Laboratuvarda yapılan araştırma Araştırma Vakfı hibe tarafından desteklenmiştir - Flanders (FWO; hibe numaraları G.0545.08 ve G.0298.11), Üniversitelerarası Atraksiyon Polonyalılar Programı (Belçika Bilim Politikası; hibe sayısı P6/28 ve P7/13) ve FWO destekli araştırma topluluğu yerleştirilmiştir. Flanders (FWO) - CDH Araştırma Vakfı bir doktora sonrası adam olduğunu. Yazarlar çok Moleküler ve Hücresel Sinyal (KU Leuven), Dr SP Srinivas (Optometri Indiana Üniversitesi, ABD), Dr Leybaert en laboratuvar (Ghent Üniversitesi) Laboratuvarı tüm mevcut ve eski üyelerine minnettar ve vardır yararlı tartışmalar sağlanan Dr Vinken (VUB), prosedürler optimize veya konneksin hemichannels çalışma için araçlar geliştirilmesi dahil edildi.

1. Kornea Endotel Hücre İzolasyonu Başlamadan önce: göz enucleating sonra yerel bir mezbaha, en kısa zamanda elde edilen taze gözlerle, gelen hücreleri izole edin. Göz maksimum 18 aylık, beş dakika ölüm sonrası ve Earle Dengeli Tuz Çözüm korunmuş bir inek olarak çıkarıldı emin olun - 4% 1 iyot çözeltisi laboratuvara taşınması için ° C. <ol><li> Earle Dengeli Tuz Çözeltisi dışında göz atın - 1% iyot çözeltisi ve bir Petri kabı (100 x 20 mm) yerleştirin. </li><li> % 70 etanol ihtiva eden bir çözelti ile göz sterilize ve% 1 iyot içeren Earle Dengeli Tuz Çözeltisi ile durulayın. </li><li> Bu adım, steril bir kaput çalışır. Dikkatlice gözden kornea incelemek ve yukarı gelecek şekilde epitel hücre tabakası ile Earle Dengeli Tuz Çözeltisi içeren bir Petri kabı (35 x 10 mm), yerleştirin. Dikkatlice kalan iris dokusu sti kaldırmakGerekirse kornea bağlanmış ll. </li><li> Yukarı endotel hücre tabakası ile petri içeren başka bir Earle Dengeli Tuz Çözeltisi için kornea aktarın ve Earle Dengeli Tuz Çözeltisi ile iki kez yıkayın. </li><li> Bir fincan şeklinde yemektir bir kum saati, yukarı bakacak şekilde endotel tabakası ile kornea aktarın ve büyüme ortamı ile örtün. Büyüme ortamı, 25 mM glukoz,% 10 fetal sığır serumu,% 6.6 L-glutamin, 2.5 ug / ml amfoterisin B ve% 1 antibiyotik-antimikotik karışım 10,000 birim ihtiva / ml penisilin, 10,000 ug içeren Dulbecco&#39;nun Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı oluşmaktadır streptomisin / ml ve 25 ug / ml amfoterisin B </li><li> Bir emme pipet ile ortam çıkarın. </li><li> Korneanın endotel tabakası (tripsin içeren tüm adımları aynı konsantrasyon ile yapılan) bir tripsin solüsyonu (0.5 g / L) 300 ul uygulayın. </li><li> Kapalı bir Petri kabındaki kornea içeren kum saati yerleştirin ve inc koydum37, 30 dakika boyunca ubator ° C ve% 5 CO2. </li><li> Yavaşça steril bir başlık bir yangın cilalı kanca şeklindeki cam Pasteur pipeti ile kornea uzak endotel hücreleri kazıyın. </li><li> Endotel hücreleri ihtiva eden çözelti emmek ve kültür ortamı 4 ml&#39;lik kültür şişeleri (25 cm2) ekleyin. </li><li> Kornea büyüme ortamı 300 ul uygulayın ve kazıma tekrar ve kültürü şişesi endotel hücreleri içeren çözeltisi ekleyin. </li><li> Bir kez daha bu son adım (1.11) tekrarlayın. </li><li> Kültür yerleştirin 37 inkübatör büyüme ortamı ° C ve% 5 CO2 &#39;de endotel hücreleri içeren şişeler. </li><li> İki gün sonra, kültür ortamı içinde 6 ml eklenir. </li><li> Iki günde bir büyüme ortamı yenileyin. </li></ol> 2. Hücre Kültürü <ol><li> Kültür ortamı çıkarın ve ulaşıldığında konfluent Earle Dengeli Tuz Çözeltisi (Abou içinde olan hücreler iki kez yıkayınizolasyon sonra t 10 gün). </li><li> Bunları ayırmak ve inkübatör şişesi yerleştirmek için hücrelere 1.5 ml tripsin çözeltisi ekleyin (37 ° C,% 5 CO2) 3-4 dakika karıştırıldı. </li><li> Büyüme ortamı 12 ml ilave edilir. Hücreleri dağıtmak ve hücreleri saymak için içinde ve dışında orta üç kez pipetle. </li><li> Hücre yoğunluğu ve inkübatör koyun bağlı olarak değişken bir kısmı ile tohum hücreleri. 165.000 hücre hücre sayısı (cm 2 başına hücre yoğunluğu 39.286) ile iki iyi odacıklı slaytlar (4.2 cm 2 bir alana sahip) hazırlayın. Cm2 başına 6250 bir yoğunlukta yeni bir pasaj boyunca 80 cm2 kültürü şişeleri hazırlayın ve 25 ml&#39;lik bir toplam hacme taze kültür ortamı ile toplayın. </li><li> Her iki günde orta yenileyin. </li><li> Hücre tabakası birleşene 3-4 gün sonra ulaşılır. Deneyler için hücreler kullanır. </li><li> Şişeler, hücre tabakasının konfluent ulaşıldığında, 2.6 &#39;dan 2.1 adımları tekrarlayın. 2 pasaj kadar hücre kültürleri kullanılan f edilebilirveya deneyler. </li></ol> 3. Indükleyen Kalsiyum Wave için mekanik Uyarım <ol><li> 10 uM Fluo-4 ile odacıklı slayt hücreleri yük AM 37, 30 dakika boyunca fosfat tamponlu tuz ° C&#39;de hafifçe çalkalandı. </li><li> Fluo-4 AM çözeltisi çıkarın, fosfat tamponlu tuz ile hücreler beş defa yıkanır, fosfat tamponlu tuz ile hücre inkübasyon ve ölçümden önce, oda sıcaklığında en az 5 dakika boyunca hücreler bırakın. </li><li> Argon lazer ve kullanım ışın ayırıcı HFT 488 ile 488 nm de Excite, bir uzun geçiş emisyon filtresi LP 505 ile 530 nm floresan emisyon toplamak en azından iğne deliği ayarlayın. Bir yağ daldırma 40X objektif (Hava, 1.2 NA) kullanın. ARL-67156 ile deneylerde, bir 10X objektif kullanın (Hava, 0.3 NA). </li><li> Hücreleri konfokal mikroskop birleşik olduğu bir alan arayın. </li><li> Pozisyon, 45 odacıklı slayta açıdan ° ve-hücre membranı dokunmadan üstünde olacak şekilde pipet.Tek bir hücreye kısa (≈ 1 sn) mekanik stimülasyon kışkırtmak. Mekanik uyarma kısa olan bir amplifikatör aracılığıyla çalıştırılabilir bir piezoelektrik kristal nanopositioner birleştirilmiş bir cam mikropipet (uç çapı &lt;1 mm) ile, hücre zarının% 1&#39;den daha az dokunarak hücre akut, kısa süreli bir etkiye deformasyon oluşmaktadır bir mikro-manipülatör monte. Cam mikropipet çekici bir mikroelektrot ile yapılır. Nanopositioner mekanik uyarılması sırasında 0,2 ve 1,5 V arasında bir gerilim tarafından işletilen olduğundan emin olun. 1,5 V daha bir gerilim yüksek hücre hasarına neden olabilir. Her hücre tipi ve durumu için, hücre zarar vermeden mekanik uyarılması için en uygun voltaj dikkatli yüksek (1,5 V) gerilimi (0,2 V) düşük başlayarak gerilim bir dizi uygulanarak belirlenmelidir. Bu voltaj, hücre zarı uygulanan mekanik stres ve gerginlik belirlediği için gerilim uyarım kuvveti için bir ölçüdür.Mekanik uyarı kuvveti alanı ile mekanik strese çarpılarak hesaplanabilir. Alanı (&lt;3.14 mikron 2) ve mekanik gerilme hem de çok düşük olduğu için, mekanik uyarma gücü düşüktür. (Bir hücre hasar görmesi durumunda, hücre ve hücre dışına floresan sızıntıları karanlık döner unutmayın.) </li><li> Mekansal değişiklikleri ölçmek [Ca 2 +] konfokal mikroskop ile mekanik stimülasyon takip i. </li><li> Görüntü toplama ve depolama. </li><li> Konfokal mikroskop yazılımı kullanarak duyarlı hücreleri (aktif alan, AA) toplam yüzey alanı tanımlamak için ilgi bir çokgen bölge çizin. </li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu yazıda, bir mikropipet kullanarak lokalize ve kontrollü mekanik stimülasyon sağlayarak birincil sığır kornea endotel hücrelerinin tek katmanlarını içinde hücreler arası Ca 2 +-dalga yayılımı ölçmek için basit bir yöntem tarif. Mekanik olarak uyarılmış hücreleri +, her ikisi de arası Ca 2 + dalga yayılımının 11,67 sürücü gerekli hücre içi sinyal molekülleri, hücre içi IP 3 ve Ca 2 yerel bir artış ile yanıt verir. ...

Hücreler arası iletişim ve sinyal doku ve tüm organ düzeyinde 1,2 de hücre dışı agonistler yanıt olarak fizyolojik süreçlerin koordinasyonu için gereklidir. Hücreler arası iletişimin en doğrudan yolu boşluğu kavşak oluşumu tarafından oluşturulur. Gap junction 3,4 komşu hücrelerin iki konneksin (Cx) hemichannels (Şekil 1) başkanı kafaya yerleştirme ile oluşan protein kanalları gap junction kanalları plaklar vardır. Ara bağlantılar neden olan ve modüle Ca2 komşu hücreler 6 (Şekil 2) arasında hücre içi mağazalarından +-serbest bırakma., Ca2 + veya IP 3 5 de dahil olmak üzere, en az 1.5 kDa arasında bir moleküler ağırlığa sahip küçük sinyal moleküllerinin geçişine izin Boşluk birleşme kanalları sıkıca redoks modifikasyon ve benzeri gibi, intra-ve intermoleküler protein etkileşimleri ile ve hücresel sinyal süreçler ile düzenlenirfosforilasyon 7. Gjs böylece kimyasal ve elektriksel syncytium olarak hareket eden, bağlı hücrelerin koordine cevabı sağlar. Örneğin, atriyal ve ventriküler kalp miyositleri arasında hareket potansiyelinin yayılmasını Cx-tabanlı GJ kanal 85 aracılığıyla gerçekleşir. Cxs sadece gap junction kanalları olarak rol değil, aynı zamanda eşleşmemiş hemichannels oluşturmak, böylece düzenli iyon kanalları 8-10 (Şekil 1) benzer zarlarında kanalları olarak çalışmıyor. Hemichannels hücre içi ve dışı çevre arasındaki iyon ve sinyal molekülleri değişimini kontrol ederek komşu hücreler arasında parakrin sinyal katılmak. Bir çok hücre tipinde (epitel hücreleri, osteoblastik hücrelerin, astrositlerin, endotelyal hücreler, vb gibi) ve organların (beyin, karaciğer, retina, koklea ve damarsal gibi), hücreler arası Ca 2 + dalgalar hücreli yanıtların koordinasyonu için temel olan <sus&gt; 11. Belirli bir hücrede hücre içi Ca 2 + düzeylerinde artış bu hücre ile sınırlı, ama böylece bir hücreler arası Ca 2 +-dalga 12,13 kurulması, çevredeki komşu hücrelere yaymak değildir. Bu hücreler arası Ca 2 + dalgaları syncytium ve düzensizliği patofizyolojik işlemleri 11 ile ilişkili olduğu gibi hücre katmanları fizyolojik düzenlenmesi için önemlidir. Kornea endotel ve epitel, kendi 25-33 gibi farklı grupları 14-24, hücreler arası iletişim mekanizmaları ve rolleri okudu. Olmayan uyarılabilir hücrelerde, kornea endotel hücreleri gibi, hücreler arası iletişim iki ayrı modu 28,29, yani boşluk kavşak arası iletişim ve parakrin hücreler arası iletişim ortaya çıkar. Gap kavşak arası iletişim boşluğu kavşak 7 ile sinyal molekülleri doğrudan bir değişimi içerir. Gap junctional arası iletişim, doku dengesini korumak hücre çoğalması kontrol ve hücre dışı stres 10,34,35 bir senkronize cevap kurmak için önemlidir. Patolojiler bir dizi, gap junction bağlantı nedeniyle hatalı CXS düşürüldü, ve burada boşluk kavşak arası iletişim 36 etkiliyor. Bu çok hücreli organizmalarda boşluğu kavşak arası iletişimin önemini ve etkisini vurgular. Bu yayılabilir dışı haberciler (Şekil 2) sürümü içerdiğinden boşluğu kavşak arası iletişim aksine, parakrin hücreler arası iletişim, hücre-hücre apozisyon bağlı değildir. Sinyal moleküllerinin farklı hücre sinyalizasyon hücre dışı boşlukta serbest bırakılır. Molekül daha sonra belirli bir reseptör proteini ile tespit edilir, hedef hücreye taşınır. Daha sonra reseptör sinyal kompleksi olan bir hücresel yanıtı indüklersinyal, ya da etkisiz hale duyarsızlaştırma çıkarılması ile sonlandırılır. Çıkış lipofilik hücre dışı sinyal haberciler membran nüfuz ve hücre içi reseptörleri üzerinde hareket ederler. Buna karşılık, hidrofilik haberciler yanıt hücrenin plazma zarı çapraz değil, ama sonra hücre içi çevreye sinyal röle yüzey ifade reseptör proteinler, bağlanan bir ligand olarak hareket ederler. Iyon-kanalı-bağlantılı, enzim-bağlı ve G-protein-bağlantılı: hücre yüzeyi reseptör proteinlerinin üç önemli aile bu süreçte yer alırlar. Serbest haberci molekül yakın (parakrin) hedef hücreleri üzerinde, aynı hücre (otokrin) reseptörleri üzerinde hareket edebilir, ya da dolaşım sistemi (endokrin) gerektiren uzak hedef hücreler üzerinde. Kornea endotel 28,29 dahil olmak üzere birçok hücre tipi içinde, hücre içi ATP Ca 2 + dalgalar 37-40 yayılma sürücü büyük hidrofilik, parakrin faktörlerden biridir. DurÇeşitli maddeler olarak kaldırılması ile mekanik deformasyon, hipoksi, inflamasyon veya stimülasyon, ATP kayma gerilmesi, çekme ya da ozmotik 44,45 şişme tepki olarak 41-44 sağlıklı hücrelerden serbest bırakılabilir. Farklı ATP-serbest bırakma mekanizmaları veziküler ekzositozu 44 ve bu, ATP-bağlayıcı kaset (ABC), taşıyıcılar, plasmalemmal voltaj bağımlı anyon kanalları 46, P2X7 reseptör kanalı 47,48 yanı sıra, ayrıca nakil mekanizması, bir bolluk da dahil olmak üzere, öne sürülmüştür konneksin hemichannels 49-52 ve pannexin hemichannels 43,49,53. Hücre dışı ATP ADP, AMP hızla hidrolize olması ve hücre dışı ortamda mevcut ectonucleotidases ile 54,55 adenozin olabilir. Ekstraselüler serbest ATP ve metaboliti ADP 56 difüzyon yoluyla yayılacak. Komşu hücrelerde purinerjik reseptörleri ile bu nükleotidlerin işlemler daha sonra p rolü de ortaya konmuşturarası Ca 2 +-dalgaları 28,37,51 bir ropagation. Purinerjik reseptörlerinin iki farklı sınıflar mevcut: Her iki pürin (ATP, ADP) ve pirimidin (UTP, UDP) nükleotidler en P2-purinoceptors 57 hareket ise adenozin, P1-purinoceptors için başlıca doğal ligand olduğunu. Hücreler arası iletişim gibi kazıma yükleme, boya transferi, IP 3 ve Ca 2 +, mekanik uyaran, vb gibi agonistlerin yerel uncaging gibi farklı yöntemlerle incelenebilir. Burada + dalga yayılımı, tek bir hücrenin mekanik uyarılar ile ortaya çıkarılan Ca 2 çalışma açıklar. Mekanik olarak uyarılmasıyla, Ca 2 +-dalga yayılımı eğitim avantajı + dalga zamanla Ca 2 yayılmasını ölçmek için kolay bir araç sağlar ve kantitatif olarak farklı hücre ön işlemleri karşılaştırarak izin vermektedir. Kornea endotel, bu hücreler arası Ca 2 +-dalgaları eş izintek tabaka gelen koordine yanıt, burada göz içi ameliyat sırasında hücre dışı zorlamalara dayanıklı endotel yardımcı olmayan rejeneratif kornea endotel olası bir savunma mekanizması olarak hareket, ya da bağışıklık ret veya üveit 58,59 sırasında inflamatuvar mediatörlerin maruz üzerine.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Column1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Earle's Balanced Salt Solution (EBSS)</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>14155-048</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Iodine</td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>38060-1EA</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>11960-044</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-glutamine (Glutamax)</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>35050-038</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amphotericin-B</td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>A2942</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Antibiotic-antimycotic mixture</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>15240-096</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsin</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>25300-054</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dulbecco's PBS</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>14190-091</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluo-4 AM</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>F14217</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ARL-67156 (6-N,N-Diethyl-b,g-dibromomethylene-D-ATP) </td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>A265</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Apyrase VI</td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>A6410</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Apyrase VII</td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>A6535</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gap26 (VCYDKSFPISHVR)</td>
 <td>Custom peptide synthesis</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gap27 (SRPTEKTIFII)</td>
 <td>Custom peptide synthesis</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Control Peptide (SRGGEKNVFIV)</td>
 <td>Custom peptide synthesis</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>siRNA1 Cx43 (sense: 5'GAAGGAGGAGGAACU-CAAAdTdT) </td>
 <td>Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>siRNA2 Cx43 (sense: 5'CAAUUCUUCCUGCCGCAAUdTdT) </td>
 <td>Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>siRNA scramble: scrambled sequence of siCx43-1 (sense: 5'GGUAAACG-GAACGAGAAGAdTdT) </td>
 <td>Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TAT-L2 (TAT- DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK)</td>
 <td>Thermo Electron (Ulm, Germany)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TAT-L2-H126K/I130N (TAT-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK) </td>
 <td>Thermo Electron (Ulm, Germany)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Two chambered glass slides</td>
 <td>Laboratory-Tek Nunc (Roskilde, Denmark)</td>
 <td>155380</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Confocal microscope </td>
 <td>Carl Zeiss Meditec (Jena, Germany)</td>
 <td>LSM510</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Piezoelectric crystal nanopositioner (Piezo Flexure NanoPositioner)</td>
 <td>PI Polytech (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>P-280</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HVPZT-amplifier</td>
 <td>PI Polytech (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>E463 HVPZT-amplifier</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass tubes (glass replacement 3.5 nanoliter)</td>
 <td>World Precision Instruments, Inc. Sarasota, Florida, USA</td>
 <td>4878</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microelectrode puller </td>
 <td>Zeitz Instrumente (Munchen, Germany)</td>
 <td>WZ DMZ-Universal Puller</td>
 <td></td>
 </tr>
</tbody>
 </table>

mechanical stimulation-induced calcium wave propagation in cell monolayers: the example of bovine corneal endothelial cells

Hücreler arası iletişim, beyin, karaciğer, retina, koklea ve damarsal içeren organlar ve dokular, çeşitli hücreler arasında fizyolojik süreçlerin koordinasyonu için gereklidir. Deneysel ayarlarında, hücreler arası Ca 2 +-dalgaları tek bir hücreye mekanik bir uyaran uygulanarak elde edebilir. Bu hücre içi sinyal IP molekülleri 3 ve Ca 2 serbest bırakılması yol açar + komşu hücrelere mekanik uyarılmış hücreden + dalga eş Ca 2 yayılma başlatmasını. Arası Ca 2 +-dalga yayılımı kontrol ana moleküler yollar IP 3 doğrudan transferi yoluyla ve ATP serbest bırakılması ile hemichannels tarafından gap junction kanalları tarafından sağlanmaktadır. Özellikleri ve farklı konneksin ve boşluk kavşak kanalları ve hemichannels olarak pannexin izoformlarının düzenlenmesi belirlenmesi ve karakterizasyonu quantificatio izin verdiğin arası Ca 2 +-dalga siRNA ve boşluk kavşak kanalları ve hemichannels inhibitörlerinin kullanımının yayılması. Burada, bir sonucu olarak hücreler arası Ca2 hücre akut, kısa süreli bir etkiye deformasyonu ile oluşturulan bir kontrollü ve lokalize mekanik uyarıcıya tepki olarak Fluo4-AM yüklendi primer endotel hücrelerinin mono tabakaları + dalga ölçmek için bir yöntem tarif az 1 mikron bir ipucu çaplı bir micromanipulator kontrollü cam mikropipet ile hücre zarının dokunmadan. Ayrıca birincil sığır kornea endotel hücreleri ve + dalgaları ATP serbest bırakılması ile arası Ca 2 için tahrik güç olarak Cx43-hemichannel aktivite değerlendirmek için model sistem olarak kullanımı izolasyonu açıklar. Son olarak, kullanımı, avantajları, sınırlamalar ve boşluk kavşak kanal ve hemichannel araştırma bağlamında bu yöntemin alternatifleri tartışmak.

Tüm deneyler ilgili tüm kurallar, düzenlemeler ve düzenleyici kurumlar uygun olarak yürütülür ve ortaya olan protokol KU Leuven hayvan bakımı ve kullanımı komitesi rehberlik ve onay altında yapılır. Sığır kornea endotel hücreleri (BCEC) olarak, fonksiyonel gap junction ifade ve boşluk kavşak arası iletişim ve parakrin hücreler arası iletişim hem de interaktif bir şekilde hücreler arası iletişim önemli katkı, ancak ana yol aracılık parakrin hücreler arası i...

Watch this Scientific Journal Video about Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells at JoVE.com

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Hücreler arası Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;-Dalgaları gap junction kanalları ve hemichannels tarafından tahrik edilmektedir. Burada, hücreler arası Ca ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır<sup&gt; 2 +</sup&gt;-Dalgaları yerel bir tek hücreli mekanik uyaran ve özellikleri ve boşluk kavşak kanalları ve hemichannels düzenlenmesi araştırmak için uygulama yanıt olarak hücre mono tabakaları içinde.

Hücre Tek katmanlar mekanik uyarılması bağlı Kalsiyum Dalga Yayılım: Sığır Kornea Endotel Hücreleri Örneği

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

mechanical-stimulation-induced-calcium-wave-propagation-cell

Research

JoVE Journal

Biology

16.1K Görüntüleme.  KU Leuven. Hücreler arası Ca 2 +-Dalgaları gap junction kanalları ve hemichannels tarafından tahrik edilmektedir. Burada, hücreler arası Ca ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır 2 +-Dalgaları yerel bir tek hücreli mekanik uyaran ve özellikleri ve boşluk kavşak kanalları ve hemichannels düzenlenmesi araştırmak için uygulama yanıt olarak hücre mono tabakaları içinde.

Video: Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

İnsan Embriyonik Kök Hücre (ES) yayılması

Biyoloji

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

İzolasyon ve Büyük Ölçekli Genişleme Yetişkin İnsan Endotel Koloni Oluşturan Progenitör Hücreler

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin

The microvascular endothelium plays an important role as a selectively permeable barrier to fluids and solutes. The adhesive junctions between endothelial cells regulate permeability of the endothelium, and many studies have indicated the important contribution of the actin cytoskeleton to determining junctional integrity1-5. A cortical actin belt is thought to be important for the maintenance of stable junctions1, 2, 4, 5. In contrast, actin stress fibers are thought to generate centripetal tension within endothelial cells that weakens junctions2-5. Much of this theory has been based on studies in which endothelial cells are treated with inflammatory mediators known to increase endothelial permeability, and then fixing the cells and labeling F-actin for microscopic observation. However, these studies provide a very limited understanding of the role of the actin cytoskeleton because images of fixed cells provide only snapshots in time with no information about the dynamics of actin structures5. 
Live-cell imaging allows incorporation of the dynamic nature of the actin cytoskeleton into the studies of the mechanisms determining endothelial barrier integrity. A major advantage of this method is that the impact of various inflammatory stimuli on actin structures in endothelial cells can be assessed in the same set of living cells before and after treatment, removing potential bias that may occur when observing fixed specimens. Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) are transfected with a GFP-&beta;-actin plasmid and grown to confluence on glass coverslips. Time-lapse images of GFP-actin in confluent HUVEC are captured before and after the addition of inflammatory mediators that elicit time-dependent changes in endothelial barrier integrity. These studies enable visual observation of the fluid sequence of changes in the actin cytoskeleton that contribute to endothelial barrier disruption and restoration. 
Our results consistently show local, actin-rich lamellipodia formation and turnover in endothelial cells. The formation and movement of actin stress fibers can also be observed. An analysis of the frequency of formation and turnover of the local lamellipodia, before and after treatment with inflammatory stimuli can be documented by kymograph analyses. These studies provide important information on the dynamic nature of the actin cytoskeleton in endothelial cells that can used to discover previously unidentified molecular mechanisms important for the maintenance of endothelial barrier integrity.

Microscopic imaging of live endothelial cells expressing GFP-actin allows characterization of dynamic changes in cytoskeletal structures. Unlike techniques that use fixed specimens, this method provides a detailed assessment of temporal changes in the actin cytoskeleton in the same cells before, during, and after various physical, pharmacological, or inflammatory stimuli.

GFP-Aktin ifade Canlı Endotel Hücreleri Aktin Sitoiskelet Çalışması

The microvascular endothelium plays an important role as a selectively permeable barrier to fluids and solutes. The adhesive junctions between endothelial ...

Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection

The pancreatic acinar cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary role in the secretion of pancreatic enzymes into the pancreatic duct. It is also the site for the initiation of pancreatitis. Here we describe how acinar cells are isolated from whole pancreas tissue and intracellular calcium signals are measured. In addition, we describe the techniques of transfecting these cells with adenoviral constructs, and subsequently measuring the leakage of lactate dehydrogenase, a marker of cell injury, during conditions that induce acinar cell injury in vitro. These techniques provide a powerful tool to characterize acinar cell physiology and pathology.

We describe a reproducible method of preparing mouse pancreatic acinar cells from a mouse for the purpose of examining acinar cell calcium signals and cellular injury with physiologically and pathologically relevant stimuli. A method for adenoviral infection of these cells is also provided.

Kalsiyum Görüntüleme amacı, Hücre Yaralanma Ölçümler ve Adenoviral Enfeksiyon için Pankreas Asiner Hücreleri hazırlanması

The pancreatic acinar  cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary  role in the secretion of pancreatic enzymes into ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

Kalsiyum değerlendirilmesi Bozulmamış İskelet kas liflerinin içinde Sparks

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

Ozmotik Su Geçirgenliği Katsayısı (P Ölçme<sub&gt; F</sub&gt;) Küresel Hücreleri: Bir Örnek olarak İzole Bitki protoplastlan

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Murin Vana Endotel Hücreleri İzolasyon

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This occurs when endothelial cells, which line blood vessels, become adhesive to circulating immune cells such as monocytes. In vitro measurement of this adhesiveness has until now been done by quantifying the total number of monocytes that adhere to an endothelial layer either as a direct count or by indirect measurement of the fluorescence of adherent monocytes. While such measurements do indicate the average adhesiveness of the endothelial cell population, they are confounded by a number of factors, such as cell number, and do not reveal the proportion of endothelial cells that are actually adhesive. Here we describe and demonstrate a method which allows the enumeration of adhesive cells within a tested population of endothelial monolayer. Endothelial cells are grown on glass coverslips and following desired treatment are challenged with monocytes (that may be fluorescently labeled). After incubation, a rinsing procedure, involving multiple rounds of immersion and draining, the cells are fixed. Adhesive endothelial cells, which are surrounded by monocytes are readily identified and enumerated, giving an adhesion index that reveals the actual proportion of endothelial cells within the population that are adhesive.

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

Endotel Hücre yapışma miktarının belirlenmesi<em&gt; In Vitro</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Yüksek çözünürlüklü Time-lapse Görüntüleme ve Yaşayan İnsan Umbilikal Ven Endotelyal Hücrelerinde Mikrotubul Dinamiği Otomatik Analizi

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Dinamik Hücresel Protrüzyonlarda Protein Konsantrasyonunun Yazılım Destekli Takibi için Grafiksel Bir Kullanıcı Arayüzü

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...