이 작품은 파스퇴르 연구소의 자금 의해 리그 국립 contre 르 암 (보조금 R05/75-129 및 RS07/75-75), 협회 부어 라 공들인 쉬르 르 암 (/ 부여 ARC A09에서 교부금에 의해 부분적으로 지원되었다 오천삼십일분의 일 및 4867) 및 직원은 국립 드 라 공들인 (ANR07 MIME 009 02과 ANR09 풍채 026 01). MM은 MENRT의 교제받는 사람이었다.

1. 효모 두 하이브리드 스크리닝 <ol><li> 다음의 필수 솔루션을 만들기 : <ol><li> 완전한 합성 드롭 아웃 (SD)는 : 물 1 L의 포도당 최소 SD베이스의 26.7 g을 용해. 다음과 같이 준비 아미노산 혼합물 2g을 추가 2g 아데닌 hemisulfate, 2g 아르기닌 HCL에, 2g 히스티딘 염산, 2g 이소류신, 4g 류신, 2g 리진 염산, 2g 메티오닌, 3g 페닐알라닌, 2g L -세린, 2g L-트레오닌, 트립토판 3g, 2g 티로신 1.2 g 우라실, 9g 발린. </li><li> SD-L/-W/-H 아웃 선택 드롭 : SD가 그 지정된 제외한 모든 필수 아미노산을 포함하는 (-L :-류신,-W :-트립토판,-H :-히스티딘). </li><li> YPGLU : 1 L, 무게 효모 추출물, Bacto 펩톤 10 g와 포도당 20g의 10g하십시오. 고체 미디어 25g Bacto 한천로 작성합니다. </li><li> YCM : YPGLU과 동일하지만, pH를 4.5로 조정. </li></ol></li><li> 짝짓기 및 확산 <ol><li> 사전 변환 냉동 분주을 사용하여pACT2에서 복제 된 cDNA의 라이브러리를 포함 ED Y187 효모 균주 (연결 타입 α). SD-L 플레이트에 시리얼 희석 도금하여 세포 생존을 확인합니다. </li><li> pGBKT7 벡터에 병원체 ORF를 복제하고, AH109 효모 균주 (연결 유형)에 표준 절차를 사용하여 재조합 플라스미드를 변환 할 수 있습니다. </li><li> 확산 SD-W 플레이트에 AH109 효모 pGBKT7는 변환 된. 가습 배양기에서 적어도 두 일 30 ° C를 품어. 접시는 4 ° C에서 두 하이브리드 심사까지 저장할 수 있습니다. </li><li> 병원균 &#39;단백질에 의해 HIS3 리포터 유전자의 자기 transactivati​​on 잠재력을 방해하는 3 aminotriazole (3-AT), HIS3 효소의 경쟁적 억제제를 사용합니다. SD-W/-H 접시에 pGBKT7 변환 된 효모의 성장을 방지 3-AT의 농도를 측정하여 자동으로 정품 인증 테스트를 수행합니다. </li><li> pGBKT7 변환 된 AH109 몇 식민지와 SD-W의 씨앗 30 ML. 회전 30 ° C에서 30 시간을 품어. </li><li> 30 mL로 SD-W의 씨앗 200 MLAH109 문화. 30에서 20 시간 정도 회전 품어 ° C. </li><li> 20 ML YPGLU, 30 품어 10 분 ° 회전 C에서 cDNA를 라이브러리 변환 Y187를 해동 품어. </li><li> 20 ℃에서 3,500 rpm으로 5 분 동안 가능한 Y187 효모 세포의 상당 금액에 해당하는 pGBKT7 - 변환 AH109 문화의 볼륨을 원심 분리기 조심스럽게 10 ML YPGLU에서 뜨는을 Resuspend 펠렛을 철회. </li><li> Y187 포함하는 라이브러리를 재 부유 AH109 효모를 혼합합니다. 50 ML 튜브에 전송합니다. 20 3,500 rpm으로 5 분 ° C, 원심 분리주의 깊게 상층 철회 (깨지기 쉬운 펠렛). </li><li> YPGLU의 펠렛을 Resuspend 1.5 ML의 총을 얻을 수 있습니다. </li><li> 확산 효모 YCM-한천 3에 150mm 격판 덮개, 0.5 ML / 판. 30에 4.5 시간을 품어 ° C. </li><li> SD-L/-W/-H 10 ㎖에있는 레이크 유리로 긁어 YCM 판에서 성관계 효모를 수집합니다. 5 ML SD-L/-W/-H 매체와 풀과 접시를 두 번 헹구십시오. </li><li> 20, 3,500 rpm에서 5 분간 원심 분리° C. 뜨는을 취소하고 5 ML SD-L/-W/-H 배지에서 효모 펠렛을 resuspend을. </li><li> 자동 정품 인증 시험에서 측정 3 aminotriazole의 적절한 농도 (3-AT)와 보충 SD-L/-W/-H 한천의 10 판 (0.5 ML / 플레이트)에 어울리게 효모를 확산. 6-10일을위한 배양기에서 30 ° C에서 알을 품다. </li><li> SD-L/-W 접시에 어울리게 효모 현탁액의 연속 희석 250 μL (10 -6 ~ 10 -4) 확산에 의해 결합 효율을 평가하기 위하여 배체 (2N) 속도를 결정합니다. 이틀 동안 30 ° C에서 번호판을 품어. SD-L/-W에 성장 식민지를 계산하고 성관계 효모의 초기 볼륨에 존재하는 총 배체 번호를 추론. 배체 속도를 계산하기 위해 실행 가능한 라이브러리를 포함하는 효모 숫자로 배체 번호를보고합니다. 그것은 10-25 % 정도 범위한다. </li><li> 6-10일 30 부화 후 ° C, 신선한 SD-L/-W/-H의 성관계 효모 식민지 + 플레이트 3-AT를 선택합니다. [팁 : 주문 효모 8 구성표가]를 시퀀싱 이후 쉬울 것이다 그래야 96 웰 플레이트를 재현 12 우물의 차선. 효모 식민지 배양기에서 30 4-5일 ° C에 대한 성장하자. </li></ol></li><li> PCR 및 시퀀싱에 의해 HIS3 긍정적 인 클론의 선별 목표는 PCR은 ORF가 선택 SD-L/-H/-W 접시에 성장 효모 식민지의 pACT2 벡터에 포함 된 증폭하는 것입니다. <ol><li> 얼음에 96 잘 PCR 플레이트를 넣습니다. </li><li> 효모 세포를 용해하기 위해, 50 μL 당 잘 Zymolase 20T 솔루션 (10 MM의 HEPES 버퍼 pH가 7.7에서 2.5 밀리그램 / ML)를 추가합니다. </li><li> 부드럽게 잘 당 하나의 식민지를 resuspend을. </li><li> 37 95 ° C 및 15 분 ° C.에 15 분 알을 품다 </li><li> 얼음에 다시 접시를 넣어. 잘 당 증류수 50 μl를 추가합니다. 아래로 피펫에 의해 잘 섞는다. </li><li> 3,500 rpm을 4에서 5 분 동안 원심 분리기 ° C. </li><li> PCR은 pACT2 벡터에서의 cDNA에서 파생 된 ORF의 어느 측면을 어닐링 프라이머를 사용하여 삽입을 감지하는 10 μl를 증폭. 프로토콜은 g입니다ExTaq 중합 효소와 함께 96 용해 효모 식민지의 증폭 iven. 다음 혼합 준비 525 μL 10X ExTaq 버퍼 420 μL dNTPs 믹스 (2.5 ㎜), 10.5 μL 앞으로 프라이머 (1 ㎍ / ㎕의), 10.5 μL 역방향 프라이머 (1 ㎍ / ㎕의), 31.5 μL ExTaq를 (5 U / μL ) 및 3202.5 μL H 2 0. 96 잘 PCR 플레이트에 잘 당 믹스의 40 μl를 배포 할 수 있습니다. 당 잘 용해 효모의 10 μl를 추가합니다. 7 분 1 4 분 분, 72 ° C, 72로 끝나는 ° C를위한 30 초, 60 ° C에 대해 94에서 다음 3 분, 35주기 ° C에 대해 94 ° C : 다음과 같이 증폭을 수행합니다. PCR 양성 클론을 감지하는 1.2 % 아가로 오스 겔에 PCR 제품의 3 μl를 실행합니다. 사용하여 프리 캐스트 96도 아가 로스 젤을 권장합니다. [팁 : 플레이트가 몇 달 동안 -20 ° C에 저장하고 새로운 PCR을 위해 다시 사용할 수 있습니다] </li><li> HIS3 긍정적 인 클론에서 분리 PCR 증폭 단편 시퀀스입니다. 휴대 ORF를 식별하기 위해 BLAST 분석을 수행합니다. 낮은 신뢰 정렬 (E 값 &amp;GT, 10 -10, ID가 &lt;80 %, 펩타이드 길이 &lt;20 아미노산)뿐만 아니라 frameshifted 무시하고 서열을 포함하는 조기 정지 코돈. </li></ol></li></ol> 2. HT-GPCA을위한 매트릭스 건물 HT-GPCA 모두 병원체와 호스트 단백질이 일시적으로 분할 Gaussia 프린 루시 페라 제의 보완 조각에 융합 표현되는 포유 동물 세포 기반 분석이다. 파트너의 상호 작용에 따라,이 효소는 효소 활성의 측정을 허용 재구성합니다. 상호 작용 강도는 따라서 표준화 된 발광 비율 (아래 참조 및 그림 1)에서 추론된다 <ol start="4"><li> 숙주 세포 파트너의 선택 <ol><li> 데이터 집합의 신뢰 구를 높이기 위해 포유 동물 세포에서 추가 검증을 위해 Y2H 검사에서 3 회 이상 확인하는 단백질을 선택합니다. </li><li> positi의 같은 병원체 단백질의 알려진 상호 작용 파트너를 추가컨트롤 VE. </li></ol></li><li> HT-GPCA 호환 벡터로 전송 <ol><li> 아미노산 루시 페라 제 자신의 N-말단 (GL2 병원체 단백질 융합)에 융합 인간 답게 Gaussia의 프린의 110-185과 병원체 단백질을 생성하는 pSPICA-N2 벡터의 각 병원체 단백질 ORF를 복제합니다. </li><li> PCR은 ORF 직접 Y2H 긍정적 인 클론이나 다른 ORF 자원 (인적 ORFeome의에서 세포 단백질을 증폭 <a href="http://horfdb.dfci.harvard.edu/" target="_blank">http://horfdb.dfci.harvard.edu/</a> 와 N-말단에 융합 단백질을 생성하는)와 pSPICA-N1 벡터로 전송할 아미노산 인간 답게 Gaussia 프린 루시 페라 제 (GL1 호스트 단백질 융합)의 18-109. [팁 : 대규모 복제의 경우, 게이트웨이 복제 시스템이 권장됩니다. 이 경우, PCR 증폭을위한 게이트웨이와 호환 사이트를 포함하도록 디자인 된 프라이머를 사용]을 클릭합니다. </li><li> 시퀀스 모두 발현 벡터합니다. pSPICA-N1과 pSPICA-N2의 순서참고 8에서 찾을 수 있습니다. </li></ol></li></ol> 플라스미드 구조가 pSPICA-N1에서, 즉 병원체 단백질을 반전 및 호스트 단백질 pSPICA-N2로 할 수 있습니다. 3. 높은 처리량 Gaussia 프린 루시 페라 기반 단백질 보완 분석 실험 (HT-GPCA) <ol start="6"><li> 세포 형질 <ol><li> 항생제없이 10 % 태아 소 혈청 (FBS)와 DMEM의 35 세포 / ㎖에서 종자 293T 세포. / 잘 멸균 화이트 배양 접시에 100 μl를 배포 할 수 있습니다. 한 실험에서 10 판을 초과하지 마십시오. 세포는 5 % CO 2와 37 ° C에서 24 시간 동안 성장하자. [팁 :. pSPICA 플라스미드는 SV40 기원을 포함되기 때문에, 293T 세포의 사용은 형질 전환 세포에서의 복제를 허용하고 따라서 두 루시 페라 조각의 발현에 이르게] </li><li> 다음 날, 임의의 적절한 형질 프로토콜을 사용하여 형질 세포. 뉴 특정 형질 시약을 위해 그것을 참고세포 시드의 mber가 적응해야 할 수도 있습니다. 100 NG 당 잘 병원체와 호스트 ORF 플라스미드 구조를 모두 사용합니다. 형질 전환 효율 정상화 플라스미드 CMV-반딧불 루시 페라 제의 잘 당 공동 형질 10 NG. 각 점은 세중의에서 테스트합니다. [팁 :. DNA 혼합물은 접착 씰 형질 전날 수행하고 -20 ° C에 저장할 수 있습니다] </li><li> 배양 293T 세포의 접시에 형질 믹스를 전송합니다. 293T 강력하게 접착되지 않고 쉽게 잘 바닥에서 분리로 부드럽게 세포에 DNA 믹스를 입금주의하십시오. 5 % CO 2와 37 ° C에서 24-30 시간 동안 배양 세포 배양기에서 배양한다. </li></ol></li></ol><ol start="7"><li> 세포 용해 및 Gaussia 루시 페라 제의 투여 <ol><li> PBS (물론 100 μL /)로 세포를 씻어. 40 μL 1X Renilla의 용해 버퍼를 추가합니다. 교반 실온에서 30 분 동안 품어. </li><li> 다른 흰색 플랫폼에서 세포 용 해물의 10 μl를 저장반딧불 루시 페라 제 활동의 다음 복용량을위한 전자. 4에서 보관 ° C 또는 양자 택일 -20 ° 씰링 C. </li><li> Renilla의 루시 페라 제 분석 시약 100 μL를 추가하고 luminometer로 10 초 동안 발광을 계산하여 세포 용 해물의 나머지 30μl에 Gaussia 활동을 측정합니다. 96 잘 플레이트의 용량은 절반 정도 시간이 소요됩니다. 냉동 또는 장기 보관 상호 작용 매개 Gaussia 활동에 영향을 미칠 수 있기 때문에 신선한 세포 추출물 측정을 수행합니다. </li></ol></li></ol><ol start="8"><li> 반딧불 활동의 측정 <ol><li> 반딧불 루시 페라 제 분석 시약 50 μL를 추가하고 10 초 동안 발광을 계산하여 세포 용 해물의 저장 10 μL에 반딧불 활동을 측정합니다. 96 잘 플레이트의 용량은 절반 정도 시간이 소요됩니다. [팁 : 반딧불 루시 페라 제의 투여는 냉동 해물에 다음날 수행 할 수 있습니다.] </li></ol></li></ol><ol start="9"><li> NLR 계산 <ol><li&gt; 각 상호 작용, Gaussia 루시 페라 제 활동과 계정의 transfection 효율과 세포 생존 능력을 고려하여 표준화 된 Gaussia 발광 값을 얻기 위해 반딧불 루시 페라 제 활동 사이의 비율을 계산합니다. triplicates의 평균을 계산합니다. </li><li> 상호 작용을 모니터링하려면, 각 병원체 호스트 쌍에 대한 표준화 발광 비율 (NLR)를 추정한다. 이렇게하려면, 제어 우물에서 측정 활동의 합 (참고 8에서 적응 그림 1)에 의해 병원체와 호스트 단백질 양의 면전에서 발견 정규화 Gaussia 발광 활동을 나눕니다. 긍정적 인 상호 작용 NLR 컷오프 값은 3.5 약 8 할 것으로 추정하고있다. </li></ol></li></ol><ol start="10"><li> 데이터 분석 <ol><li> R 통계 패키지를 사용하여 계층 적 클러스터링을 수행합니다. 첫째, 그룹 범주로 NLR 데이터는 다음 완전한 결합 방법을 사용하여 상호 작용 dendrogram을 계산합니다. 이 시각화JavaTreeView 10로 dendrogram. 피어슨 상관 계수를 사용하여 상호 작용 dendrogram 및 계통 사이의 거리를 계산합니다. </li><li> 상호 작용 네트워크를 생성하려면 HT-GPCA 데이터 집합의 긍정적 인 상호 작용을 선택하고 Cytoscape 소프트웨어 사용 1. 호스트 단백질의 정도를 추출하고 네트워크 지역 역학에 액세스하기 위해 배포를 플롯. 호스트 병원체 네트워크는 호스트 셀룰러 네트워크에서 병원체 단백질의 글로벌 영향 평가를 제공하는 호스트 interactome에 중첩 할 수 있습니다. </li><li> GO (유전자 온톨로지) 데이터 집합의 기능 농축을 평가하는 DAVID 생물 정보학 데이터베이스 12 개 대상 세포 요인과 관련된 용어를 추출합니다. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Davey, N. E., Trave, G., Gibson, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+viruses+hijack+cell+regulation.">How viruses hijack cell regulation.</a> Trends in Biochemical Sciences. 36, 159-169 (2011).</li><li>Calderwood, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epstein-Barr+virus+and+virus+human+protein+interaction+maps.">Epstein-Barr virus and virus human protein interaction maps.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7606-7611 (2007).</li><li>de Chassey, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+C+virus+infection+protein+network.">Hepatitis C virus infection protein network.</a> Mol. Syst. Biol. 4, 230 (2008).</li><li>Simonis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-pathogen+interactome+mapping+for+HTLV-1+and+-2+retroviruses.">Host-pathogen interactome mapping for HTLV-1 and -2 retroviruses.</a> Retrovirology. 9, 26 (2012).</li><li>Dyer, M. D., Murali, T. M., Sobral, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+human+proteins+interacting+with+viruses+and+other+pathogens.">The landscape of human proteins interacting with viruses and other pathogens.</a> PLoS Pathog. 4, e32 (2008).</li><li>Rual, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+proteome-scale+map+of+the+human+protein-protein+interaction+network.">Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network.</a> Nature. 437, 1173-1178 (2005).</li><li>Venkatesan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+empirical+framework+for+binary+interactome+mapping.">An empirical framework for binary interactome mapping.</a> Nat. Methods. 6, 83-90 (2009).</li><li>Cassonnet, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchmarking+a+luciferase+complementation+assay+for+detecting+protein+complexes.">Benchmarking a luciferase complementation assay for detecting protein complexes.</a> Nat. Methods. 8, 990-992 (2011).</li><li>Ito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+two-hybrid+analysis+to+explore+the+yeast+protein+interactome.">A comprehensive two-hybrid analysis to explore the yeast protein interactome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 4569-4574 (2001).</li><li>Saldanha, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Java+Treeview--extensible+visualization+of+microarray+data.">Java Treeview--extensible visualization of microarray data.</a> Bioinformatics. 20, 3246-3248 (2004).</li><li>Smoot, M. E., Ono, K., Ruscheinski, J., Wang, P. L., Ideker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoscape+2.8:+new+features+for+data+integration+and+network+visualization.">Cytoscape 2.8: new features for data integration and network visualization.</a> Bioinformatics. 27, 431-432 (2011).</li><li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources.">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nat. Protoc. 4, 44-57 (2009).</li><li>Muller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+genotype+comparison+of+human+papillomavirus+E2-host+interaction+networks+provides+new+insights+for+e2+molecular+functions.">Large scale genotype comparison of human papillomavirus E2-host interaction networks provides new insights for e2 molecular functions.</a> PLoS Pathog. 8, e1002761 (2012).</li><li>Neveu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+virus-host+interactomes+with+a+mammalian+high-throughput+protein+complementation+assay+based+on+Gaussia+princeps+luciferase.">Comparative analysis of virus-host interactomes with a mammalian high-throughput protein complementation assay based on Gaussia princeps luciferase.</a> Methods. , (2012).</li><li>Braun, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimentally+derived+confidence+score+for+binary+protein-protein+interactions.">An experimentally derived confidence score for binary protein-protein interactions.</a> Nat. Methods. 6, 91-97 (2009).</li></ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

독립적으로, 효모 이러한 두 GST 풀다운 Lumier의 또는 MAPPIT으로 하이브리드 및 포유류의 상호 작용 분석은 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하는 효과적인 도구로 입증했지만, 양성과 거짓 음성의 높은 속도에 의해 제한됩니다 상호 작용은 이러한 기술 15과 관련된. 또한, 증거가 직교 방법을 결합하여 얻어진 상호 작용 데이터 세트 7의 신뢰성을 증가 시킨다는 성장하고있다. HT-GPCA...

단백질 - 단백질 상호 작용지도를 생성하기 위해 수집 된 데이터의 양이 증가 더욱 병원체 감염을 이해하는 관점을 엽니 다. 병원균 감염의 글로벌 이해가 등장하기 시작, 그것은 인간 프로테옴 1 연결할 때 병원균의 단백질에 의해 유도 교란의 범위에 대한 액세스를 제공합니다. 그것은 따라서 병원균이 숙주 세포의 기계를 조작하는 방법을 이해하는 방법을 제공합니다. 특히, 여러 가지 바이러스 호스트 상호 작용 네트워크의 매핑은 바이러스 성 단백질이 우선적으로 고 (허브) 셀룰러 네트워크에 연결되어 있거나 네트워크 (병목 단백질) 2-4 여러 경로의 중심되는 호스트 단백질을 표적으로 나타났습니다. 이러한 상호 작용은 전염성 자손을 복제하고 생산 수단이되는 바이러스는 중요한 세포 프로세스를 조작 할 수 있습니다. 비교 상호 작용을 매핑은 최근을 기준으로 정보를 추출하는 것을 목표로 관련 바이러스에 실시되었다발병 4. 또한, 호스트 병원체 상호 작용 풍경의 연구는 많은 병원체 5 확장되었습니다. 대상 셀 요인 식별 세포를 감염하는 병원체에 의해 사용되는 전략에 대한 통찰력을 제공하고 잠재적 인 병원성 마커를 감지 할 수 있습니다. 효모 두 하이브리드 시스템은 유전자 검사는 단백질 - 단백질 상호 작용의 높은 처리량 매핑을위한 효율적이고 중요한 도구이기 때문에 바이너리 상호 작용을 확인하는 가장 인기있는 방법입니다. 접근 방식은 더함으로써 병원체 호스트 단백질 - 단백질 상호 작용의 비교 개요에 대한 액세스를 제공, 여러 병원균 변형 변형 단백질을 평가하여 개별 Y2H 검진을 향상 여기에 제안했다. 그것은 전체의 상호 작용 6의 약 20 %를 복구 있기 때문에 또한, 효모 두 하이브리드 심사의 주요 제한은, 높은 위음성 율에 자리 잡고 있습니다. 이 병리의 부분 집합만을 감지하는 상호 작용을 의미씨족의 변형은 다른 사람과 감지를 탈출 할 수도 있습니다. 따라서 모든 두 하이브리드 검진에서 나오는 각각의 파트너는 더욱 비교 상호 작용 데이터 세트를 제공하는 연구 균주의 전체 범위의 상호 작용을 위해 도전하고 있습니다. 그것은 다른 방법을 결합하여 강력하게 단백질 - 단백질 상호 작용 데이터 세트 7의 견고성을 증가한다는 것을 증명 되었기 때문에,이 검증은 HT-GPCA 8이라는 새로 개발 된 단백질 조각 보완 분석하여 포유 동물 세포에서 수행됩니다. 이 셀 기반 시스템은 Gaussia 프린의 보완에 의한 단백질 상호 작용의 검출 루시 페라 제를 분할하고 높은 처리량 형식과 호환되도록 설계되었습니다 수 있습니다. 의 발광 기반 기술에 대한 감사의 낮은 배경 소음이 다른 형광 기반의 분석과 비교, HT-GPCA이 현저하게 높은 감도를 보여줍니다. 전반적으로,이 방법은 효율적 구성납치 숙주 세포의 세계 이해를 향한 첫 단계를 나타냅니다 호스트 병원체의 interplays의 포괄적 인 매핑을 생성하는 도구입니다.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast strains</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimal SD base</td>
			<td>US biological</td>
			<td>D9500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino acids</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-amino-1,2,4-Triazole (3-AT)</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>264571000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymolase</td>
			<td>Seikagaku</td>
			<td>120491</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>31966</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>BioWest</td>
			<td>S1810</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>14190</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>15140</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>25300</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Renilla luciferase assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2820</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White culture plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655083</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-wellPCR plates</td>
			<td>4titude</td>
			<td>4t-i0730/C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (30 &deg;C)</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (37 &deg;C)</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Berthold</td>
			<td>Centro XS-LB 960</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a comparative approach to characterize the landscape of host-pathogen protein-protein interactions

상당한 노력은 대규모의 종합 단백질 - 단백질 상호 작용 네트워크의지도를 생성하기 위해 모였다. 이 병원체 호스트 관계를 이해하는 수단이며, 본질적으로 효모 두 하이브리드 시스템을 유전 검사에 의해 수행되었다. Gaussia 루시 페라 기반의 파편 보완 분석에 의한 단백질 - 단백질 상호 작용 검출의 최근 개선은 이제 엄격 세포 요소의 공통 집합에 대해 서로 다른 병원체 변형 변종 단백질의 상호 작용 프로파일을 비교하기 위해 필요한 통합 비교 interactomic 방법을 개발하는 기회를 제공합니다. 이 논문은 특히 단백질 - 단백질 상호 작용 데이터 세트를 생성하는 두 개의 직교 방법을 결합하는 유틸리티에 초점을 맞추고 효모 두 하이브리드 (Y2H)과 새로운 분석, 포유 동물 세포에서 수행 높은 처리량 Gaussia 프린 단백질 보완 분석 (HT-GPCA). NT는 &quot;병원체 단백질의 세포 파트너&gt;의 대규모 식별은 여러 병원체 변형 변형을 사용하여 cDNA를 라이브러리의 두 하이브리드 상영 짝짓기 기반 효모에 의해 수행됩니다. 높은 신뢰도 통계 득점에서 선택한 상호 작용하는 파트너의 하위 집합이 더 있습니다 HT-GPCA을 사용 병원균의 변종 단백질의 전체 세트와 짝 상호 작용 포유 동물 세포에 확인. 두 개의 보완적인 방법이 조합은 상호 작용 데이터 집합의 견고성을 향상하고, 엄격한 비교의 상호 작용 분석의 성능을 할 수 있습니다. 이러한 비교 interactomics은 해독하는 병원체 호스트 interplays에 신뢰할 수있는 강력한 전략을 구성합니다.

그림 2의 HPV E2 단백질 (참고 13 일부터 적용)에 대한 거짓 긍정과 거짓 부정 비율의 평가에 의해 그림과 같이 HT-GPCA의 주요 장점은, 높은 감도에있다. 음성률을 확인하려면, HPV16에서 E2의 알려진 상호 작용은 HT-GPCA (그림 2A)에 의해 평가 하였다. 18의 상​​호 작용 중 네 가지가 (22 % 위음성 율에 해당) 복구되지 않았다. 거짓 긍정적 인 상호 작용은 세포 단백질의 임의의 집?...

Watch this Scientific Journal Video about A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions at JoVE.com

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

이 문서에서는 호스트와 두 개의 직교 방법의 조합을 사용 병원균의 단백질 사이의 높은 자신감 상호 작용 집합의 식별에 초점을 맞추고 효모 두 하이브리드 HT-GPCA이라는 포유 동물 세포에서 높은 처리량의 상호 작용 분석에 의해 따랐다.

호스트 병원체 단백질 - 단백질 상호 작용의 풍경의 특성을 비교 접근

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

a-comparative-approach-to-characterize-landscape-host-pathogen

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.1K 조회수.  Institut Pasteur. 이 문서에서는 호스트와 두 개의 직교 방법의 조합을 사용 병원균의 단백질 사이의 높은 자신감 상호 작용 집합의 식별에 초점을 맞추고 효모 두 하이브리드 HT-GPCA이라는 포유 동물 세포에서 높은 처리량의 상호 작용 분석에 의해 따랐다.

비디오: A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Comparative in vivo Study of gp96 Adjuvanticity in the Frog Xenopus laevis

We have developed in the amphibian Xenopus laevis a unique non-mammalian model to study the ability of certain heat shock proteins (hsps) such as gp96 to facilitate cross-presentation of chaperoned antigens and elicit innate and adaptive T cell responses. Xenopus skin graft rejection provides an excellent platform to study the ability of gp96 to elicit classical MHC class Ia (class Ia) restricted T cell responses. Additionally, the Xenopus model system also provides an attractive alternative to mice for exploring the ability of gp96 to generate responses against tumors that have down-regulated their class Ia molecules thereby escaping immune surveillance. Recently, we have developed an adoptive cell transfer assay in Xenopus clones using peritoneal leukocytes as antigen presenting cells (APCs), and shown that gp96 can prime CD8 T cell responses in vivo against minor histocompatibility skin antigens as well as against the Xenopus thymic tumor 15/0 that does not express class Ia molecules. We describe here the methodology involved to perform these assays including the elicitation, pulsing and adoptive transfer of peritoneal leukocytes, as well as the skin graft and tumor transplantation assays. Additionally we are also describing the harvesting and separation of peripheral blood leukocytes used for flow cytometry and proliferation assays which allow for further characterization of the effector populations involved in skin rejection and anti-tumor responses.

Comparative in vivo Study of gp96 Adjuvanticity in the Frog Xenopus laevis

The frog Xenopus laevis provides an attractive alternative non-mammalian model for exploring the ability of heat shock protein such as gp96 to promote antigen-specific CD8 T cell responses. We present methods to study in vivo facilitation of cross-presentation of skin and tumor antigens by gp96.

비교적 생체내에</em개구리의 gp96 Adjuvanticity의> 학습 Xenopus laevis</em

We have developed in the amphibian Xenopus laevis a unique non-mammalian model to study the ability of certain heat shock proteins (hsps) such as gp96 to ...

연구

면역학 및 감염병학

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

동적 라이브 셀 이미징에 대한 호스트 병원체 상호 작용 연구를위한 광학 트랩의 사용

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

장기 호스트 병원체 상호 작용을 특성화에 대한 EpiAirway 모델의 사용

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage sequences share no homology to current annotated proteins. As a result, a large proportion of phage genes are annotated as hypothetical. This reality heavily affects the annotation of both structural and auxiliary metabolic genes. Here we present phenomic methods designed to capture the physiological response(s) of a selected host during expression of one of these unknown phage genes. Multi-phenotype Assay Plates (MAPs) are used to monitor the diversity of host substrate utilization and subsequent biomass formation, while metabolomics provides bi-product analysis by monitoring metabolite abundance and diversity. Both tools are used simultaneously to provide a phenotypic profile associated with expression of a single putative phage open reading frame (ORF). Representative results for both methods are compared, highlighting the phenotypic profile differences of a host carrying either putative structural or metabolic phage genes. In addition, the visualization techniques and high throughput computational pipelines that facilitated experimental analysis are presented.

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

파지 Phenomics : 생리 학적 접근 방법은 소설 바이러스 성 단백질의 특성을

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

박테리아 - 호스트 상호 작용의 특성을 생체 모방 재료

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Many experimental systems have been utilized to understand the mechanisms regulating T cell development and function in an immune response. Here a genetic approach using retroviral transduction is described, which is economic, time efficient, and most importantly, highly informative in identifying regulatory pathways.

공부하는 유전 적 접근으로 헬퍼 T 세포의 레트로 바이러스 형질 도입은 메커니즘 자신의 차별화 및 기능 제어

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into possible MOA, morphologic changes associated with antibiotic exposure can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Integrating SEM imaging with traditional kill curves may improve our insight into drug action and advance the drug development process. To test this premise, kill curves and SEM studies were conducted using drugs with known but different MOA (vancomycin and metronidazole). C. difficile cells (R20291) were grown with or without the presence of antibiotic for up to 48 h. Throughout the 48 h interval, cells were collected at multiple time points to determine antibiotic efficacy and for imaging on the SEM. Consistent with previous reports, vancomycin and metronidazole had significant bactericidal activity following 24 h of treatment as measured by colony-forming unit (CFU) counting. Using SEM imaging we determined that metronidazole had significant effects on cell length (&#62; 50% reduction in cell length for each antibiotic; P&#60; 0.05) compared to controls and vancomycin. While the phenotypic response to drug treatment has not been documented previously in this manner, they are consistent with the drug&#39;s MOA demonstrating the versatility and reliability of the imaging and measurements and the application of this technique for other experimental compounds.

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Antibiotic efficacy is most commonly determined by conducting killing kinetic studies and measuring colony forming units (CFUs). By integrating scanning electron microscopy (SEM) with these standard methods, we can distinguish the pharmacological effects of treatment between different antibiotics.

형태 변화를 규명하기위한 프로토콜<em&gt; 클로스 트리 디움 디피 실</em&gt; 항생제 치료에 대한 반응

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

호스트 병원 체 응답 및 쥐에 백신의 효능 평가

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal drugs, IA can cause &#62;50% mortality in infected immunocompromised patients. It is crucial to determine both host and pathogen factors that contribute to infection susceptibility and low survival rates in infected patients in order to develop novel therapeutics. Innate immune responses play a pivotal role in recognition and clearance of Aspergillus spores, though little is known about the exact cellular and molecular mechanisms. Reliable models are required to investigate detailed mechanistic interactions between the host and pathogen. The optical clarity and genetic tractability of zebrafish larvae make them an intriguing model&#160;to study host-pathogen interactions of multiple human bacterial and fungal infections in a live and intact host. This protocol describes a larval zebrafish Aspergillus infection model. First, Aspergillus spores are isolated and injected into the zebrafish hindbrain ventricle via microinjection. Then, chemical inhibitors such as immunosuppressive drugs are added directly to the larval water. Two methods to monitor the infection in injected larvae are described, including the 1) homogenization of larvae for colony forming unit (CFU) enumeration and 2) a repeated, daily live imaging setup. Overall, these techniques can be used to mechanistically analyze the progression of Aspergillus infection in vivo and can be applied to different host backgrounds and Aspergillus strains to interrogate host-pathogen interactions.

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

This protocol describes an Aspergillus infection model in zebrafish larvae. Aspergillus spores are microinjected into the hindbrain of larvae, and chemical treatment is used to induce immunosuppression. Infection progression is monitored via a daily imaging setup to monitor fungal growth and immune responses as well as enumeration of live spores by colony forming unit plating.

호스트 병원체 상호 작용의 분석을 위한 아스퍼질러스 포자를 가진 얼룩말 물고기 애벌레의 감염

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal ...

Label-Free Quantitative Proteomics Workflow for Discovery-Driven Host-Pathogen Interactions

The technological achievements of mass spectrometry (MS)-based quantitative proteomics opens many undiscovered avenues for analyzing an organism&#8217;s global proteome under varying conditions. This powerful strategy applied to the interactions of microbial pathogens with the desired host comprehensively characterizes both perspectives towards infection. Herein, the workflow describes label-free quantification (LFQ) of the infectome of Cryptococcus neoformans, a fungal facultative intracellular pathogen that is the causative agent of the deadly disease cryptococcosis, in the presence of immortalized macrophage cells. The protocol details the proper protein preparation techniques for both pathogen and mammalian cells within a single experiment, resulting in appropriate peptide submission for liquid-chromatography (LC)-MS/MS analysis. The high throughput generic nature of LFQ allows a wide dynamic range of protein identification and quantification, as well as transferability to any host-pathogen infection setting, maintaining extreme sensitivity. The method is optimized to catalogue extensive, unbiased protein abundance profiles of a pathogen within infection-mimicking conditions. Specifically, the method demonstrated here provides essential information on C. neoformans pathogenesis, such as protein production necessary for virulence and identifies critical host proteins responding to microbial invasion.

Here, we present a protocol to profile the interplay between host and pathogen during infection by mass spectrometry-based proteomics. This protocol uses label-free quantification to measure changes in protein abundance of both host (e.g., macrophages) and pathogen (e.g., Cryptococcus neoformans) in a single experiment.

발견 중심의 숙주-병원균 상호 작용을 위한 라벨 프리 정량적 프로테오믹스 워크플로우

The technological achievements of mass spectrometry (MS)-based quantitative proteomics opens many undiscovered avenues for analyzing an organism&#8217;s ...