Bu çalışma Institut Pasteur fon tarafından ve Ligue Nationale contre le Kanser (hibe R05/75-129 ve RS07/75-75), Derneği pour la Recherche sur le Kanser (/ hibe ARC A09 hibe kısmen desteklenmiştir 1/5031 ve 4867) ve Agence Nationale de la Recherche (ANR07 MIME 009 02 ve ANR09 MIEN 026 01). MM bir MENRT dostluk bir alıcı oldu.

1. Maya İki melez Gösterimleri <ol><li> Aşağıdaki gerekli çözümleri olun: <ol><li> Komple Sentetik Drop Out (SD): 1 su L glukoz ile minimum SD tabanının 26.7 g çözülür. Aşağıdaki gibi elde amino asit karışımı, 2 g ekleyin 2 g Adenin hemisülfat, 2 gr Arginin HCI, 2 gr Histidin HCI, 2 gr izolösin, lösin 4 gr, 2 gr Lizin HCI, 2 gr Metionin, Fenilalanin 3 g, 2 g L -Serin, 2 gr L-treonin, 3 g Triptofan, Tirosin 2 gr, 1.2 gr urasil, 9 g Valin. </li><li> SD-L/-W/-H Out Seçici Bırak: SD belirtilenler hariç her esansiyel amino asitleri içeren (-L:-Lösin,-W:-Triptofan,-H:-Histidin). </li><li> YPGLU: 1 L, ağırlık maya özü, Bacto pepton, 10 g glukoz ve 20 g 10 g. Katı ortam için 25 g Bacto agar ile tamamlayın. </li><li> YCM: YPGLU ile aynı, ancak pH 4.5 &#39;e ayarlanır. </li></ol></li><li> Çiftleşme ve yayılan <ol><li> Ön dönüşümünün dondurulmuş alikotları kullanınpACT2 klonlanmış bir cDNA kitaplığı ihtiva ed Y187 maya suşu (eşleşme tip α). SD-L plakalar üzerinde seri seyreltme kaplama ile hücre canlılığı kontrol edin. </li><li> PGBKT7 vektörünün içine patojen ORF klon ve AH109 maya suşu (eşleşme tip a) standart bir prosedür kullanılarak, rekombinant plazmid dönüşümü. </li><li> Yayılmasını SD-W plakalar üzerinde AH109 maya pGBKT7-dönüştürdü. Nemlendirilmiş bir inkübatör içinde en az iki gün 30 ° C&#39;de inkübe edin. Levhalar 4 ° C de iki hibrit tarama kadar saklanabilir. </li><li> Patojenlerin proteinler tarafından HIS3 raportör geninin kendi kendine trans potansiyelini ortadan kaldırmak için 3-amino triazol (3-AT), HIS3 enziminin bir rekabetçi inhibitörüdür kullanın. SD-W/-H plakalar üzerinde pGBKT7-dönüştürülmüş maya büyümesini engeller 3-AT, konsantrasyonu belirleyerek otomatik aktivasyon testi yapın. </li><li> PGBKT7 dönüştürülmüş AH109 birkaç kolonileri ile SD-W Tohum 30 ml. Rotasyon ile 30 ° C&#39;de 30 saat inkübe edilir. </li><li> 30 ml, SD-W Tohum 200 miAH109 kültürlerin. 30 20 saat etrafında dönme ile inkübe ° C </li><li> 20 ml YPGLU, 30 inkübe 10 dakika ° rotasyon ile C cDNA kütüphanesi dönüştürülmüş Y187 çözülmüş inkübe edin. </li><li> 20 ° C &#39;de 3500 rpm&#39;de 5 dakika için uygun Y187 maya hücrelerinin bir eşdeğer miktara tekabül pGBKT7-dönüştürülmüş AH109 bir kültür hacmi Santrifüj Dikkatlice 10 ml YPGLU içinde süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet geri. </li><li> Y187 içeren kütüphane ile süspanse AH109 maya karıştırın. 50 ml&#39;lik bir tüp içinde aktarın. 20 3.500 rpm&#39;de 5 dakika ° C, santrifüj dikkatlice süpernatant geri (kırılgan pelet). </li><li> YPGLU içinde tekrar süspansiyon pelet 1,5 ml toplam almak için. </li><li> Yayılmasını maya YCM-Agar 3 için 150 mm plakalar, 0.5 ml / plaka. 4.5 saat 30 ° C&#39;de inkübe </li><li> SD-L/-W/-H 10 ml bir komisyon cam kazınarak YCM plakalardan evlendirilen maya toplayın. 5 ml SD-L/-W/-H orta ve havuzlu plakalar iki kez durulayın. </li><li> 20, 3500 rpm&#39;de 5 dakika santrifüj° C Süpernatant atın ve 5 ml SD-L/-W/-H ortamda maya pelet tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Otomatik aktivasyon testinde belirlenen 3-amino triazol uygun konsantrasyonda (3-AT) ile desteklenmiş SD-L/-W/-H Agar plakaları 10 (0.5 ml / plaka) üzerine şeklindeki maya yayılır. 6-10 gün için nemli bir atmosferde 30 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> SD-L/-W tabakalarına şeklindeki maya süspansiyonu seri dilüsyonları 250 ul (10 -6 ila 10 -4) yayarak çiftleşme etkinliğini değerlendirmek amacıyla, diploid (2n) oranını belirlemek. İki gün boyunca 30 ° C&#39;de inkübe edin. SD-L/-W yetişen kolonileri sayın ve evlendirilen maya ilk hacmi bulunan toplam diploid sayısını anlamak. Diploid oranını hesaplamak için uygun kütüphane içeren maya sayısı bu diploid sayısını bildirin. Bu, yaklaşık% 10-25 arasında olmalıdır. </li><li> 6-10 gün 30 inkübasyondan sonra ° C, taze SD-L/-W/-H olarak evlendirilen maya kolonileri + plakalar 3-AT seçin. [İpucu: sipariş maya 8 bir düzenibu] sıralama için daha sonra daha kolay olacaktır, böylece bir 96 plaka yeniden 12 kuyu şerit. Maya kolonileri ile nemlendirilmiş bir atmosferinde 30 ° C&#39;de 4-5 gün boyunca büyümeye izin verin. </li></ol></li><li> PCR ve sıralama ile his3 pozitif klonların Eleme Hedef PCR ORF seçici SD-L/-H/-W plakaları üzerinde büyüyen maya kolonileri pACT2 vektörleri içerdiği yükseltirler. <ol><li> Buz üzerinde bir 96 PCR plaka koyun. </li><li> Maya hücreleri lize etmek için, 50 ul başına iyi bir Zymolase 20T çözeltisi (10 mM HEPES tampon pH 7.7 içinde 2.5 mg / ml) ilave edilmektedir. </li><li> Yavaşça başına iyi bir koloni tekrar süspansiyon. </li><li> 37 95 ° C de ve 15 dakika ° C &#39;de 15 dakika inkübe </li><li> Buz geri plaka koyun. Çukur başına distile su 50 ul ekle. Aşağı yukarı pipetleme ve ile iyice karıştırın. </li><li> 3500 rpm ve 4, 5 dakika boyunca santrifüje ° C </li><li> PCR pACT2 vektörler cDNA&#39;dan türetilmiş ORF bölgesinin her iki tarafında tavlama primerler kullanarak bir uç tespit etmek için 10 ul yükseltmek. Protokol gExTaq polimeraz ile 96 parçalanmış maya kolonileri amplifikasyonu için iven. Aşağıdaki karışımı hazırlayın: 525 ul 10X ExTaq tampon, 420 ul dNTP karışımı (2.5 mM), 10.5 ul İleri Primer (1 mg / ml), 10.5 ul Ters Primer (1 mg / ml), 31.5 ul ExTaq (5 U / ml ) ve 3202,5 ​​ul H 2 0. 96 oyuklu bir plaka PCR oyuk başına 40 ul karışım dağıtın. De başına parçalanmış maya 10 ul ekleyin. 7 dakika için 1 dakika için 4 dakika, 72 ° C arasında ve 72 ile son ° C&#39;de 30 saniye, 60 ° C&#39;de 94 daha sonra da 3 dakika, 35 ° C döngü boyunca 94 ° C&#39;de aşağıdaki gibidir: amplifikasyon gerçekleştirin. PCR pozitif klonların tespit etmek için% 1.2 agaroz jel üzerinde PCR ürünleri 3 ul çalıştırın. Kullanılarak önceden dökme 96 agaroz jel önerilir unutmayın. [İpucu: plaka birkaç ay boyunca -20 ° C&#39;de saklanır ve yeni PCR için yeniden kullanılabilir] </li><li> HIS3 pozitif klonların izole PCR amplifiye parçaları dizisi. Hücresel ORF belirlemek için bir patlama analizi yapın. Düşük güven diziler (E değeri veGT, 10 -10, kimlik &lt;% 80, peptid uzunluğu &lt;20 amino asit) yanı sıra, frameshifted atılır ve dizilerini içeren erken durdurma kodonu. </li></ol></li></ol> 2. HT-GPCA için matris bina HT-GPCA hem de patojen ve konak proteinlerin geçici olarak bölünmüş Gaussia princeps&#39;in lusiferaz tamamlayıcı parçaları kaynaşmış ifade edilmiştir, bir memeli hücresi bazlı tahlil oluşturmaktadır. Ortakları arasındaki etkileşimi üzerine, bu enzim, enzim aktivitesinin ölçümü sağlayan sulandırılır. Etkileşim yoğunluğu böylece Normalize Lüminesans Oranı (aşağıya bakın ve 1 Şekil) çıkarılabilir edilir <ol start="4"><li> Host hücre taraflarının seçilmesi <ol><li> Veri kümesi güven 9 artırmak için memeli hücrelerinde daha fazla doğrulama için Y2H gösterimleri fazla üç kez tanımlanır proteinleri seçin. </li><li> Positi gibi patojen proteinlerin bilinen etkileşim ortakları eklekontrol ettik. </li></ol></li><li> HT-GPCA uygun vektörlere transfer <ol><li> Amino asitler lusiferaz N-terminuslarıyla (GL2-patojen protein füzyonları) de erimiş hümanize Gaussia princeps&#39;in 110-185 patojen proteinlerin üretilmesi için pSPICA-N2 vektörü içinde, her patojenin ORF proteini klonlama. </li><li> PCR ORF doğrudan Y2H pozitif klonların ya da başka bir bilgi ORF (insan ORFeome ikinci hücresel protein yükseltmek <a href="http://horfdb.dfci.harvard.edu/" target="_blank">http://horfdb.dfci.harvard.edu/</a> ile N-terminalinde kaynaşmış protein üretmek için) ve pSPICA-N1 vektörlerine aktarmak amino asitler hümanize Gaussia princeps&#39;in lusiferaz (GL1-ana protein füzyonları) 18-109. [İpucu: büyük ölçekli klonlama için, Ağ Geçidi klonlama sistemi önerilir. Bu durumda, PCR amplifikasyonu için, ağ geçidi uyumlu siteler ihtiva etmek üzere tasarlanmış primerler de]. </li><li> Sıra tüm ifade vektörleri. PSPICA-N1 ve pSPICA-N2 dizilerireferans 8 bulunabilir. </li></ol></li></ol> Plazmid yapıları pSPICA-N1, yani patojen protein ters çevrilerek ve ana protein pSPICA-N2 olabilir unutmayın. 3. Yüksek Verim Gaussia princeps&#39;in Lusiferaz Tabanlı Protein tamamlama Testi (HT-GPCA) <ol start="6"><li> Hücre transfeksiyonu <ol><li> Antibiyotik olmaksızın% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS) ile DMEM 350,000 hücre / ml &#39;de Tohum 293T hücreleri. / Iyi steril beyaz kültürü plakaları 100 ul dağıtın. Tek bir deneyde 10 plakaları aşmayın. Hücreler% 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de 24 saat süre ile büyümesine izin. [Kriteri:. PSPICA plazmid bir SV40 kopyalama kaynağını kullanır bu yana, 293T hücreleri kullanılır ve transfekte hücreler çoğaldıktan izin verir ve böylece iki lusiferaz fragmanlarının ekspresyonu yol] </li><li> Ertesi gün, uygun olan herhangi bir transfeksiyon protokolü kullanılarak transfekte hücreler. Nu, bazı transfeksiyon reaktifler için unutmayınhücre tohumlanan mber adapte edilmesi gerekebilir. 100 ng başına kuyunun patojen ve ev sahibi ORF plazmid yapıları hem de kullanın. Transfeksiyon verimlilik için normalleştirmek için plazmid CMV-Firefly lusiferaz bir çok iyi başına Co-transfect 10 ng. Her bir nokta üç kopya halinde test edildi. [İpucu:. DNA karışımları yapışkanlı ile transfeksiyon bir gün önce yapılan ve -20 ° C&#39;de saklanabilir] </li><li> Kültür 293T hücrelerinin levhalara transfeksiyon karışımı aktarın. 293T güçlü yapışık değildir ve kolayca kuyunun dibinde ayırmak gibi, yavaşça hücreleri üzerine DNA karışımı yatırmak için dikkatli olun. % 5 CO2 ile 37 ° C&#39;de 24-30 saat boyunca bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin. </li></ol></li></ol><ol start="7"><li> Hücre parçalama ve Gaussia lusiferaz doz <ol><li> PBS (iyi 100 ul /) ile hücreleri yıkayın. 40 ul 1X Renilla lizis tamponu ekleyin. Karıştırma altında, oda sıcaklığında 30 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> Başka bir beyaz plat hücre lizatları 10 ul kaydetateşböceği lusiferaz aktivitesinin sonraki dozaj e. 4 ° C&#39;de saklayın ya da alternatif olarak -20 ° sızdırmazlık C. </li><li> Renilla lusiferaz analiz ayıraçı 100 ul ekleyerek ve bir luminometre ile 10 saniye boyunca ışıldama sayımı ile hücre lizatları üzerinde kalan 30μl Gaussia aktivitesi ölçülür. , 96 gözlü bir levhanın bir dozaj, yaklaşık yarım saat sürer. Dondurma veya uzun süreli depolama etkileşimi-aracılı Gaussia aktivitesini etkileyebilir çünkü taze hücre özleri ile ölçüm yapın. </li></ol></li></ol><ol start="8"><li> Ateşböceği aktivite ölçümü <ol><li> Ateşböceği lusiferaz deneme ayıracı 50 ul ekleyerek ve 10 saniye boyunca ışıldama sayımı ile hücre lizatları kayıtlı 10 ul ilgili Ateşböceği aktivitesi ölçülür. , 96 gözlü bir levhanın bir dozaj, yaklaşık yarım saat sürer. [Kriteri: ateşböceği lusiferaz dozaj dondurulmuş lizatları üzerindeki bir gün sonra gerçekleştirilebilir.] </li></ol></li></ol><ol start="9"><li> NLR Hesaplamalar <ol><li&gt; Her etkileşim için, Gaussia lusiferaz faaliyet ve hesap transfeksiyon verimlilik ve hücre canlılığı dikkate alınarak normalize Gaussia lüminesans değeri elde etmek için Firefly lusiferaz aktivite arasındaki oranı hesaplar. Triplicates, ortalama hesaplayın. </li><li> Etkileşimi izlemek için her bir patojen-ev sahibi çifti için bir Normalize Lüminesans Oranı (NLR) tahmin ediyoruz. Bunu yapmak için, kontrol kuyuları ölçülen aktivitelerinin toplamından (referans 8 uyarlanmıştır Şekil 1) patojen ve konak proteinlerin hem varlığı tespit normalize Gaussia lüminesans aktivitesi bölün. Olumlu etkileşim için NLR kesim değeri 3,5 8 civarında olduğu tahmin edilmektedir. </li></ol></li></ol><ol start="10"><li> Veri analizi <ol><li> R istatistik paketi kullanılarak hiyerarşik kümeleme gerçekleştirin. İlk olarak, grup kategoride NLR veriler, daha sonra tam bir bağlantı yöntemi kullanılarak bir etkileşim dendrograma hesaplar. Bu görselleştirmekJavaTreeView 10 ile dendrogram. Bir Pearson korelasyon katsayısı ile etkileşim dendrogram ve filogenetik ağaç arasındaki mesafeyi hesaplayın. </li><li> Etkileşim ağları oluşturmak için, HT-GPCA kümesi gelen olumlu etkileşim seçin ve Cytoscape yazılım 1&#39;i kullanın. Ev sahibi proteinlerin derece ayıklamak ve ağ yerel dinamikleri erişmek için kendi dağıtım arsa. Host-patojen ağlar ana hücresel ağ patojen proteinlerin küresel etkisi bir değerlendirme sağlamak için ana interactome için yerleştirilebilir. </li><li> GO (Gen Ontoloji) veri kümesi işlevsel zenginleştirme değerlendirmek için DAVID biyoinformatik veritabanı 12 ile hedeflenen hücresel faktörler ile ilgili terimler ayıklayın. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Davey, N. E., Trave, G., Gibson, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+viruses+hijack+cell+regulation.">How viruses hijack cell regulation.</a> Trends in Biochemical Sciences. 36, 159-169 (2011).</li><li>Calderwood, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epstein-Barr+virus+and+virus+human+protein+interaction+maps.">Epstein-Barr virus and virus human protein interaction maps.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7606-7611 (2007).</li><li>de Chassey, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+C+virus+infection+protein+network.">Hepatitis C virus infection protein network.</a> Mol. Syst. Biol. 4, 230 (2008).</li><li>Simonis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-pathogen+interactome+mapping+for+HTLV-1+and+-2+retroviruses.">Host-pathogen interactome mapping for HTLV-1 and -2 retroviruses.</a> Retrovirology. 9, 26 (2012).</li><li>Dyer, M. D., Murali, T. M., Sobral, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+human+proteins+interacting+with+viruses+and+other+pathogens.">The landscape of human proteins interacting with viruses and other pathogens.</a> PLoS Pathog. 4, e32 (2008).</li><li>Rual, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+proteome-scale+map+of+the+human+protein-protein+interaction+network.">Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network.</a> Nature. 437, 1173-1178 (2005).</li><li>Venkatesan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+empirical+framework+for+binary+interactome+mapping.">An empirical framework for binary interactome mapping.</a> Nat. Methods. 6, 83-90 (2009).</li><li>Cassonnet, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchmarking+a+luciferase+complementation+assay+for+detecting+protein+complexes.">Benchmarking a luciferase complementation assay for detecting protein complexes.</a> Nat. Methods. 8, 990-992 (2011).</li><li>Ito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+two-hybrid+analysis+to+explore+the+yeast+protein+interactome.">A comprehensive two-hybrid analysis to explore the yeast protein interactome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 4569-4574 (2001).</li><li>Saldanha, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Java+Treeview--extensible+visualization+of+microarray+data.">Java Treeview--extensible visualization of microarray data.</a> Bioinformatics. 20, 3246-3248 (2004).</li><li>Smoot, M. E., Ono, K., Ruscheinski, J., Wang, P. L., Ideker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoscape+2.8:+new+features+for+data+integration+and+network+visualization.">Cytoscape 2.8: new features for data integration and network visualization.</a> Bioinformatics. 27, 431-432 (2011).</li><li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources.">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nat. Protoc. 4, 44-57 (2009).</li><li>Muller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+genotype+comparison+of+human+papillomavirus+E2-host+interaction+networks+provides+new+insights+for+e2+molecular+functions.">Large scale genotype comparison of human papillomavirus E2-host interaction networks provides new insights for e2 molecular functions.</a> PLoS Pathog. 8, e1002761 (2012).</li><li>Neveu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+virus-host+interactomes+with+a+mammalian+high-throughput+protein+complementation+assay+based+on+Gaussia+princeps+luciferase.">Comparative analysis of virus-host interactomes with a mammalian high-throughput protein complementation assay based on Gaussia princeps luciferase.</a> Methods. , (2012).</li><li>Braun, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimentally+derived+confidence+score+for+binary+protein-protein+interactions.">An experimentally derived confidence score for binary protein-protein interactions.</a> Nat. Methods. 6, 91-97 (2009).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Bağımsız, maya-iki gibi GST açılır, Lumier veya MAPPIT gibi hibrid ve memeli etkileşim deneyleri, protein-protein etkileşimleri tespit etmek için etkili araçlar olduğu kanıtlanmış, ama yanlış pozitif ve yanlış-negatif yüksek oranda sınırlıdır etkileşimler bu teknikler 15 ile ilgilidir. Ayrıca, kanıt dik yöntemleri birleştirerek elde edilen etkileşim veri kümesi 7 güvenilirliğini artırdığını büyüyor. HT-GPCA tekniğin son gelişmeler, memeli hücrelerinde ikili...

Protein-protein etkileşimleri haritaları oluşturmak için toplanan verilerin artan miktarda daha fazla patojen enfeksiyonları anlamak için perspektifler açar. Patojen enfeksiyonların küresel anlayış ortaya çıkmaya başladığında, bu insan proteom 1 bağlanırken patojenler proteinlerin neden olduğu tedirginlikler aralığında erişim sağlar. Bu sayede patojenlerin konak hücre makine işlemek nasıl anlamak için bir yol sunar. Özellikle, birçok viral-host etkileşim ağlarının haritalama viral proteinler tercihen yüksek (hub) hücresel ağa bağlı, ya da bir ağ (darboğazları proteinler) 2-4 birçok yollara merkezi olduğunu ana protein hedef ortaya koydu. Bu etkileşimler bulaşıcı döl çoğaltmak ve üretmek için enstrümantal olan virüsler önemli hücresel süreçleri işlemek için izin verir. Karşılaştırmalı etkileşimleri haritalama son göre bilgileri ayıklamak amacı ile ilgili virüsler üzerinde yapılmıştırpatogenezi 4. Ayrıca, ev sahibi-patojen etkileşimleri peyzaj çalışmaları birçok patojen 5 genişletilmiştir. Hedeflenen hücre faktörler kimlik hücreleri enfekte için patojenler tarafından kullanılan stratejileri içine bilgiler sağlar ve potansiyel patojen belirteçlerin algılanmasını sağlar. Maya iki hibrid sistemi genetik tarama protein-protein etkileşimleri yüksek verimli haritalama için verimli ve hassas bir araç olduğu için ikili etkileşimleri tanımlamak için en popüler yöntemdir. Yaklaşım, böylece patojen-ana protein-protein etkileşimleri karşılaştırmalı bir bakış erişim sağlayan, birden fazla patojen gerginlik türevleri bir protein değerlendirerek bireysel Y2H gösterimleri geliştirir Burada önerilen. Bunun toplam etkileşimleri 6 yaklaşık% 20 kurtarır Dahası, maya iki hibrit tarama önemli bir sınırlama, yüksek yanlış negatif oranı yatıyor. Bu pato yalnızca bir alt kümesini ile tespit bu etkileşimleri imagens türevleri başkalarıyla algılama kaçmış olabilir. Bu nedenle, tüm iki-hibrid gösterimleri çıkan bireysel ortaklar daha karşılaştırmalı etkileşim veri setleri sağlayarak, çalışılan suşları tam yelpazesi ile etkileşim için zorlanmaktadır. Farklı yöntemler birleştirerek güçlü protein-protein etkileşimi veri setleri 7 sağlamlığını artırır olduğu gösterilmiştir, çünkü bu doğrulama HT-GPCA 8 olarak adlandırılan yeni geliştirilmiş bir protein fragmanı tamamlama analizi ile memeli hücrelerinde gerçekleştirilir. Bu hücre-tabanlı sistem Gaussia princeps&#39;in complemantasyon protein etkileşimlerinin saptanmasında lusiferaz bölünmüş ve yüksek verimli bir formatta ile uyumlu olacak şekilde tasarlanmıştır sağlar. Onun lüminesans tabanlı teknoloji sayesinde ve düşük arka plan gürültü diğer floresan bazlı analiz ile karşılaştırıldığında, HT-GPCA çarpıcı yüksek hassasiyet gösterir. Genel olarak, bu yaklaşım, etkin bir teşkilkaçırma konak hücre küresel bir anlayış doğru ilk adımı temsil konak-patojen interplays kapsamlı haritalama, oluşturmak için bir araç.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast strains</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimal SD base</td>
			<td>US biological</td>
			<td>D9500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino acids</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-amino-1,2,4-Triazole (3-AT)</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>264571000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymolase</td>
			<td>Seikagaku</td>
			<td>120491</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>31966</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>BioWest</td>
			<td>S1810</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>14190</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>15140</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>25300</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Renilla luciferase assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2820</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White culture plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655083</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-wellPCR plates</td>
			<td>4titude</td>
			<td>4t-i0730/C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (30 &deg;C)</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (37 &deg;C)</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Berthold</td>
			<td>Centro XS-LB 960</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a comparative approach to characterize the landscape of host-pathogen protein-protein interactions

Önemli çabalar büyük ölçekli kapsamlı protein-protein etkileşimleri ağ haritaları oluşturmak için toplanmıştır. Bu patojen-konakçı ilişkileri anlamak için etkili olup, esas olarak maya iki-hibrid sistem genetik gösterimleri ile gerçekleştirildi. Bir Gaussia lusiferaz tabanlı parçası tamamlama yöntemi ile protein-protein etkileşimleri algılama son gelişme şimdi titizlikle hücresel faktörlerin ortak bir dizi karşı farklı patojen gerginlik seçenekleri arasından proteinlerin etkileşim profillerinin karşılaştırılması gerekli bütünleştirici karşılaştırmalı interactomic yaklaşımlar geliştirme fırsatı sunuyor. Bu kağıt özellikle protein-protein etkileşimleri veri setleri oluşturmak için iki dik yöntem birleştirme programı üzerinde duruluyor: maya iki hibrid (Y2H) ve yeni bir tahlil, memeli hücrelerinde yapılan yüksek verimli Gaussia princeps&#39;in protein tamamlama testi (HT-GPCA). nt &quot;bir patojen protein hücre ortaklar&gt; büyük ölçekli bir kimlik birden fazla patojen suşu türevleri kullanılarak cDNA kütüphaneleri iki-hibrid gösterimleri çiftleşme tabanlı maya tarafından gerçekleştirilir. yüksek güven istatistiksel puanlama seçilen etkileşim ortakların bir alt kümesi daha fazla olduğunu HT-GPCA kullanarak patojen türevleri proteinlerin tüm set ile çift-bilge etkileşimleri için memeli hücrelerinde geçerli. birbirini tamamlayan iki yöntem kombinasyonu etkileşim veri kümesi sağlamlığı artırır ve sıkı bir karşılaştırmalı etkileşim analizi performans sağlar. Böyle karşılaştırmalı interactomics deşifre herhangi bir patojen-ana interplays için güvenilir ve güçlü bir strateji oluşturmaktadır.

Şekil 2&#39;de HPV E2 protein (referans 13 uyarlanmıştır) için yanlış pozitif ve yanlış negatif oranları değerlendirilmesi ile gösterildiği gibi HT-GPCA önemli bir gücü, yüksek hassasiyet yatıyor. Yanlış negatif oranını belirlemek için, HPV16 gelen E2 bilinen etkileşimleri HT-GPCA (Şekil 2A) ile değerlendirildi. 18 etkileşimleri dışında dört (% 22 yanlış negatif oranı karşılık gelen) geri değildi. Yanlış pozitif etkileşimleri hücresel proteinler...

Watch this Scientific Journal Video about A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions at JoVE.com

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Bu makalede, ev sahibi ve iki dik yöntemleri bir arada kullanarak patojen proteinler arasında yüksek güvenen etkileşim veri setlerinin belirlenmesi üzerinde duruluyor: maya iki hibrit HT-GPCA adı verilen memeli hücrelerinde yüksek verimli bir etkileşim yöntemi ile izledi.

Ana-Patojen protein-protein etkileşimleri ve Peyzaj karakterize etmek Karşılaştırmalı Bir Yaklaşım

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

a-comparative-approach-to-characterize-landscape-host-pathogen

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.1K Görüntüleme.  Institut Pasteur. Bu makalede, ev sahibi ve iki dik yöntemleri bir arada kullanarak patojen proteinler arasında yüksek güvenen etkileşim veri setlerinin belirlenmesi üzerinde duruluyor: maya iki hibrit HT-GPCA adı verilen memeli hücrelerinde yüksek verimli bir etkileşim yöntemi ile izledi.

Video: A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

Dinamik Canlı Hücre Görüntüleme Konukçu-Patojen Etkileşimleri Çalışma Optik Tuzak

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

Uzun vadeli Host-patojen Etkileşimleri karakterize EpiAirway Model kullanın.

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage sequences share no homology to current annotated proteins. As a result, a large proportion of phage genes are annotated as hypothetical. This reality heavily affects the annotation of both structural and auxiliary metabolic genes. Here we present phenomic methods designed to capture the physiological response(s) of a selected host during expression of one of these unknown phage genes. Multi-phenotype Assay Plates (MAPs) are used to monitor the diversity of host substrate utilization and subsequent biomass formation, while metabolomics provides bi-product analysis by monitoring metabolite abundance and diversity. Both tools are used simultaneously to provide a phenotypic profile associated with expression of a single putative phage open reading frame (ORF). Representative results for both methods are compared, highlighting the phenotypic profile differences of a host carrying either putative structural or metabolic phage genes. In addition, the visualization techniques and high throughput computational pipelines that facilitated experimental analysis are presented.

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

Faj Phenomics: Fizyolojik Yaklaşımlar Roman Viral Proteinler karakterize etmek

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

Bakteri-konak Etkileşimleri karakterize etmek Biyomimetik Malzemeler

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Many experimental systems have been utilized to understand the mechanisms regulating T cell development and function in an immune response. Here a genetic approach using retroviral transduction is described, which is economic, time efficient, and most importantly, highly informative in identifying regulatory pathways.

Eğitim için bir genetik Yaklaşım olarak yardımcı T hücrelerinin retroviral İletimi Mekanizmaları kendi Farklılaşma ve Kontrol Fonksiyonunun

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into possible MOA, morphologic changes associated with antibiotic exposure can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Integrating SEM imaging with traditional kill curves may improve our insight into drug action and advance the drug development process. To test this premise, kill curves and SEM studies were conducted using drugs with known but different MOA (vancomycin and metronidazole). C. difficile cells (R20291) were grown with or without the presence of antibiotic for up to 48 h. Throughout the 48 h interval, cells were collected at multiple time points to determine antibiotic efficacy and for imaging on the SEM. Consistent with previous reports, vancomycin and metronidazole had significant bactericidal activity following 24 h of treatment as measured by colony-forming unit (CFU) counting. Using SEM imaging we determined that metronidazole had significant effects on cell length (&#62; 50% reduction in cell length for each antibiotic; P&#60; 0.05) compared to controls and vancomycin. While the phenotypic response to drug treatment has not been documented previously in this manner, they are consistent with the drug&#39;s MOA demonstrating the versatility and reliability of the imaging and measurements and the application of this technique for other experimental compounds.

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Antibiotic efficacy is most commonly determined by conducting killing kinetic studies and measuring colony forming units (CFUs). By integrating scanning electron microscopy (SEM) with these standard methods, we can distinguish the pharmacological effects of treatment between different antibiotics.

Morfolojik Değişiklikleri Karakterize Eden Bir Protokol<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; Antibiyotik Tedavisine Yanıt Vermek

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Ana bilgisayar-patojen yanıt ve aşı etkinliği farelerde değerlendirilmesi

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal drugs, IA can cause &#62;50% mortality in infected immunocompromised patients. It is crucial to determine both host and pathogen factors that contribute to infection susceptibility and low survival rates in infected patients in order to develop novel therapeutics. Innate immune responses play a pivotal role in recognition and clearance of Aspergillus spores, though little is known about the exact cellular and molecular mechanisms. Reliable models are required to investigate detailed mechanistic interactions between the host and pathogen. The optical clarity and genetic tractability of zebrafish larvae make them an intriguing model&#160;to study host-pathogen interactions of multiple human bacterial and fungal infections in a live and intact host. This protocol describes a larval zebrafish Aspergillus infection model. First, Aspergillus spores are isolated and injected into the zebrafish hindbrain ventricle via microinjection. Then, chemical inhibitors such as immunosuppressive drugs are added directly to the larval water. Two methods to monitor the infection in injected larvae are described, including the 1) homogenization of larvae for colony forming unit (CFU) enumeration and 2) a repeated, daily live imaging setup. Overall, these techniques can be used to mechanistically analyze the progression of Aspergillus infection in vivo and can be applied to different host backgrounds and Aspergillus strains to interrogate host-pathogen interactions.

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

This protocol describes an Aspergillus infection model in zebrafish larvae. Aspergillus spores are microinjected into the hindbrain of larvae, and chemical treatment is used to induce immunosuppression. Infection progression is monitored via a daily imaging setup to monitor fungal growth and immune responses as well as enumeration of live spores by colony forming unit plating.

Konakçı-Patojen Etkileşimlerinin Analizi için Zebra Balığı Larvalarının Aspergillus Sporları ile Enfeksiyonu

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal ...

Label-Free Quantitative Proteomics Workflow for Discovery-Driven Host-Pathogen Interactions

The technological achievements of mass spectrometry (MS)-based quantitative proteomics opens many undiscovered avenues for analyzing an organism&#8217;s global proteome under varying conditions. This powerful strategy applied to the interactions of microbial pathogens with the desired host comprehensively characterizes both perspectives towards infection. Herein, the workflow describes label-free quantification (LFQ) of the infectome of Cryptococcus neoformans, a fungal facultative intracellular pathogen that is the causative agent of the deadly disease cryptococcosis, in the presence of immortalized macrophage cells. The protocol details the proper protein preparation techniques for both pathogen and mammalian cells within a single experiment, resulting in appropriate peptide submission for liquid-chromatography (LC)-MS/MS analysis. The high throughput generic nature of LFQ allows a wide dynamic range of protein identification and quantification, as well as transferability to any host-pathogen infection setting, maintaining extreme sensitivity. The method is optimized to catalogue extensive, unbiased protein abundance profiles of a pathogen within infection-mimicking conditions. Specifically, the method demonstrated here provides essential information on C. neoformans pathogenesis, such as protein production necessary for virulence and identifies critical host proteins responding to microbial invasion.

Here, we present a protocol to profile the interplay between host and pathogen during infection by mass spectrometry-based proteomics. This protocol uses label-free quantification to measure changes in protein abundance of both host (e.g., macrophages) and pathogen (e.g., Cryptococcus neoformans) in a single experiment.

Keşif Odaklı Konak-Patojen Etkileşimleri için Etiketsiz Nicel Proteomik İş Akışı

The technological achievements of mass spectrometry (MS)-based quantitative proteomics opens many undiscovered avenues for analyzing an organism&#8217;s ...

Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions

Nowadays, it is possible to find a wide range of molecular tools available to study parasite-host cell interactions. However, some limitations exist to obtain commercial monoclonal or polyclonal antibodies that recognize specific cell structures and proteins in parasites. Besides, there are few commercial antibodies available to label trypanosomatids. Usually, polyclonal antibodies against parasites are prepared in-house and could be more challenging to use in combination with other antibodies produced in the same species. Here, the protocol demonstrates how to use polyclonal and monoclonal antibodies raised in the same species to perform double labeling immunofluorescence to study host cell and pathogen interactions. To achieve the double labeling immunofluorescence, it is crucial to incubate first the mouse polyclonal antibody and then follow the incubation with the secondary mouse IgG antibody conjugated to any fluorochrome. After that, an additional blocking step is necessary to prevent any trace of the primary antibody from being recognized by the next secondary antibody. Then, a mouse monoclonal antibody and its specific IgG subclass secondary antibody conjugated to a different fluorochrome are added to the sample at the appropriate times. Additionally, it is possible to perform triple labeling immunofluorescence using a third antibody raised in a different species. Also, structures such as nuclei and actin can be stained subsequently with their specific compounds or labels. Thus, these approaches presented here can be adjusted for any cell whose sources of primary antibodies are limited.

Here, the protocol describes how to perform double labeling immunofluorescence using primary antibodies raised in the same species to study host-pathogen interactions. Also, it can include the third antibody from a different host in this protocol. This approach can be made in any cell type and pathogens.

Konak-Patojen Etkileşimlerini İncelemek için Aynı Türden Antikorlar Kullanarak Çift Etiketleme İmmünofluoresans

Nowadays, it is possible to find a wide range of molecular tools available to study parasite-host cell interactions. However, some limitations exist to ...

Methods Article

Ana-Patojen protein-protein etkileşimleri ve Peyzaj karakterize etmek Karşılaştırmalı Bir Yaklaşım