עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מימון מהמכון פסטר ועל ידי מענקים מLigue Nationale contre le הסרטן (מענקי R05/75-129 וRS07/75-75), איגוד pour la משוכלל ונדיר sur le הסרטן (מענקים ARC A09 / 1/5031 ו4867), וסוכנות הידיעות Nationale de la Recherche (ANR07 MIME 009 02 וANR09 הבעת 026 01). MM היה מקבל מלגת MENRT.

1. שתי הקרנות היברידיות-שמרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את פתרונות הדרושים הבאים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתוך סינטטי מלא בגלילה (SD): לפזר 26.7 גרם של בסיס SD מינימאלי עם גלוקוז ב1 ליטר של מים. הוסף 2 גרם של תערובת חומצת אמינו מוכנה כדלקמן: hemisulfate 2 גרם אדנין, 2 גרם ארגינין הידרוכלוריד, 2 גרם היסטידין HCl, 2 גרם Isoleucine, 4 גרם לאוצין, 2 גרם ליזין הידרוכלוריד, 2 גרם מתיונין, 3 גרם פנילאלנין, 2 גרם L -סרין, אורציל 2 גרם L-תראונין, 3 גרם טריפטופן, טירוזין G 2, 1.2 גר &#39;, 9 גרם Valine. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרוק סלקטיבית מתוך SD-L/-W/-H: SD המכיל כל חומצות אמינו חיוניות, למעט אלו שצוינו (-L:-אוצין;-W:-טריפטופן;-H:-היסטידין). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> YPGLU: עבור 1 ליטר, במשקל 10 גרם של תמצית שמרים, 10 גרם של Bacto Peptone ו20 גרם של גלוקוז. השלם עם 25 גרם אגר Bacto לתקשורת מוצקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> YCM: כמו YPGLU, אבל מותאם לרמת חומציות 4.5. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזדווגות ומתפשט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש aliquots הקפוא של טרום ההתמרהזן אד Y187 שמרים (הזדווגות הסוג α) המכיל ספריית cDNA המשובטת בpACT2. בדקו כדאיות תא על ידי ציפוי דילולים סדרו על צלחות SD-L. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשכפל ORF הפתוגן לתוך pGBKT7 וקטור, ולהפוך את פלסמיד רקומביננטי באמצעות הליך סטנדרטי לזן שמרי AH109 (סוג הזדווגות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מורחים pGBKT7-שינו AH109 שמרים על צלחות SD-W. דגירה לפחות יומיים 30 ° C בחממת humidified. ניתן לאחסן צלחות על 4 מעלות צלזיוס עד להקרנת שתי ההיברידית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 3-aminotriazole (3-AT), מעכב תחרותי של אנזים HIS3, כדי לנטרל את transactivation עצמי הפוטנציאל של גן הכתב HIS3 על ידי החלבונים של פתוגנים. בצע בדיקה אוטומטי הפעלה על ידי קביעת הריכוז של 3-AT, אשר מונע צמיחה של שמרי pGBKT7-הופכים על צלחות SD-W/-H. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיליליטר זרע 30 של SD-W עם כמה מושבות של AH109 pGBKT7-טרנספורמציה. דגירה 30 שעות ב 30 ° C עם רוטציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעים 200 מ&quot;ל של SD-W עם 30 מ&quot;למAH109 התרבויות. דגירה עם סיבוב סביב 20 שעות ב 30 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה מופשר Y187-ספרייה הפך cDNA ב20 מ&quot;ל YPGLU, דגירה 10 דקות בשעה 30 ° C עם רוטציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה נפח pGBKT7-שינתה AH109 התרבות מקבילה לסכום שווה ערך של תאי שמרי Y187 קיימא עבור 5 דקות ב 3500 סל&quot;ד ב 20 ° C. למשוך את supernatant ו resuspend גלולה ב 10 מ&quot;ל YPGLU בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את שמרי AH109 המושעים עם Y187 ספרייה ובה. להעביר בצינור 50 מ&quot;ל. צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 3500 סל&quot;ד ב 20 ° C, לסגת בזהירות supernatant (גלולה שבירה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה בYPGLU כדי לקבל סכום כולל של 1.5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמרים מורחים על 3 YCM-אגר 150 צלחות מ&quot;מ, 0.5 מ&quot;ל / צלחת. דגירה 4.5 שעות ב 30 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף שמרי הזדווגו מצלחות YCM על ידי גירוד עם כוס לגרוף 10 מ&quot;ל של SD-L/-W/-H. יש לשטוף את הצלחות שתי פעמים עם מדיום SD-L/-W/-H 5 מ&quot;ל ובריכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 5 דקות ב -3,500 סל&quot;ד, 20° C. בטל supernatant ו resuspend את השמרים בגלולה 5 בינוניות SD-L/-W/-H מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מורחים שמרי הזדווגו על 10 צלחות (0.5 מ&quot;ל / צלחת) של אגר SD-L/-W/-H השלימו עם הריכוז המתאים של 3-aminotriazole (3-AT) נקבע בבדיקה אוטומטית ההפעלה. לדגור על 30 מעלות צלזיוס באווירת humidified עבור 6-10 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע דיפלואידי (2n) השיעור על מנת להעריך את יעילות הזדווגות על ידי הפצת 250 μl של דילולים סדרתי (10 -4 עד 10 -6) של ההשעיה שמרי הזדווגו על צלחות SD-L/-W. דגירה צלחות על 30 מעלות צלזיוס במשך יומיים. לספור מושבות גדלו על SD-L/-W, ולהסיק המספר הכולל דיפלואידי ההווה בהיקף הראשוני של שמרי הזדווגו. דווח על מספר דיפלואידי זה למספר שמרים המכיל ספרייה בת קיימא כדי לחשב את שיעור דיפלואידי. זה צריך לנוע סביב 10-25%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 6-10 ימים לאחר דגירה על 30 מעלות צלזיוס, לבחור מושבות שמרי הזדווגו בSD-L/-W/-H הטרי + 3-AT צלחות. [טיפ: כדי השמרים בערכה של 8נתיבים של 12 בארות המתרבות בצלחת 96 היטב, כדי שיהיה קל יותר אחר כך עבור סידור]. בואו מושבות שמרים לגדול במשך 4-5 ימים ב30 ° C באווירת humidified. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקרנה של HIS3 שיבוטים חיוביים על ידי PCR וסדר המטרה היא PCR להגביר ORF כלול בpACT2 וקטורים של מושבות שמרים שגדלו על צלחות SD-L/-H/-W סלקטיבית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשים היטב PCR צלחת 96 על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לlyse תאי שמרים, להוסיף 50 μl לכל טוב של פתרון 20T Zymolase (2.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ב10 מ&quot;מ המאגר pH HEPES 7.7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות resuspend מושבה אחת בכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 15 דקות בשעה 37 ° C ו 15 דקות ב 95 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את הצלחת בחזרה על קרח. הוסף 50 μl של מים מזוקקים בכל טוב. מערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 3500 סל&quot;ד ו 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PCR להגביר 10 μl לזהות באמצעות הוספת פריימרים חישול או צדדים של ORF נגזרים מcDNA בpACT2 וקטורים. הפרוטוקול הוא GIven להגברה של 96 מושבות שמרי lysed עם פולימראז ExTaq. מכין את התערובת הבאה: 525 חיץ μl 10X ExTaq, 420 תמהיל dNTPs μl (2.5 מ&quot;מ), 10.5 פריימר קדימה μl (1 מיקרוגרם / μl), 10.5 פריימר ההפוך μl (1 מיקרוגרם / μl), 31.5 ExTaq μl (5 U / μl ) ו3202.5 H 2 0 μl. הפץ 40 μl של התערובת לכל גם בצלחת 96-PCR היטב. הוסף 10 μl של שמרי lysed בכל טוב. לבצע הגברה כדלקמן: 94 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות, ולאחר מכן 35 מחזורים ב 94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 60 מעלות צלזיוס במשך דקות 1, 72 מעלות צלזיוס במשך 4 דקות, וסופו של דבר עם 72 מעלות צלזיוס במשך 7 דקות. הפעלת 3 μl של מוצרי ה-PCR על 1.2% ג&#39;ל agarose כדי לזהות שיבוטים PCR-חיוביים. שים לב שהשימוש טרום יציקה 96 גם agarose ג&#39;לי מומלץ. [טיפ: ניתן לאחסן צלחת ב -20 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים ושימוש חוזרת לPCR החדש] </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצף שברי PCR מוגברים בודדו מHIS3 שיבוטים חיוביים. לבצע ניתוח תפציץ לזהות הסלולרי ORF. מערכים נמוך ביטחון (E &amp; ערךGT; 10 -10, זהות &lt;80%, אורך הפפטיד &lt;20 חומצות אמינו) מבוטלות, כמו גם frameshifted והמוקדם קודון STOP המכיל רצפים. </li></ol></li></ol> 2. מטריקס בניין לHT-GPCA HT-GPCA הוא assay מבוסס תאי יונקים שבו שני חלבוני הפתוגן ומארח transiently הביעו התמזגו ברים משלימים של פיצול לוציפראז Princeps Gaussia. על האינטראקציה של בני הזוג, אנזים זה מחדש ומאפשר מידה של הפעילות האנזימטית שלה. עוצמת האינטראקציה היא להסיק מכך יחס הארה מנורמל (ראה להלן ואיור 1) <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחירה של שותפי תא מארח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר חלבונים שמזוהים יותר משלוש פעמים בהקרנות Y2H עבור אימות נוספת בתאי יונקים להגדיל את מערך הביטחון 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף שותפים באינטראקציה ידועה של חלבוני הפתוגן כpositive פקדים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר לוקטורים תואמים HT-GPCA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשכפל כל חלבון ORF הפתוגן בוקטור pSPICA-N2 לייצר חלבוני הפתוגן עם חומצות אמינו 110-185 של Princeps Gaussia מואנשים התמזגו לוציפראז ב( fusions חלבון GL2 לפתוגן) N-סופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PCR להגביר חלבון תאי ORF ישירות מהשיבוטים החיוביים Y2H או ממקורות אחרים ORF (ORFeome אנוש <a href="http://horfdb.dfci.harvard.edu/" target="_blank">http://horfdb.dfci.harvard.edu/)</a> ולהעביר אותם לוקטורי pSPICA-N1 כדי לייצר חלבונים התמזגו בN-הסופית עם חומצות אמינו של 18-109 האנושי Gaussia Princeps לוציפראז (fusions חלבון GL1-מארחת). [עצה: לשיבוט בקנה מידה גדול, מערכת שיבוט השער מומלצת. במקרה זה, להגברת PCR, השתמש פריימרים נועדו להכיל אתרים תואמים Gateway]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצף כל וקטורי הביטוי. רצפים של pSPICA-N1 ו-N2 pSPICAניתן למצוא בהתייחסות 8. </li></ol></li></ol> שים לב שניתן inversed בונה פלסמיד, חלבונים פתוגנים כלומר בpSPICA-N1 ומארח חלבון לתוך pSPICA-N2. 3. Assay תפוקה גבוהה Gaussia Princeps מבוסס לוציפראז חלבון שלמה (HT-GPCA) <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfection הסלולרי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 293T תאי זרע ב350,000 תאים / מ&quot;ל ​​של DMEM עם סרום 10% שור עוברי (FBS) ללא אנטיביוטיקה. הפץ 100 μl / היטב בתרבות צלחות לבנות סטרילי. לא יעלה על 10 צלחות בניסוי יחידה. בואו תאים לגדול במשך 24 שעות ב 37 ° C עם 5% CO 2. [טיפ:. מאז פלסמידים pSPICA מכילים המוצא SV40, השימוש בתאי 293T מאפשר השכפול שלהם בתאי transfected ובכך מוביל לביטוי יתר של שני שברי לוציפראז] </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, תאי transfect באמצעות כל פרוטוקול transfection מתאים. שימו לב כי לריאגנטים transfection מסוימים, נוmber של תאים שנזרעו אולי צריך להיות מותאם. השתמש 100 ננוגרם לכל גם הן את הפתוגן ומארח ORF בונה פלסמיד. שיתוף transfect 10 ng לכל גם של CMV-Firefly לוציפראז פלסמיד לנרמל ליעילות transfection. כל נקודה היא נבדק בשלושה עותקים. [טיפ:. ניתן לבצע תערובות DNA היום לפני transfection ומאוחסנות ב -20 ° C עם חותמות דבק] </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את תערובת transfection לצלחות של תאי 293T תרבית. להיות זהיר כדי להפקיד את התערובת בעדינות על ה-DNA בתאים, כמו 293T הם לא מאוד חסיד ולנתק בקלות מתחתית הבאר. דגירה בתא תרבות חממה עבור 24-30 שעות ב 37 ° C עם 5% CO 2. </li></ol></li></ol><ol start="7" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמוגה תא ומינון לוציפראז Gaussia <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים עם PBS (100 μl / טוב). הוסף 40 מאגר תמוגה Renilla 1X μl. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר תחת תסיסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסוך 10 μl של lysates התא בפלאט הלבן אחרדואר למינון הבא של פעילות לוציפראז Firefly. החנות ב 4 מעלות צלזיוס או לחלופין ב -20 ° C עם איטום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את פעילות Gaussia על 30μl הנותרים של lysates תא על ידי הוספת 100 μl של מגיב assay לוציפראז Renilla וספירת הארה עבור 10 שניות עם luminometer. המינון של 96 צלחת גם לוקח בערך חצי שעה. לבצע מדידה עם תמציות תאי אחסון טריות מאז הקפאה או לטווח ארוך עשוי להשפיע על פעילות Gaussia אינטראקציה בתיווך. </li></ol></li></ol><ol start="8" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדידה של פעילות Firefly <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את הפעילות בגחלילית הציל 10 μl של lysates תא על ידי הוספת 50 μl של מגיב assay לוציפראז Firefly וספירת הארה עבור 10 שניות. המינון של 96 צלחת גם לוקח בערך חצי שעה. [טיפ: המינון של Firefly לוציפראז יכול להתבצע ביום שאחרי על lysates קפוא.] </li></ol></li></ol><ol start="9" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישובי NLR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li&gt; לכל אינטראקציה, לחשב את היחס בין פעילות לוציפראז Gaussia ופעילות לוציפראז Firefly להשיג ערך הארה Gaussia מנורמל תוך לקיחה בחשבון של היעילות transfection וכדאיויות תא. לחשב את הממוצע של triplicates. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לפקח על האינטראקציה, מעריך יחס הארה מנורמל (NLR) עבור כל זוג הפתוגן-מארח. לשם כך, יש לחלק את פעילות הארה Gaussia המנורמלת זוהתה בנוכחותם של שני חלבוני הפתוגן ומארח בסכום של הפעילות שנמדדה בשליטת בארות (איור 1 מותאם מהתייחסות 8). ערך חתך NLR לאינטראקציות חיוביות כבר מוערך כ 3.5 8. </li></ol></li></ol><ol start="10" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע אשכולות היררכי באמצעות חבילת נתון R. ראשית, קבוצה את נתוני NLR לקטגוריות, ואז לחשב dendrogram אינטראקציה תוך שימוש בשיטת ההצמדה המלאה. דמיינו את זהdendrogram עם JavaTreeView 10. לחשב את המרחק בין dendrogram אינטראקציה ועץ פילוגנטי באמצעות מקדם מתאם פירסון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור אינטראקציה רשתות, בחר את האינטראקציות חיוביות מבסיס נתוני HT-GPCA ולהשתמש בתוכנת Cytoscape 1. חלץ את מעלות של החלבונים המארחים ולהתוות ההפצה שלהם כדי לגשת לדינמיקה המקומית ברשת. ניתן גבי רשתות Host-פתוגנים לinteractome המארח כדי לספק הערכה של ההשפעה הגלובלית של חלבוני הפתוגן ברשת הסלולרית המארחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלץ GO (אונטולוגיה ג&#39;ין) מונחים הקשורים לגורמים הסלולריים הממוקדים עם דוד מסד הנתונים ביואינפורמטיקה 12 להעריך את ההעשרה התפקודית של בסיס הנתונים. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Davey, N. E., Trave, G., Gibson, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+viruses+hijack+cell+regulation.">How viruses hijack cell regulation.</a> Trends in Biochemical Sciences. 36, 159-169 (2011).</li><li>Calderwood, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epstein-Barr+virus+and+virus+human+protein+interaction+maps.">Epstein-Barr virus and virus human protein interaction maps.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7606-7611 (2007).</li><li>de Chassey, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+C+virus+infection+protein+network.">Hepatitis C virus infection protein network.</a> Mol. Syst. Biol. 4, 230 (2008).</li><li>Simonis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-pathogen+interactome+mapping+for+HTLV-1+and+-2+retroviruses.">Host-pathogen interactome mapping for HTLV-1 and -2 retroviruses.</a> Retrovirology. 9, 26 (2012).</li><li>Dyer, M. D., Murali, T. M., Sobral, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+human+proteins+interacting+with+viruses+and+other+pathogens.">The landscape of human proteins interacting with viruses and other pathogens.</a> PLoS Pathog. 4, e32 (2008).</li><li>Rual, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+proteome-scale+map+of+the+human+protein-protein+interaction+network.">Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network.</a> Nature. 437, 1173-1178 (2005).</li><li>Venkatesan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+empirical+framework+for+binary+interactome+mapping.">An empirical framework for binary interactome mapping.</a> Nat. Methods. 6, 83-90 (2009).</li><li>Cassonnet, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchmarking+a+luciferase+complementation+assay+for+detecting+protein+complexes.">Benchmarking a luciferase complementation assay for detecting protein complexes.</a> Nat. Methods. 8, 990-992 (2011).</li><li>Ito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+two-hybrid+analysis+to+explore+the+yeast+protein+interactome.">A comprehensive two-hybrid analysis to explore the yeast protein interactome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 4569-4574 (2001).</li><li>Saldanha, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Java+Treeview--extensible+visualization+of+microarray+data.">Java Treeview--extensible visualization of microarray data.</a> Bioinformatics. 20, 3246-3248 (2004).</li><li>Smoot, M. E., Ono, K., Ruscheinski, J., Wang, P. L., Ideker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoscape+2.8:+new+features+for+data+integration+and+network+visualization.">Cytoscape 2.8: new features for data integration and network visualization.</a> Bioinformatics. 27, 431-432 (2011).</li><li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources.">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nat. Protoc. 4, 44-57 (2009).</li><li>Muller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+genotype+comparison+of+human+papillomavirus+E2-host+interaction+networks+provides+new+insights+for+e2+molecular+functions.">Large scale genotype comparison of human papillomavirus E2-host interaction networks provides new insights for e2 molecular functions.</a> PLoS Pathog. 8, e1002761 (2012).</li><li>Neveu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+virus-host+interactomes+with+a+mammalian+high-throughput+protein+complementation+assay+based+on+Gaussia+princeps+luciferase.">Comparative analysis of virus-host interactomes with a mammalian high-throughput protein complementation assay based on Gaussia princeps luciferase.</a> Methods. , (2012).</li><li>Braun, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimentally+derived+confidence+score+for+binary+protein-protein+interactions.">An experimentally derived confidence score for binary protein-protein interactions.</a> Nat. Methods. 6, 91-97 (2009).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

באופן עצמאי, שמרים, שני מבחני אינטראקציה היברידיים ויונקים, כגון GST הנפתח, LUMIER או MAPPIT, הוכיחו להיות כלים יעילים לאיתור חלבונים אינטראקציות, אבל מוגבלים על ידי השיעור הגבוה של חיובית שגוי וכוזב שליליים אינטראקציות קשורות לטכניקות אלה 15. יתר על כן, ראיות הולכות וג?...

הכמות הולכת והגדלה של נתונים שנאספו כדי ליצור מפות אינטראקציה בין חלבונים פותחת אופקים כדי להבין עוד יותר זיהומי הפתוגן. ככל שהבנה הגלובלית של זיהומי פתוגן מתחילה להתגלות, הוא מספק גישה למגוון של הפרעות הנגרמות על ידי חלבוני גורמי מחלה בעת חיבור proteome האנושי 1. זה ובכך מציע דרך כדי להבין איך לתפעל את מכונות פתוגנים התא המארחת. בפרט, המיפוי של מספר רשתות אינטראקציה ויראלי-מארחות גילה כי חלבונים נגיפיים מעדיפים למקד חלבונים מארחים שהם מאוד מחוברים ברשת הסלולרית (רכזות), או שהם מרכזיים בנתיבים רבים ברשת (חלבוני צווארי בקבוק) 2-4. אינטראקציות אלה מאפשרים לוירוסים כדי לתפעל תהליכים תאיים חשובים, אשר היא סייע לשכפל ולייצר צאצאים מדבקים. מיפוי אינטראקציות השוואתי שנערכו לאחרונה על וירוסים הקשורים במטרה לחלץ מידע ביחס לפתוגנזה 4. יתר על כן, מחקרים של הנוף מארח פתוגנים האינטראקציות שהורחבו לפתוגנים רבים 5. זיהוי הגורמים ממוקד התא מספק תובנות האסטרטגיות בשימוש על ידי פתוגנים להדביק תאים ומאפשר זיהוי של סמנים פתוגניים פוטנציאליים. המערכת דו היברידי השמרים היא השיטה הפופולרית ביותר לזיהוי אינטראקציות בינאריים מאז סריקות גנטיות היא כלי יעיל ורגיש למיפוי תפוקה גבוהה של אינטראקציות בין חלבונים. הגישה מוצעת כאן עוד יותר משפר את הקרנות Y2H בודדות על ידי הערכת חלבון של גרסאות זן פתוגנים רבות, המספק גישה לסקירה השוואתית של אינטראקציות בין חלבונים הפתוגן-מארחים וכך. יתר על כן, מגבלה עיקרית של הקרנת שתי היברידי שמרים טמון בשיעור שגוי שלילי גבוה, מאחר שהוא מתאושש כ -20% מאינטראקציות סה&quot;כ 6. משמעות הדבר הוא כי אינטראקציות עם אותרו רק קבוצת משנה של פתיוגרסאות גנס אולי חמקו מזיהוי עם האחרים. לכן, שותפים בודדים המתעוררים מכל ההקרנות של שתי ההיברידיות מאותגרים עוד יותר לאינטראקציה עם מגוון רחב של זנים למדו מלא, ומספקים מערכי נתונים השוואתיים אינטראקציה. מאז שהוכיח כי שילוב מתודולוגיות שונות מגביר משמעותי את החוסן של מערכי נתונים אינטראקציה בין חלבונים 7, אימות זה מבוצעת בתאי יונקים ידי assay שלמת חלבון שבר חדש שפותח בשם HT-GPCA 8. מערכת מבוססת תא זה מאפשר זיהוי של אינטראקציות חלבון על ידי שלמה של Princeps Gaussia לפצל לוציפראז ותוכנן כך שיתאים לפורמט תפוקה גבוהה. הודות לטכנולוגיה המבוססת על הארה שלה ורעש הרקע הנמוך שלה בהשוואה לassay הקרינה מבוססת אחרים, HT-GPCA מציג רגישות גבוהה להפליא. באופן כללי, גישה זו מהווה יעילהכלי ליצירת מיפוי מקיף של interplays מאכסן לפתוגן, המייצג את הצעד הראשון לקראת הבנה גלובלית של התא המארח חטיפה.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast strains</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimal SD base</td>
			<td>US biological</td>
			<td>D9500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino acids</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-amino-1,2,4-Triazole (3-AT)</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>264571000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymolase</td>
			<td>Seikagaku</td>
			<td>120491</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>31966</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>BioWest</td>
			<td>S1810</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>14190</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>15140</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>25300</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Renilla luciferase assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2820</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White culture plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655083</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-wellPCR plates</td>
			<td>4titude</td>
			<td>4t-i0730/C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (30 &deg;C)</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (37 &deg;C)</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Berthold</td>
			<td>Centro XS-LB 960</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a comparative approach to characterize the landscape of host-pathogen protein-protein interactions

מאמצים משמעותיים נאספו ליצירת מפות רשת אינטראקציה בין חלבונים מקיפות בקנה מידה גדולה. זו היא סייעה להבין את יחסי פתוגן-מארחים ולמעשה בוצעה על ידי הקרנות גנטיות בשמרים שתי מערכות היברידיות. השיפור האחרון של זיהוי אינטראקציה בין חלבונים על ידי assay שלמת בר מבוסס לוציפראז Gaussia מציע כעת את ההזדמנות לפתח גישות interactomic השוואתיות אינטגרטיביים הדרושים על מנת להשוות בקפדנות פרופילי אינטראקציה של חלבונים מגרסות זן פתוגן שונים נגד מערך משותף של גורמים הסלולר. מאמר זה מתמקד באופן ספציפי את השירות של שילוב של שתי שיטות מאונך ליצירת מערכי נתונים אינטראקציה בין חלבונים: שמרי שני היברידי (Y2H) ובדיקה חדש, assay תפוקה גבוהה Gaussia Princeps חלבון שלמה (HT-GPCA) שבוצע בתאי יונקים. NT &quot;&gt; זיהוי בקנה מידה גדול של שותפים הסלולר של חלבון הפתוגן מבוצע על ידי הזדווגות מבוססת שמרי הקרנות שתי היברידיות של ספריות cDNA באמצעות גרסאות זן פתוגן מרובות. משנה של שותפים באינטראקציה שנבחרו על ניקוד ברמת הוודאות גבוהה הוא סטטיסטי נוסף תוקף בתאי יונקים לאינטראקציות חכמות זוג עם המערך השלם של חלבוני גרסאות פתוגן באמצעות HT-GPCA. זה שילוב של שתי שיטות משלימות משפר את חוסנו של מערך יחסי הגומלין, ומאפשר ביצועים של ניתוח השוואתי אינטראקציה מחמירה. interactomics השוואתי כאלה מהווה אסטרטגיה אמינה וחזקה לפענח כל interplays הפתוגן-מארח.

כוח עיקרי של HT-GPCA טמון ברגישות הגבוהה שלו, כפי שמודגם על ידי ההערכה של שיעורים שליליים שווא ושקר חיובי לחלבון HPV E2 באיור 2 (עיבוד ההתייחסות 13). כדי לקבוע את השיעור השלילי הכוזב, אינטראקציות ידועות של E2 מHPV16 הוערכו על ידי HT-GPCA (איור 2 א). ארבעה מתוך 18 אינטר?...

Watch this Scientific Journal Video about A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions at JoVE.com

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

מאמר זה מתמקד בזיהוי של מערכי נתונים אינטראקציה גבוה בין המארח בטוח וחלבוני הפתוגן באמצעות שילוב של שתי שיטות מאונך: שמרים שני היברידיים ואחרי assay אינטראקציה תפוקה גבוהה בתאי יונקים הנקרא HT-GPCA.

גישה השוואתית כדי לאפיין את הנוף של אינטראקציות בין חלבונים מאכסן לפתוגן

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

a-comparative-approach-to-characterize-landscape-host-pathogen

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.1K Views.  Institut Pasteur. מאמר זה מתמקד בזיהוי של מערכי נתונים אינטראקציה גבוה בין המארח בטוח וחלבוני הפתוגן באמצעות שילוב של שתי שיטות מאונך: שמרים שני היברידיים ואחרי assay אינטראקציה תפוקה גבוהה בתאי יונקים הנקרא HT-GPCA.

Video: A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Comparative in vivo Study of gp96 Adjuvanticity in the Frog Xenopus laevis

We have developed in the amphibian Xenopus laevis a unique non-mammalian model to study the ability of certain heat shock proteins (hsps) such as gp96 to facilitate cross-presentation of chaperoned antigens and elicit innate and adaptive T cell responses. Xenopus skin graft rejection provides an excellent platform to study the ability of gp96 to elicit classical MHC class Ia (class Ia) restricted T cell responses. Additionally, the Xenopus model system also provides an attractive alternative to mice for exploring the ability of gp96 to generate responses against tumors that have down-regulated their class Ia molecules thereby escaping immune surveillance. Recently, we have developed an adoptive cell transfer assay in Xenopus clones using peritoneal leukocytes as antigen presenting cells (APCs), and shown that gp96 can prime CD8 T cell responses in vivo against minor histocompatibility skin antigens as well as against the Xenopus thymic tumor 15/0 that does not express class Ia molecules. We describe here the methodology involved to perform these assays including the elicitation, pulsing and adoptive transfer of peritoneal leukocytes, as well as the skin graft and tumor transplantation assays. Additionally we are also describing the harvesting and separation of peripheral blood leukocytes used for flow cytometry and proliferation assays which allow for further characterization of the effector populations involved in skin rejection and anti-tumor responses.

Comparative in vivo Study of gp96 Adjuvanticity in the Frog Xenopus laevis

The frog Xenopus laevis provides an attractive alternative non-mammalian model for exploring the ability of heat shock protein such as gp96 to promote antigen-specific CD8 T cell responses. We present methods to study in vivo facilitation of cross-presentation of skin and tumor antigens by gp96.

יחסי In vivo לימוד Adjuvanticity gp96 ב הצפרדע Xenopus laevis</em

We have developed in the amphibian Xenopus laevis a unique non-mammalian model to study the ability of certain heat shock proteins (hsps) such as gp96 to ...

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

השימוש מלכודת אופטית לחקר מארח הפתוגן אינטראקציות עבור הדמיה דינמי תא חי

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

שימוש במודל EpiAirway לאפיון לטווח ארוך מארח הפתוגן אינטראקציות

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage sequences share no homology to current annotated proteins. As a result, a large proportion of phage genes are annotated as hypothetical. This reality heavily affects the annotation of both structural and auxiliary metabolic genes. Here we present phenomic methods designed to capture the physiological response(s) of a selected host during expression of one of these unknown phage genes. Multi-phenotype Assay Plates (MAPs) are used to monitor the diversity of host substrate utilization and subsequent biomass formation, while metabolomics provides bi-product analysis by monitoring metabolite abundance and diversity. Both tools are used simultaneously to provide a phenotypic profile associated with expression of a single putative phage open reading frame (ORF). Representative results for both methods are compared, highlighting the phenotypic profile differences of a host carrying either putative structural or metabolic phage genes. In addition, the visualization techniques and high throughput computational pipelines that facilitated experimental analysis are presented.

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

Phenomics הפאג: גישות פיזיולוגיות לאפיין חלבונים חדשים ויראלי

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

חומרי Biomimetic לאפיין אינטראקציות חיידקים-מארח

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Many experimental systems have been utilized to understand the mechanisms regulating T cell development and function in an immune response. Here a genetic approach using retroviral transduction is described, which is economic, time efficient, and most importantly, highly informative in identifying regulatory pathways.

Retroviral תמרה של Helper T תאים כגישה גנטית לחקר מנגנוני בקרת הבידול והתפקוד שלהם

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into possible MOA, morphologic changes associated with antibiotic exposure can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Integrating SEM imaging with traditional kill curves may improve our insight into drug action and advance the drug development process. To test this premise, kill curves and SEM studies were conducted using drugs with known but different MOA (vancomycin and metronidazole). C. difficile cells (R20291) were grown with or without the presence of antibiotic for up to 48 h. Throughout the 48 h interval, cells were collected at multiple time points to determine antibiotic efficacy and for imaging on the SEM. Consistent with previous reports, vancomycin and metronidazole had significant bactericidal activity following 24 h of treatment as measured by colony-forming unit (CFU) counting. Using SEM imaging we determined that metronidazole had significant effects on cell length (&#62; 50% reduction in cell length for each antibiotic; P&#60; 0.05) compared to controls and vancomycin. While the phenotypic response to drug treatment has not been documented previously in this manner, they are consistent with the drug&#39;s MOA demonstrating the versatility and reliability of the imaging and measurements and the application of this technique for other experimental compounds.

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Antibiotic efficacy is most commonly determined by conducting killing kinetic studies and measuring colony forming units (CFUs). By integrating scanning electron microscopy (SEM) with these standard methods, we can distinguish the pharmacological effects of treatment between different antibiotics.

פרוטוקול לאפיין את השינויים המורפולוגיים של<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; בתגובה לטיפול אנטיביוטי

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

הערכה של פתוגן-פונדקאי תגובות והיעילות החיסון בעכברים

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal drugs, IA can cause &#62;50% mortality in infected immunocompromised patients. It is crucial to determine both host and pathogen factors that contribute to infection susceptibility and low survival rates in infected patients in order to develop novel therapeutics. Innate immune responses play a pivotal role in recognition and clearance of Aspergillus spores, though little is known about the exact cellular and molecular mechanisms. Reliable models are required to investigate detailed mechanistic interactions between the host and pathogen. The optical clarity and genetic tractability of zebrafish larvae make them an intriguing model&#160;to study host-pathogen interactions of multiple human bacterial and fungal infections in a live and intact host. This protocol describes a larval zebrafish Aspergillus infection model. First, Aspergillus spores are isolated and injected into the zebrafish hindbrain ventricle via microinjection. Then, chemical inhibitors such as immunosuppressive drugs are added directly to the larval water. Two methods to monitor the infection in injected larvae are described, including the 1) homogenization of larvae for colony forming unit (CFU) enumeration and 2) a repeated, daily live imaging setup. Overall, these techniques can be used to mechanistically analyze the progression of Aspergillus infection in vivo and can be applied to different host backgrounds and Aspergillus strains to interrogate host-pathogen interactions.

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

This protocol describes an Aspergillus infection model in zebrafish larvae. Aspergillus spores are microinjected into the hindbrain of larvae, and chemical treatment is used to induce immunosuppression. Infection progression is monitored via a daily imaging setup to monitor fungal growth and immune responses as well as enumeration of live spores by colony forming unit plating.

זיהום זחלי זברה עם נבגי אספרגילוס לניתוח אינטראקציות מארח-פתוגן

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal ...

Label-Free Quantitative Proteomics Workflow for Discovery-Driven Host-Pathogen Interactions

The technological achievements of mass spectrometry (MS)-based quantitative proteomics opens many undiscovered avenues for analyzing an organism&#8217;s global proteome under varying conditions. This powerful strategy applied to the interactions of microbial pathogens with the desired host comprehensively characterizes both perspectives towards infection. Herein, the workflow describes label-free quantification (LFQ) of the infectome of Cryptococcus neoformans, a fungal facultative intracellular pathogen that is the causative agent of the deadly disease cryptococcosis, in the presence of immortalized macrophage cells. The protocol details the proper protein preparation techniques for both pathogen and mammalian cells within a single experiment, resulting in appropriate peptide submission for liquid-chromatography (LC)-MS/MS analysis. The high throughput generic nature of LFQ allows a wide dynamic range of protein identification and quantification, as well as transferability to any host-pathogen infection setting, maintaining extreme sensitivity. The method is optimized to catalogue extensive, unbiased protein abundance profiles of a pathogen within infection-mimicking conditions. Specifically, the method demonstrated here provides essential information on C. neoformans pathogenesis, such as protein production necessary for virulence and identifies critical host proteins responding to microbial invasion.

Here, we present a protocol to profile the interplay between host and pathogen during infection by mass spectrometry-based proteomics. This protocol uses label-free quantification to measure changes in protein abundance of both host (e.g., macrophages) and pathogen (e.g., Cryptococcus neoformans) in a single experiment.

זרימת עבודה פרוטאומית כמותית ללא תוויות עבור אינטראקציות מארח-פתוגן מונחות גילוי

The technological achievements of mass spectrometry (MS)-based quantitative proteomics opens many undiscovered avenues for analyzing an organism&#8217;s ...