Yazarlar Ligue Francaise contre l&#39;Epilepsie (MA-L), (FJ için) Institut National de la Sante et de la Recherche Médicale Grant AVENIR R12087FS, Montpellier Üniversitesi&#39;nden hibe (FJ için) ve hibe kabul etmek istiyorum Federasyonu (nm) la Recherche sur le cerveau dökün. Biz Montpellier in vivo görüntüleme çekirdek platformu tesis IPAM de Chrystel Lafont teknik yardım kabul. Biz de yazının redaksiyon Mary Vernov (Weill Cornell Medical College) teşekkür ederim.

Fareler yiyecek, su ad libitum giriş izin verilir ve bir 12-st bir ışık-karanlık döngüsünde tutulur. laboratuar hayvanları da içeren tüm prosedürler Ulusal ve Avrupa yasaları uyduğu ve Eğitim ve Bilimsel Araştırma (CEEA-LR-00651-01) Fransız Bakanlığı tarafından onaylanmıştır. 6 transgenik 5xFAD 4 yavru vahşi tipli (WT) kontrol farelerinin toplam Bu prosedür kullanıldı. 1. Ameliyat öncesi hazırlık <ol><li> Intraperitoneal (İP) metoksi-x04 (10 mg / kg) Aβ mevduat 11 etiketlemek için ameliyattan önce 48 saat enjekte edilir. </li><li> Steril yapay serebrospinal akışkan (CSF) (120 mM NaCI, 26.2 mM NaHCO 3, 2.5 mM KCI, Hazırlama 1 mM NaH 2 PO 4, 1.3 mM MgCl2, 10 mM glikoz, 95% O 2/5% CO2 önce kabarcık 2.5 mM CaCl2) eklenmiştir. </li><li> Bir otoklav veya aseptik önce sıcak bir boncuk sterilizatör kullanılarak, cerrahi aletleri (makas, forseps, jilet ve matkap ucu) Sterilizecerrahi. </li><li> Temiz emici bir bezle% 70 etanol ve kapaklı cerrahi tezgah ve mikroskop plaka temizleyin. </li><li> ketamin / ksilazin (75 mg / kg ve 10 mg / kg, sırası ile) ve analjezik ketoprofen (2.5 mg / kg) IP enjekte edilir. </li><li> pençe ya da kuyruk tutam anestezi uygun seviyesini kontrol edin. </li><li> Gözleri steril oftalmik merhem sürün ve bıyık kaçınarak kürk (kulak burun) tıraş. dikkatli cilt tahrişi önlemek için su ile durulanır, ardından olduğu gibi tüy dökücü krem ​​sürece kullanılabilir. bir jilet kalan kürk traş. povidon-iyot antiseptik solüsyon ile cilt sterilize edin. </li><li> binoküler mikroskop altında fare yerleştirin ve burun kulaklar bir cilt kesi yapmak. kafatası açığa çıkarmak için yanlara cilt çekin. periost insizyon ve art arda olası kanamayı durdurmak için steril aCSF ile kafatası durulayın. </li></ol> 2. Damarlanma Etiketleme ve inceltilmiş KafatasıPencere hazırlanması (40 dakika) <ol><li> Bir pamuk uçlu göz merhemi çıkarın. Topikal oftalmik anestetik (tetrakain% 1) bir damla uygulayın ve nazikçe çıkıntı elde etmek için göz çukurlarının çevresindeki deri baskı. </li><li> Yardeni ve arkadaşları 12 tarafından tarif edilen prosedür takip edilerek, retro-orbital sinüste (deri altı insülin iğne 100 mg / kg ya da 50 mg / ml solüsyon, 50 uL), dekstran (70 kDa) ile konjuge floresein izotiosiyanat (FITC) enjekte edilir. Gözleri steril oftalmik merhem sürün. </li><li> cilt geri çekilmiş ve kafatası seçilen görüntüleme alanı çevresinde temiz ve kuru olduğundan emin olun. Cihazı monte baş pencerenin etrafında siyonoakrilik tutkal küçük bir miktar uygulayın birkaç saniye 10 hafif basınç uygulayarak hedef bölgenin etrafında ve tutkal (yığılmış jilet bıçakları oluşan Şekil 1). </li><li> alan emin, cihaz monte baş pencerenin kenarına deri uçlarını çekinkuru. Cildi ve veteriner sınıf siyonoakrilik tutkal küçük bir miktar ile pencerenin kenarına sabitleyin ve kuru (Şekil 1) kadar bekleyin. </li><li> Baş-montaj cihazı kullanılarak aşamada hayvan sabitleyin. Steril aCSF ile durulayın ve iyice deri ve kafa monte aygıt arasında tamamen sızdırmaz olduğundan emin olun. normotermi korumak için bir hayatta kalma battaniye fareyi sarın. </li><li> Daha önce 10 açıklandığı gibi aCSF çözeltisi içinde kafatası incelme gerçekleştirin. kafa derisi tamamen kaldırıldı unutmayın. Düzenli kemik enkaz temizlemek için ve doku aşırı ısınmasını önlemek için aCSF değiştirin. Kalan kemik enkaz kısa hava ponponları kaldırılabilir. aCSF çözümü de sondaj yarattığı titreşimleri azaltır. NOT: hayvanın yaşına ve ilgi bölgeye göre 150 mikron 80 ila fare kafatası kalınlığı değişir. </li><li> (Orta hızda ve bir 0.7 mm çapak) bir diş matkap kullanarak bir alanda 1 kafatası yüzeyi incelme başlar.kafatasına düzenli dikey hareket paralel kullanarak ve kaldırmak çapı 0 mm süngerimsi kemik çoğu (ilk 40-70 mikron). ACSF her 20-30 saniyede değiştirin ve 3-4 sn kesintisiz sondaj sınırlamak için unutmayın. kemik yakın sütür Not oldukça vaskülarize olduğunu. aCSF nihai kanamayı durdurmak için gelfoam önceden ıslatılmış uygulayın. </li><li> aşırı baskı uygulamak için dikkatli olmak, kafatasının incelmesi ile devam etmek için keskin bir tek kullanımlık göz mikrocerrahi bıçak kullanın. 35 um - Nihai bölgesi çapında ve 20 bir kalınlığı yaklaşık 0.5 mm taşımaktadır. NOT: Kemik büyütme ve yara izi, her görüntüleme oturumda daha ince pencere için gerekli nedeniyle. </li></ol> 3. İki foton Mikroskopi (45 dk) <ol><li> Gerekirse, uygun anesteziyi muhafaza etmek üzere 19 mg / kg ketamin enjekte edilir. </li><li> İki foton lazer mikroskop altında (headmount aşamasına sabit) fare aktarın. 20X suya daldırma obj kullanarak1,0 sayısal diyafram ile özelliklerin etkili epi-floresan lamba kullanarak optik alanın merkezinde incelmiş kranial pencereyi bulun. Amaç her zaman aCSF dalmış olduğundan emin olun. </li><li> Bir mod kilitli darbeli lazer (Ti-Safir 680-1040nm) ile lazer tarama başlatın. sırasıyla, mavi ve yeşil kanallarda yayılan metoksi-XO4 floresan ve FITC-dekstran tespit etmek için, 750 nm de dalgaboyu ayarlayın. Not: Mikroskop 506 nm ve 555 nm &#39;de iki ışın dağıtıcıları, yer alır. Mavi ışık, bir 470 ± 12 nm filtresi ile donatılmış bir NDD detektörü tarafından yakalanır. Yeşil ışık 525 ± 25 nm filtresi ile donatılmış yüksek hassasiyet GaAsP dedektör tarafından yakalanır. amaç yayılan maksimal lazer gücü, lazer kaynaklı doku hasarı önlemek için 10 mW aşmamalıdır. </li><li> düşük bir büyütme yığını Edinme (500 mm x 500 mm, 512 x 512 piksel, 2 mikron adım) ROI kesin yerini değiştirmesi için bir 3D harita oluşturmak için 0.7X sayısal zoomsonraki zaman noktalarında. </li><li> 2X sayısal zoom 4 yüksek dijital büyütme görüntülerin bir mozaik Edinme (200 mm x 200 mm, 512 x 512 piksel, 1 mikron adım). görüntüleme yazılımı 200 mikron adımda penceresini taşımak kullanarak tüm bölgeleri yakalamak için. yığınlar derinliği mozaik her görüntüde Pial yüzeyinden başlayarak, tipik olarak 250 mm. </li><li> mikroskop fareyi çıkarmadan önce, bir resim çekmek veya görüntüleme alanının gelecekteki yerini değiştirmesi için pial damarsal bir elle çizilmiş 2D harita yapmak. </li></ol> 4. Kurtarma ve Yeniden görüntüleme <ol><li> altında kafatası tutarken çekiş uygulayarak kafa monte aygıtı kaldırın. Herhangi bir tutkal kafatası ya da deriye takılı kalırsa, ince forseps ile dikkatlice kazıyın. derisini dikin ve ev kafesine dönmeden önce anestezi kurtarma izlemek için ısıtılmış bir kafes içinde fare yerleştirin. sütür topikal antibiyotik krem ​​sürün ve ketoprofen enjekte (2.5 mg / kg) IP 2 gün sonra. </li><li> Tekrarlayın 1.1 tekrarlanan görüntüleme oturumları için 2.5 için yineleyin. Gerekirse, görüntünün en iyi kaliteyi sağlamak için bir mikrocerrahi bıçak ile kemik tıraş. NOT: görüntüleme oturumları arasındaki aralık bir aydan daha uzun olduğunda diş matkap ile ek inceltme gerekli olabilir. </li><li> önceki oturumda (adım 3.6) alınan pial damarların 2B haritasına göre epifluorescent ışık kullanarak mikroskop altında fare yerleştirin. </li><li> İki foton lazer tarama başlatın ve adım 3.4 &#39;de elde edilen 3 boyutlu harita kullanarak mikrometre ölçekte uyum sağlanması için mikroskop sahne ayarlayın. Adım 3.5 anlatıldığı gibi ayrıntılı görüntüleme geçin. </li></ol> 5. Post-satın alma Üç boyutlu İmar ve Görüntü Analizi <ol><li> Üç boyutlu damarların rekonstrüksiyon ve Imaris olarak 3D görüntü analiz yazılımı kullanarak amiloid birikimlerinin (sürüm 8.0 ve 7.7.2 kullanılan) edinin. </li&gt; <li> Görüntü yığını bütün derinliği iki kanal ideal kontrast elde etmek için görüntü işleme menüsü ve kontrast değişikliği alt menüsünde Normale Katman eklentisi kullanın. </li><li> Aynı anda tüm zaman noktalarında aynı bölgeden görüntüleri açın ve her zaman farklı zaman noktalarında karşılaştırmak amacıyla paralel olarak bunları işlemek. </li><li> Filament izleyici modülü kullanılarak iz gemiler. <ol><li> Yeni bir filaman oluşturmak için Filament simgesine tıklayın otomatik izleyici atlamak ve otomatik yol yöntemini seçin. </li><li> Seçilen kanal damar görüntü ve işaretçi seçin fonksiyonunu kullanarak karşılık emin olun, bir başlangıç ​​noktası belirlemek için shift + kontrol tuşlarını tutarken görüntüleme oturumları arasında muhafaza edilir bir gemi bifürkasyonunda tıklayın. işaretçi seçme işlevini kullanın ve filamentler bitiş noktalarını seçmek için shift tuşuna basılı tutarken tıklatın. Not: obtai karşılaştırılmasıned iskeletler damarların yapısal değişiklikler gösterecektir. </li></ol></li><li> Yeni plaklar izlemek için uçak analizi ile uçağı gerçekleştirin. Aβ plaklar büyümesini izlemek için mavi kanala yüzey modülünü uygulayın. Yeni bir yüzey oluşturmak ve otomatik yüzey oluşturma ile devam etmek yüzey simgesini tıklayın. ayarlamak ve arka plan sinyalini çıkarmak için eşikleme yöntemi kullanın. istatistik menüsü bireysel amiloid birikintilerinin yüzeyine veri göreli sağlar. </li></ol>

<ol>
	<li>Harb, R., Whiteus, C., Freitas, C., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+cerebral+microvascular+plasticity+from+birth+to+death.">In vivo imaging of cerebral microvascular plasticity from birth to death.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 33 (1), 146-156 (2013).</li><li>Whiteus, C., Freitas, C., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perturbed+neural+activity+disrupts+cerebral+angiogenesis+during+a+postnatal+critical+period.">Perturbed neural activity disrupts cerebral angiogenesis during a postnatal critical period.</a> Nature. 505 (7483), 407-411 (2014).</li><li>Masamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+sprouting,+extension,+and+creation+of+new+capillary+connections+with+adaptation+of+the+neighboring+astrocytes+in+adult+mouse+cortex+under+chronic+hypoxia.">Microvascular sprouting, extension, and creation of new capillary connections with adaptation of the neighboring astrocytes in adult mouse cortex under chronic hypoxia.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 34 (2), 325-331 (2014).</li><li>Marchi, N., Lerner-Natoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrovascular+remodeling+and+epilepsy.">Cerebrovascular remodeling and epilepsy.</a> Neuroscientist. 19 (3), 304-312 (2013).</li><li>Giannoni, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrovascular+pathology+during+the+progression+of+experimental+Alzheimer's+disease.">Cerebrovascular pathology during the progression of experimental Alzheimer's disease.</a> Neurobiol Dis. 88, 107-117 (2016).</li><li>Kimbrough, I. F., Robel, S., Roberson, E. D., Sontheimer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+amyloidosis+impairs+the+gliovascular+unit+in+a+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Vascular amyloidosis impairs the gliovascular unit in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Brain. 138 (Pt 12), 3716-3733 (2015).</li><li>Herzig, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abeta+is+targeted+to+the+vasculature+in+a+mouse+model+of+hereditary+cerebral+hemorrhage+with+amyloidosis.">Abeta is targeted to the vasculature in a mouse model of hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis.</a> Nat Neurosci. 7 (9), 954-960 (2004).</li><li>Oakley, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraneuronal+beta-amyloid+aggregates,+neurodegeneration,+and+neuron+loss+in+transgenic+mice+with+five+familial+Alzheimer's+disease+mutations:+potential+factors+in+amyloid+plaque+formation.">Intraneuronal beta-amyloid aggregates, neurodegeneration, and neuron loss in transgenic mice with five familial Alzheimer's disease mutations: potential factors in amyloid plaque formation.</a> J Neurosci. 26 (40), 10129-10140 (2006).</li><li>Liston, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+glucocorticoid+oscillations+promote+learning-dependent+synapse+formation+and+maintenance.">Circadian glucocorticoid oscillations promote learning-dependent synapse formation and maintenance.</a> Nat Neurosci. 16 (6), 698-705 (2013).</li><li>Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice.">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nat Protoc. 5 (2), 201-208 (2010).</li><li>Klunk, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Abeta+plaques+in+living+transgenic+mice+with+multiphoton+microscopy+and+methoxy-X04,+a+systemically+administered+Congo+red+derivative.">Imaging Abeta plaques in living transgenic mice with multiphoton microscopy and methoxy-X04, a systemically administered Congo red derivative.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 61 (9), 797-805 (2002).</li><li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retro-orbital+injections+in+mice.">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab Anim (NY). 40 (5), 155-160 (2011).</li><li>Cao, V. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+imaging+of+experience-dependent+molecular+changes+in+cortical+neurons.">In vivo two-photon imaging of experience-dependent molecular changes in cortical neurons.</a> J Vis Exp. (71), (2013).</li><li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+term,+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">Long term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li><li>Heppner, F. L., Ransohoff, R. M., Becher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+attack:+the+role+of+inflammation+in+Alzheimer+disease.">Immune attack: the role of inflammation in Alzheimer disease.</a> Nat Rev Neurosci. 16 (6), 358-372 (2015).</li><li>Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thin-skull+window+technique+for+chronic+two-photon+in+vivo+imaging+of+murine+microglia+in+models+of+neuroinflammation.">A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation.</a> J Vis Exp. (43), (2010).</li><li>Joseph-Mathurin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+beta+immunization+worsens+iron+deposits+in+the+choroid+plexus+and+cerebral+microbleeds.">Amyloid beta immunization worsens iron deposits in the choroid plexus and cerebral microbleeds.</a> Neurobiol Aging. 34 (11), 2613-2622 (2013).</li><li>Sadowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+prion+amyloid+deposits+in+vivo.">Targeting prion amyloid deposits in vivo.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 63 (7), 775-784 (2004).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları var.

In vivo iki foton mikroskopi için açık kafatası tekniği büyük görüntüleme alanları 13,14 sınırsız görüntüleme oturumları avantajı sunuyor. Ancak, bu teknik, aynı zamanda ilgi 14 bölgede inflamasyon üreten, genellikle uyumsuz ya da etkileyen nöro-vasküler okuma-çıkışları 15. Aksine, inceltilmiş kafatası transkraniyal tekniği güvenilir serebrovasküler yapıların görüntüleme ve plak birikimini 10,14 sağlayan nöro-inflamasyon ile so...

Beyin damar anatomik ve fonksiyonel nöron elde etmek için bir çok hücreli yapıdır. Gemilerin dinamik yeniden şekillenme beyin gelişimi süresince ve merkezi sinir sistemi (MSS) 1,2 patolojilerin ilerlemesi sırasında oluşur. Yaygın serebrovasküler hasar Alzheimer hastalığı (AH), epilepsi dahil olmak üzere birçok CNS hastalıkları, travmatik beyin hasarının bir işaretidir ve 3,4 ensefalit olduğu kabul edilmektedir. Başlangıcından ve kronik evreye, MSS hastalıkları modelleme nedenle, in vivo serebrovasküler değişiklikleri izleme belirgin hale gelir. serebrovasküler değişiklikler genellikle nöronal hasar veya plastisite ile eşzamanlı meydana geldiğinde nöro-damar yapısının görüntüleme MSS hastalığı patofizyolojiye deşifre etmek önemli bir giriş noktasını temsil eder. Bu protokol, bir fare modelinde cerebrovasculature bir yenileme izlemek için uzunlamasına iki foton göre prosedürü anlatmaktadırAD nedeniyle amiloidojenik plak birikimi 5-7 büyük ve küçük kalibreli damarları serebrovasküler kusurları ile işaretlenmiş bir ilerici patoloji. Bu prosedür, hastalığın süresi boyunca nörovasküler yeniden ile ilgili amiloid birikintileri ve konum ve büyüme izleme olarak gösterebilir. Vital floresan boyalar transgenik AD fareler 8 cerebrovasculature ve amiloid plaklarının görüntülenmesi için her bir görüntüleme oturumundan önce enjekte edilir. Bir inceltilmiş kafatası transkranial pencereden bir ROI Mükerrer görüntüleme oturumları non-invaziv ve seçim yöntemi yaşayan fare beyninde 2,5,9,10 nörovasküler biçimlenme değerlendirmek için. Aşağıdaki prosedür cerrahi protokol, görüntü toplama ve işleme özetliyor. çoğunlukla büyük leptomeningeal ve delici arteriyollerde serebral amiloid anjiyopati (CAA) erken ilerlemesi karakterizedir.

<table><tbody><tr><td>methoxy-X04</td><td>tocris</td><td>4920</td><td>use 10 mg/kg</td></tr><tr><td>FITC-Dextran 70 Kda</td><td>sigma</td><td>46945</td><td>use 100 mg/kg</td></tr><tr><td>gelfoam/Bloxang</td><td>Bausch and Lomb</td><td></td><td></td></tr><tr><td>micorsurgical blade</td><td>surgistar</td><td>6900</td><td>must be sharp and not dented</td></tr><tr><td>povidone-iodine</td><td>betadine</td><td></td><td>antisceptic solution</td></tr><tr><td>binocular stereomicroscope</td><td>olympus</td><td>SX10</td><td>optimal image contrast is crucial for this procedure</td></tr><tr><td>2-photon microscope</td><td>zeiss</td><td></td><td>Zeiss LSM 710mp</td></tr><tr><td>fine scissors-toughcut</td><td>Fine science tools</td><td>14058-09</td><td>this scissors are optimized for cutting skin and soft tissue</td></tr></tbody></table>

longitudinal in vivo imaging of the cerebrovasculature: relevance to cns diseases

beynin damarsal Tadilat beyin patolojileri ortak bir özelliktir. In vivo görüntüleme teknikleri serebrovasküler plastisite veya hasar fazla mesai meydana gelen ve nöronal aktivitenin ya da kan akışına ilişkin tespit etmek esastır. In vivo iki foton mikroskopi yaşam beyinde büyük hücresel birimlerinin yapısal ve fonksiyonel plastisite çalışma sağlar. Özellikle, inceltilmiş-kafatası pencere hazırlama önemli beyin iltihabı neden olmadan faiz (ROI) kortikal bölgelerinde görselleştirme sağlar. kortikal ROI Tekrarlanan görüntüleme oturumları çok sayıda CNS hastalıklarının ilerlemesi sırasında zamanla hastalık işaretlerinden karakterizasyonu sağlayan mümkün bulunmaktadır. Beynin 250 um olan pial yapıları erişmek Bu teknik, genetik hücresel belirteçleri ve / veya vital boyaların tarafından kodlanan floresan probları tespitine dayanır. Ikinci (örneğin, floresan dekstranlar) Lumin eşlemek için kullanılırserebrovasküler yapıların al bölmesi. Burada tarif edilen protokole Germane Alzheimer hastalığı (AD) ilerlemesini değerlendirmek için amiloid birikintilerinin in vivo işaretleyici, metoksi-O4, kullanılmasıdır. Biz de vasküler değişiklikleri ve amiloid birikimlerinin izlemek için kullanılan alım sonrası görüntü işleme açıklar. AD model üzerinde halen odaklanarak, açıklanan protokol patolojik serebrovasküler değişiklikler meydana diğer merkezi sinir sistemi bozukluklarına alakalı.

Bu protokol, cerebrovasculature ve amiloid birikintileri mesai görüntülenmesi için bir yöntemi tarif etmektedir. Floresan boyalar amiloid birikimlerinin (metoksi-XO4) 11 etiketlemek için ve serebrovasküler lümen (FITC Dextran) 1 doldurmak için enjekte edildi. 3D görüntü analiz yazılım modülleri ardışık zaman noktalarında çekilen görünümü sabit bir alanının 3D görüntüler oluşturmak için kullanıldı. Temsilcisi görüntüleri 5XFAD fare...

Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases at JoVE.com

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

Bu yazının uzunlamasına iki foton mikroskopi kullanılarak in vivo amiloid plak birikimi sırasında cerebrovasculature bir biçimlenme izlemek için bir yordam açıklanır. Incelmiş kafatası preparat, Alzheimer hastalığının bir fare modelinde serebrovasküler hasara ilerlemesini değerlendirmek için floresan boyalar görselleştirme sağlar.

uzunlamasına<em&gt; İn Vivo</em&gt; Cerebrovasculature Görüntüleme: MSS Hastalıkları uygunluk

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular ...

longitudinal-vivo-imaging-cerebrovasculature-relevance-to-cns

Research

JoVE Journal

Medicine

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

7.0K Görüntüleme.  Institute of Functional Genomics.  Bu yazının uzunlamasına iki foton mikroskopi kullanılarak in vivo amiloid plak birikimi sırasında cerebrovasculature bir biçimlenme izlemek için bir yordam açıklanır. Incelmiş kafatası preparat, Alzheimer hastalığının bir fare modelinde serebrovasküler hasara ilerlemesini değerlendirmek için floresan boyalar görselleştirme sağlar. 

Video: Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

Yeni Bir Yüksek çözünürlüklü<em&gt; In vivo</emTümör Büyüme ve Tedavi için İntrakranial Yapıların Dinamik Tepki Eğitim&gt; Görüntüleme Tekniği

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Tıp

Non-invasive Parenchymal, Vascular and Metabolic High-frequency Ultrasound and Photoacoustic Rat Deep Brain Imaging

Photoacoustics and high frequency ultrasound stands out as powerful tools for neurobiological applications enabling high-resolution imaging on the central nervous system of small animals. However, transdermal and transcranial neuroimaging is frequently affected by low sensitivity, image aberrations and loss of space resolution, requiring scalp or even skull removal before imaging. To overcome this challenge, a new protocol is presented to gain significant insights in brain hemodynamics by photoacoustic and high-frequency ultrasounds imaging with the animal skin and skull intact. The procedure relies on the passage of ultrasound (US) waves and laser directly through the fissures that are naturally present on the animal cranium. By juxtaposing the imaging transducer device exactly in correspondence to these selected areas where the skull has a reduced thickness or is totally absent, one can acquire high quality deep images and explore internal brain regions that are usually difficult to anatomically or functionally describe without an invasive approach. By applying this experimental procedure, significant data can be collected in both sonic and optoacoustic modalities, enabling to image the parenchymal and the vascular anatomy far below the head surface. Deep brain features such as parenchymal convolutions and fissures separating the lobes were clearly visible. Moreover, the configuration of large and small blood vessels was imaged at several millimeters of depth, and precise information were collected about blood fluxes, vascular stream velocities and the hemoglobin chemical state. This repertoire of data could be crucial in several research contests, ranging from brain vascular disease studies to experimental techniques involving the systemic administration of exogenous chemicals or other objects endowed with imaging contrast enhancement properties. In conclusion, thanks to the presented protocol, the US and PA techniques become an attractive noninvasive performance-competitive means for cortical and internal brain imaging, retaining a significant potential in many neurologic fields.

The present work describes a new protocol to perform non-invasive high-frequency ultrasound and photoacoustic based imaging on rat brain, to efficiently visualize deep subcortical regions and their vascular patterns by directing signals on skull foramina naturally present on animal cranium.

Non-invaziv parankim, Vasküler ve Metabolik Yüksek frekanslı ultrason ve foto akustik Sıçan Derin Beyin Görüntüleme

Photoacoustics and high frequency ultrasound stands out as powerful tools for neurobiological applications enabling high-resolution imaging on the central ...

Nörobilim

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic neuroinflammatory state within the central nervous system (CNS), thought to be driven principally by virally-mediated activation of microglia and brain resident macrophages. HIV-1 infection is also accompanied by changes in cerebrovascular blood flow (CBF), raising the possibility that HIV-associated chronic neuroinflammation may lead to changes in CBF and/or in cerebral vascular architecture. To address this question, we have used a mouse model for HIV-induced neuroinflammation, and we have tested whether long-term exposure to this inflammatory environment may damage brain vasculature and result in rarefaction of capillary networks. In this paper we describe a method to quantify changes in cortical capillary density in a mouse model of neuroinflammatory disease (HIV-1 Tat transgenic mice). This generalizable approach employs in vivo two-photon imaging of cortical capillaries through a thin-skull cortical window, as well as ex vivo two-photon imaging of cortical capillaries in mouse brain sections. These procedures produce images and z-stack files of capillary networks, respectively, which can be then subjected to quantitative analysis in order to assess changes in cerebral vascular architecture.

This paper describes a method by which the vascular architecture in the brain can be quantified using in vivo and ex vivo two-photon microscopy.

HIV kaynaklı Nöroinflamasyondan bir Fare Modeli İki foton Mikroskop kullanarak Serebral Vasküler Mimarlık Niceleme

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Focal cerebral ischemia (i.e., ischemic stroke) may cause major brain injury, leading to a severe loss of neuronal function and consequently to a host of motor and cognitive disabilities. Its high prevalence poses a serious health burden, as stroke is among the principal causes of long-term disability and death worldwide1. Recovery of neuronal function is, in most cases, only partial. So far, treatment options are very limited, in particular due to the narrow time window for thrombolysis2,3. Determining methods to accelerate recovery from stroke remains a prime medical goal; however, this has been hampered by insufficient mechanistic insights into the recovery process. Experimental stroke researchers frequently employ rodent models of focal cerebral ischemia. Beyond the acute phase, stroke research is increasingly focused on the sub-acute and chronic phase following cerebral ischemia. Most stroke researchers apply permanent or transient occlusion of the MCA in mice or rats. In patients, occlusions of the MCA are among the most frequent causes of ischemic stroke4. Besides proximal occlusion of the MCA using the filament model, surgical occlusion of the distal MCA is probably the most frequently used model in experimental stroke research5. Occlusion of a distal (to the branching of the lenticulo-striate arteries) MCA branch typically spares the striatum and primarily affects the neocortex. Vessel occlusion can be permanent or transient. High reproducibility of lesion volume and very low mortality rates with respect to the long-term outcome are the main advantages of this model. Here, we demonstrate how to perform a chronic cranial window (CW) preparation lateral to the sagittal sinus, and afterwards how to surgically induce a distal stroke underneath the window using a craniotomy approach. This approach can be applied for sequential imaging of acute and chronic changes following ischemia via epi-illuminating, confocal laser scanning, and two-photon intravital microscopy.

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Surgical occlusion of a distal middle cerebral artery branch (MCAo) is a frequently used model in experimental stroke research. This manuscript describes the basic technique of permanent MCAo, combined with the insertion of a lateral cranial window, which offers the opportunity for longitudinal intravital microscopy in mice.

Yanal Kronik Kranial Pencere Hazırlık sağlar<em&gt; İn Vivo</em&gt; Farelerde Distal Orta Serebral Arter Tıkanıklığı takiben Gözlem

Focal cerebral ischemia (i.e., ischemic stroke) may cause major brain injury, leading to a severe loss of neuronal function and consequently to a host of ...

Simultaneous Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Light Scattering Properties of the In Vivo Rat Brain Using Multispectral Diffuse Reflectance Imaging

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional multispectral diffuse reflectance imaging system. This system is constructed from a broadband white light source, a motorized filter wheel with a set of narrowband interference filters, a light guide, a collecting lens, a video zoom lens, and a monochromatic charged-coupled device (CCD) camera. An ellipsoidal cranial window is made in the skull bone of a rat under isoflurane anesthesia to capture in vivo multispectral diffuse reflectance images of the cortical surface. Regulation of the fraction of inspired oxygen using a gas mixture device enables the induction of different respiratory states such as normoxia, hyperoxia, and anoxia. A Monte Carlo simulation-based multiple regression analysis for the measured multispectral diffuse reflectance images at nine wavelengths (500, 520, 540, 560, 570, 580, 600, 730, and 760 nm) is then performed to visualize the two-dimensional maps of hemodynamics and the light scattering properties of the in vivo rat brain.

Simultaneous Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Light Scattering Properties of the In Vivo Rat Brain Using Multispectral Diffuse Reflectance Imaging

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional multispectral diffuse reflectance imaging system.

Serebral Hemodinamiğin ve Işık Saçılımının Eşzamanlı Değerlendirilmesi<em&gt; In Vivo</emÇokspektrumlu yaygın reflektans ımaging&#39;i kullanarak&gt; Sıçan Beyin

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional ...

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues throughout the acute injury phase. In fact, endothelial cells appear to be the first to die after a contusive SCI. The early vascular events, including increased permeability of the blood-spinal cord barrier (BSCB), induce vasogenic edema and contribute to detrimental secondary injury events caused by complex injury mechanisms. Targeting the vascular disruption, therefore, could be a key strategy to reduce secondary injury cascades that contribute to histological and functional impairments after SCI. Previous studies were mostly performed on postmortem samples and were unable to capture the dynamic changes of the vascular network. In this study, we have developed an in vivo duo-color two-photon imaging method to monitor acute vascular dynamic changes following contusive SCI. This approach allows detecting blood flow, vessel diameter, and other vascular pathologies at various sites of the same rat pre- and post-injury. Overall, this method provides an excellent venue for investigating vascular dynamics.

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

We introduce an in vivo imaging method using two different fluorescent dyes to track dynamic spinal vascular changes following a contusive spinal cord injury in adult Sprague-Dawley rats.

İçinde bir Vivo Vasküler Dynamics Contusive Medulla Spinalis Yaralanmalarında takip görüntüleme için duo-renk yöntemi

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

Precise Brain Mapping to Perform Repetitive In Vivo Imaging of Neuro-Immune Dynamics in Mice

The central nervous system (CNS) is regulated by a complex interplay of neuronal, glial, stromal, and vascular cells that facilitate its proper function. Although studying these cells in isolation in vitro or together ex vivo provides useful physiological information; salient features of neural cell physiology will be missed in such contexts. Therefore, there is a need for studying neural cells in their native in vivo environment. The protocol detailed here describes repetitive in vivo two-photon imaging of neural cells in the rodent cortex as a tool to visualize and study specific cells over extended periods of time from hours to months. We describe in detail the use of the grossly stable brain vasculature as a coarse map or fluorescently labeled dendrites as a fine map of select brain regions of interest. Using these maps as a visual key, we show how neural cells can be precisely relocated for subsequent repetitive in vivo imaging. Using examples of in vivo imaging of fluorescently-labeled microglia, neurons, and NG2+ cells, this protocol demonstrates the ability of this technique to allow repetitive visualization of cellular dynamics in the same brain location over extended time periods, that can further aid in understanding the structural and functional responses of these cells in normal physiology or following pathological insults. Where necessary, this approach can be coupled to functional imaging of neural cells, e.g., with calcium imaging. This approach is especially a powerful technique to visualize the physical interaction between different cell types of the CNS in vivo when genetic mouse models or specific dyes with distinct fluorescent tags to label the cells of interest are available.

This protocol describes a chronic cranial window implantation technique that can be used for longitudinal imaging of neuro-glio-vascular structures, interactions, and function in both healthy and diseased conditions. It serves as a complementary alternative to the transcranial imaging approach that, while often preferred, possesses some critical limitations.

Farelerde Nöro-İmmün Dinamiğin Vivo Görüntülemesinde Tekrarlayan Performans için Hassas Beyin Haritalaması

The central nervous system (CNS) is regulated by a complex interplay of neuronal, glial, stromal, and vascular cells that facilitate its proper function. ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and magnetic resonance imaging (MRI) have enabled in vivo quantification of CSF flow but they are limited by reduced imaging volumes and low spatial resolution, respectively. Recent work has found that CSF enters the brain parenchyma through a network of perivascular spaces surrounding the pial and penetrating arteries of the rodent cortex. This perivascular entry of CSF is a primary driver of the glymphatic system, a pathway implicated in the clearance of toxic metabolic solutes (e.g., amyloid-&#946;). Here, we illustrate a new macroscopic imaging technique that allows real-time, mesoscopic imaging of fluorescent CSF tracers through the intact skull of live mice. This minimally-invasive method facilitates a multitude of experimental designs and enables single or repeated testing of CSF dynamics. Macroscopes have high spatial and temporal resolution and their large gantry and working distance allow for imaging while performing tasks on behavioral devices. This imaging approach has been validated using two-photon imaging and fluorescence measurements obtained from this technique strongly correlate with ex vivo fluorescence and quantification of radio-labeled tracers. In this protocol, we describe how transcranial macroscopic imaging can be used to evaluate glymphatic transport in live mice, offering an accessible alternative to more costly imaging modalities.

Transcranial optical imaging allows wide-field imaging of cerebrospinal fluid transport in the cortex of live mice through an intact skull.

İçinde vivo beyin omurilik akışkan taşınması floresan Makroskopisi kullanarak bozulmamış fare kafatası aracılığıyla görüntüleme

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...

Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and cardiac arrest are remarkably sexually dimorphic diseases, and both induce cerebral ischemia. However, progress in understanding the vascular cognitive impairment, and then developing sex-specific treatments, has been partly limited by challenges in investigating the brain microcirculation from mouse models in functional studies. Here, we present an approach to examine the capillary-to-arteriole signaling in an ex vivo hippocampal capillary-parenchymal arteriole (HiCaPA) preparation from mouse brain. We describe how to isolate, cannulate, and pressurize the microcirculation to measure arteriolar diameter in response to capillary stimulation. We show which appropriate functional controls can be used to validate the HiCaPA preparation integrity and display typical results, including testing potassium as a neurovascular coupling agent and the effect of the recently characterized inhibitor of the Kir2 inward rectifying potassium channel family, ML133. Further, we compare the responses in preparations obtained from male and female mice. While these data reflect functional investigations, our approach can also be used in molecular biology, immunochemistry, and electrophysiology studies.

The present manuscript details how to isolate hippocampal arterioles and capillaries from the mouse brain and how to pressurize them for pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.

Fonksiyonel Çalışma için Ex Vivo Basınçlı Hipokampal Kapiller-Parenkimal Arteriyol Hazırlığı

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and ...

In Vivo Fiber-Coupled Pre-Clinical Confocal Laser-scanning Endomicroscopy (pCLE) of Hippocampal Capillaries in Awake Mice

The goal of this protocol is to describe fiber-optic-bundle-coupled pre-clinical confocal laser-scanning endomicroscopy (pCLE) in its specific application to elucidate capillary blood flow effects during seizures, driven by mural cells. In vitro and in vivo cortical imaging have shown that capillary constrictions driven by pericytes can result from functional local neural activity, as well as from drug application, in healthy animals. Here, a protocol is presented on how to use pCLE to determine the role of microvascular dynamics in neural degeneration in epilepsy, at any tissue depth (specifically in the hippocampus). We describe a head restraint technique that has been adapted to record pCLE in awake animals, to address potential side-effects of anesthetics on neural activity. Using these methods, electrophysiological and imaging recordings can be conducted over several hours in deep neural structures of the brain.

In Vivo Fiber-Coupled Pre-Clinical Confocal Laser-scanning Endomicroscopy pCLE of Hippocampal Capillaries in Awake Mice

Whereas multiphoton imaging is only effective at limited depths from the tissue&#8217;s surface, it is possible to achieve 3 &#181;m resolution imaging at any depth via pCLE. Here, we present a protocol to conduct pCLE imaging to measure microvascular dynamics in the hippocampus of ictal and wild-type mice.

Uyanık Farelerde Hipokampal Kılcal Damarların İn Vivo Fiber Bağlantılı Klinik Öncesi Konfokal Lazer Taramalı Endomikroskopisi (pCLE)

The goal of this protocol is to describe fiber-optic-bundle-coupled pre-clinical confocal laser-scanning endomicroscopy (pCLE) in its specific application ...

uzunlamasına

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Yeni Bir Yüksek çözünürlüklü