Bu çalışma, İsviçre Ulusal Bilim Vakfı tarafından hibe ve Cenevre Devlet tarafından desteklenmiştir.

SCBA monte sonra, embriyoların büyümesi birkaç gün boyunca izlenir. Bu nedenle, SCBA&#39;daki tohum diseksiyon işlemi ve montaj önce, bir embriyo gelişimi üzerinde tohum kaplama malzemesinin etkisine uygun bir değerlendirme engelleyebilir gelecek kirletmesini önlemek için tohum sterilize etmek gerekmektedir. 1.. Tohum Sterilizasyon <ol><li> Bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, olgun ve kuru Arabidopsis tohum 50-60 ul dökün ve% 70 etanol solüsyon hazırlanır. </li><li> Tohum içeren mikrosantrifüj tüpüne% 70 etanol çözeltisi içinde 1 ml ilave edilir ve bir vortexer 1.200 rpm&#39;de 10 dakika boyunca oda sıcaklığında çalkalanır. </li><li> 3 saniye santrifüj Mikrosantrifüj tüpü 4,000 xg&#39;de tüpün altındaki tohum konsantre. </li><li> Dikkatli bir mikrosantrifüj tüpün altındaki tohum bırakarak vakum emme ucu ile,% 70 etanol solüsyonu aspire. </li><li> T için steril damıtılmış su ile 1 ml ilave edilir<html> O mikrosantrifüj tüp hala tohum içeren. </li><li> 1,200 rpm&#39;de 10 dakika boyunca oda sıcaklığında çalkalayın. </li><li> 3 saniye santrifüj Mikrosantrifüj tüpü 4,000 xg&#39;de tüpün altındaki tohum konsantre. Dikkatli bir şekilde tüpün altındaki tohum bırakarak vakum emme ucu kullanılarak süpernatan aspire su. </li><li> Hala tohum içeren mikrosantrifüj tüpüne steril su, damıtılmış suyun 1 ml ilave edilir. Suyun akışı homojen tüp içindeki tohum askıya emin olun. Burada amaç tohumların bütünlüğünü korumak üzere daha fazla sallayarak kaçınmaktır. </li><li> Tohumlar 30 saniye boyunca yine tüp bırakarak tüpün altındaki yerçekimiyle yerleşmek olsun. Dikkatli bir şekilde tüpün altındaki tohum bırakarak vakum emme ucu kullanılarak süpernatan aspire su. </li><li> 1,8-1,9 adımları dört kez tekrarlayın. Genel sterilizasyon prosedürü yaklaşık 30 dakika sürer. </li></ol> 2. Tohum Kaplama &quot;ontent&gt; Tüm sonraki basamaklar steril koşullarda korumak için bir laminer akış kabini içinde yapılır. <ol><li> (N-morfolino) etansülfonik asit (MES-KOH - bir Petri tabağı 2.5 mM 2 4.3 g / L Murashige ve Skoog ortamını ihtiva eden bir çözelti otoklav ile hazırlanabilir çimlenme ortamının 30 ml ihtiva eden (100 mm çapında, 20 mm yükseklik) hazırlanması , pH 5.7) ve 0.8 g / L agar. Çözüm Petri plaka üzerine dökülmeden önce 50 ° C su banyosunda soğumaya bırakın. </li><li> Tohumları ihtiva eden tüpe steril damıtılmış su 200 ul ekleyin. Tohum yeniden süspanse edin ve 1 ml ucu ile standart bir pipet kullanarak çimlenme ortamının yüzeyi üzerine transfer edin. </li><li> Bir vakum emme ucunu kullanarak çimlenme ortamının yüzeyinde tohumları çevreleyen su çıkarın. </li><li> Başka bir kurutma işlemi 2 saat boyunca laminer akış kabini içine Kapağın olmaksızın tohum içeren Petri kabı bırakın. Kapaklı Petri kabı kapatın ve laminer altında bekletinyaklaşık 4 saat, tohum sterilizasyon işlemi (adım 1.2) de başlatılmasından bu yana geçen, böylece yaklaşık 90 dakika boyunca kabine akar. </li></ol> 3. Tohum Diseksiyon Aşağıdaki adımlar laminer akış kaputu dolap içinde yerleştirilen bir stereo çalışma gerektirir. A Dumont forseps 5. kesik (yani künt) ipuçları ile büyük ölçüde tohumların kullanımı (Şekil 1A) kolaylaştırır. <ol><li> Çimlenme ortamının 30 ml içeren bir Petri kabı, yeni levha hazırlayın. Ortam, iki yan yana dikdörtgen steril Whatman 3MM kağıt (• Şekil 1 B, aşama 1, 1,5 cm x 1.0 cm) yüzeyinde bir yer. Whatman 3MM kağıt bir otoklav içinde sterilize edilir. </li><li> Steril forseps (Şekil 1B, adım 2) kullanılarak Whatman 3MM kağıtlara tohumları aktarın. </li><li> Yavaşça kesik forseps yan yana küt uçları (kullanılarak tohum basarak Whatman 3MM kağıt karşı tek bir tohum tutun <stRong&gt; Şekil 1B, 3. adım). </li><li> (12.7 mm x, örneğin U100 insülin şırınga + 1 ml şırınga içinde, 0.33 mm (29 g)), bir şırınga iğnesi kullanılarak tohum, tohum kabuğunu (testa ve endosperm) kesme (Şekil 1B, aşama 4). Arabidopsis tohum şekli elipsoidal olup, kotiledonlar (yani uzak kök ucundan) radikula birleştirilir yere mümkün olduğunca yakın en uzun yarı-ana ekseni boyunca, tohum kabuğunu kesmek için tavsiye edilir. Bu diseksiyon prosedürünün sonraki aşamada embriyonun güvenli serbest yardımcı olur. </li><li> Kesik forseps (Şekil 1B, adım 5) yan yana künt ipuçlarını kullanarak Whatman 3MM kağıt karşı tohum itin. Bu adım adım, 3,4 (Şekil 1B, aşama 6) oluşturulan açıklıktan dışarı tohum kabuğu embriyo serbest bırakır. Bu kotiledon ucu Kökçüğün ucuna en yakın olan tohum (yani, uzak fr itme uygulanması önerilirom açılması). </li></ol> 4. Meclis Tohum Portmanto Yatak Deneyi (SCBA) Tohum kat ve embriyo sayısı uygun seçimi için açıklamalara bakın. <ol><li> Çimlenme ortamının 30 ml içeren bir Petri kabı, yeni levha hazırlayın. Ortamının yüzeyi üzerine yerleştirin, naylon elekten bir steril dikdörtgen parça (3.5 cm x 5.0 cm) (Şekil 2, adım 1). </li><li> Zarar görmesini önlemek için, embriyo ve tohum kat yavaşça şırınga iğnesi (Şekil 2, adım 2) kullanarak onları iterek forseps metalik kenarlarının yüzeyine taşınmış olabilir. Embriyo transferi ve Naylon örgü (Şekil 2, 3. adım) üzerine tohum kat. </li><li> Tohumlar kat mümkün olduğunca çok yaklaştırdı (Şekil 2, adım 4) olduğundan emin köreltilmiş forseps ve iğne kullanarak tohum kat dairesel ve tek bir katman birleştirin. Mümkün olduğunca maruz deneyin tarafından üretilen tohum kabuğu açılışyukarı iğne. Bu adım sistematik test değildi. Embriyonun gelişimini inhibe yayılabilir maddeler doğrudan ondan embriyo dışarı doğru difüze yerine beklenmektedir Bununla beraber, bu SCBA&#39;daki verimliliğini artırabilir. </li><li> Adım 4.3 &#39;de monte edilmiş tohum kabuğu yatak ortasına, yuvarlak tek bir tabaka (Şekil 2, adım 5) halinde embriyolar yerleştirin. Embriyoların mümkün olduğu kadar yakın yakınlık içinde olduğundan emin olun. </li><li> 20-21 ° C&#39;de sürekli ışık (40 mol / m 2 s ec) altında SCBAs inkübe FR bir darbe, çimlenme tutuklama normal ışık altında SCBA&#39;yı monte tarif edildiği gibi FR nabız 9 uygulamak ve karanlıkta Petri çanağı bırakmak için kullanılan durumunda. </li></ol>

<ol>
	<li>Debeaujon, I., Leon-Kloosterziel, K. M., Koornneef, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+testa+on+seed+dormancy,+germination,+and+longevity+in+Arabidopsis.">Influence of the testa on seed dormancy, germination, and longevity in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 122, 403-414 (2000).</li><li>Baroux, C., Spillane, C., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+origins+of+the+endosperm+in+flowering+plants.">Evolutionary origins of the endosperm in flowering plants.</a> Genome Biol. 3, reviews1026 (2002).</li><li>Debeaujon, I., Lepiniec, L., Pourcel, L., Routaboul, J. -. M., Bradford, K., Nonogaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Seed development, dormancy and germination. , 25-43 (2007).</li><li>Finch-Savage, W. E., Leubner-Metzger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seed+dormancy+and+the+control+of+germination.">Seed dormancy and the control of germination.</a> New Phytol. 171, 501-523 (2006).</li><li>Bethke, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+aleurone+layer+responds+to+nitric+oxide,+gibberellin,+and+abscisic+acid+and+is+sufficient+and+necessary+for+seed+dormancy.">The Arabidopsis aleurone layer responds to nitric oxide, gibberellin, and abscisic acid and is sufficient and necessary for seed dormancy.</a> Plant Physiol. 143, 1173-1188 (2007).</li><li>Lee, K. P., Piskurewicz, U., Tureckova, V., Strnad, M., Lopez-Molina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+seed+coat+bedding+assay+shows+that+RGL2-dependent+release+of+abscisic+acid+by+the+endosperm+controls+embryo+growth+in+Arabidopsis+dormant+seeds.">A seed coat bedding assay shows that RGL2-dependent release of abscisic acid by the endosperm controls embryo growth in Arabidopsis dormant seeds.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19108-19113 (2010).</li><li>Reed, J. W., Nagatani, A., Elich, T. D., Fagan, M., Chory, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytochrome+A+and+Phytochrome+B+Have+Overlapping+but+Distinct+Functions+in+Arabidopsis+Development.">Phytochrome A and Phytochrome B Have Overlapping but Distinct Functions in Arabidopsis Development.</a> Plant Physiol. 104, 1139-1149 (1994).</li><li>Shinomura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+spectra+for+phytochrome+A-+and+B-specific+photoinduction+of+seed+germination+in+Arabidopsis+thaliana.">Action spectra for phytochrome A- and B-specific photoinduction of seed germination in Arabidopsis thaliana.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 8129-8133 (1996).</li><li>Lee, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+and+genetically+distinct+control+of+seed+germination+by+phytochromes+A+and+B.">Spatially and genetically distinct control of seed germination by phytochromes A and B.</a> Genes Dev. 26, 1984-1996 (2012).</li><li>Lee, K. P., Lopez-Molina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+seed+germination+in+the+shade.">Control of seed germination in the shade.</a> Cell Cycle. 11, 4489-4490 (2012).</li><li>Piskurewicz, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gibberellic+acid+signaling+repressor+RGL2+inhibits+Arabidopsis+seed+germination+by+stimulating+abscisic+acid+synthesis+and+ABI5+activity.">The gibberellic acid signaling repressor RGL2 inhibits Arabidopsis seed germination by stimulating abscisic acid synthesis and ABI5 activity.</a> Plant Cell. 20, 2729-2745 (2008).</li><li>Piskurewicz, U., Tureckova, V., Lacombe, E., Lopez-Molina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-red+light+inhibits+germination+through+DELLA-dependent+stimulation+of+ABA+synthesis+and+ABI3+activity.">Far-red light inhibits germination through DELLA-dependent stimulation of ABA synthesis and ABI3 activity.</a> EMBO J. 28, 2259-2271 (2009).</li><li>Debeaujon, I., Koornneef, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gibberellin+requirement+for+Arabidopsis+seed+germination+is+determined+both+by+testa+characteristics+and+embryonic+abscisic+acid.">Gibberellin requirement for Arabidopsis seed germination is determined both by testa characteristics and embryonic abscisic acid.</a> Plant Physiol. 122, 415-424 (2000).</li><li>Sun, T. P., Kamiya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+GA1+locus+encodes+the+cyclase+ent-kaurene+synthetase+A+of+gibberellin+biosynthesis.">The Arabidopsis GA1 locus encodes the cyclase ent-kaurene synthetase A of gibberellin biosynthesis.</a> Plant Cell. 6, 1509-1518 (1994).</li><li>Alonso, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+insertional+mutagenesis+of+Arabidopsis+thaliana.">Genome-wide insertional mutagenesis of Arabidopsis thaliana.</a> Science. 301, 653-657 (2003).</li><li>Rook, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+sucrose-induction+mutants+reveal+the+modulation+of+sugar-induced+starch+biosynthetic+gene+expression+by+abscisic+acid+signalling.">Impaired sucrose-induction mutants reveal the modulation of sugar-induced starch biosynthetic gene expression by abscisic acid signalling.</a> Plant J. 26, 421-433 (2001).</li></ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Burada açıklanan çiğit yatak deneyi (SCBA) prosedürü prensip olarak Arabidopsis tohum çimlenme bloke (ya da sonra) ve endosperm, bu tutuklama uygulamaya şüphelenilen herhangi bir durum için geçerlidir. İkincisi, tohum kabuğunu (testa ve endosperm) kaldırılması ve embriyolar, tohum kaplama ile çevrili zaman bu göre daha hızlı bir büyüme embriyonik ilerler gözlemlenen gözlemleyerek kanıtlanabilir. Çimlenme özellikle çevresel, fiziksel parametrelere (örneğin su ya da potansiy...

Arabidopsis olgun tohumlarda, tohum kabuğu testa, maternal kökenli ölü doku bir dış tabaka, ve endosperm, embriyo doğrudan 1 çevredeki canlı doku tek bir hücre tabakası oluşmaktadır. Endosperm ve embriyo ayrı fertilizasyon olaylardan türetilmiştir: embriyo, bir anne ve bir baba genomu 2 ile diploid doku ise endosperm anne ve bir baba genom iki ile bir triploid dokudur. Geleneksel olarak endosperm atanan ana işlevi bir besleyici doku olmasıdır. Bununla birlikte, aynı zamanda endosperm tohum çimlenmesi kontrol etmek için merkezi bir rol oynadığını giderek daha belirgin hale gelmektedir. Bu kavram, uyuşukluk durumunda yeni üretilen tohumlar tarafından sergilenen bir özellik birinci belli oldu. Uyuyan tohumlar çimlenme elverişli koşulların varlığına rağmen çimlenmeye başarısız. Tohumlar bir olgunlaşma döneminden sonra kendi uyuşukluğuna kaybeder ve nondorman halineuygun çimlenme koşullarına maruz kaldığında t, yani çimlenir. Model bitki Arabidopsis dahil olmak üzere birçok bitki türünün içinde, tohum kabuğu kesinlikle çiğit kaldırma embriyonik büyüme ve 3,4 yeşillendirme tetikler beri uykuda tohumların çimlenmesini önlemek için gereklidir. Arabidopsis&#39;te, Bethke et al. Çimlenme endosperm 5 çevreleyen endosperm korurken testa çıkardıktan sonra bastırılmış kaldığı görülmektedir. Bu gözlemler, güçlü endosperm, embriyo üzerinde baskı uygulayarak aktivitesi tohum kabuğu içindeki doku olduğunu belirtti. Ancak, tohum kabuğu kaldırma deneyleri zorunlu tohum kat tarafından sağlanan çimlenme baskıcı faaliyetin doğasını açıklığa kavuşturulması ne de bunu uygulamak genlerin belirlenmesi yardım yok. Biz son zamanlarda tohum kabukları ve embriyolar fiziksel olarak ayrılmış ama yakın proxi tutulur bir tohum kat yatak tahlili (SCBA) tanıttımity endosperm sağladığı çimlenme baskıcı aktivitesi 6 korunur, böylece. SCBA, uyuyan nondormant ve genetiği değiştirilmiş tohum ceket ve embriyonik malzemelerin birleştirici kullanımına izin verir. Bunun bir sonucu olarak, çimlenme ve özellikle endosperm ve embriyoda işletim kontrol genetik yolları çıkarılmasına olanak sağlar. SCBA endosperm 6 büyümesini bastırmak için embriyo doğru fitohormon absisik asit (ABA) serbest bırakır göstermek için uyuşukluk bağlamında kullanılmıştır. Ayrıca biz Dormantlığı tanıtmak için sinyal endosperminde faaliyet yollar ve embriyonik doku tanımlamak için SCBA&#39;yı kullanabilirsiniz. Çimlenme kontrol endospermin rolü daha çok kırmızı (FR) ışık darbesine maruz nondormant tohumların davayı dikkate alarak güçlendi. Erken tohumun çekilmesi üzerine bir FR ışık palsı çimlenme 7,8 inhibe ettiği bilinmektedir. Tohum kat tohumlardan FR bir ışık nabız kaldırıldığındaşiddetle endosperm de nondormant tohumların 9 çimlenmesini ezemez düşündüren, çimlenme inhibe edemedi. Dikkate değer olarak, bağımsız solunum aparatı da çimlenme FR-bağımlı inhibisyonu özetlemek için kullanılabilir. Bu tohum çimlenme bu FR-bağımlı inhibisyonu da endosperm 9 ABA salınmasını içeren bir süreç olduğunu göstermektedir bırakıldı. Ayrıca, bağımsız solunum aparatı endosperm ve hafif ipuçları 9,10 cevaben nondormant tohum çimlenmesi kontrol etmek için embriyo faaliyet gösteren farklı ışıklı sinyal yollarını tespit izin verdi. SCBA tohum çimlenme kontrolü bağlamında endosperm işlevini keşfetmek için güvenilir bir teknik olduğu, bu nedenle görünüyor. Ayrıca, çimlenme kontrol şüphelenilen genler endosperm, embriyo ya da her ikisi dokularda faaliyet olup olmadığını değerlendirmek için in vitro güçlü bir araçtır. Burada bir ayrıntı SCBA&#39;yı birleştirmek için gereken çeşitli adımları biz.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>To refer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer Comfort</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>5355 000.011</td>
			<td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacusafe Comfort</td>
			<td>INTEGRA Biosciences AG</td>
			<td>158 310</td>
			<td>Integra Biosciences AG, Zizers, Switzerland</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish plate (100 mm x 20 mm)</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH</td>
			<td>664 102</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5524</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar (plant agar)</td>
			<td>Duchefa Biochemie B.V.</td>
			<td>P1001</td>
			<td>Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps #5</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle</td>
			<td>BD Micro-Fine</td>
			<td>324827</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh (SEFAR NYTEX)</td>
			<td>SEFAR AG</td>
			<td>03-50/31</td>
			<td>Sefar AG, Heiden, Switzerland</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth chamber</td>
			<td>CLF Plant Climatics</td>
			<td>Percival I-30BLLX</td>
			<td>CLF plant Climatics, Wertingen, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclobutrazol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46046</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a seed coat bedding assay to genetically explore in vitro how the endosperm controls seed germination in arabidopsis thaliana

Arabidopsis endosperm olgun embriyoyu çevreleyen ve uyuyan tohumların çimlenmesini veya (FR) uzak kırmızı ışık atımı ile ışınlanmış nondormant tohumların bunu önlemek için önemli bir rol oynayan bir tek hücre tabakası oluşur. Ayrıca endosperm tarafından uygulanan çimlenme baskıcı aktivitesi altında yatan moleküler genetik mekanizmaları anlamak için, bir &quot;tohum kat yatak&quot; deneyi (SCBA) icat edildi. SCBA fiziksel tohum kat altta yatan bir katman üzerinde embriyo gelişimini izleme sağlar tohumlardan tohum mont ve embriyolar ayıran bir diseksiyon işlemdir. Dikkate değer, SCBA tohum dinlenmesi ve tohum çimlenme FR-bağımlı kontrolü bağlamında tohum kat çimlenme baskıcı faaliyetlerini yeniden oluşturulmasını. SCBA, atıl nondormant ve genetik olarak değiştirilmiş tohum kabuğu ve embriyo malzemeleri, çimlenme kontrol genetik yollarının kombinasyon kullanımına izin verir ve özel olarak op yanaendosperm ve embriyo aşmayınız disseke edilebilir. Burada bir ayrıntı SCBA&#39;yı monte prosedürü biz.

Önceki iş GA sentezlemek mümkün mutant tohum tohum 11,12 yüksek ABA birikiminin bir sonucu olarak çimlenme koyamadık olduğunu gösterdi. Onun kaldırma embriyonik büyüme 13 tetikler Ancak, çimlenmeye yetersizlik tohum kat gerektirir. Bu durum kuvvetle GA sentezlenmesi için mümkün tohumların endosperm embriyonik büyümesini bloke etmek ABA serbest olduğunu göstermiştir. Bu nedenle GA ve ABA sentezlemek mümkün tohum kat aksine SCBA&#39;daki embriyoların gelişimini engellemek i?...

Watch this Scientific Journal Video about A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana at JoVE.com

A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

Biz Arabidopsis thaliana tohum tohum kat yatak tahlili (SCBA) monte prosedürü sunuyoruz. SCBA genetik ve in vitro keşfetmek için güçlü bir araç olduğu gösterilmiştir nasıl uyuyan tohum ve hafif uyaranlara yanıt olarak endosperm kontrolleri tohum çimlenme. SCBA endosperm embriyonik büyümeyi etkilemek için şüphelenilen her durumda altında uygulanabilir prensip olarak.

Genetiği keşfedin A Tohum Kabuğunun Yatak Deneyi<em&gt; In Vitro</em&gt; Nasıl Endosperminde Denetimler Çimlenme içinde<em&gt; Arabidopsis thaliana</em

The Arabidopsis endosperm consists of a single cell layer surrounding the mature embryo and playing an essential role to prevent the germination of ...

a-seed-coat-bedding-assay-to-genetically-explore-vitro-how-endosperm

Research

JoVE Journal

Biology

A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

13.2K Görüntüleme.  Université de Genève.  Biz Arabidopsis thaliana tohum tohum kat yatak tahlili (SCBA) monte prosedürü sunuyoruz. SCBA genetik ve in vitro keşfetmek için güçlü bir araç olduğu gösterilmiştir nasıl uyuyan tohum ve hafif uyaranlara yanıt olarak endosperm kontrolleri tohum çimlenme. SCBA endosperm embriyonik büyümeyi etkilemek için şüphelenilen her durumda altında uygulanabilir prensip olarak. 

Video: A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

Use of Arabidopsis eceriferum Mutants to Explore Plant Cuticle Biosynthesis

The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation, but is also an important barrier against the entry of pathogenic microorganisms.  The cuticle is made up of a tough crosslinked polymer called "cutin" and a protective wax layer that seals the plant surface.  The waxy layer of the cuticle is obvious on many plants, appearing as a shiny film on the ivy leaf or as a dusty outer covering on the surface of a grape or a cabbage leaf thanks to light scattering crystals present in the wax.  Because the cuticle is an essential adaptation of plants to a terrestrial environment, understanding the genes involved in plant cuticle formation has applications in both agriculture and forestry. Today, we'll show the analysis of plant cuticle mutants identified by forward and reverse genetics approaches.


The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation but is also an important barrier against the entry of pathogenic microorganisms. In this video, we demonstrate the analysis of plant cuticle mutants identified by forward and reverse genetics approaches.

Bitki Tırnak biyosentezi keşfedin Arabidopsis eceriferum Mutants

The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation, but is also an important barrier against the entry of ...

Biyoloji

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA methyltransferases is viable, thus providing a system to study how loss of DNA methylation in a genome affects growth and development. Imprinting refers to differential expression of maternal and paternal alleles and plays an important role in reproduction development in both mammal and plants. DNA methylation is critical for determining whether the maternal or paternal alleles of an imprinted gene is expressed or silenced. In flowering plants, there is a double fertilization event in reproduction: one sperm cell fertilizes the egg cell to form embryo and a second sperm fuses with the central cell to give rise to endosperm. Endosperm is the tissue where imprinting occurs in plants. MEDEA, a SET domain Polycomb group gene, and FWA, a transcription factor regulating flowering, are the first two genes shown to be imprinted in endosperm and their expression is controlled by DNA methylation and demethylation in plants. In order to determine imprinting status of a gene and methylation pattern in endosperm, we need to be able to isolate endosperm first. Since seed is tiny in Arabidopsis, it remains challenging to isolate Arabidopsis endosperm and examine its methylation. In this video protocol, we report how to conduct a genetic cross, to isolate endosperm tissue from seeds, and to determine the methylation status by bisulfite sequencing.

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Imprinting is a phenomenon in plant and mammal reproduction. DNA methylation plays an important role in mechanisms of imprinting. Isolating endosperm and determining methylation status of imprinted genes in Arabidopsis can be difficult. In this protocol, we describe how to isolate endosperm and determine methylation by bisulfite sequencing.

Baskılı Genler DNA metilasyon Belirlenmesi Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA ...

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

Signal transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain proliferation and differentiation and requires tight control. Signal transduction is initiated by binding of an external ligand to a transmembrane receptor and activation of downstream signaling cascades. A key regulator of mitogenic signaling is Grb2, a modular protein composed of an internal SH2 (Src Homology 2) domain flanked by two SH3 domains that lacks enzymatic activity. Grb2 is constitutively associated with the GTPase Son-Of-Sevenless (SOS) via its N-terminal SH3 domain. The SH2 domain of Grb2 binds to growth factor receptors at phosphorylated tyrosine residues thus coupling receptor activation to the SOS-Ras-MAP kinase signaling cascade. In addition, other roles for Grb2 as a positive or negative regulator of signaling and receptor endocytosis have been described. The modular composition of Grb2 suggests that it can dock to a variety of receptors and transduce signals along a multitude of different pathways1-3.
	Described here is a simple microscopy assay that monitors recruitment of Grb2 to the plasma membrane. It is adapted from an assay that measures changes in sub-cellular localization of green-fluorescent protein (GFP)-tagged Grb2 in response to a stimulus4-6. Plasma membrane receptors that bind Grb2 such as activated Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) recruit GFP-Grb2 to the plasma membrane upon cDNA expression and subsequently relocate to endosomal compartments in the cell. In order to identify in vivo protein complexes of Grb2, this technique can be used to perform a genome-wide high-content screen based on changes in Grb2 sub-cellular localization. The preparation of cDNA expression clones, transfection and image acquisition are described in detail below. Compared to other genomic methods used to identify protein interaction partners, such as yeast-two-hybrid, this technique allows the visualization of protein complexes in mammalian cells at the sub-cellular site of interaction by a simple microscopy-based assay. Hence both qualitative features, such as patterns of localization can be assessed, as well as the quantitative strength of the interaction.

A high-content screening method for the identification of novel signaling competent transmembrane receptors is described. This method is amenable to large-scale automation and allows predictions about in vivo protein binding and the sub-cellular localization of protein complexes in mammalian cells.

İfade Klonlama tarafından Grb2 Sinyal Kompleksi Eğitim için bir Yüksek içerik Görüntüleme İş Akışı

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light conditions, which are preferably variable in quantity and quality so that studies under different setups can be conducted. These requirements are met by climatic chambers featuring light emitting diodes (LED) lights, which can &#8211; in contrast to fluorescent lights &#8211; be set to different wavelengths. LEDs are energy conserving and emit virtually no heat even at light intensities, which often constitutes a problem with other light sources. The presented protocol provides a step-by-step guidance of how to program a climatic chamber equipped with variable LED lights as well as describing several approaches for in depth analysis of growth phenotypes. Depending on the experimental set-up various characteristics of the growing plants can be observed and analyzed. Here we describe how to determine fresh weight, leaf area, photosynthetic activity, and stomatal density. We demonstrate that in order to obtain reliable data and draw valid conclusions it is mandatory to use a sufficient number of individuals for statistical evaluation. Taking too few plants for this kind of analysis results in high statistical errors and consequently in less clear interpretations of the data.

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Here, we present a protocol for studying plant growth behavior and especially phenotypes in a reproducible manner. We show how to provide variable and at the same time stable light conditions. Proper analyses depend on sufficient sample numbers and valid statistical evaluations.

Farklı ışık nitelikleri Arabidopsis thaliana büyüme davranış analizi

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light ...

A Simple Dry Sectioning Method for Obtaining Whole-Seed-Sized Resin Section and Its Applications

The morphology, size and quantity of cells, starch granules&#160;and protein bodies in seed determine the weight and quality of seed. They are significantly different among different regions of seed. In order to view the morphologies of cells, starch granules and protein bodies clearly, and quantitatively analyze their morphology parameters accurately, the whole-seed-sized section is needed. Though the whole-seed-sized paraffin section can investigate the accumulation of storage materials in seeds, it is very difficult to quantitatively analyze the morphology parameters of cells and storage materials due to the low resolution of the thick section. The thin resin section has high resolution, but the routine resin sectioning method is not suitable to prepare the whole-seed-sized section of mature seeds with a large volume and high starch content. In this study, we present a simple dry sectioning method for preparing the whole-seed-sized resin section. The technique can prepare the cross and longitudinal whole-seed-sized sections of developing, mature, germinated, and cooked seeds embedded in LR White resin, even for large seeds with high starch content. The whole-seed-sized section can be stained with fluorescent brightener 28, iodine, and Coomassie brilliant blue R250 to specifically exhibit the morphology of cells, starch granules, and protein bodies clearly, respectively. The image obtained can also be analyzed quantitatively to show the morphology parameters of cells, starch granules, and protein bodies in different regions of seed.

This technique allows for the fast and simple preparation of whole-seed-sized resin section for the observation and analysis of cells, starch granules, and protein bodies in different regions of the seed.

Tam Tohum Lu Reişin Elde Edilmesinde Basit Bir Kuru Kesit Yöntemi ve Uygulamaları

The morphology, size and quantity of cells, starch granules&#160;and protein bodies in seed determine the weight and quality of seed. They are ...

Analysis of Effect of Compound Salt Stress on Seed Germination and Salt Tolerance Analysis of Pepper (Capsicum annuum L.)

To determine the salt tolerance and physiological mechanism of pepper (Capsicum annuum L.) at the germination stage, the Hongtianhu 101 and Xinxiang 8 varieties, which have large differences in salt tolerance, are employed as the study materials. Six mixed salt concentrations of 0, 3, 5, 10, 15, and 20 g/L derived using equal molar ratios of Na2CO3, NaHCO3, NaCl, CaCl2, MgCl2, MgSO4, and Na2SO4 are used. To determine their effects, the related indexes of seed germination, seedling growth, and physiology are measured, and salt tolerance is comprehensively evaluated using membership function analysis. The results show that as the mixed salt concentration increases, the germination potential, germination index, germination rate, seed germination vigor index, root length, and root fresh weight of the two cultivars significantly decrease, whereas the relative salt rate gradually increases. The hypocotyl length and fresh weight aboveground increase first and then decrease, while the malondialdehyde (MDA), proline (Pro) content, catalase (CAT), peroxidase (POD), and superoxide dismutase (SOD) activity decrease and then increase. The germination potential, germination index, germination rate, seed germination vigor index, root length, root fresh weight, MDA and Pro content, and CAT activity of the Hongtianhu 101 seeds are higher than those of Xinxiang 8 for all salt concentrations employed here. However, hypocotyl length, fresh weight aboveground, and relative salt rate are lower in Hongtianhu 101 than in Xinxiang 8. The comprehensive evaluation of salt tolerance reveals that the total weighted values of the two membership function indexes increase first and then decrease as the mixed salt concentration increases. Compared with 5 g/L, which has the highest membership function value, the index under salt concentrations of 3 g/L, 10 g/L, and 15 g/L decreases by 4.7%-11.1%, 25.3%-28.3%, and 41.4%-45.1%, respectively. This study provides theoretical guidance for the breeding of salt-tolerant varieties of pepper and an analysis of the physiological mechanisms involved in salt tolerance and salt-tolerant cultivation.

Analysis of Effect of Compound Salt Stress on Seed Germination and Salt Tolerance Analysis of Pepper Capsicum annuum L.

The paper below presents a protocol for measuring seed germination, seedling growth, and physiological indexes of two pepper varieties with salinity tolerance differences in response to six mixed salt concentrations. This protocol can be used to evaluate the salt tolerance of pepper varieties.

Bileşik Tuz Gerilmesinin Tohum Çimlenmesine Etkisinin Analizi ve Karabiberin Tuz Toleransı Analizi (Capsicum annuum L.)

To determine the salt tolerance and physiological mechanism of pepper (Capsicum annuum L.) at the germination stage, the Hongtianhu 101 and Xinxiang 8 ...

ERL1 Dinamiğinin Konfokal Görüntüleme ile Uzay-Zamansal Olarak İncelenmesi

Image-Based Methods to Study Membrane Trafficking Events in Stomatal Lineage Cells

In eukaryotic cells, membrane components, including proteins and lipids, are spatiotemporally transported to their destination within the endomembrane system. This includes the secretory transport of newly synthesized proteins to the cell surface or the outside of the cell, the endocytic transport of extracellular cargoes or plasma membrane components into the cell, and the recycling or shuttling transport of cargoes between the subcellular organelles, etc. Membrane trafficking events are crucial to the development, growth, and environmental adaptation of all eukaryotic cells and, thus, are under stringent regulation. Cell-surface receptor kinases, which perceive ligand signals from the extracellular space, undergo both secretory and endocytic transport. Commonly used approaches to study the membrane trafficking events using a plasma membrane-localized leucine-rich-repeat receptor kinase, ERL1, are described here. The approaches include plant material preparation, pharmacological treatment, and confocal imaging setup. To monitor the spatiotemporal regulation of ERL1, this study describes the co-localization analysis between ERL1 and a multi-vesicular body marker protein, RFP-Ara7, the time series analysis of these two proteins, and the z-stack analysis of ERL1-YFP treated with the membrane trafficking inhibitors brefeldin A and wortmannin.

Yazar Spotlight: Stoma Soy Hücrelerinde Membran Kaçakçılığı Olaylarını İncelemek için Görüntü Tabanlı Yöntemler  

Several commonly used methods are introduced here to study the membrane trafficking events of a plasma membrane receptor kinase. This manuscript describes detailed protocols including the plant material preparation, pharmacological treatment, and confocal imaging setup.

Stoma Soy Hücrelerinde Membran Kaçakçılığı Olaylarını İncelemek için Görüntü Tabanlı Yöntemler

In eukaryotic cells, membrane components, including proteins and lipids, are spatiotemporally transported to their destination within the endomembrane ...

Memeli Hücrelerinde Çinko Taşıma Mekanizmasının FluoZin-3 Testi ile İncelenmesi

Characterizing Mammalian Zinc Transporters Using an In Vitro Zinc Transport Assay

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured indirectly by determining the expression level of the transporter under different concentrations of Zn2+. This was done by utilizing immunohistochemistry, measuring mRNA in the tissue, or determining the cellular Zn2+ levels. With the development of intracellular Zn2+ sensors, the activities of zinc transporters are currently primarily determined by correlating changes in intracellular Zn2+, detected using fluorescent probes, with the expression of the Zn2+ transporters. However, even today, only a few labs monitor dynamic changes in intracellular Zn2+ and use it to measure the activity of zinc transporters directly. Part of the problem is that out of the 10 zinc transporters of the ZnT family, except for ZnT10 (transports manganese), only zinc transporter 1 (ZnT1) is localized at the plasma membrane. Therefore, linking the transport activity to changes in the intracellular Zn2+ concentration is hard. This article describes a direct way to determine the zinc transport kinetics using an assay based on a zinc-specific fluorescent dye, FluoZin-3. This dye is loaded into mammalian cells in its ester form and then trapped in the cytosol due to cellular di-esterase activity. The cells are loaded with Zn2+ by utilizing the Zn2+ ionophore pyrithione. The ZnT1 activity is assessed from the linear part of the reduction in fluorescence following the cell washout. The fluorescence measured at an excitation of 470 nm and emission of 520 nm is proportional to the free intracellular Zn2+. Selecting the cells expressing ZnT1 tagged with the mCherry fluorophore allows for monitoring only the cells expressing the transporter. This assay is used to investigate the contribution of different domains of ZnT1 protein to the transport mechanism of human ZnT1, a eukaryotic transmembrane protein that extrudes excess zinc from the cell.

Yazar Spotlight: ZnT1 İşlevselliği ile Hücresel Çinko Düzenlemesini Keşfetmek 

Zinc transport has proven challenging to measure due to the weak causal links to protein function and the low temporal resolution. This protocol describes a method for monitoring, with high temporal resolution, Zn2+ extrusion from living cells by utilizing a Zn2+ sensitive fluorescent dye, thus providing a direct measure of Zn2+ efflux.

İn Vitro Çinko Taşıma Testi Kullanılarak Memeli Çinko Taşıyıcılarının Karakterize Edilmesi

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured ...