Biz embriyo izolasyon tavsiyeleri için Tal Nawy ve Martin Bayer teşekkür etmek istiyorum. MTR, VG, UG ve CB embriyo izolasyon ekipman geliştirmiştir. MTR, VG ve CB embriyo izolasyon protokolü geliştirdi. MTR, VG ve CB, protokol kurulan embriyolar izole ve oluşturulan embriyo cDNA, VG PCR, MTR GUS boyama, JJ FISH deneyler yaptı. MTR, VG, CG ve UG el yazması yazdı. Bu çalışma Zürih Üniversitesi, Roche Araştırma Vakfı (mtr) bir Bursu ve İsviçre Ulusal Vakfı (UG ve CB) hibe tarafından finanse edildi.

Bu prosedür, Şekil 1&#39;de gösterilen akış şeması özetlenmiştir. Mikrokapilerler ve etkili kurulum Şekil 2 ve Şekil 3&#39;te gösterilmiştir, ve embriyo izolasyon tipik aşamalar, Şekil 4 &#39;de gösterilmiştir. 1. Gereç ve Tampon Hazırlanması Cam mikrokapilerler 1.1 silikon kaplama <ol><li> Sigmacote (Sigma) ~ 5 ml, 15 ml Falcon tüp mikrokapilerler yerleştirin ve birkaç kez ters çevirin. </li><li> Çözüm çıkarın, 60 ° C de bir alüminyum folyo ile kılcal içeren Falcon tüp yerleştirin ve 3 saat için onları fırında Oda sıcaklığında saklayın. </li></ol> 1.2 ~ 50-100 mikron çaplı microcapillary ipuçları elde <ol><li> El ile bir Bunsen beki üzerinden veya ticari bir çektirmesi (dikey filament çektirmenin veya mikropipet çektirmenin) kullanarak ya 1 mm çaplı cam kılcal çekin. </li><li> Bir elmas kullanınuçlu kalem veya istediğiniz açılış oluşturmak için çekti kılcal ucu kesmek için bıçak. , Bir stereo mikroskop altında iyi şeklinde kılcal seçin. Açılış 50-100 mikron (Şekil 2) olması gerekmektedir. </li></ol> 1.3 Slayt hazırlanması <ol><li> 5 dakika boyunca Sigmacote (~ 1 ml / slayt) ile tüm kuyuları kaplayarak temiz slaytlar Siliconize, kaldırın. Alüminyum folyo ile fırında, 3 saat. Oda sıcaklığında saklayın. </li><li> % 10 SDS, nükleaz içermeyen su içinde 2 x 2 dakika (DEPC GKD 2 O otoklavlanmış),% 70 etanol içinde 2 dakika,% 100 etanol içinde 2 dakika, 10 dakika süreyle çok iyi bir cam mikroskop lamları yıkayın hava kurulayın. Tüm adımlar otoklavlanmış Coplin kavanoz içinde yapılır. Slaytlar her kullanımı arasında kapsamlı bir temizlik sağlayan birden çok kez yeniden kullanılabilir. </li><li> Hemen önce embriyo izolasyon yayılmasına ~ 10 0.5 ul mg / ml sığır serum albümin (BSA) her iyi ve hava-kuru tüm yüzey üzerinde bir pipet ile. </li></ol> 1.4 Mikroskop ve kılcal kurulum &lt;ol&gt; <li> 10x ve 20x büyütme hedefi ile ters bir mikroskop kullanın. Işık kontrast Optimize (embriyo oldukça şeffaf). </li><li> Mikroskop yanında kılcal cam tutmak için bir micromanipulator yerleştirin. Kılcal cam bir lastik tüp ile bir mikroenjektör (Şekil 3A) veya düzenli P-200 pipet bağlı (Şekil 3B, bu kurulum ayrıntılı bir açıklama için Tartışma bakınız). </li><li> Bir ~ 70 ° &#39;lik açıyla mikroskop lamı (Şekil 3) üzerinde kılcal yerleştirin ve görüş alanında açılması için konumunu ayarlamak. </li><li> Hemen önce embriyo izolasyon kadar sürebilir ve bırakın ~ 5-10 ul BSA (1 mg / ml) kat kılcal için. </li></ol> 1.5 Tamponlar Tablo 1, alt uygulamalara bağlı olarak izolasyon ve hedef tampon listeler. <ol><li> ~ Örnek başına 1 ml izolasyon tampon taze önce kullanmak ve buz üzerinde tutmak hazırlayın. </li><li> Buz (moleküler uygulamaları) ya da bir nemli odasında bir mikroskop lamı (sitolojik uygulamaları) bir 0.5 ml Eppendorf düşük bağlayıcı tüp hedef tampon hazırlayın. </li></ol> 2. Tohum Diseksiyon ve Embriyo Ekstraksiyon Tohum Geliştirme 2.1 Senkronizasyon <ol><li class="jove_content"> Çiçek erkekleştirmek ve diğer çiçeklerle maruz pistils temas kaçınarak onları iklim odasında 2 gün tutmak, sonra onları (örneğin 11) tozlaşmak. </li><li class="jove_content"> Temizlenir tohumların mikroskobik inceleme ile sizin büyüme koşullarında geliştirme aşamasında test edin. 4 DAP küresel vermiştir - büyüme koşullarına tohumları (DAP) tozlaşma sonra 2.5 gün toplanan (21 16 saat ışık ° C, 18 karanlık 8 saat ° C ve% 70 nem) özellikle 2-4 hücreli embriyo ve tohum 3,5 toplanan vermiştir embriyolar. </li></ol> 2.2 Tohum Diseksiyon ve Kopma <ol><li> S çıkarınforseps ve insülin iğneleri ile bir stereo mikroskop altında 10-15 meyvaları (~ 2.5 DAP) den eeds. </li><li> Buz üzerine yerleştirilir, 2 ml lik yuvarlak dipli Eppendorf tüp içinde 20 ul tampon içinde izolasyon tohum daldırın. </li><li> Yavaşça çekirdeği özütü bulutlu hale gelene kadar embriyo serbest bırakmak için bir plastik havaneli (DEPC GKD 2 O ile çalkalandı,% 10 SDS ile önceden temizlenmiş ve% 70 etanol ile yıkanmış) ile tohum kırmaktadır. Uygulamak için kuvvet deneme üzerine her kullanıcı tarafından belirlenecektir. </li><li> Havaneli yıkayın ve örnek sulandırmak için izolasyon tampon 300 ul ile havan eli durulayın. </li><li> Spin-aşağı 5 saniye için 5000 xg özü. Yavaşça yukarı ve aşağı 2-3 kez pipetleme pelet özü tekrar süspansiyon. </li><li> 30 mikron naylon örgü (PartecCelltricks gelen örneğin, tüp adaptörler monte) ile süzülür. Ek bir 200 ul izolasyon tamponu ile örgü durulayın. </li></ol> 3. Embriyo İzolasyon 3.1 Slayt hazırlanması <ol> &lt;li&gt; Yeri ters mikroskop sahnede temiz, BSA ile kaplanmış ve silikonlu çok iyi slayt, yukarı ve aşağı yavaşça pipetleme filtre çekirdeği ekstresi tekrar süspansiyon ve 1 veya 2 kuyulara 40-50 ul çekirdeği ekstresi 2 damlacıkları pipetle . Aynı anda sadece 1 veya 2 damla Eleme örnek buharlaşmasını önler. </li><li> Daha önce olduğu gibi hazırlanan farklı bir slayt iyi taze izolasyon tampon Sıra 50 ul (1. yıkama damla). Buharlaşmasını önlemek için üstü kapalı, nemli odasında bu slayt tutun. </li></ol> 3.2 Ekran, temiz, toplamak <ol><li> 10x büyütme amacı ile istenilen aşamada embriyo için çekirdeği ekstresinin damlacıkları ekran. Gerekirse, 20x büyütme ile sahne onaylayın. Embriyolar genellikle slayt dibine çöker. </li><li> Manuel bir tungsten iğne, bir insülin iğne veya benzeri ekipman ile embriyo etrafında pislikleri temizleyin. </li><li> Mikromanipülatör, t kullanarak embriyo yakın kılcal cam taşıyınmümkün olduğu kadar az çözüm olarak ile embriyo kadar AKE. </li><li> Birkaç embriyolar (örneğin tek bir damlacık) toplamak ve 1. yıkama damla (moleküler uygulama) veya hedef tamponu (sitolojik uygulamaları) bunları bırakın. Her toplama yuvarlak az hacmi (tüm toplama mermi toplam hacmi &lt;5 ul olmalıdır) toplanmalıdır 5-10 dakika ve embriyoların içinde tutulmalıdır. </li><li> Embriyoların istenilen miktarda (merkezi, mümkünse, hatırlama kolaylaştırmak için) 1. yıkama damla toplanan kadar tarama ve tahsilat tekrarlayın. </li><li> Yıkama damla (enkaz üzerinden yapılmaktadır eğer, hatırlama önce iğne ile bunları kaldırmak) için aynı anda tüm embriyolar hatırlamak. </li><li> 50 ul bir 2. yıkama damla içine embriyolar bırakın. 3.2.6 tekrarlayın. </li><li> Hedef tampon içinde embriyoların bırakın. Transfer kılcal ucu sadece bir kişi değil, daldırma, içermelidir. </li><li> Microcapil değiştirinBir sonraki örnek ları. </li></ol>

<ol>
	<li>Gehring, M., Bubb, K. L., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+demethylation+of+repetitive+elements+during+seed+development+underlies+gene+imprinting.">Extensive demethylation of repetitive elements during seed development underlies gene imprinting.</a> Science. 324, 1447-1451 (2009).</li><li>Muller, B., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinin+and+auxin+interaction+in+root+stem-cell+specification+during+early+embryogenesis.">Cytokinin and auxin interaction in root stem-cell specification during early embryogenesis.</a> Nature. 453, 1094-1097 (2008).</li><li>Gehring, M., Missirian, V., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analysis+of+parent-of-origin+allelic+expression+in+Arabidopsis+thaliana+seeds.">Genomic analysis of parent-of-origin allelic expression in Arabidopsis thaliana seeds.</a> PLoS One. 6, 23687-23 (2011).</li><li>Xiang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+reveals+gene+expression+and+metabolic+network+dynamics+during+embryo+development+in+Arabidopsis.">Genome-wide analysis reveals gene expression and metabolic network dynamics during embryo development in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 156, 346-356 (2011).</li><li>Nawy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GATA+factor+HANABA+TARANU+is+required+to+position+the+proembryo+boundary+in+the+early+Arabidopsis+embryo.">The GATA factor HANABA TARANU is required to position the proembryo boundary in the early Arabidopsis embryo.</a> Dev Cell. 19, 103-113 (2010).</li><li>Baroux, C., Pecinka, A., Fuchs, J., Schubert, I., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+triploid+endosperm+genome+of+Arabidopsis+adopts+a+peculiar,+parental-dosage-dependent+chromatin+organization.">The triploid endosperm genome of Arabidopsis adopts a peculiar, parental-dosage-dependent chromatin organization.</a> Plant Cell. 19, 1782-1794 (2007).</li><li>Autran, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+epigenetic+pathways+control+parental+contributions+to+Arabidopsis+early+embryogenesis.">Maternal epigenetic pathways control parental contributions to Arabidopsis early embryogenesis.</a> Cell. 145, 707-719 (2011).</li><li>Wohrmann, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+DNA+methylation-independent+imprinting+control+region+at+the+Arabidopsis+MEDEA+locus.">Identification of a DNA methylation-independent imprinting control region at the Arabidopsis MEDEA locus.</a> Genes Dev. 26, 1837-1850 (2012).</li><li>Raissig, M. T., Baroux, C., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+Flexibility+of+Genomic+Imprinting+during+Seed+Development.">Regulation and Flexibility of Genomic Imprinting during Seed Development.</a> Plant Cell. 23, 16-26 (2011).</li><li>Rea, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+DNA+methylation+of+imprinted+genes+in+Arabidopsis+endosperm.">Determination of DNA methylation of imprinted genes in Arabidopsis endosperm.</a> J. Vis Exp. 47 (47), e2327 (2011).</li><li>Breuninger, H., Rikirsch, E., Hermann, M., Ueda, M., Laux, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+WOX+genes+mediates+apical-basal+axis+formation+in+the+Arabidopsis+embryo.">Differential expression of WOX genes mediates apical-basal axis formation in the Arabidopsis embryo.</a> Dev Cell. 14, 867-876 (2008).</li><li>Kohler, C., Page, D. R., Gagliardini, V., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+thaliana+MEDEA+Polycomb+group+protein+controls+expression+of+PHERES1+by+parental+imprinting.">The Arabidopsis thaliana MEDEA Polycomb group protein controls expression of PHERES1 by parental imprinting.</a> Nature. 37, 28-30 (2005).</li><li>Fransz, P., De Jong, J. H., Lysak, M., Castiglione, M. R., Schubert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interphase+chromosomes+in+Arabidopsis+are+organized+as+well+defined+chromocenters+from+which+euchromatin+loops+emanate.">Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14584-14589 (2002).</li><li>Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+of+single+cells.">Transcriptome analysis of single cells.</a> J. Vis. Exp. (50), e2634 (2011).</li><li>Nodine, M. D., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+and+paternal+genomes+contribute+equally+to+the+transcriptome+of+early+plant+embryos.">Maternal and paternal genomes contribute equally to the transcriptome of early plant embryos.</a> Nature. 482 (7383), (2012).</li><li>Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A., Bevan, M. W. G. U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fusions:+beta-glucuronidase+as+a+sensitive+and+versatile+gene+fusion+marker+in+higher+plants.">fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants.</a> EMBO J. 6, 3901-3907 (1987).</li><li>Schmidt, A., W&#246;hrmann, H., Raissig, M. T., Arand, J., Gheyselinck, J., Gagliardini, V., Heichinger, C., Walter, J., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Polycomb+group+protein+MEDEA+and+the+DNA+methyltransferase+MET1+interact+in+Arabidopsis+to+repress+autonomous+endosperm+development.">The Polycomb group protein MEDEA and the DNA methyltransferase MET1 interact in Arabidopsis to repress autonomous endosperm development.</a> Plant J. 73 (5), (1111).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Biz etkili, hızlı bir embriyo izolasyon protokolü geliştirilmiş ve kolayca diğer laboratuarlara transfer edilebilir. Burada tanımlanan cihaz, bir ters mikroskop, bir mikromanipülatör, cam mikrokapilerler, dikey bir filaman çektirme ve mikroenjektör (Şekil 3A) oluşur. Kurulum transkriptomik analizleri 17 için tek bir hayvan hücre izolasyonu için tarif edilen yönteme benzerdir. Biz de başarıyla cam mikrokapilerler elle bir alev gerilir (ve bir elm...

Çiçekli bitkiler embriyo endosperm, ikinci bir gübreleme olay türetilen bir besleyici doku ile çevrilidir. Her ikisi de, embriyo ve endosperm çekirdek katının birkaç hücre tabakası ile çevrilidir. Toplu bu dokuların meyve içinde geliştirmek bir tohum, oluşturur. Böylece doku ve Arabidopsis embriyoların hücre spesifik analizleri güçlü bir şekilde erişilememesi nedeniyle bozulmaktadır. Bununla birlikte, geç-küresel ya da geç aşamalarında embriyo nispeten iyi stereomicroscope altında ince tungsten iğneler kullanarak manuel diseksiyon için uygun, ya da onları ayıklamak için forseps kullanarak tohum hafif baskı uygulayarak vardır. Bu tür teknikler, başarılı bir şekilde transkriptomunun veya mikrodizi hibridizasyon, bisülfit dizileme veya RNA sekansları (örneğin, 1-3) Epigenom profil analizleri için kullanıldı. Buna karşılık, erken küresel sahneye zigot de embriyoların çalışmalar teknik olarak zor kalır. Bugüne kadar, sadece birkaç çalışma temsilcisi varsabit tohum bölüm 4 veya ince araçlar 5 ile tohum içinde tek tek embriyo el çekiminden embriyonik dokuların ya lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) kullanarak genç embriyolar üzerinde orted transcriptome analizleri. Ancak, LCM ekipman erken aşamalarında yaygın olarak bulunan ve manuel embriyo çıkarma değil zaman kolayca transfer edilemez mükemmel diseksiyonu becerileri tüketen ve gerektiren bir. Genom analizleri ek olarak, in situ gen ifade analizleri de Arabidopsis genç, tam monte edilen embriyoların gerçekleştirmek zordur. Bir dereceye kadar, genç embriyolar tohum hafif basınç ile mikroskop slaytlar yayınlanacak ve (örneğin 6,7 bakınız) immün tarafından bildirici gen deneylerinden veya protein tespiti için kullanılır. Bu teknik, ancak, bu nedenle kantitatif analizleri engelleyen, yüksek verimli embriyo izolasyon izin vermez. Bu nedenle, etkin ve hızlı bir protokol geliştirdi, kolay transfer, ve alt çeşitli uygulamalar için uygun kurmak için basit Arabidopsis tohum erken embriyo izolasyonu için. Uygun bir izolasyon tampon plastik bir havan tokmağı kullanılarak bir Eppendorf tüpü içinde genç meyvalarda gelen parçalanmış - temel ilkesi, yavaşça tohum ezmek için. Tohum ekstresi, çok oyuklu slayt damlalar halinde yerleştirilir ve bir ters mikroskop kullanılarak istenen aşamada serbest embriyoların varlığı için taranır. Embriyolar bir cam mikroenjektör veya standart laboratuvar pipet bağlı microcapillary kullanılarak toplanır. Moleküler uygulamalar için, embriyo az hacimde hedef tampon aktarmadan önce yeni izolasyon tampon damla içine tekrarlanan serbest iki kez yıkanır. Sitolojik uygulamaları (muhabiri deneyleri, immün, FISH) için, yıkama adımları atlanabilir. Bu yöntem çeşitli avantajlar sunmaktadır: (i) sitolojik uygulaması için ~ 45 dakika içinde 25-40 embriyolar üretirmoleküler uygulamaları (yıkama adımları dahil) Dokümanında veya 3-4 saat içinde, (ii) bu özel embriyonik aşamalarında izolasyonu, (iii) (iv), kolayca basit ayarları nedeniyle diğer kişi ve laboratuarlar için devredilemez sağlar , yükseltmeleri için uygun olan temel kurulum için uygun ekipman gerektirir, ve (v) başarıyla bu RNA sıralama 8, gen-spesifik DNA-metilasyon analizi 9, muhabiri testleri (10 ve Raissig ve ark. gibi çeşitli alt uygulamalar için kullanıldı olarak hazırlık.) ve FISH (J. Jaenisch, U. Grossniklaus, C. Baroux yayınlanmamış,) bkz. Şekil 5.

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the Reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sigmacote</td>
 <td>SIGMA </td>
 <td>SL2-100 ml</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNAse OUT</td>
 <td>Invitrogen (life technologies)</td>
 <td>10777-019</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>First- strand buffer</td>
 <td>Invitrogen (life technologies)</td>
 <td>18064-022</td>
 <td>contained in Superscript II package</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DTT</td>
 <td>Invitrogen (life technologies)</td>
 <td>18064-022</td>
 <td>contained in Superscript II package</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bovine serum albumin (BSA) 100x =10 mg/ml </td>
 <td>New England Biolabs Inc.</td>
 <td></td>
 <td>Different suppliers will also work </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Thin wall Capillaries 1.0 mm</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>TW100F-4</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNA LoBind tube 0.5 ml</td>
 <td>Vaudaux-Eppendorf</td>
 <td>0030108.035</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CellTrics&Delta; 30 &mu;m</td>
 <td>PARTEC</td>
 <td>04-0042-2316</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5wells 10 mm diameter slides</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>63421-10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Formaldehyde Solution</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>F1635</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Superfrost Plus slide</td>
 <td>Thermo Fisher</td>
 <td>J1800AMNZ</td>
 <td>Menzel-Gl&auml;ser</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris</td>
 <td>Amaresco</td>
 <td>0497</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA</td>
 <td>Applichem</td>
 <td>A2937</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycin</td>
 <td>Fluka</td>
 <td>50050</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SDS pellets</td>
 <td>Roth</td>
 <td>CN30.3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micro Pestle</td>
 <td>VWR</td>
 <td>431-0094</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microfine insulin syringes</td>
 <td>BD</td>
 <td>U-100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DEPC</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D5758</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethanol</td>
 <td>Schaurlau</td>
 <td>ET00102500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Forceps N5</td>
 <td>Dumont</td>
 <td>0108-5</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bioanalyzer Pico Chip</td>
 <td>Agilent Technologies</td>
 <td>5067-1513</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Inverted microscope</td>
 <td>Nikon TMS (Japan),</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micromanipulator</td>
 <td>Leitz</td>
 <td></td>
 <td>Leica</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micomanipulator Post mount LH1 probe</td>
 <td>Leica microsystems</td>
 <td>39430101</td>
 <td>Different brand will also do the work</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vertical filament puller</td>
 <td>Sutter instrument</td>
 <td>P-20 model</td>
 <td>Other model are also suitable </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cell Tram vario</td>
 <td>Vaudaux-Eppendorf</td>
 <td>5176.000.033</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bioanalyzer</td>
 <td>Agilent Technologies</td>
 <td>2100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Qubit Fluorometer</td>
 <td>Invitrogen (life technologies</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
	 </tbody>
 </table>

efficient and rapid isolation of early-stage embryos from arabidopsis thaliana seeds

Endosperm - - anne tohum integuments (ya da tohum kabuğu) ile çevrili çiçekli bitkiler olarak, embriyo besleyici bir doku içinde gelişir. Sonuç olarak, erken dönemde (küresel sahneye 1 hücre) de bitki embriyoların izolasyonu teknik göreli erişilememesi nedeniyle zordur. Erken aşamalarında Verimli manuel diseksiyon güçlü genç Arabidopsis tohumların küçük boyutlu ve çevre dokulara embriyonun yapışma tarafından bozulur. Burada, biz aşağı uygulamaya bağlı olarak, 1 saat ile 4 saat içinde 40 embriyolar kadar verimli, genç Arabidopsis embriyoların verimli izolasyon sağlayan bir yöntem açıklanmaktadır. Embriyolar, hafif bir Eppendorf tüpü içinde plastik bir havan tokmağı ile 250-750 tohum ezilmesi izolasyon tampon salınır. Bir cam standart laboratuvar pipet ya bağlı microcapillary (bir lastik tüp ile) veya hidrolik kontrollü mikroenjektör damlacıkları yerden embriyo toplamak için kullanılırters ışık mikroskobu çok iyi slayt d. Gerekli teknik beceri basit ve kolay transfer edilebilir ve temel kurulum pahalı ekipman gerektirmez. Toplanan embriyolar gibi RT-PCR, RNA sekansları, DNA metilasyon analizleri, in situ hibridizasyon (FISH), floresan, immün ve haberci gen deneyleri gibi alt çeşitli uygulamalar için uygundur.

Moleküler yıkama uygulamaları için, örneğin, gerçekleştirilmesi durumunda eden embriyo izolasyon prosedürü (Şekil 1), 4 saat içinde 40 embriyo kadar izolasyonu sağlayan ya da bir saatten daha kısa bir süre içinde yıkama, ihmal sitolojik uygulamalar için, örneğin eğer. Gösterir Şekil 2, yüksek ve alçak kalite mikrokılcal uçlarına ve Şekil 3, embriyo izolasyon makinenin bir yapıyı göstermektedir. Şekil 4,...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds at JoVE.com

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Biz gelen geliştirmenin erken aşamalarında embriyo izole için etkili ve basit bir yöntem rapor<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Tohum. En fazla 40 embriyo alt uygulamaya bağlı olarak 1 saat ile 4 saat içinde izole edilebilir. Prosedür, DNA metilasyonu, muhabiri gen, immün ve floresan transcriptome için uygundur<em&gt; In situ</em&gt; Melezleme analizleri.

Erken evre Embriyolar verimli ve hızlı İzolasyon<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Tohumlar

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

efficient-rapid-isolation-early-stage-embryos-from-arabidopsis

Research

JoVE Journal

Biology

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

17.6K Görüntüleme.  University of Zürich. Biz gelen geliştirmenin erken aşamalarında embriyo izole için etkili ve basit bir yöntem rapor Arabidopsis thaliana Tohum. En fazla 40 embriyo alt uygulamaya bağlı olarak 1 saat ile 4 saat içinde izole edilebilir. Prosedür, DNA metilasyonu, muhabiri gen, immün ve floresan transcriptome için uygundur In situ Melezleme analizleri.

Video: Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development. These proteins have been shown to be critical for cell fate determination, cell migration, and formation of neural circuits. Neuronal induction and patterning involve bone morphogenetic protein (BMP), sonic hedgehog (SHH), fibroblast growth factor (FGF), among others. In particular, the expression pattern of Fgf8 is in close proximity to regions expressing BMP4 and SHH. This expression pattern is consistent with developmental interactions that facilitate patterning in the telencephalon.

Here we provide a visual demonstration of a method in which an in ovo preparation can be used to test the effects of Fgfs in the formation of the forebrain. Beads are coated with protein and placed in the developing neural tube to provide sustained exposure. Because the procedure uses small, carefully placed beads, it is minimally invasive and allows several beads to be placed within a single neural tube. Moreover, the method allows for continued development so that embryos can be analyzed at a more mature stage to detect changes in anatomy and in neural patterning. This simple but useful protocol allows for real time imaging. It provides a means to make spatially and temporally limited changes to endogenous protein levels.

A variety of growth factors and proteins interact to induce cells to take on different cell fates during development. Here we demonstrate the use of an in ovo preparation to address possible interactions between different proteins in development by placing beads on E2.5 chick embryos.

Erken Evre Tavuk Embriyolar Büyüme Faktörü-Kaplı Boncuk yerleştirme

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development.   These proteins have been shown to be critical for cell ...

Biyoloji

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

Protoplasts are plant cells that have had their cell walls enzymatically removed. Isolation of protoplasts from different plant tissues was first reported more than 40 years ago 1 and has since been adapted to study a variety of cellular processes, such as subcellular localization of proteins, isolation of intact organelles and targeted gene-inactivation by double stranded RNA interference (RNAi) 2-5. Most of the protoplast isolation protocols use leaf tissues of mature Arabidopsis (e.g. 35-day-old plants) 2-4. We modified existing protocols by employing 14-day-old Arabidopsis seedlings. In this procedure, one gram of 14-day-old seedlings yielded 5 106-107 protoplasts that remain intact at least 96 hours. The yield of protoplasts from seedlings is comparable with preparations from leaves of mature Arabidopsis, but instead of 35-36 days, isolation of protoplasts is completed in 15 days. This allows decreasing the time and growth chamber space that are required for isolating protoplasts when mature plants are used, and expedites the downstream studies that require intact protoplasts.

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

This video shows a procedure for isolating intact protoplasts from tissues of 14-day-old seedlings of Arabidopsis. Given that the isolated protoplasts remain intact for at least 96h and are isolated from seedlings instead of one-month-old mature plants, this procedure expedites assays requiring intact protoplasts.

14 gün eski Fideler Dokular protoplast izolasyonu Arabidopsis thaliana</em

Protoplasts are plant cells that have had their cell walls enzymatically removed. Isolation of protoplasts  from different plant tissues was first ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

Erken evre Fare Embriyolar kullanarak Doku özel Genler Kromatin Immunoprecipitation Testi

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Kinesin İzolasyonu ve Saflaştırılması gelen Drosophila Embriyolar

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively in the study of secondary cell wall formation. Secondary cell wall deposition occurs after the primary cell wall is laid down, a process carried out exclusively by specialized cells such as those forming vessel and fiber tissues. Most secondary cell walls are composed of cellulose (40&#8211;50%), hemicellulose (25&#8211;30%), and lignin (20&#8211;30%). Several mutations affecting secondary cell wall biosynthesis have been isolated, and the corresponding mutants may or may not exhibit obvious biochemical composition changes or visual phenotypes since these mutations could be masked by compensatory responses. Staining procedures have historically been used to show differences on a cellular basis. These methods are exclusively visual means of analysis; nevertheless their role in rapid and critical analysis is of great importance. Congo red and calcofluor white are stains used to detect polysaccharides, whereas M&#228;ule and phloroglucinol are commonly used to determine differences in lignin, and toluidine blue O is used to differentially stain polysaccharides and lignin. The seemingly simple techniques of sectioning, staining, and imaging can be a challenge for beginners. Starting with sample preparation using the A. thaliana model, this study details the protocols of a variety of staining methodologies that can be easily implemented for observation of cell and tissue organization in secondary cell walls of plants.

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.

Histokimyasal boyama<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Ortaöğretim Hücre Duvar Elemanları

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of microbial contaminants present on the seed surface. Currently, Arabidopsis seeds are sterilized using two distinct sterilization techniques in conditions that differ slightly between labs and have not been standardized, often resulting in only partially effective sterilization or in excessive seed mortality. Most of these methods are also not easily scalable to a large number of seed lines of diverse genotypes. As technologies for high-throughput analysis of Arabidopsis continue to proliferate, standardized techniques for sterilizing large numbers of seeds of different genotypes are becoming essential for conducting these types of experiments. The response of a number of Arabidopsis lines to two different sterilization techniques was evaluated based on seed germination rate and the level of seed contamination with microbes and other pathogens. The treatments included different concentrations of sterilizing agents and times of exposure, combined to determine optimal conditions for Arabidopsis seed sterilization. Optimized protocols have been developed for two different sterilization methods: bleach (liquid-phase) and chlorine (Cl2) gas (vapor-phase), both resulting in high seed germination rates and minimal microbial contamination. The utility of these protocols was illustrated through the testing of both wild type and mutant seeds with a range of germination potentials. Our results show that seeds can be effectively sterilized using either method without excessive seed mortality, although detrimental effects of sterilization were observed for seeds with lower than optimal germination potential. In addition, an equation was developed to enable researchers to apply the standardized chlorine gas sterilization conditions to airtight containers of different sizes. The protocols described here allow easy, efficient, and inexpensive seed sterilization for a large number of Arabidopsis lines.

The objective of this study was to determine the effects of bleach and chlorine gas sterilization on seed germination of a range of Arabidopsis genotypes grown on sterile media. Optimized sterilization protocols have been developed to prevent the growth of microbial contaminants while providing satisfactory seed survival.

Yüksek işlem hacmi sterilizasyon Arabidopsis tohum için standart yöntem

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...

ERL1 Dinamiğinin Konfokal Görüntüleme ile Uzay-Zamansal Olarak İncelenmesi

Image-Based Methods to Study Membrane Trafficking Events in Stomatal Lineage Cells

In eukaryotic cells, membrane components, including proteins and lipids, are spatiotemporally transported to their destination within the endomembrane system. This includes the secretory transport of newly synthesized proteins to the cell surface or the outside of the cell, the endocytic transport of extracellular cargoes or plasma membrane components into the cell, and the recycling or shuttling transport of cargoes between the subcellular organelles, etc. Membrane trafficking events are crucial to the development, growth, and environmental adaptation of all eukaryotic cells and, thus, are under stringent regulation. Cell-surface receptor kinases, which perceive ligand signals from the extracellular space, undergo both secretory and endocytic transport. Commonly used approaches to study the membrane trafficking events using a plasma membrane-localized leucine-rich-repeat receptor kinase, ERL1, are described here. The approaches include plant material preparation, pharmacological treatment, and confocal imaging setup. To monitor the spatiotemporal regulation of ERL1, this study describes the co-localization analysis between ERL1 and a multi-vesicular body marker protein, RFP-Ara7, the time series analysis of these two proteins, and the z-stack analysis of ERL1-YFP treated with the membrane trafficking inhibitors brefeldin A and wortmannin.

Yazar Spotlight: Stoma Soy Hücrelerinde Membran Kaçakçılığı Olaylarını İncelemek için Görüntü Tabanlı Yöntemler  

Several commonly used methods are introduced here to study the membrane trafficking events of a plasma membrane receptor kinase. This manuscript describes detailed protocols including the plant material preparation, pharmacological treatment, and confocal imaging setup.

Stoma Soy Hücrelerinde Membran Kaçakçılığı Olaylarını İncelemek için Görüntü Tabanlı Yöntemler

In eukaryotic cells, membrane components, including proteins and lipids, are spatiotemporally transported to their destination within the endomembrane ...

Arabidopsis thaliana'da Polen Hidrasyon Profillerini Ölçmek İçin Geliştirilmiş Bir Yöntem

A High-Resolution, Single-Grain, In Vivo Pollen Hydration Bioassay for Arabidopsis thaliana

Sexual reproduction in flowering plants requires initial interaction between the pollen grain and the stigmatic surface, where a molecular dialog is established between the interacting partners. Studies across a range of species have revealed that a series of molecular checkpoints regulate the pollen-stigma interaction to ensure that only compatible, generally intraspecific pollen is successful in effecting fertilization. In species that possess a 'dry stigma', such as the model plant Arabidopsis thaliana, the first post-pollination, prezygotic compatibility checkpoint is the establishment of pollen hydration. 
This phase of pollination is tightly regulated, whereby signals from the pollen grain elicit the release of water from the stigma, thus permitting pollen hydration. The ability to accurately measure and track pollen hydration over time is key to the design of experiments directed at understanding the regulation of this critical step in reproduction. Published protocols frequently utilize flowers that have been excised from the parent plant, maintained on liquid or solid media, and bulk pollinated. 
This paper describes a noninvasive, in vivo pollination bioassay that permits minute-by-minute hydration tracking of individual A. thaliana pollen grains at high resolution. The assay is highly reproducible, able to detect very subtle variations of pollen hydration profiles, and thus is suitable for the analysis of mutants that affect pathways regulating pollination. Although the protocol is lengthier than those described for bulk pollinations, the precision and reproducibility it provides, along with its in vivo nature, make it ideal for the detailed dissection of pollination phenotypes.

Yazar Spot Işığı: Arabidopsis thaliana için Yüksek Çözünürlüklü, Tek Taneli, İn Vivo Polen Hidrasyon Biyotahlili  

An improved method to measure pollen hydration profiles in Arabidopsis thaliana is described here. The new method offers higher resolution, is noninvasive, and is highly reproducible. The protocol represents a new tool for a finer dissection of the processes that regulate the early stages of pollination.

Arabidopsis thaliana için Yüksek Çözünürlüklü, Tek Taneli, In Vivo Polen Hidrasyon Biyotahlili

Sexual reproduction in flowering plants requires initial interaction between the pollen grain and the stigmatic surface, where a molecular dialog is ...