Biz Dr Joshua B. Rubin GL261-luc hücrelerinin hazırlanması yararlı öneri için lentivirüs sisteminin yanı sıra Mahil Rao plazmid cömert bir hediye kabul etmek istiyorum. Beyin Tümörü Araştırma (SSBTR), Barrow Nörolojik Vakfı ve cömert destek için Wallace Vakfı Destekleme öğrenciler çok teşekkür ediyoruz. Joseph Hastanesi ve Tıp Merkezi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak hayvanlar üzerinde deneyler yapıldı.

1. Hücre Kültürü <ol><li> Kanser Tedavi ve Tanı (DCTD) Ulusal Kanser Enstitüsü (NCI), Frederick, MD Bölümünden GL26 hücre hattı elde edildi. GL261 hücreler tümör büyüme hızının bir miktar ölçümü kolaylaştırmak için bioluminescent Lenti-X HT Ambalaj Mix (Clontech Laboratories, Inc) ve FUW Lentiphos HT Sistemi (Clontech Laboratories, Inc, Mountain View, CA) kullanılarak yapıldı GL plazmid (JB Rubin, MD, PhD laboratuvar cömert bir hediye.) Hücreler% 10 tetrasiklin Fötal Buzağı Serumu (FCS; Clontech Laboratories, Inc), Dulbecco&#39;nun Modifiye Kartal Orta (DMEM) devam edildi. GL261 hücreleri de stably pGL4.51 [luc2 / CMV / Neo] gen kodlama luc2 kullanarak vektör (Promega Corp, Madison, WI) ve FuGENE 6 Transfeksiyon Reaktif (IN Roche Applied Science, Indianapolis,) tarafından belirtilen aşağıdaki koşullar transfekte edildi üreticisi. Luc2 gen ateşböceği Lucifera kodon optimize edilmiş versiyonu.standart luc gen göre anlamlı derecede daha yüksek ışık çıkışı sağlar se. Kararlı transfektanları% 10 FCS ve 100 mg / ml Geneticin (G418, Invitrogen Corp, Carlsbad, CA) içeren DMEM medya ve tutuldu. </li><li> Kültürlü hücreler, implantasyon öncesinde trypsinzation tarafından hasat serum olmadan DMEM kez yıkanmış ve 1 x 10 7 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyon serum olmadan DMEM yeniden bekletildi. </li></ol> 2. Cerrahi Kurulum 2 <ol><li> Steril bir ortamda, tüm cerrahi aletleri, sarf malzemeleri, eldiven, örtüleri, vb de dahil olmak üzere, ameliyat boyunca devam eder. </li><li> On hafta eski C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr (albino C57BL / 6) farelerde Frederick Hayvansal Üretim Programı, Ulusal Kanser Enstitüsü satın ve ortalama 20 gram ağırlığı (NCI, Frederick, MD) kullanılır. </li><li> Hayvanlar ksilizin (5 mg / kg), ketamin (50 mg / kg) ve buprenorfin (0.05 mg / kg) intraperitoneal anestezi. Içine tutam ameliyat başladı önce hayvan yeterli anestezi olduğunu sağlamak için yapılır. Hayvanın herhangi bir bölümünün Hareketi (azda olsa bile), anestezi düzeyinin azaltılması bir göstergesidir. Hayvan hemen ek bir 3.3 mg / kg xylazine ve 26.6 mg / kg ketamin verilmiştir. Vücut ısısı, vücudu kaplayan bir lamba ve steril pansuman ile korunur. </li><li> Hayvan düzgün uyuşturulduktan sonra, stereotaktik headframe minderli yatak (Model 900 Küçük Hayvan Stereotaksik David Kopf Instruments) [Şekil 1] konur. </li><li> Akwa Tears Oftalmik Yağlayıcı Merhem küçük bir miktar (1 / 4 inç) kornealar üzerine uygulanır. </li><li> Hayvan hayvanın ağzı (hayvanın çene etrafında parmağı ve başparmak koyarak) stereotaktik çerçeve içinde girinti içine açılması ve üst ön dişler kayar stereotaktik çerçeve içinde sabitlenir. Kelepçe emin olun kulaklık hayvanın başının güvenli sıkılır ki incie kafa hizalandığından ve gözleri ancak hayvanın kafasını aşırı güç uygulamak için değil emin olun, ortalanmış. </li><li> O 2 hortum, hayvanın burun delikleri yakın aşağı bantlanmış . Oksijen debisi 0.5 lt / dk. </li><li> Alt sırt ve kuyruk solunum uzlaşma için dikkatli olmak stereotaktik yatağa aşağı bantlanmış. </li><li> Cerrahi kesi yeri traş. Povidin-İyot Swab stickler, iyot hayvanın gözlerinin içine damla değildir emin olun, iyot ile kulakları arasındaki bölgeye geri dönüyor gözleri arasındaki bölgeyi yıkamak için kullanılır. </li><li> Hücreler hemen önce cerrahi implantasyon için hazırlanır ve razı olmayan sağlamak için periyodik olarak karıştırılır. </li><li> 10 ul, 50 mm Dünya Hassas Çalgı (TEFE), Sarasota, FL, iğne ile 26 göstergesi Eğimli şırınga hücre inokulum ile yüklenir. Hücrelerin bir araya kümesinin gibi görünüyorsa şırınga yeniden yüklemek için gerekli olabilir. </li><li> 10 ul şırınga UMP3-1 UltraM yerleştiriliricroPump mikro enjektör (TEFE, Sarasota, FL). </li></ol> 3. İntrakranial İmplantasyonu 2 <ol><li> Cilt insizyonu bir boyutu 15 neşter bıçak ve dişli forseps kullanılarak yapılır. Bregma (kafatasının üst kısmında sagital ve koronal sütür kavşağı) açığa hayvanın kulağına doğru hareket, boyuna hayvanın gözleri arasında 10-15 mm kesi yapılır. Bregma [Şekil 2] distal sinüs alanı ile kolayca karışabilir için düzgün bregma tanımlamak için emin olun. </li><li> Hayvan sedasyon sonra% 0.25 &#39;lik (2.5 mg / ml) bupivakain bir insizyonel içi enjeksiyon alır. </li><li> Burrhole yavaş yavaş bir kafatası nüfuz ve beyin maruz kadar büküm ise iğne çok az basınç uygulayarak, bir 16 gauge 1 ½ inç iğne elle büküm orta hatta sağ bregma posterior 0.1 mm ve 2.3 mm yapılır. </li><li> Şırınga iğnesi Microdrive ste kullanarak pozisyon içine indireotactic şırınga sahibinin sadece beynin yüzeyine temas edene kadar. Bu pozisyonda, iğne, 3 mm derinliğe kadar beyin içine gelişmiş ve 3 dakika boyunca bir yerde saklanmalıdır. </li><li> İğne hücreleri infüze edilmelidir küçük bir cep oluşturarak, beyin yüzeyinin altında 2.6 mm toplam derinliği 0,4 mm geri çekilir. Bu noktada hayvan iğne düzgün yerleştirme ve derinlik sağlamak için bir X-ray görüntü almak isteğe bağlıdır. </li><li> 667 nL / dakika infüzyon hızı ile 2000 nL (2 mcL) bir birime ayarlamak mikro enjektör ile 3 dakika içinde hücre süspansiyonu demlenir. </li><li> Iğne, infüzyon sitesinden sızıntıyı önlemek için 2 dakika yerde kaldı. </li><li> İğne yavaş yavaş tamamen iptal edilir. </li><li> Burrhole Penfield disektör kullanarak kemik balmumu ile doludur. </li><li> Kesi büyük boşluklar cilt sol emin bir 4-0 (1.5 Metrik) Vicryl dikiş kullanılarak sütüre edilir. Vicryl çözülür bir dikiş materyalive bu nedenle sütürler kesi iyileşene kaldırılması gerek yok. </li><li> Ameliyattan sonra hayvanların 30 kafesinin alt yüzeyi ısıtmak için gerekli yüksekliği ayarlanmış bir ısıtma lambası ° C altında bir kafes yerleştirilir Hayvanlar tamamen uyanık olduğunda (kafes normal hareketi tarafından değerlendirilecek) grubu konut iade edilir. Oral ibuprofen ameliyat sonrası 5 gün boyunca kendi içme suyuna eklenir. Ibuprofen (100mg/5ml) 100 mg 473 ml standart bir kemirgen şişe su eklenir. Hayvanlar günlük ve görüntülü gözlenen ve her 3 günde bir tartılır. İki hafta implantasyon sonrası gözlem, iki kez her gün artar. Hunched duruş, daha az hareketlilik ve görünür bir vücut ağırlığı kaybı (≥% 20) içerir azalan sağlık belirtileri göstermeye Hayvanlar ötenazi. Bu belirtiler tümörün yayımlanmış bir tepki vardır ve bunlar tekrarlanabilir, tümör nedeniyle ölüme yaklaşık 1 gün önce görünür. </li></ol> 4. In vivo </em&gt; Biyoparlaklık Görüntüleme 3 <ol><li> [Yaşam] yazılımı başlatın. </li><li> IVIS Görüntüleme Sistemi [başlat IVIS Sistemi] Kontrol panelinin sağ alt tarafında düğmesini tıklayarak Başlamaya. </li><li> Kontrol panelinin sol üst tarafta [Luminesans] Görüntü Modu seçin. </li><li> Görüntüleme luciferase enjeksiyon sonrası kinetik çalışmada gerekli olan en uygun zamanı belirlemek için [Şekil 3]. Bu açıklamalar ateşböceği lusiferaz; <ol class="lalpha"><li> Aşağıda açıklandığı gibi, D-luciferase ateşböceği (Kaliper Yaşam Bilimleri Katalog XR-1001 veya başka bir satıcı, benzer bir ürün 15mg/ml PBS içinde) 10μl / g vücut ağırlığı hayvan içine enjekte edilir. </li><li> 3 dakika bekleyin ve ardından gaz anestezi odası (% 2 O 2 İsofluranın gaz) içine koyarak fare uyutmak. </li><li> Gaz anestezi odasına kapatın ve anestezi vana ve IVIS manifoldu vakum açık. Hemen yer sedatize hayvansıcaklık kontrollü görüntüleme platformu, gaz anestezi manifoldu farenin burun deliği düzgün yerleştirildiğinden emin. İlk görüntü, yaklaşık 5 dakika luciferase enjeksiyon sonra alınmalıdır. IVIS Spectrum cihaz içinde bir defada 5 hayvanlara görüntülenebilir. 5 hayvandan az görüntülü edilecekse, isofluran gaz tasarrufu için kullanılmayan manifold fiş (ler) mümkündür. </li><li> Luciferase ifade için bir kinetik eğri oluşturmak için bir saat için bir dizi oluşturarak her 3 dakikada bir almaya devam edin. <ol><li> Kontrol panelinde [Sıra Setup] düğmesine tıklayın. </li><li> Dizisi editörü görünür. </li><li> Kontrol paneli, sıradaki ilk bioluminescent görüntü ayarlarını belirtin. <ol class="lroman"><li> Orta binning ile başlayan öneririz. </li><li> Ayrıca optimum pozlama süresini belirlemek için Otomatik Pozlama tavsiye ederiz. </li><li> Dizisi editörü [Gecikme] düğmesini seçinnd her edinimi arasındaki 3 dakikalık bir gecikme süresi belirtin. </li></ol></li><li> Dizisi editörü [Ekle] tıklayın. Toplama parametreleri daha sonra tabloya eklenir. </li><li> Sırayla her bir görüntü için 4. adımı yineleyin. </li></ol></li><li> Eğrisi kurulduktan sonra, en uygun görüntüleme süresi, sinyal gücü (yoğunluk) karşı komplo tarafından tespit edilebilir. Resim hayvanların en yüksek in vivo foton anda en güçlü ve en doğru sinyali almak için sayılır. </li></ol></li><li> Ancak Erken deneylerde kullanılan luciferase intraperitoneal (ip) enjeksiyonu, ip enjeksiyonları bazen biraz tümör hiçbir biyoparlaklık gösteren aralıklı sonuçları sonuçlandı. Biz sinyal zaman zaman rastgele olmaması, barsak veya diğer iç organları luciferase teslim bağlı olduğunu varsaydık. Bu nedenle subkutan (sc) luciferase enjeksiyonları kullanmaya başladı ve daha fazla görüntüleme tekrarlanabilirlik gördüm [Şekil 3]. </li><li> Yirmisc enjeksiyon sonrası dakika, tepkisiz kadar O 2% 2 İsofluranın gaz odasına yerleştirerek, hayvanların anestezi. </li><li> Anestezi hayvan (lar) görüntüleme odasına taşınır. Oftalmik merhem görüntüleme uzunluğu nedeniyle kinetik çalışma için kullanılmalıdır. Süresi kısa, çünkü diğer görüntüleme işlemleri için gerekli değildir. </li><li> Görüntü orta binning 5 dakikalık bir poz süresi ile elde edilir. Otomatik satın alma seçeneği de kullanılıyor olabilir. </li><li> Sinyal doymuş ve / veya orta binning zayıf ise, binning ya da pozlama süresi ayarlanabilir. </li><li> Program dosyaları ve daha sonraki görüntü yorum kullanıcının bilgisayarına dizinde kaydedilir. </li></ol> 5. 3D Görüntüleme 3 <ol><li> [Sıra Setup] kontrol paneli penceresi [Görüntüleme Sihirbazı] sekmesini tıklayın. </li><li> Görüntüleme Sihirbazı başlangıç ​​ekranında görüntüleme modu ve cl [Biyoparlaklık]ick [Sonraki]. </li><li> &quot;Biyoparlaklık - DLIT&quot; görüntüleme sihirbazı penceresi [Firefly] muhabiri prob seçin. Seçilen ateşböceği kaynak spektrum emisyon / uyarma elde edilecek altı karşılık gelen filtre seçimleri ile görünecektir. </li><li> Otomatik pozlama toplama Profil C. Varsayılan ayarlar Alan çok iyi bir çalışma parametreleri ve varsayılan seçenekleri ile en son ekran görünecektir; Ancak gerekirse, bu ayarlar değiştirilebilir. </li><li> [Next] ve dizi editörü penceresinde, 20 nm geniş filtreleri (560 nm, 580 nm, 600 Nm, 620 nm, 640 nm ve 660nm) az altı spektral bölgeleri sırası ile doldurulur. Basın [Sıra Edinme]. İlk filtre (560 nm), yüzey topografyası kurmak için bir lazer galvanometre kullanarak yapılandırılmış bir ışık deseni içerir. </li><li> Aracı Paleti [Yüzey Topografya] sekmesini seçin. Yüzey düzeltme, yeniden yapılanma süreci sırasında oluşturulan herhangi bir keskin açıları için hesap yapılabilir.Varsayılan düşük yumuşatma tavsiye edilir. </li><li> [Oluştur] ve tomografi analiz kutusu görünecektir. Tüm hayvan içeren bir kırpma kutusunu çizin ve ardından [Next] düğmesini tıklatın. </li><li> Eşik aracı seçilen bölge üzerinde mor bir maske olarak görünecektir. Hayvanın fotoğrafını maç için maske otomatik olarak ayarlanması gerekir. Gerekirse, daha uygun hayvan anahat uygun maske ayarlayabilirsiniz.Özellik. </li><li> [Finish] ve yeniden inşa mesh görünecektir. Rekonstrüksiyon sonra sonuçları sekmesinde kaydedilebilir. </li><li> Hayvanın yüzey topografya yaratma ardından, [DLIT 3D İmar devam Aracı Paleti aşağı bırakın. </li><li> [Analiz] sekmesi altında yeniden yapılanma gerçekleştirmek için tüm altı dalga boylarını seçin. 600 altında doymuş piksel veya sayıları vermiştir işaretini kaldırın görüntüler. [Parametreler] sekmesinde ayarları varsayılan olarak bırakın. </li><li> [Özellikler] sekmesi altında, &quot;Muscle&quot; varsayılan seçenek olarak listelenir olmalıdırr Doku Özellikleri ve &quot;Ateşböceği&quot; kaynak spektrum olarak listelenmiş olmalıdır. </li><li> Çözümle sekmesi altında [Yeniden İnşa] ve hayvan yüzey ve sinyal kaynağını karşılık gelen yeniden yapılanma 3D rekonstrüksiyon [Şekil 4] görünmelidir. </li><li> Sinyal konumu ve yoğunluğunu belirlemek için, Araç Paleti 3D Araçlar sekmesinde vokseller düğmesini seçin. <ol><li> Görüntülenen tüm vokseller etrafında bir kare çizin ve toplam akı ölçümlerini hacmi sekmesinin altında gösterilir. </li><li> Seçilen vokseller sinyal konumu belirlemek için [Kütle Merkezi] tıklayın. Hayvan koronal, sagital ve transaksiyal dilim görünür ve [Ölçüm İmleç Display] kullanarak hayvanın yüzeyinin voksel merkezine uzaklık ölçülebilir. </li></ol></li><li> Yaşayan Görüntü Yazılımı Kullanıcı Kılavuzu co-kayıt organı atlaslar ve diğer gelişmiş özellikleri hakkında daha fazla bilgi için bakınız. </li></ol> 6. Data Analysis 3 <ol><li> Görüntü kazanmış ve kaydedildikten sonra, [Gözat] düğmesine tıklayarak ve dosyayı seçerek programın dosya erişim. </li><li> Görüntü bilgileri [View] altında bulunan olabilir → [Bilgi]. </li><li> Faiz (ROI) [ROI Araçlar] düğmesine Bölge Of seçerek sinyal yoğunluğu belirlenebilir. Görüntü görüntü kontrol panelinin sol üst köşesinde açılan listeden &quot;Foton&quot; seçerek [Photon] modu altında analiz edilir emin olun. </li><li> &quot;Tipi&quot; açılır listesinde [Ölçüm ROI] düğmesini seçin. Ilgi yatırım getirisini şekli seçin; seçenekleri Daire, Kare, ve Izgara içerir. Elde edilen imge yoğunluğu tüm alanlarını kapsayacak. </li><li> ROI pozisyon bioluminescent sinyal içeren bölgeye yatırım getirisini şekli seçimi sürükleyerek ayarlanır. </li><li> [Ölçü] düğmesine tıklayarak ROI sinyal yoğunluğu hesaplanır. ROI etiket yoğunluğunu gösterir. ROI yönetilen ve USI kaydedilebilirng Yaşayan Image yazılımı. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar: Başarılı hücre implantasyonu implante hücreleri cerrahi gününde IVIS tayfı kullanılarak saptanabilir açıktır. GL261-luc ve GL261-luc2 hücrelerin her ikisi de saptanabilir, ancak daha yüksek bir seviyeye biyoparlaklık [Şekil 5] luc2 gen sağlayacaktır. , Kısa bir süre implantasyon sonra çekilen görüntüler, arka plan olarak göz ardı edilmesi gereken hayvanın pençeleri ve burun non-spesifik sinyal olabilir. Implantasyon yerinde bulunan sinyal gerçek ve sinyal [Şekil 6] zamanla artacaktır. 6 gün sinyal yoğunluğunda düşüş, tekrarlanabilir ve implante hücrelerin bazı tümör kaybı nedeniyle büyük olasılıkla. Tümör yükü nicel ölçümler sonuçta hayvan hastalığa yenik kadar düzenli olarak artmaya gerektiğini tekrarlanabilir. Ancak, büyüme eğrileri implante hücreleri devlet, ya da kaçınılmaz küçük var büyük ölçüde bağlıdır.<html> implantasyon prosedürü iability. Laboratuvarımız her üç günde bir görüntü implante hayvanlar için seçti. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3403/3403fig1.jpg" /> Fareyi doğru uyuşturulduktan sonra Şekil 1, stereotaktik çerçeve yerleştirilir. Fare kafası ağız kelepçe ile sabitlenir. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3403/3403fig2.jpg" /> Şekil 2. cilt, ana anatomik işaretleri bregma, koronal ve sagital sütür de dahil olmak üzere tespit açıldıktan sonra . Burrhole, kafatası nüfuz ve beyin maruz kadar küçük bir miktarda basınç yavaş yavaş, 16 gauge 1 ½ inç iğne büküm bregma sağ 2.3mm yapılır. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3403/3403fig3.jpg" /> Şekil 3 subkutan bir kinetik karşılaştırma (iles/ftp_upload/3403/3403fig3_1.jpg &quot;alt =&quot; Figure3.1 &quot;/&gt;) karşı intraperitoneal ( <img src="/files/ftp_upload/3403/3403fig3_2.jpg" alt="Figure3.2" /> Subkütan luciferase enjeksiyon programını göstermek için ve görüntü aşağıdaki luciferase yönetim için en uygun zamanı belirlemek için) luciferase enjeksiyon yapıldı. Üç dakika luciferase sonra fare, sedasyon IVIS Spectrum aleti yerleştirilir ve biyoparlaklık bir kinetik eğri oluşturmak için bir saat ve bundan sonra her 6 dakika için her 3 dakikada bir görüntülü olarak enjekte edildi. Bu luciferase yönetiminin subkutan rota elimizde bir intraperitoneal üstün olduğu ve hayvanların görüntü için en uygun zaman GL261-luc hücreleri kullanılan luciferase enjeksiyonu takiben yaklaşık 25 dakika olduğunu gösterdi. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3403/3403fig4.jpg" /> 3-Boyutlu bir reconst Şekil 4. Birden çok görünümGL261 luc2 hücreleri intrakranial implantasyonu karışıklık fare iskelet ve beyin ile birlikte kayıtlı. <img alt="Şekil 5" src="/files/ftp_upload/3403/3403fig5.jpg" /> Şekil 5 GL261-luc hücreleri vs GL261-luc2 hücreleri kaynaklanan tümörler elde Foton sayar. Sonuçlar 5 hayvanların ortalama. <img alt="Şekil 6" src="/files/ftp_upload/3403/3403fig6.jpg" /> Şekil 6 albino C57BL / 6 fare GL261-luc tümör hücre büyüme grafiği. Biyoparlaklık 3 günde ölçülen ve in vivo foton sayısı karşısında gün implantasyon sonrası olarak çizilir. Fotoğraflar çeşitli zaman noktalarında biyoparlaklık göstermektedir. Renklendirme, tümör hücre sayısı (renk çubuğunun sağ tarafında gösterilir) göre biyoparlaklık bir göstergesidir (piksel yoğunluğu). Hayvan hastalığa yenik sonra beyin diseke edildi ve luciferase ex vivo imag elde etmek için topikal eklendi.e içerlek rakam gösterilmiştir.

<ol>
	<li>Candolfi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+glioblastoma+models+in+preclinical+neuro-oncology:+neuropathological+characterization+and+tumor+progression.">Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathological characterization and tumor progression.</a> J Neurooncol. 85, 133-148 (2007).</li><li>Stafford, P., Abdelwahab, M. G., do, K. i. m., Preul, Y., Rho, M. C., M, J., Scheck, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ketogenic+diet+reverses+gene+expression+patterns+and+redudes+reactive+oxygen+species+levels+when+used+as+an+adjuvant+therapy+for+glioma.">The ketogenic diet reverses gene expression patterns and redudes reactive oxygen species levels when used as an adjuvant therapy for glioma.</a> Nutr Metab. 7, (2010).</li><li>Caliper Life Sciences, Inc. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Living Image Software Version 4.0. VivoVision Systems. , (2010).</li><li>Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2001).</li><li>Jouanneau, E., Poujol, D., Gulia, S., Le, M. I., Blay, J. Y., Belin, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+are+essential+for+priming+but+inefficient+for+boosting+antitumour+immune+response+in+an+orthotopic+murine+glioma+model.">Dendritic cells are essential for priming but inefficient for boosting antitumour immune response in an orthotopic murine glioma model.</a> Cancer Immunol Immunother. 55, 254-267 (2006).</li></ol>

Bu makalenin Ücretsiz Erişim kaliper Life Sciences tarafından desteklenmektedir.

Hücre inokulum 0,4 mm cep oluşturduktan sonra beyin yüzeyinden 2.6 mm derinlikte demlenir. Iğne doğru yerleştirilmesi ve derinlik sağlamak için bir X-ışını, bir C-Kol ya da benzer bir X-ray görüntü yoğunlaştıran cihazı kullanılarak alınabilir, ancak bu isteğe bağlıdır. Hayvan düzgün sedasyon değilse, ameliyat komplikasyonları, hayvan hücre infüzyonu sırasında hareket edebilir ve bu noktada ortaya çıkabilir. Bu iğne parça hücre karışımı veya kanama sızıntıya neden olabilir. Kaçak hücreler, tümör hücrelerinin ektopik büyümesine neden olur. Burrhole protokolü 4 olarak açıklanan 2.3 mm medial yapılırsa da ponksiyon yapılabilir ventrikül önemli değildir. 2 ul metilen mavisi ile bir fare beslerken ve beyin dokusu diseksiyon infüze boya yerini kontrol etmek için iğne ve hücre yayılmasını doğru yerleştirme test edildi. Bu protokolde, in vivo görüntüleme sistemi ve t IVIS SpektrumBu alet ile kullanılmak üzere tasarlanmış Görüntü yazılımı (v 4.0) yaşamak. (Kaliper Life Sciences). In vivo görüntüleme sistemi, görüntü analiz araçları herhangi bir karşılaştırılabilir benzer sonuçlar elde etmek için kullanılabilir. Bu sistemler, deneysel bir intrakranial tümör büyümesini takip geleneksel manyetik rezonans görüntüleme (MRG) üzerinden bazı avantajlar sağlar. 2 araçların en belirgin göreli maliyetler hayvan MRI makineleri çok daha pahalı ve genellikle yetenekli bir MRG teknisyen hizmetleri gerektirir. In vivo görüntüleme, burada açıklandığı gibi son kullanıcı tarafından yapılabilir. MRI veri kantitatif zaman alıcı ve biraz zan ise biyoparlaklık verileri, kantitatif. Ayrıca, MR görüntüleri tümör hücrelerinin yanı sıra ödem ve inflamasyon ve tedavi etkisi tümör ayırmak zor olabilir. Bu nedenlerden dolayı, büyüyen tümörün doğru hacimsel ölçümler elde etmek zor olabilir. Biyoparlaklık ATP, Bu nedenle sadece canlı tümör hücrelerinin tümör boyutu verilerine katkıda bulunmaktadır. Buna rağmen bir makine varsa, MR için bazı avantajları vardır. Hücreler, MRG tarafından görüntülenebilmekte bioluminescent işaretleyici ile etiketlenmesine gerek yoktur. Peri-tümöral ödem görselleştirmek için yeteneği bazı deneysel protokoller için bir avantaj olabilir. Her iki teknolojinin kullanılabilir duruma geldiğinde, her iki teknolojinin gücü birini kullanarak diğer kullanılmasına engel olmadığını, bu yüzden verilerin yanı sıra aynı hayvan peri-tümöral ödem ve inflamasyon varlığı, tümör büyüme elde edilebilir. araştırmacı.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif ya da tedarik Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> GL261-luc2 BioWare Ultra </td><td> Kaliper Yaşam Bilimleri </td><td> GL261-luc2 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco&#39;nun Modifiye Kartal Medium (DMEM) </td><td> Invitrogen </td><td> 10313039 </td><td></td></tr><tr><td> Geneticin (G418) </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 11811-023 </td><td></td></tr><tr><td> Fötal Buzağı Serumu (FCS) </td><td> Invitrogen </td><td> 26140079 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfat tamponlu salin (PBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 70011044 </td><td></td></tr><tr><td> C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr Fare </td><td> NCI-Frederick </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Akwa Tears Yağ Oftalmik merhem </td><td> Akorn Inc. </td><td> 17478-062-35 </td><td></td></tr><tr><td> Ketaset (ketamin hidroklorür) </td><td> Wyeth </td><td> 11570775 </td><td></td></tr><tr><td> Sedazine (ksilizin hidroklorür) </td><td> Wyeth </td><td> 10031894 </td><td></td></tr><tr><td> Küçük Hayvan Stereotaksik Enstrüman </td><td> Kopf Aletleri </td><td> 900 </td><td></td></tr><tr><td> SYS-Micro4 Kontrolörü ile UltraMicroPump </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td> UMP3-1 </td><td> Eğer mevcut değilse, elle demlenmeye mümkün </td></tr><tr><td> 26 gauge 10μl şırınga iğnesi eğimli </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td> SGE010RNS </td><td></td></tr><tr><td> Adison Forseps </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td> 500092 </td><td></td></tr><tr><td> Penfield Dissector </td><td> Codman </td><td> 65-1015 </td><td></td></tr><tr><td> 16g 1 ½ Hassas Glide İğne </td><td> Beckton, Dickinson and Company (BD) </td><td> 305198 </td><td></td></tr><tr><td> Cerrahi Bıçak Kolu </td><td> BD </td><td> 371030 </td><td></td></tr><tr><td> Boyut 15 Bıçak </td><td> BD </td><td> 371315 </td><td></td></tr><tr><td> 4-0 Vicryl Sütür </td><td> Ethicon </td><td> VCP496G </td><td></td></tr><tr><td> Kemik Wax </td><td> Medline </td><td> DYNJBW25 </td><td></td></tr><tr><td> Povidin-İyot Swab stickler </td><td> Medline </td><td> MD93901 </td><td></td></tr><tr><td> D-luciferase Potasyum Tuz </td><td> Kaliper Yaşam Bilimleri </td><td> 122796 </td><td></td></tr><tr><td> Forane (İsofluranın) </td><td> Baxter </td><td> 1001936060 </td><td></td></tr><tr><td> OPMI Pentero Mikroskop </td><td> Carl Zeiss, Inc. </td><td></td><td> Herhangi bir cerrahi mikroskop yeterli olacaktır </td></tr><tr><td> Isteğe bağlı anestezi sistemi ile Xenogen IVIS Spectrum </td><td> Kaliper Yaşam Bilimleri </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

intracranial implantation with subsequent 3d in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas

Insan glioblastoma multiforme (GBM) özellikleri birçok özetlediği fare glioma 261 (GL261) in vivo modeldir sistemi olarak kabul edilmektedir. Hücre hattı başlangıçta C57BL / 6 singeneik fare suşu 1 3-metil-cholantrene intrakranial enjeksiyonu ile indüklenen; bu nedenle, immünolojik yetkili C57BL / 6 fareler kullanılabilir. GL261 kullanırken, aşağıdaki protokolü, herhangi intrakraniyal bir fare tümör modeli implantasyon ve izleme için kullanılabilir. GL261 hücrelerin stabil bir şekilde ifade ateşböceği lusiferaz (GL261-luc) için tasarlanmış. Biz de CMV organizatörü ifade luc2 gen istikrarlı transfeksiyon parlak GL261-luc2 hücre hattı oluşturdu. C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr fareler Ulusal Kanser Enstitüsü, Frederick, MD (C57BL / 6 albino varyant), siyah deri ve kürk neden ışık zayıflama ortadan kaldırmak için kullanılmıştır. Albino C57BL / 6 farelerin kullanımı ile; in vivo görüntüleme IVIS Spektrum kullanarak in vivo imsistemi yaşlanma gün (Kaliper Yaşam Bilimleri, Hopkinton, MA) implantasyonu mümkün. GL261-luc ve GL261-luc2 hücre hatları ebeveyn GL261 hücreler olarak aynı in vivo davranış gösterdi . Insan GBMs paylaşılan histolojik özellikleri ve bu fare modeli bazıları şunlardır: tümör nekroz, pseudopalisades, neovaskülarizasyon, istila, hiperselüler ve inflamasyon 1. Implantasyon öncesinde hayvanlara bir stereotaktik aparatı ve bir kesi yerleştirilen bir intraperitoneal ketamin enjeksiyonu (50 mg / kg) ksilizin (5 mg / kg) ve buprenorfin (0.05 mg / kg), anestezi edildi üzerinden bir neşter ile yapıldı kranial orta hat. Burrhole bregma ve orta hat sağ için 2.3mm 0.1mm posterior yapıldı. Bir iğne 2.6mm derinliği 3mm ve geri 0.4mm derinliğe yerleştirildi. İki ul GL261-luc veya GL261 luc2 hücreleri (10 7 hücre / ml), 3 dakika boyunca infüze edildi . Burrhole kapatıldıbonewax ve kesi dikildi. Stereotaktik implantasyonu takiben bioluminescent hücreler implantasyon günden itibaren saptanabilir ve tümör IVIS Spectrum enstrüman, 3D görüntü rekonstrüksiyonu özelliği kullanılarak analiz edilebilir. Hayvanlar 150μg luciferase / görüntüleme için önce kg vücut ağırlığı 20 dakika subkütan enjeksiyon alırsınız. Tümör yükü, zaman içinde ortalama tümör biyoparlaklık kullanarak miktarı. Tümör taşıyan farelere morbidite değerlendirmek için günlük olarak gözlenmiş ve aşağıdaki belirtilerden biri veya daha fazlası mevcut olduğunda ötenazi: uyuşukluk, ambulasyon yetmezliği, hunched duruş, damat başarısızlık, iştahsızlık&gt;% 10 kilo kaybı ile sonuçlanan. Tümörler tüm hayvanların nekropsi belirgindi.

Watch this Scientific Journal Video about Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas at JoVE.com

Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

İntrakraniyal GL261 hücrelerin içine C57BL / 6 farelerin implantasyon birçok insan glioblastoma multiforme işaretlerinden özetlemek malign gliomlar üretir. Biz bizi kullanmasına izin stably lusiferaz ifade GL261 hücreleri kullandı<em&gt; In vivo</em&gt; Görüntüleme tümör progresyonu takip etmek. Ameliyat ve 3D<em&gt; In vivo</em&gt; Görüntüleme göstermiştir.

Müteakip 3D ile İntrakranial İmplantasyonu In Vivo Murin Gliomlar Bioluminescent Görüntüleme

The mouse glioma 261 (GL261) is recognized as an in vivo model system that recapitulates many of the features of human glioblastoma multiforme (GBM). The ...

intracranial-implantation-with-subsequent-3d-vivo-bioluminescent

Research

JoVE Journal

Medicine

Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

20.3K Görüntüleme.  Barrow Neurological Institute of St. Joseph’s Hospital and Medical Center. 中文

Video: Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

Murine Bioluminescent Hepatic Tumour Model

This video describes the establishment of liver metastases in a mouse model that can be subsequently analysed by bioluminescent imaging. Tumour cells are administered specifically to the liver to induce a localised liver tumour, via mobilisation of the spleen and splitting into two, leaving intact the vascular pedicle for each half of the spleen. Lewis lung carcinoma cells that constitutively express the firefly luciferase gene (luc1) are inoculated into one hemi-spleen which is then resected 10 minutes later. The other hemi-spleen is left intact and returned to the abdomen. Liver tumour growth can be monitored by bioluminescence imaging using the IVIS whole body imaging system. Quantitative imaging of tumour growth using IVIS provides precise quantitation of viable tumour cells. Tumour cell death and necrosis due to drug treatment is indicated early by a reduction in the bioluminescent signal. This mouse model allows for investigating the mechanisms underlying metastatic tumour-cell survival and growth and can be used for the evaluation of therapeutics of liver metastasis. 

This article describes a procedure for the induction of orthotopic bioluminescent liver tumours in mice, and subsequent analysis of tumour growth confined to the liver using live whole body luminescence imaging.

Murin Bioluminescent Karaciğer Tümör Modeli

This video describes the establishment of liver metastases in a mouse model that can be subsequently analysed by bioluminescent imaging. Tumour cells are ...

Tıp

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

Our understanding of how and when breast cancer cells transit from established primary tumors to metastatic sites has increased at an exceptional rate since the advent of in vivo bioluminescent imaging technologies 1-3. Indeed, the ability to locate and quantify tumor growth longitudinally in a single cohort of animals to completion of the study as opposed to sacrificing individual groups of animals at specific assay times has revolutionized how researchers investigate breast cancer metastasis. Unfortunately, current methodologies preclude the real-time assessment of critical changes that transpire in cell signaling systems as breast cancer cells (i) evolve within primary tumors, (ii) disseminate throughout the body, and (iii) reinitiate proliferative programs at sites of a metastatic lesion. However, recent advancements in bioluminescent imaging now make it possible to simultaneously quantify specific spatiotemporal changes in gene expression as a function of tumor development and metastatic progression via the use of dual substrate luminescence reactions. To do so, researchers take advantage for two light-producing luciferase enzymes isolated from the firefly (Photinus pyralis) and sea pansy (Renilla reniformis), both of which react to mutually exclusive substrates that previously facilitated their wide-spread use in in vitro cell-based reporter gene assays 4. Here we demonstrate the in vivo utility of these two enzymes such that one luminescence reaction specifically marks the size and location of a developing tumor, while the second luminescent reaction serves as a means to visualize the activation status of specific signaling systems during distinct stages of tumor and metastasis development. Thus, the objectives of this study are two-fold. First, we will describe the steps necessary to construct dual bioluminescent reporter cell lines, as well as those needed to facilitate their use in visualizing the spatiotemporal regulation of gene expression during specific steps of the metastatic cascade. Using the 4T1 model of breast cancer metastasis, we show that the in vivo activity of a synthetic Smad Binding Element (SBE) promoter was decreased dramatically in pulmonary metastasis as compared to that measured in the primary tumor 4-6. Recently, breast cancer metastasis was shown to be regulated by changes within the primary tumor microenvironment and reactive stroma, including those occurring in fibroblasts and infiltrating immune cells 7-9. Thus, our second objective will be to demonstrate the utility of dual bioluminescent techniques in monitoring the growth and localization of two unique cell populations harbored within a single animal during breast cancer growth and metastasis.

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

Herein we describe the methods to construct, visualize, and quantify the bioluminescent reactions of both firefly and renilla luciferase enzymes expressed in metastatic breast cancer cells during their growth and metastasis in vivo.

Vivo Çift Yüzey Bioluminescent Imaging&#39;de

Our understanding of how and when breast cancer cells transit from established primary tumors to metastatic sites has increased at an exceptional rate ...

Implantation of a Carotid Cuff for Triggering Shear-stress Induced Atherosclerosis in Mice

It is widely accepted that alterations in vascular shear stress trigger the expression of inflammatory genes in endothelial cells and thereby induce atherosclerosis (reviewed in 1 and 2). The role of shear stress has been extensively studied in vitro investigating the influence of flow dynamics on cultured endothelial cells 1,3,4 and in vivo in larger animals and humans 1,5,6,7,8. However, highly reproducible small animal models allowing systematic investigation of the influence of shear stress on plaque development are rare. Recently, Nam et al. 9 introduced a mouse model in which the ligation of branches of the carotid artery creates a region of low and oscillatory flow. Although this model causes endothelial dysfunction and rapid formation of atherosclerotic lesions in hyperlipidemic mice, it cannot be excluded that the observed inflammatory response is, at least in part, a consequence of endothelial and/or vessel damage due to ligation.
In order to avoid such limitations, a shear stress modifying cuff has been developed based upon calculated fluid dynamics, whose cone shaped inner lumen was selected to create defined regions of low, high and oscillatory shear stress within the common carotid artery 10. By applying this model in Apolipoprotein E (ApoE) knockout mice fed a high cholesterol western type diet, vascular lesions develop upstream and downstream from the cuff. Their phenotype is correlated with the regional flow dynamics 11 as confirmed by in vivo Magnetic Resonance Imaging (MRI) 12: Low and laminar shear stress upstream of the cuff causes the formation of extensive plaques of a more vulnerable phenotype, whereas oscillatory shear stress downstream of the cuff induces stable atherosclerotic lesions 11. In those regions of high shear stress and high laminar flow within the cuff, typically no atherosclerotic plaques are observed.
 
In conclusion, the shear stress-modifying cuff procedure is a reliable surgical approach to produce phenotypically different atherosclerotic lesions in ApoE-deficient mice.

The constricting cuff presented in this article is designed to induce atherosclerosis in the murine common carotid artery. Due to the conical shape of its inner lumen the implanted cuff generates well-defined regions of low, high and oscillatory shear stress triggering the development of atherosclerotic lesions of different inflammatory phenotypes.

Fare Shear stres İndüklenmiş Ateroskleroz Tetikleme Karotis Kol İmplantasyonu

It is widely accepted that alterations in vascular shear stress trigger the expression of inflammatory genes in endothelial cells and thereby induce ...

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

Glioblastoma multiforme (GBM) is a high-grade primary brain cancer with a median survival of only 14.6 months in humans despite standard tri-modality treatment consisting of surgical resection, post-operative radiation therapy and temozolomide chemotherapy 1. New therapeutic approaches are clearly needed to improve patient survival and quality of life. The development of more effective treatment strategies would be aided by animal models of GBM that recapitulate human disease yet allow serial imaging to monitor tumor growth and treatment response. In this paper, we describe our technique for the precise stereotactic implantation of bio-imageable GBM cancer cells into the brains of nude mice resulting in tumor xenografts that recapitulate key clinical features of GBM 2. This method yields tumors that are reproducible and are located in precise anatomic locations while allowing in vivo bioluminescent imaging to serially monitor intracranial xenograft growth and response to treatments 3-5. This method is also well-tolerated by the animals with low perioperative morbidity and mortality.

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

We describe an integrated method for the precise, stereotactic implantation of human glioblastoma multiforme cells into the brains of nude mice and subsequent serial in vivo imaging to monitor growth and response to treatment of the resultant xenografts.

Stereotaktik intrakranial implantasyon ve<em&gt; In vivo</emGlioblastoma Multiforme bir Mouse Model Sistemde Tümör Xenografts arasında&gt; Bioluminescent Görüntüleme

Glioblastoma multiforme (GBM) is a high-grade primary brain cancer with a median survival of only 14.6 months in humans despite standard tri-modality ...

A Murine Model of Stent Implantation in the Carotid Artery for the Study of Restenosis

Despite the considerable progress made in the stent development in the last decades, cardiovascular diseases remain the main cause of death in western countries. Beside the benefits offered by the development of different drug-eluting stents, the coronary revascularization bears also the life-threatening risks of in-stent thrombosis and restenosis. Research on new therapeutic strategies is impaired by the lack of appropriate methods to study stent implantation and restenosis processes. Here, we describe a rapid and accessible procedure of stent implantation in mouse carotid artery, which offers the possibility to study in a convenient way the molecular mechanisms of vessel remodeling and the effects of different drug coatings.

A model of stent implantation in mouse carotid artery is described. Compared to other similar methods, this procedure is very rapid, simple and accessible, offering the possibility to study in a convenient way the vascular wall reaction to different drug-eluting stents and the molecular mechanisms of restenosis.

Restenoz Çalışmaları Karotis Arter Stent İmplantasyonu bir murin Modeli

Despite  the considerable progress made in the stent development in the last decades,  cardiovascular diseases remain the main cause of death in western ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

Yeni Bir Yüksek çözünürlüklü<em&gt; In vivo</emTümör Büyüme ve Tedavi için İntrakranial Yapıların Dinamik Tepki Eğitim&gt; Görüntüleme Tekniği

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions preclinically. However, valid assessment of pathological alterations often requires histological analysis, and when performed ex vivo, necessitates death of the animal. Therefore in conventional experimental settings, intra-individual follow-up examinations are rarely possible. Thus, development of murine endoscopy in live mice enables investigators for the first time to both directly visualize the gastrointestinal mucosa and also repeat the procedure to monitor for alterations. Numerous applications for in vivo murine endoscopy exist, including studying intestinal inflammation or wound healing, obtaining mucosal biopsies repeatedly, and to locally administer diagnostic or therapeutic agents using miniature injection catheters. Most recently, molecular imaging has extended diagnostic imaging modalities allowing specific detection of distinct target molecules using specific photoprobes. In conclusion, murine endoscopy has emerged as a novel cutting-edge technology for diagnostic experimental in vivo imaging and may significantly impact on preclinical research in various fields.

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Small animal imaging techniques allow serial diagnostic examinations and therapeutic interventions in vivo. Recently, the scope of applications has significantly widened and currently includes assessment of colonic tumor development, wound healing and monitoring of inflammation. This protocol illustrates these diverse potential applications of murine endoscopy.

Murin için Endoskop<em&gt; In Vivo</em&gt; Karsinojenez ve bağırsak Değerlendirilmesi Multimodaller Görüntüleme Yara İyileşmesi ve İltihap

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

Murine Model of Femoral Artery Wire Injury with Implantation of a Perivascular Drug Delivery Patch

Percutaneous interventions including balloon angioplasty and stenting have been used to restore blood flow in vessels with occlusive vascular disease. While these therapies lead to the rapid restoration of blood flow, these technologies remain limited by restenosis in the case of bare metal stents and angioplasty, or reduced healing and possibly enhanced risk of thrombosis in the case of drug eluting stents. A key pathophysiological mechanism in the formation of restenosis is intimal hyperplasia caused by the activation of vascular smooth muscle cells and inflammation due to arterial stretch and injury. Surgeries that induce arterial injury in genetically modified mice are useful for the mechanistic study of the vascular response to injury but are often technically challenging to perform in mouse models due to the their small size and lack of appropriate sized devices. We describe two approaches for a surgical technique that induces endothelial denudation and arterial stretch in the femoral artery of mice to produce robust neointimal hyperplasia. The first approach creates an arteriotomy in the muscular branch of the femoral artery to obtain vascular access. Following wire injury this arterial branch is ligated to close the arteriotomy. A second approach creates an arteriotomy in the main femoral artery that is later closed through localized cautery. This method allows for vascular access through a larger vessel and, consequently, provides a less technically demanding procedure that can be used in smaller mice. Following either method of arterial injury, a degradable drug delivery patch can be placed over or around the injured artery to deliver therapeutic agents.

We describe a surgical technique that produces wire injury in the femoral artery of mice to induce neointimal hyperplasia to serve as a model testing system for the perivascular delivery of therapeutic compounds for the inhibition of restenosis.

Bir Perivasküler Drug Delivery Patch İmplantasyonunda ile Femoral Arter Tel Yaralanma sıçan Modeli

Percutaneous interventions including balloon angioplasty and stenting have been used to restore blood flow in vessels with occlusive vascular disease. ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

İnsan Tümör ksenogratflarının gelen Fare Hücrelerinin tükenmesi Anlamlı Hedef Hücre Alt Analizi geliştirir

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently labelled structures in large biological specimens, and is down to cellular resolution. Meanwhile, the constant refinement of underlying protocols and the enhanced availability of specialized commercial systems enable us to investigate the microstructure of whole mouse organs and even allow for the characterization of cellular behavior in various live-cell imaging approaches. Here, we describe a protocol for the spatial whole-mount visualization and quantification of the CD45+ leukocyte population in inflamed mouse hearts. The method employs a transgenic mouse strain (CD11c.DTR)that has recently been shown to serve as a robust, inducible model for the study of the development of fulminant fatal myocarditis, characterized by lethal cardiac arrhythmias. This protocol includes myocarditis induction, intravital antibody-mediated cell staining, organ preparation, and LSFM with subsequent computer-assisted image post-processing. Although presented as a highly-adapted method for our particular scientific question, the protocol represents the blueprint of an easily adjustable system that can also target completely different fluorescent structures in other organs and even in other species.

Here, we describe a light-sheet microscopy approach to visualize the cardiac CD45+ leukocyte infiltrate in a murine model of aseptic fulminant myocarditis, which is induced by the intratracheal diphtheria toxin treatment of CD11c.DTR mice.

Bir Fulminan Miyokardit Modelinde Işık Yeri Mikroskopisi İle Lökosit İnfiltrasyonunun Nicel Görselleştirilmesi

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...