissors</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25870-002</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22G Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305156</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G 0.5 ml TB syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>305620</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld Micro-Drill</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18000-17</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.7 mm Trephine drillbit</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18004-27</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &mu;l 30G Hamilton syringe</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>20909-U</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Coverslip 3 mm</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0720 CS-3R</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence goggles</td>
			<td>BLS</td>
			<td>FHS/T01</td>
			<td>Basic head frame</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>stoelting</td>
			<td>51950</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse restrainer for IV injection</td>
			<td>Brain Tree Lifescience</td>
			<td>MTI</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel high-resolution in vivo imaging technique to study the dynamic response of intracranial structures to tumor growth and therapeutics

Biz başarıyla entegre önce intrakranial doku yapısı değişiklikleri doğrudan uzun vadeli görselleştirme sağlayan yeni bir platform geliştirmek için intravital ile 2-foton konfokal mikroskopi Kafa içi pencere (ICW) teknolojisi 1-4 kurduk. Gerçek zamanlı şekilde tek bir hücre çözünürlükte görüntüleme doku &#39;anlık görüntü&#39; kesitlerde sadece bakar standart son nokta histolojik analiz, tarafından sağlanan ötesinde ek dinamik bilgi sağlar. Floresan kimerik farelerde bu intravital görüntüleme tekniği kurulması, biz aynı anda görüntü dört floresan kanal edebiliyoruz. Bu GFP gibi + kemik iliği içeren floresan etiketli hücreleri tarafından, bu doku içinde uzun vadeli göç, entegrasyon ve farklılaşma okuyan bu hücrelerin kaderini izlemek mümkündür. Böyle bir MCherry glioma tümörünün hattı gibi bir ikincil raportör hücre, daha fazla entegrasyon karakterize sağlarhücre etkileşimleri: hücre dirilen. Doku mikro yapısal değişiklikler örneğin CD31 etiketli antikorlar ve Dekstran moleküller için, içi hayati boyalar ve antikor eklenmesi ile vurgulanmış olabilir. Ayrıca, iyonize radyasyon uygulamasından sonra meydana gelen dinamik doku değişiklikleri değerlendirilebilir, üzerinden bir platform oluşturmak, stereotaktik radyoterapi sağlayan küçük bir hayvan mikro-ışınlama ile ICW görüntüleme modeli kombinasyonu tarif. Bizim modeli Mevcut sınırlamaları beyin dorsal eksenine görüntüleme sınırlayan alt kortikal yüzeyinden 900 mm kadar bir derinliğe kadar sınırlıdır, mikroskop penetrans içerir. Kafatası kemik varlığı şu anda meme dokusu ve yağ yastıkları 5-7 incelemek için kullanılan daha kurulmuş ve kullanılan odasına modellere göre, ICW daha zorlu bir teknik işlemi yapar. Buna ek olarak, plaka ile ataides pek çok sorun görüntüleme optimize.

NODscid farelerin BM yeniden yapılandırılması ve isteğe bağlı adım NODscid &#39;ev sahibi&#39; farelerin% 100 floresan &#39;donör&#39; BM bir% 80 alım olur, TBI ancak optimizasyon Diğer uzun sulandırma geliştirmek için gerekli olacaktır -immunocompromsed suşları. Fareler başarısız yeniden Eğer onlar hasta ve prosedürü izleyerek hızla ölecek, zayıflamış fareler ek gıda ve su kaynakları gerektirebilir. Bir kez bitmiş ICW Şekil 2Biv görülen böyle bakmak gerekir. Bu kafatası ile birleştirme kuvvet verir gibi cam lamel çevreleyen akrilik bir sırt için idealdir. Mükemmel pencereler tekrarlanabilir ve nesil (Şekil 2C) ardından en fazla 8 hafta için tekrar görüntüleme için izin verir. Bu en iyi pencerelerden üretilen Görüntüler Şekil 3Bi görüldüğü gibi bakacağız. Pencere nesil kusurları kötü görüntüleri üretecekörneğin kalite, pencerenin altında hava kabarcıkları görüntülü olan bakış tüm alanları önleyecektir, alanları hava lazer görüntüleme (Şekil 3Bii) engeller olarak. karanlık görünür lamel aşırı yapıştırıcı ve akrilik ile arka plan yüksek düzeyde olacaktır floresan ve kir eşiğe pencere küçük noktalar üzerinde olup benzer ise, Şekil 3Biii görüldüğü gibi büsbütün kör olan alanın alanları alanında (Şekil 3Biv) görünür olacak. ICW görüntüleme Başarı cerrahi teknik bütünlüğünü tarafından önceden belirlenmiş, ancak, hatta en iyi ICWS görüntüleme oturumu sırasında sorunlarla karşılaşabilirsiniz. Bu nedenle, bir dizi açıklık derecesi ve Şekil 3&#39;te görüldüğü üretilen görüntüler bulunmaktadır. Her şey iyi olduğunda Şekil 3C tasvir yayın kaliteli görüntü oluşur. Tüm fareler için mümkün değildir, ancak bu, görüntünün% 80 beklemek mümkün olduğunus şöyle oluşturulur. Mevcut mikroskopi kurulumunda büyük kusurları biri ters lazerlerin kullanılmasıdır. Fareler görüntüleme sırasında nefes yorucu yol açabilir aşırı stres ve rahatsızlık sırtlarına ve bu sonuçlar üzerinde konumlandırılmış olması gerekir. Solunum oluşur ortalama engelleyen gibi bu bir &#39;çizgili&#39; görüntü oluşturur görüntüleme sırasında, bu sayede, her piksel satır dört kez ve dört ortalama, en son resimde görüntülenir görüntülü. Nefes, Şekil 3D görülen görüntü üzerinde bir çizgi olarak görünür bir eser yaratacak yorucu bu tür bu kadar ortalama sırasında herhangi bir hareket neden oldu. Görüntüleme sırasında yetersiz anestezi olan Fareler de bu sorunla karşılaşabilirsiniz. &#39;Çizgili&#39; etkisi için ortalama görüntü sınırlayarak azaltılabilir, ancak bu görüntü kalitesini düşürür dönecek ve sorunu ortadan kaldırmak değil. Alternatif olarak fareler yeniden yerleştirilebileceğini ya da solunum normale ne zaman denenmesi. Kullanmak ofareler &#39;yüzüstü pozisyonda&#39; görüntülü olabilir gibi f dik 2PLM bu sorunu inkâr olur. Ters 2PLM üzerinde görüntüleme ile ek bir sorun fare mikroskop ve bu Şekil 3E görülen olduğu gibi &#39;parçalı&#39; görüntülere yol açar kez ICW konumlandırma için sınırlı erişilebilirlik içerir. Burada, lazer ve kapak birbirine dik konumlandırılmış ve bu görüntü bir açı ortaya çıkar değildir. Görüş alanının iki yansıma olmayan bir segmentli &#39;görüntünün üretimi ile sonuçlanır. Sorun kolayca lamel Şekil 3Aii görülen tutturma ile kafasına bir kez tamamen yatay olmasını sağlamak için fare yeniden konumlandırılması ile çözülmüştür. Makin - modeli özellikle tümör dokusunun damarlanmada BMDCs rolünü incelemek için kullanılan ve aynı anda üç farklı kanal kullanma yeteneği (Alexa647 ve APC Kiraz, GFP, Uzak-kırmızı) gösteren edildi Burada sunulang bu özel hikaye için OBP ve SHG gereksiz. Biz pencere kaynaklanan herhangi bir zararlı etkisi ile, bir tek hücre düzeyinde damar içine BM hücrelerin işe alım ve entegrasyon eğitim, en fazla 8 hafta için boyuna görüntü farelere başardık. Bu model, kaynak ve damar oluşumu ve önceden son nokta histolojik analizi yoluyla kaybedilen ilgi farklı hücre tipleri, etkileşim dinamik bilgi toplama kolaylığı göstermektedir. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Adım </td><td> Sorun </td><td> Muhakeme </td><td> Çözüm </td></tr><tr><td> 1.4 </td><td> Paramparça Kemik </td><td> Blunt araçları </td><td> Bilenmiş makas veya taze neşter bıçak kullanarak yeni bir fare oluşturan kemik iliği toplamak, kemik parçaları TV enjeksiyon engeller </td></tr><tr><td> 1.5 </td><td> Düşük çıkarma (düşük viscosity) </td><td> Kemik omurun çok distal kesmek, kötü toplama yöntemi </td><td> Kemikler olarak proksimale mümkün kesilmiş ve geri sıçrama önlemek için toplama tüpünün içindeki kemik ile tahsil edilmesi gerekir Zaman maksimum ve dikkatle BM ayıklamak için harcanan olmalıdır 1 ml su içine gerekli havuzu birden fazla fare Eğer </td></tr><tr><td></td><td> Yüksek Ekstraksiyon (yüksek Viskozite) </td><td> Düşük toplama tampon </td><td> , Ekstra% 0.1 BSA ile çözüm sulandırmak fare maksimum 500 ul için üç alıcı fareler kadar bölünmüş </td></tr><tr><td> 1.6 </td><td> Bad intravenöz enjeksiyon </td><td> Kötü vazodilatasyon ve damar görünürlük </td><td> Isı lambası ile dilatasyon geliştirin. Erişim yardım etmek için ışık kaynağı yerleşik kuyruk ven süzgeç yerleştirin fare </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Hasta Fare </td><td> Enfeksiyon </td><td> Kurumun kurallarına göre fareler kurban. Kuyrukları önce enjeksiyon için temizlenir emin olun ve sterilite kontrolkültür çıkarılan BM </td></tr><tr><td></td><td> Fare die </td><td> Kötü BM alımı </td><td> Ölü fare floresan BM alımını% kontrol edin. Kullanılan farelerin gerginlik için TBI optimize BM enjeksiyon (örneğin iki alıcılar için kullanmak bir donör fare) miktarını artırın </td></tr><tr><td> 2.4 </td><td> Küçük kanama </td><td> Dura sondaj sırasında ihlal </td><td> Jel yastıkları ile baskı ve ve sürekli steril serum fizyolojik yıkama </td></tr><tr><td></td><td> Büyük kanama </td><td> Beyin delme zarar </td><td> Kurum kurallarına göre fare Sacrifice </td></tr><tr><td> 2.8 </td><td> Lamel altında Hava kabarcıkları </td><td> Kortikal yüzeyi ile zayıf iletişim doğru yerleştirilmesi önler </td><td> Lamel çıkarın ve kabarcıklarını çıkarmak için pencere üzerine lamel yüzer ekstra PBS ekleyin </td></tr><tr><td> 2.10 </td><td> Yapıştırma sırasında lamel kayması </td><td> AcrAKRİLİK kitle lamel üzerinde baskı, ağır ve yol lamel dışında hareket </td><td> Vetbond ve akrilik uygulanır ise cımbız lamel basılı tutun için kullanılmalıdır </td></tr><tr><td> 4.2 </td><td> Bad intravenöz enjeksiyon </td><td> Kötü vazodilatasyon ve damar görünürlük </td><td> Isı lambası ile dilatasyon geliştirin. Erişim yardım etmek için ışık kaynağı yerleşik kuyruk ven süzgeç yerleştirin fare </td></tr><tr><td> 4.4 Şekil 3C </td><td> &#39;Çizgili&#39; görüntüleri </td><td> Yorucu veya düzensiz nefes </td><td> Çerçeveden fareyi çıkarın ve kurtarmak için izin Anestezi uygulanan düzeyi artırmak ve boyun sağlamak için konumunu ayarlamak aşırı fleksiyonda veya nefes önlemek için genişletilmiş değildir </td></tr><tr><td> Şekil 3C </td><td> &#39;Segment&#39; görüntü </td><td> Beyin hedefleri paralel değil </td><td> Düz olduğundan emin olmak için lamel konumunu ayarlamak </td></tr><tr><td></td><td> Gemi görüntülendi değil </td><td> enjeksiyon intravasküler görmedim </td><td> Iyi vazodilatasyon sağlamak için alternatif kuyruk ven, sıcak kuyruk içine enjeksiyon yeniden </td></tr><tr><td></td><td> Yüksek arka plan </td><td> Kirli lamel, Hava Bubbles, Akrilik </td><td> Nemli% 70 etanol bezle lamel silin, akrilik altında nüfuz olabilir ıslatın ve beyin dokusu zarar vermez </td></tr></tbody></table> Tablo 2&#39;de. Sorun Giderme. Prosedürlerin sorunlu alanlar için gerekli düzeltici adımlar için bir kılavuz. <img alt="Şemaları 1" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50363/50363schemata1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50363/50363schemata1.jpg" /> Schemata 1. Deneysel akış diyagramı. Bu deneysel adımları 1-4 ile olayların zaman çizelgesi göstermektedir. Fare modelleri için, bir hafta boyunca ayarlanmıştırtümör greft sağlamak için tümörün Gün 7. kadar BM düzgün tekrar oluşturur ve ilaç ile tedavi edilmez sağlamak <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50363/50363schemata1large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50363/50363fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50363/50363fig1.jpg" /> Şekil 1. BM Sulandırma. (A) BM çıkarma işlemi arka bacak kemikleri i. Diseksiyon. Arka bacaklarda gelen ii. Dissected femur ve tibia, temizlenmesi ve çıkarılması için hazır. Iii. Bones uç plakası ile beyaz görünümü gösteren, ile kaldırıldı ve kızarmış boş kemiklerin. (B) enjeksiyon için yan damarlar kuyruk konumlandırılmış nerede Şemaları gösteren. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-Page = &quot;her zaman&quot;&gt; <img alt="Şekil 2," fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50363/50363fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50363/50363fig2.jpg" /> Şekil 2. ICW nesil. (A) Tavsiye Aseptik kurulum (B) i. Exposed kafatası yüzeyi cerrahi için gerekli olan yerler ortaya, ICW bregma ve lamda eşit uzaklıkta sağ yarımkürede yerleştirilmelidir. Ii. Periostieum kaldırılması için hazır, lidokain solüsyonu ile kaldırdı . III. matkap ile üretilen kemik fragmanının alınması işlemi için gereken Diş kanca. IV. diş akrilik plaka ile tamamlandı. (C) üç örnek pencere yöntemin tekrarlanabilirlik göstermektedir. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50363/50363fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50363/50363fig3.jpg" /><br/&gt; Şekil 3,. 2PLM beklenen sonuçlar. Tüm görüntüler yeşil BM, kırmızı tümör, Mavi (sözde renkli çok kırmızı) damar göstermektedir. (A) i. Küçük hayvan ışınlayıcı içinde izofluran akışı korur baş çerçeve gösterir. 8 x 11 mm kolimatör da en portal. Ii. Fare ile etrafında hareket görülebilir görüntüleme için gerekli kafa çerçevesine yerleştirilmiş ters, moldable plastercine tüm pencereleri yerleştirilebilir sağlar. Sorunların sonuçlarının (B) İşaret fotoğrafları i pencere üretimi ile. optimal pencere, ii. lamel ve iv üzerinde iii akrilik dökülme, altında hava kabarcığı ile bir pencere. pencere kendisi kir. (C) bir ICW i başarılı üretimi takiben görüntüleme ile ortaya çıkan sorunları vurgular. en iyi görüntüleme ii . nefes eserleroluşturmak bir &#39;çizgili&#39; görüntü iii. lamel lazer bir &#39;bölünmüş&#39; görüntü oluşturmak için dik değil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50363/50363fig3large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 4," fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50363/50363fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50363/50363fig4.jpg" /> Şekil 4. Fonksiyonel kullanımları ve Model uyarlamaları. GFP görüntü beyaz diğer üç kanal yerleştirilmiştir edilebilir gerçek OBP görüntü ortaya çıkarmak için OBP görüntüden çıkarılır sayede (A) OBP sonrası görüntü işleme. Yeşil BM, Kırmızı tümör, Beyaz CSCS, Mavi (sözde renkli çok kırmızı) damar (B) SHG ile görüntülü olabilir kollajen liflerinin gösterilmesi. Yeşil Dekstran, kırmızı BM, Mavi Kollajen (C) i. vitr içinde VEGFTrap hücreleriVEGFtrap. ii ile üretilen GFP sinyal göstermek o. vivo görüntüleme açıkça VEGFtrap hücreleri gösterir ve ek olarak bakıyorsun sistem göstermek için kanal geçiş kolaylığı vurgulamaktadır. Yeşil VEGFTRap + Tümör, Kırmızı BM, Mavi (renkli sözde uzak kırmızı) damar. (D) tümör stromasında Floresein toplanmasını gösterir ve olmayan hücrelere doğrudan kırmızı tümörü olan yeşil sinyal bindirmenin eksikliği ile gösterilir. Yeşil Floresein, Kırmızı tümör. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50363/50363fig4large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> .

Watch this Scientific Journal Video about A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics at JoVE.com

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

Ayrıca yeni bir tanımlamak<em&gt; In vivo</em&gt; Görüntüleme tekniği bu kafa içi pencereler ve yüksek çözünürlüklü 2-foton mikroskopi ile çiftler floresan kimerik fareler. Bu görüntüleme platformu yardımcıları patolojik hakaret sonrasında bir tek hücre düzeyinde beyin dokusunda ve mikrovasküler dinamik değişiklikler, çalışmaları ve intrakranial ilaç dağıtım ve dağıtım değerlendirmek için uyarlanabilir.

Yeni Bir Yüksek çözünürlüklü<em&gt; In vivo</emTümör Büyüme ve Tedavi için İntrakranial Yapıların Dinamik Tepki Eğitim&gt; Görüntüleme Tekniği

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

a-novel-high-resolution-vivo-imaging-technique-to-study-dynamic

Research

JoVE Journal

Medicine

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

11.4K Görüntüleme.  Hospital for Sick Children, Toronto Medical Discovery Tower. Ayrıca yeni bir tanımlamak In vivo Görüntüleme tekniği bu kafa içi pencereler ve yüksek çözünürlüklü 2-foton mikroskopi ile çiftler floresan kimerik fareler. Bu görüntüleme platformu yardımcıları patolojik hakaret sonrasında bir tek hücre düzeyinde beyin dokusunda ve mikrovasküler dinamik değişiklikler, çalışmaları ve intrakranial ilaç dağıtım ve dağıtım değerlendirmek için uyarlanabilir.

Video: A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent until many years after removal of the primary tumor and adjuvant therapy. A likely explanation of this phenomenon is that tumor cells have seeded metastatic sites, are resistant to conventional therapies, and remain dormant for long periods of time 1-4.
The existence of dormant cancer cells at secondary sites has been described previously as quiescent solitary cells that neither proliferate nor undergo apoptosis 5-7. Moreover, these solitary cells has been shown to disseminate from the primary tumor at an early stage of disease progression 8-10 and reside growth-arrested in the patients' bone marrow, blood and lymph nodes 1,4,11. Therefore, understanding mechanisms that regulate dormancy or the switch to a proliferative state is critical for discovering novel targets and interventions to prevent disease recurrence. However, unraveling the mechanisms regulating the switch from tumor dormancy to metastatic growth has been hampered by the lack of available model systems.
in vivo and ex vivo model systems to study metastatic progression of tumor cells have been described previously 1,12-14. However these model systems have not provided in real time and in a high throughput manner mechanistic insights into what triggers the emergence of solitary dormant tumor cells to proliferate as metastatic disease. We have recently developed a 3D in vitro system to model the in vivo growth characteristics of cells that exhibit either dormant (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) or proliferative (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) metastatic behavior in vivo . We demonstrated that tumor cells that exhibit dormancy in vivo at a metastatic site remain quiescent when cultured in a 3-dimension (3D) basement membrane extract (BME), whereas cells highly metastatic in vivo readily proliferate in 3D culture after variable, but relatively short periods of quiescence. Importantly by utilizing the 3D in vitro model system we demonstrated for the first time that the ECM composition plays an important role in regulating whether dormant tumor cells will switch to a proliferative state and have confirmed this in in vivo studies15-17. Hence, the model system described in this report provides an in vitro method to model tumor dormancy and study the transition to proliferative growth induced by the microenvironment.

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

A modified 3-D in vitro system is presented in which growth characteristics of several tumor cell lines in reconstituted basement membrane correlate with the dormant or proliferative behavior of the tumor cells at a metastatic secondary site in vivo.

Bir In Vitro</emMetastatik Büyüme Tümör Dormansi ve Switch Eğitim> Sistem

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

Tıp

Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

The mouse glioma 261 (GL261) is recognized as an in vivo model system that recapitulates many of the features of human glioblastoma multiforme (GBM). The cell line was originally induced by intracranial injection of 3-methyl-cholantrene into a C57BL/6 syngeneic mouse strain 1; therefore, immunologically competent C57BL/6 mice can be used. While we use GL261, the following protocol can be used for the implantation and monitoring of any intracranial mouse tumor model. GL261 cells were engineered to stably express firefly luciferase (GL261-luc). We also created the brighter GL261-luc2 cell line by stable transfection of the luc2 gene expressed from the CMV promoter. C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr mice (albino variant of C57BL/6) from the National Cancer Institute, Frederick, MD were used to eliminate the light attenuation caused by black skin and fur. With the use of albino C57BL/6 mice; in vivo imaging using the IVIS Spectrum in vivo imaging system is possible from the day of implantation (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). The GL261-luc and GL261-luc2 cell lines showed the same in vivo behavior as the parental GL261 cells. Some of the shared histological features present in human GBMs and this mouse model include: tumor necrosis, pseudopalisades, neovascularization, invasion, hypercellularity, and inflammation 1.
Prior to implantation animals were anesthetized by an intraperitoneal injection of ketamine (50 mg/kg), xylazine (5 mg/kg) and buprenorphine (0.05 mg/kg), placed in a stereotactic apparatus and an incision was made with a scalpel over the cranial midline. A burrhole was made 0.1mm posterior to the bregma and 2.3mm to the right of the midline. A needle was inserted to a depth of 3mm and withdrawn 0.4mm to a depth of 2.6mm. Two &mu;l of GL261-luc or GL261-luc2 cells (107 cells/ml) were infused over the course of 3 minutes. The burrhole was closed with bonewax and the incision was sutured.
Following stereotactic implantation the bioluminescent cells are detectable from the day of implantation and the tumor can be analyzed using the 3D image reconstruction feature of the IVIS Spectrum instrument. Animals receive a subcutaneous injection of 150&mu;g luciferin /kg body weight 20 min prior to imaging. Tumor burden is quantified using mean tumor bioluminescence over time. Tumor-bearing mice were observed daily to assess morbidity and were euthanized when one or more of the following symptoms are present: lethargy, failure to ambulate, hunched posture, failure to groom, anorexia resulting in &gt;10% loss of weight. Tumors were evident in all of the animals on necropsy.

Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

Intracranial implantation of GL261 cells into C57BL/6 mice produces malignant gliomas that recapitulate many of the hallmarks of human glioblastoma multiforme. We used GL261 cells stably expressing luciferase to allow us to use in vivo imaging to follow tumor progression. The surgery and 3D in vivo imaging are demonstrated.

Müteakip 3D ile İntrakranial İmplantasyonu In Vivo Murin Gliomlar Bioluminescent Görüntüleme

The mouse glioma 261 (GL261) is recognized as an in vivo model system that recapitulates many of the features of human glioblastoma multiforme (GBM). The ...

The Measurement and Treatment of Suppression in Amblyopia

Amblyopia, a developmental disorder of the visual cortex, is one of the leading causes of visual dysfunction in the working age population. Current estimates put the prevalence of amblyopia at approximately 1-3%1-3, the majority of cases being monocular2. Amblyopia is most frequently caused by ocular misalignment (strabismus), blur induced by unequal refractive error (anisometropia), and in some cases by form deprivation.
Although amblyopia is initially caused by abnormal visual input in infancy, once established, the visual deficit often remains when normal visual input has been restored using surgery and/or refractive correction. This is because amblyopia is the result of abnormal visual cortex development rather than a problem with the amblyopic eye itself4,5 . Amblyopia is characterized by both monocular and binocular deficits6,7 which include impaired visual acuity and poor or absent stereopsis respectively. The visual dysfunction in amblyopia is often associated with a strong suppression of the inputs from the amblyopic eye under binocular viewing conditions8. Recent work has indicated that suppression may play a central role in both the monocular and binocular deficits associated with amblyopia9,10 .
Current clinical tests for suppression tend to verify the presence or absence of suppression rather than giving a quantitative measurement of the degree of suppression. Here we describe a technique for measuring amblyopic suppression with a compact, portable device11,12 . The device consists of a laptop computer connected to a pair of virtual reality goggles. The novelty of the technique lies in the way we present visual stimuli to measure suppression. Stimuli are shown to the amblyopic eye at high contrast while the contrast of the stimuli shown to the non-amblyopic eye are varied. Patients perform a simple signal/noise task that allows for a precise measurement of the strength of excitatory binocular interactions. The contrast offset at which neither eye has a performance advantage is a measure of the "balance point" and is a direct measure of suppression. This technique has been validated psychophysically both in control13,14 and patient6,9,11 populations.
In addition to measuring suppression this technique also forms the basis of a novel form of treatment to decrease suppression over time and improve binocular and often monocular function in adult patients with amblyopia12,15,16 . This new treatment approach can be deployed either on the goggle system described above or on a specially modified iPod touch device15.

Amblyopia is a developmental disorder of the visual cortex that is often accompanied by strong suppression of one eye. We present a new technique for measuring and treating interocular suppression in patients with amblyopia that can be deployed using virtual reality goggles or a portable iPod Touch device.

Ambliyopi içinde Bastırma Ölçme ve Tedavisi

Amblyopia, a developmental disorder of the visual cortex, is one of the leading causes of visual dysfunction in the working age population. Current ...

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

Glioblastoma multiforme (GBM) is a high-grade primary brain cancer with a median survival of only 14.6 months in humans despite standard tri-modality treatment consisting of surgical resection, post-operative radiation therapy and temozolomide chemotherapy 1. New therapeutic approaches are clearly needed to improve patient survival and quality of life. The development of more effective treatment strategies would be aided by animal models of GBM that recapitulate human disease yet allow serial imaging to monitor tumor growth and treatment response. In this paper, we describe our technique for the precise stereotactic implantation of bio-imageable GBM cancer cells into the brains of nude mice resulting in tumor xenografts that recapitulate key clinical features of GBM 2. This method yields tumors that are reproducible and are located in precise anatomic locations while allowing in vivo bioluminescent imaging to serially monitor intracranial xenograft growth and response to treatments 3-5. This method is also well-tolerated by the animals with low perioperative morbidity and mortality.

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

We describe an integrated method for the precise, stereotactic implantation of human glioblastoma multiforme cells into the brains of nude mice and subsequent serial in vivo imaging to monitor growth and response to treatment of the resultant xenografts.

Stereotaktik intrakranial implantasyon ve<em&gt; In vivo</emGlioblastoma Multiforme bir Mouse Model Sistemde Tümör Xenografts arasında&gt; Bioluminescent Görüntüleme

Glioblastoma multiforme (GBM) is a high-grade primary brain cancer with a median survival of only 14.6 months in humans despite standard tri-modality ...

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone resorption. Osteoclasts can be generated in vitro from monocyte/macrophage precursor cells in the presence of certain cytokines, which promote survival and differentiation. Here, both in vivo and in vitro techniques are demonstrated, which allow scientists to study different cytokine contributions towards osteoclast differentiation, signaling, and activation. The minicircle DNA delivery gene transfer system provides an alternative method to establish an osteoporosis-related model is particularly useful to study the efficacy of various pharmacological inhibitors in vivo. Similarly, in vitro culturing protocols for producing osteoclasts from human precursor cells in the presence of specific cytokines enables scientists to study osteoclastogenesis in human cells for translational applications. Combined, these techniques have the potential to accelerate drug discovery efforts for osteoclast-specific targeted therapeutics, which may benefit millions of osteoporosis and arthritis patients worldwide.

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiation of precursor cells into osteoclasts is regulated by cytokines and growth factors. Here, a novel gene transfer technique for differentiation of osteoclasts in vivo and cell culture protocols for differentiating precursor cells into osteoclasts in vitro as a method to study the effects of cytokines on osteoclastogenesis are described.

Bir Roman<em&gt; In vivo</em&gt; Gen Transferi Tekniği ve<em&gt; In vitro</emİskelet Hastalıkları Kemik Kaybı Çalışmaları&gt; Hücre Tabanlı Tahliller

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.

Farelerin Meme Fat Pad içine Meme Kanseri Hücreleri Ortotopik Enjeksiyon Tümör Büyüme Eğitim için.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

Facial Nerve Axotomy in Mice: A Model to Study Motoneuron Response to Injury

The goal of this surgical protocol is to expose the facial nerve, which innervates the facial musculature, at its exit from the stylomastoid foramen and either cut or crush it to induce peripheral nerve injury. Advantages of this surgery are its simplicity, high reproducibility, and the lack of effect on vital functions or mobility from the subsequent facial paralysis, thus resulting in a relatively mild surgical outcome compared to other nerve injury models. A major advantage of using a cranial nerve injury model is that the motoneurons reside in a relatively homogenous population in the facial motor nucleus in the pons, simplifying the study of the motoneuron cell bodies. Because of the symmetrical nature of facial nerve innervation and the lack of crosstalk between the facial motor nuclei, the operation can be performed unilaterally with the unaxotomized side serving as a paired internal control. A variety of analyses can be performed postoperatively to assess the physiologic response, details of which are beyond the scope of this article. For example, recovery of muscle function can serve as a behavioral marker for reinnervation, or the motoneurons can be quantified to measure cell survival. Additionally, the motoneurons can be accurately captured using laser microdissection for molecular analysis. Because the facial nerve axotomy is minimally invasive and well tolerated, it can be utilized on a wide variety of genetically modified mice. Also, this surgery model can be used to analyze the effectiveness of peripheral nerve injury treatments. Facial nerve injury provides a means for investigating not only motoneurons, but also the responses of the central and peripheral glial microenvironment, immune system, and target musculature. The facial nerve injury model is a widely accepted peripheral nerve injury model that serves as a powerful tool for studying nerve injury and regeneration.

We present a surgical protocol detailing how to perform a cut or crush axotomy on the facial nerve in the mouse. The facial nerve axotomy can be employed to study the physiological response to nerve injury and test therapeutic techniques.

Farelerde Yüz Sinir Aksotomi: Sakatlık Motonöron Yanıtı Eğitim için Bir Model

The goal of this surgical protocol is to expose the facial nerve, which innervates the facial musculature, at its exit from the stylomastoid foramen and ...

Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the lack of the bone microenvironment and auto/paracrine growth factors human MM cells are difficult to cultivate. Therefore, there is an urgent need to establish proper in vitro and in vivo culture systems to study the action of novel therapeutics on human MM cells. Here we present a model to grow human multiple myeloma cells in a complex 3D environment in vitro and in vivo. MM cell lines OPM-2 and RPMI-8226 were transfected to express the transgene GFP and were cultivated in the presence of human mesenchymal cells and collagen type-I matrix as three-dimensional spheroids. In addition, spheroids were grafted on the chorioallantoic membrane (CAM) of chicken embryos and tumor growth was monitored by stereo fluorescence microscopy. Both models allow the study of novel therapeutic drugs in a complex 3D environment and the quantification of the tumor cell mass after homogenization of grafts in a transgene-specific GFP-ELISA. Moreover, angiogenic responses of the host and invasion of tumor cells into the subjacent host tissue can be monitored daily by a stereo microscope and analyzed by immunohistochemical staining against human tumor cells (Ki-67, CD138, Vimentin) or host mural cells covering blood vessels (desmin/ASMA).
In conclusion, the onplant system allows studying MM cell growth and angiogenesis in a complex 3D environment and enables screening for novel therapeutic compounds targeting survival and proliferation of MM cells.

Human multiple myeloma (MM) cells require the supportive microenvironment of mesenchymal cells and extracellular matrix components for survival and proliferation. We established an in vivo chicken embryo model with engrafted human myeloma and mesenchymal cells to study effects of cancer drugs on tumor growth, invasion and angiogenesis.

Chicken İnsan Multipl Miyelom Xenograftlarında Modeli Kurulması Tümör Büyüme, Invasion ve Anjiogenez Eğitim için

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of women are alive 5 years after diagnosis. The omentum is a preferred site of HGSC metastasis formation. Despite the clinical importance of this microenvironment, the contribution of omental adipose tissue to ovarian cancer progression remains understudied. Omental adipose is unusual in that it contains structures known as milky spots, which are comprised of B, T, and NK cells, macrophages, and progenitor cells surrounding dense nests of vasculature. Milky spots play a key role in the physiologic functions of the omentum, which are required for peritoneal homeostasis. We have shown that milky spots also promote ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose, a key step in the development of peritoneal metastases. Here we describe the approaches we developed to evaluate and quantify milky spots in peritoneal adipose and study their functional contribution to ovarian cancer cell metastatic colonization of omental tissues both in vivo and ex vivo. These approaches are generalizable to additional mouse models and cell lines, thus enabling the study of ovarian cancer metastasis formation from initial localization of cells to milky spot structures to the development of widespread peritoneal metastases.

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

Vivo ve Ex Vivo Periton yağ içinde Samanyolu Nokta Yapıların Yumurtalık Kanseri Metastatik Kolonizasyon Eğitim Yaklaşımlar içinde

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Using Retinal Imaging to Study Dementia

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central nervous system (CNS) and shares prominent similarities with the brain in terms of embryological origin, anatomical features and physiological properties.&#160; The vascular and neuronal structure in the retina can now be visualized easily and non-invasively using retinal imaging techniques, including fundus photography and optical coherence tomography (OCT), and quantified semi-automatically using computer-assisted analysis programs. Studying the associations between vascular and neuronal changes in the retina and dementia could improve our understanding of dementia and, potentially, aid in diagnosis and risk assessment.&#160; This protocol aims to describe a method of quantifying and analyzing retinal vasculature and neuronal structure, which are potentially associated with dementia. This protocol also provides examples of retinal changes in subjects with dementia, and discusses technical issues and current limitations of retinal imaging.

The retina shares prominent similarities with the brain and thus represents a unique window to study vasculature and neuronal structure in the brain non-invasively. This protocol describes a method to study dementia using retinal imaging techniques. This method can potentially aid in diagnosis and risk assessment of dementia.

Demans çalışması için retina Imaging'i kullanma

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central ...