Biz HL-1 hücreleri ve ayrıntılı bakım protokolü sağlamak için Dr. Claycomb teşekkür etmek istiyorum. Biz de bizim çift kanal optik haritalama sistemi için bazı aksesuarlar yapım ile yaptığı yardım için hücre film ve Sayın Pete Caron üreten ile yardım için Bayan Elena Carrillo ve Dr Seth Robia teşekkür etmek istiyorum. Bu eser (XA 10GRNT3770030 &amp; 12GRNT12050478) Amerikan Kalp Derneği, Ulusal Sağlık Enstitüleri (XA HL113640), ve (XA) Loyola Üniversitesi Araştırma Geliştirme Fonu tarafından desteklenmiştir.

1. Çözüm hazırlanması <ol><li> Norepinefrin (NP) çözeltisi <ol><li> . Saflaştınlmış Milli-Q (MQ), 25 ml su içinde, 30 mM askorbik asit (0,1475 g askorbik asit, 25 ml içine NP 40 mg çözülür norepinefrin (NP) ışığa duyarlı olduğu için bu çözüm hazırlanması sırasında doğrudan ışığa maruz kaçının. </li><li> 0.22 mikron şırınga filtresi ile NP çözüm Filtre. -20 ° C&#39;de 1 ml steril mikrotüpler içine çözeltisi ve mağaza alikosu. Dondurulmuş sonra, NP, bir ay boyunca stabildir. </li></ol></li><li> Tümlenmiş Yıkama ve Son Claycomb medya <ol><li> Claycomb ortamının 43.5 ml ile başlar ve fetal sığır serumu (FBS), 5 ml, penisilin / streptomisin, 0.5 ml, NP, 0.5 ml, 1 ile ek: son takviye Claycomb ortamı 50 ml yapmak için L-glutamin seyreltildi 100. Claycomb orta ışığa duyarlı olduğundan bu çözüm hazırlanması sırasında doğrudan ışık maruz kalmaktan kaçının. </li><li> Sup aynı tarifi kullanarak yıkayın Claycomb orta hazırlayınhariç eklentilerle Claycomb ortamı% 5 FBS ekleyebilir ve NP ve L-glutamin bileşenleri ihmal. NOT: Doğrudan ışığa maruz kalmadan 4 ° C&#39;de saklandığında takviye Final ve Yıkama Claycomb medya iki hafta için iyi. </li></ol></li><li> Soya fasulyesi tripsin önleyici çözelti <ol><li> Ca-içermeyen ve Mg-içermeyen Dulbecco fosfat tamponlu tuzlu su, 100 ml (PBS) içine soya fasulyesi tripsin inhibitörü, 25 mg eritin. </li><li> 0.22 mikron şırınga filtre kullanarak çözüm Filtre. Not: 4 ° C&#39;de depolandığında steril çözelti, bir ay boyunca stabildir. </li></ol></li><li> Jelatin / Fibronektin çanak kaplama çözümü <ol><li> % 0.02 jelatin yapmak için MQ 500 ml su içine jelatin ve 0.1 g. </li><li> Otoklav, ardından% 0.02 jelatin 199 ml fibronektin 1 ml sulandırmak ve hafifçe karıştırın. </li><li> Kısım, -20 ° C&#39;de jelatin ayrı tüplere çözeltisi ve deposunun 6 mi. </li></ol></li><li> Hanks tuz çözeltisi <ol><li> Bir heyecan kullanmalevha, NaCl (136.9), KCI (5,366), KH 2 PO 4 (0,4409) NaH 2 PO 4 (0,4000), MgSO 4 (0,8142), D-GLC MQ su (mg / L) içinde, aşağıdaki tuzlar eritildi (5,051), NaHCO 3 (4,162), HEPES (5,042), CaCl2 (1,261). </li></ol></li><li> Kalsiyum duyarlı bir boya (Rhod2) çözeltisi <ol><li> Bir Rhod2 -20 ° C &#39;de stok çözeltisi ve mağaza boya için DMSO içinde% 20, Pluronic F-127 400 ul Rhod2 kuru tozun, 1 mg seyreltin. </li><li> Deneye başlamadan önce, son çalışma çözeltisi için 1.000 Hanks tuz çözeltisi ile: bu stok çözeltisi 1 seyreltin. </li></ol></li><li> Voltaja duyarlı bir boya (Rh237) çözeltisi <ol><li> -20 ° C de stok çözeltisi ve depolayın DMSO 2 ml Rh237 5 mg seyreltin. Deneye başlamadan önce son bir çalışma çözüm yapmak için 1.000 Hanks &#39;Tuz çözeltisi ile: stok solüsyonu 1 sulandırınız. </li></ol></li></ol> &amp; #160; Not: 4/1 çözüm küçük değişiklikler ile Claycomb HL-1 hücre kültürü protokolüne dayanmaktadır. 2. Pasajlanması ve Kültürleme HL-1 Atriyal miyositlerde lameller üzerine NOT: HL-1 hücreleri, Dr. Claycomb (Louisiana Eyalet Üniversitesi) elde edilebilir. <ol><li> T25 şişelerinde HL-1 hücrelerinin büyümeye ve günlük takviye Claycomb 5 ml ortam ile beslenir. Geçiş T25 hücreleri Claycomb HL-1 hücre kültürü protokolü (aşağıda tarif edilen), 10 göre, her beş günde şişeleri. </li><li> 24 saat T25 şişesi içinde hücreler önce 12 gözlü kültür levhaları içerisine Mermiyi lamelleri (20 mm çapında) pasajlandı ve daha sonra gece boyunca 37 ° C&#39;de jelatin / fibronektin ile lamelleri kapak için tamamen birleşir ve hazır. </li><li> Sonraki gün, aspirat ve kültür plakalarından jelatin / fibronektin atmak ve de her takviye Nihai Claycomb ortamı, 1.5 ml ile değiştirin. </li><li> Bir T25 Kültür Split hücreleraspire birleşik kültürü içeren T25 şişesi ortamı ve 37 ° C &#39;de PBS ile kısa süreli bir kültür durulama 5. günde tam kaynaşmaya eriştikten sonra E şişe. </li><li> PBS aspire ve hücreler ile doğrudan temasını engellemek için T25 şişesi alt üzerine tripsin / EDTA ile pipetleme 37 ° C&#39;de, 3 ml% 0.05 tripsin / EDTA ilave edin. 1 dakika için 37 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> Aspirasyon ile tripsin / EDTA çıkarın ve T25 şişesi başına başka tripsin 1.3 ml / EDTA ekleyin. 1 dakika için oda sıcaklığında inkübe edilir. Bir mikroskop altında incelemek ve hücreler hala balona bağlı ise, tam kalan hücreleri çıkarmak için dokunun. </li><li> 15 ml&#39;lik bir santrifüj tüpü içine şişeden hücreler ve transfer hücrelere soya fasulyesi tripsin inhibitörü, 1.3 ml ilave edilir. Yıkama Claycomb 5 ml ortam ile boş bir şişe durulayın. 15 ml&#39;lik bir santrifüj tüpü içinde hücrelere durulama ekleyin. 5 dakika boyunca 500 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Yavaşça süpernatant aspire ve santrifüj sonra hücre pelet yeniden askıyatakviye Nihai Claycomb ortamı 6 ml. </li><li> Hücre pasajlayarak hücre süspansiyonu, 0.5 ml, 12-çukurlu bir levhanın her çukuruna Tohum. Günlük taze katkılı Final Claycomb ortamı ile hücreleri besleyin. NOT: yakından hücrelerinin büyümesini izlemek, tipik hücre tek tabakaları günde 4 birleşen durumunu ulaşmak ve spontan aktiviteler görünür kalır. Ardından, kültürlü tek tabakalı günde 4-5 optik haritalama için hazır olacak. </li></ol> Hücreler 3. yükleme kalsiyum ve Voltaja duyarlı boyalar <ol><li> Optik haritalama çalışmaları için, hafifçe 12-yuvalı hücre kültürü plakasının lamel çıkarın ve Hanks tuz çözeltisi ile yıkayın. </li><li> Ca duyarlı bir boya Rhod2 ile hücreleri boyamak için, 3 ml lamel, hücre tekli tabakası inkübe oksijen, 30 dakika için bir su banyosu içinde 37 ° C &#39;de Rhod2 çalışma çözeltisi (% 5 CO 2/95% O 2 gaz kabarcıkları) . </li><li> V m duyarlı boya hücreleri boyamak içinRh237, başka bir 15 dakika için bir su banyosu içinde 37 ° C&#39;de oksijenlenmiş Rh237 hazır çözelti 3 ml Rhod2 yüklü hücre tek tabaka bırakın. </li></ol> 4. Çift Kanallı Optik Haritalama <ol><li> Bir ters floresan mikroskop üzerinde bir sirkülasyon odasına, V m ve Ca boyalarla çift lekeli hücre tek tabaka, yerleştirin. 35 ± 1 ° C&#39;de hücre odasının sıcaklığı tutmak için ısıtmalı sirkülasyon sistemi kullanın. Dikkatle bölmesi üzerinde fazla 0.3 ° C kadar bir gradyan önlemek için bölme içinde dolaşan akım hızını ayarlayarak perfüzat sıcaklığı kontrol eder. <ol><li> V m / Ca sinyallerini kaydetmeye önce, önceki boyama aşamalarına kalan boyayı çıkarmak için yaklaşık 5 dakika boyunca, taze Hanks çözeltisi ile hücre mono tabakasının yıkayın. </li></ol></li><li> Hanks tuz çözeltisi ve bir SILV dolu bir cam pipet oluşan iki kutuplu bir elektrot kullanarak Pace sağlıklı hücre mono tabakalarıer daha önce olduğu gibi pipet sarılı tel 12,17 nitelendirdi. </li><li> Yaklaşık 1 mV bir pacing eşiği bekliyor 2 msn 200-500 milisaniye ve darbe genişliği bir döngü uzunluğunda hızı sağlıklı hücre tek tabakaları. Not: kültüre edilmiş mono tabakaların her parti için, en az iki muamele edilmemiş tek tabakalar, hücre toplu durumunu test etmek için kullanılır. Sağlıklı kontrol mono tabakaları 200-500 msn çevrim uzunlukları elektrik pili tarafından yakalanan gerekir. Kontrol mono tabakalar elektrik tempolu olması halinde, bu, tüm hücre yığın optik haritalama deneyleri için uygun olmayabilir göstermektedir. </li><li> V m ve Ca duyarlı boyalar, her iki tahrik etmek için, bir uyarım filtre (510 nm / 40) ve bir dikroik ayna (561 nm) ile bağlanmış bir LED ışık kaynağını (520 nm dalga boyu) kullanın. <ol><li> V m bileşenine bir dikroik ayna (594 mil) ve bir Ca bileşeni ile 40X objektif ve bölünme yoluyla hücreler tarafından yayılan flüoresans sinyallerini toplamak.Bir bant geçiren filtre ile Ca kanal uzun geçiş filtresi (700 nm) ve yayılan ışık V m kanal yayılan ışığı Filtre (585/40 nm). </li><li> İki CCD kameralar (; redshirt Görüntüleme 80 x 80 piksel, 1,000 fps) kullanarak filtre floresan ışığı toplayın. </li><li> Boya photobleaching önlemek için, ışığa maruz kalma süresini sınırlamak için görüş her alanda en az 2 saniye kayıt olun. Burada, tipik görüntü her tek tabaka için dört farklı alanlarda. </li></ol></li></ol> V m veya Ca Recordings 5. Veri İşleme <ol><li> Hem V m ve Ca sinyalleri (80 x 80 piksel) için, arka plan gürültüsünü azaltmak için farklı kayıt süresi noktalarında bir yoğunluk değerine yoğunluğu yirmi beş (5 x 5) değerleri komşu pikselleri ortalama. NOT: veri ortalamaya sonra, bir bireysel eylem potansiyeli veya Ca geçici her kayıt süresi noktası ortalama x 16 16 yoğunluk değerleri ortalama içeren bir veri matrisi (verir50 um bir mekansal çözünürlükte veri kanalları). </li><li> Kaydedilen V m veya Ca sinyallerinin aktivasyon süresi (AT) tanımlayın. <ol><li> Daha önce tarif edildiği gibi tek başına bir eylem potansiyeli veya Ca geçici bir aktivasyon süresi (AT) tanımlamak için, V m veya ısmarlama MATLAB dayalı bir algoritmayı kullanarak Ca sinyallerin tepe genlik% 50 süresini hesaplamak. 12 </li><li> Manuel Program analizi sırasında oluşabilecek hataları ortadan kaldırmak için analiz ATS tashih. </li><li> Matrisin AT tanımlanan depolamak kullanılan yazılım, sırasıyla kaydedilen aksiyon potansiyeli ve kalsiyum geçici, (16 x 16 veri kanalları ortalama). </li></ol></li><li> Daha önce küçük değişiklikler 12,18 ile açıklandığı gibi vektör alanı analizi yöntemi kullanılarak AT matrisi üzerinde aksiyon potansiyeli veya kalsiyum geçici iletim hızı (CV) vektörleri hesaplayın. <ol><li> (5 × onun veri noktaları AT çevredeki bir veri kanalı akrabası CV vektör hesaplayın; 5 komşu MATLAB programı 12,18 içinde en az kare algoritması kullanarak) yüzeye AT aktivasyon süreleri (bir düz polinom yüzeyi simüle etmek) veri kanalları ortalama. </li><li> Aşağıdaki formüller kullanılarak iletim vektör hesaplayın Formül 1: <img alt="Denklem 1" fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/52542/52542eq1.jpg" /> Formül 2: θ = arctan [(dy / dt) / (dx / dt)] NOT: Ve x- ve y-eksenleri olarak tahmin CV vektörü; dx / dt x ekseninde CV vektör projeksiyonu; dy / dt y-ekseninde CV vektör projeksiyonu. T AT yüzey; x, y koordinatları 2-D bakın; T, x = ∂T / ∂X x göre T kısmi türevi olduğu; T y = ∂T / ∂y y ile ilgili T kısmi türevi olduğu; θ CV vektörü son yönü. </li><li> Pusula on derece sektörünü kapsayan her biri 36 yollara AT matris Grubu, tüm vektörler. &lt;/ Li&gt; <li> 36 iletim yollarının arasında CV vektörlerin en büyük nüfusa içeren yolunu seçin. Tek tabaka CV temsil etmek, bu yolun ortalama CV hesaplayın. </li></ol></li></ol> Wave Front Yayılma 6. Görselleştirme <ol><li> MATLAB kullanarak pik değerine bağlı olarak farklı kayıt zaman noktalarında bağımsız bir aksiyon potansiyelinin veya Ca geçici sinyal şiddetini normalize. </li><li> Geçici kullanılan MATLAB yazılımı 16 x 16 yoğunluk matris içine kaydedilen her zaman noktasında normalleştirilmiş yoğunluk verileri depolamak. </li><li> Surf.m fonksiyonunu kullanarak her kayıt süresi noktasının saklanan yoğunluğu matris bir renk kodlu yoğunluk haritası Construct. NOT: yoğunluk haritasında, kırmızı V m veya Ca sinyallerinin yüksek yoğunluğunu temsil eder ve mavi floresan sinyalleri düşük yoğunluğunu yansıtır. </li><li> Avifile.m işlevini kullanarak bir .avi dosyası oluşturun. </li><li> Tüm i kaydetaddframe.m işlevini kullanarak aksiyon potansiyeli veya Ca geçici farklı kayıt süresi noktalarında ntensity haritalar. NOT: Bu noktada, V m ve Ca yayılma iki ayrı avi dosyaları oluşturulur. </li></ol>

<ol>
	<li>Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+the+heart.">Optical imaging of the heart.</a> Circ Res. 95 (1), 21-33 (2004).</li><li>Salama, G., Hwang, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+optical+mapping+of+intracellular+free+calcium+and+action+potentials+from+Langendorff+perfused+hearts.">Simultaneous optical mapping of intracellular free calcium and action potentials from Langendorff perfused hearts.</a> Current protocols in cytometry / editorial board, J. Paul Robinson, managing editor ... [et al.]. 12 (Unit 12 17), (2009).</li><li>Laurita, K. R., Singal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+action+potentials+and+calcium+transients+simultaneously+from+the+intact+heart.">Mapping action potentials and calcium transients simultaneously from the intact heart.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 280 (5), H2053-H2060 (2001).</li><li>Fast, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+optical+imaging+of+membrane+potential+and+intracellular+calcium.">Simultaneous optical imaging of membrane potential and intracellular calcium.</a> J Electrocardiol. 38 (4 Suppl), 107-112 (2005).</li><li>Sowell, B., Fast, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+mechanism+of+shock-induced+arrhythmias:+role+of+intracellular+calcium.">Ionic mechanism of shock-induced arrhythmias: role of intracellular calcium.</a> Heart Rhythm. 9 (1), 96-104 (2012).</li><li>Fast, V. G., Kleber, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+conduction+in+cultured+strands+of+neonatal+rat+heart+cells+measured+with+voltage-sensitive+dyes.">Microscopic conduction in cultured strands of neonatal rat heart cells measured with voltage-sensitive dyes.</a> Circ Res. 73 (5), 914-925 (1993).</li><li>Hou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+role+for+HERG+in+determining+frequency+of+reentry+in+neonatal+rat+ventricular+myocyte+monolayer.">A major role for HERG in determining frequency of reentry in neonatal rat ventricular myocyte monolayer.</a> Circ Res. 107 (12), 1503-1511 (2010).</li><li>Beauchamp, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+contributions+of+connexins+40+and+43+to+atrial+impulse+propagation+in+synthetic+strands+of+neonatal+and+fetal+murine+cardiomyocytes.">Relative contributions of connexins 40 and 43 to atrial impulse propagation in synthetic strands of neonatal and fetal murine cardiomyocytes.</a> Circ Res. 99 (11), 1216-1224 (2006).</li><li>Xia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+L-+and+T-type+Ca2++channels+in+murine+HL-1+cells.">Functional expression of L- and T-type Ca2+ channels in murine HL-1 cells.</a> J Mol Cell Cardiol. 36 (1), 111-119 (2004).</li><li>Claycomb, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HL-1+cells:+a+cardiac+muscle+cell+line+that+contracts+and+retains+phenotypic+characteristics+of+the+adult+cardiomyocyte.">HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (6), 2979-2984 (1998).</li><li>Fahrenbach, J. P., Ai, X., Banach, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+intercellular+coupling+improves+the+function+of+cardiac+pacemakers+derived+from+mouse+embryonic+stem+cells.">Decreased intercellular coupling improves the function of cardiac pacemakers derived from mouse embryonic stem cells.</a> J Mol Cell Cardiol. 45 (5), 642-649 (2008).</li><li>Yan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-Jun+N-terminal+kinase+activation+contributes+to+reduced+connexin43+and+development+of+atrial+arrhythmias.">c-Jun N-terminal kinase activation contributes to reduced connexin43 and development of atrial arrhythmias.</a> Cardiovasc Res. 97 (3), 589-597 (2013).</li><li>White, S. M., Constantin, P. E., Claycomb, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+physiology+at+the+cellular+level:+use+of+cultured+HL-1+cardiomyocytes+for+studies+of+cardiac+muscle+cell+structure+and+function.">Cardiac physiology at the cellular level: use of cultured HL-1 cardiomyocytes for studies of cardiac muscle cell structure and function.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (3), H823-H829 (2004).</li><li>Yang, Z., Shen, W., Rottman, J. N., Wikswo, J. P., Murray, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+stimulation+causes+electrical+remodeling+in+cultured+atrial+myocytes.">Rapid stimulation causes electrical remodeling in cultured atrial myocytes.</a> J Mol Cell Cardiol. 38 (2), 299-308 (2005).</li><li>Brundel, B. J., Kampinga, H. H., Henning, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calpain+inhibition+prevents+pacing-induced+cellular+remodeling+in+a+HL-1+myocyte+model+for+atrial+fibrillation.">Calpain inhibition prevents pacing-induced cellular remodeling in a HL-1 myocyte model for atrial fibrillation.</a> Cardiovasc Res. 62 (3), 521-528 (2004).</li><li>Umapathy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrogram+fractionation+in+murine+HL-1+atrial+monolayer+model.">Electrogram fractionation in murine HL-1 atrial monolayer model.</a> Heart Rhythm. 5 (7), 1029-1035 (2008).</li><li>Fast, V. G., Cheek, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+mapping+of+arrhythmias+induced+by+strong+electrical+shocks+in+myocyte+cultures.">Optical mapping of arrhythmias induced by strong electrical shocks in myocyte cultures.</a> Circ Res. 90 (6), 664-670 (2002).</li><li>Bayly, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+conduction+velocity+vector+fields+from+epicardial+mapping+data.">Estimation of conduction velocity vector fields from epicardial mapping data.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 45 (5), 563-571 (1998).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

Bu makalede, kalsiyum ve gerilim duyarlı floresan boyalar ile boyanmış bir kültür HL-1 atriyal miyosit tek tabaka optik haritalama kilit yönlerini açıklar. Bu, optimal HL-1 hücre tek tabaka, haritalama ekipman kurulumu kültürleme bir kültür tek tabaka eşleme ve veri analizi içerir. Başarıyla kültür hücreleri eşleştirmek için, anahtar düzgün yayılı hücre tek tabaka hazırlamaktır. Lamelleri üzerine hücreleri ekim yaparken, eşit hücrelerini dağıtmak için emi...

Benzersiz kalsiyum (Ca) ve gerilim (V m) çift kanal optik haritalama tekniği 1-5 eşzamanlı sağlam kalpleri ve kültürlü hücre tek tabakalarında hem de V m ve Ca sinyallerini kaydetmek için etkili bir araç olarak ortaya çıkmaktadır. Bu teknik sayesinde daha iyi kardiyak aritmilerin yatan elektrofizyolojik mekanizmaları anlamak için kalsiyum geçici ve aksiyon potansiyellerinin arasındaki ilişki ile ilgili güçlü bilgi edinmek için yapar. Kültürlenmiş hücre tekli katmanları, kardiyak elektrofizyoloji ve aritmiler altında yatan mekanizma üzerinde çalışmak için yararlı bir hücre modeli olduğunu kanıtlamıştır. 4,6-8 HL-1 hücreleri, iyi karakterize edilmiş atriyal miyosit kültür çizgisidir. HL-1 hücreleri de morfolojik, elektrofizyolojik ve yetişkin atriyal miyositlerin farmakolojik özelliklerini içeren benzersiz farklılaşmış genotip ve fenotip korumak. Bu hücreler importa dahil olmak üzere kalp genleri ve proteinleri ekspresent kardiyak iyon kanalları (örneğin, L- ve T-tipi kalsiyum kanalları) 9 ve sarkomerik kontraktil proteinlerin olgun izoformları normal diğerleri gibi yetişkin atriyal miyositlerde bulunan ve daha önce de bildirilmiştir. 10-13 Buna ek olarak, HL-1 hücreleri olabilir 2-boyutlu (2-D), miyosit mono-katman oluşturmak için kültürlendi. Bu nedenle, kültürlenmiş HL-1 tek tabakaları kullanılmasının avantajları şunlardır: 1) göreceli olarak düşük bir maliyet ve kolay bir izole edilmesi ve birincil yenidoğan miyositleri kültür daha miyosit kültür satır elde etmek için; 2) hücrelerinin konfluent tek tabaka kalbin 3-B yapısından kaynaklanan yapısal karmaşıklığı azaltır; 3) Bir hücre tek tabaka sağlam kalbinde meydana interstisyel fibrozis girişim ortadan kaldırabilir. Bu fibroblast ve arası matris müdahalesi olmadan miyositler bir grup özel elektrofizyolojik fonksiyonlarını incelemek için de kullanılabilir; Cul farmakolojik veya genetik manipülasyon fonksiyonel sonuçları 4) değerlendirilmesiYapılandırılmış hücre mono tabakaları etkili bir şekilde elde edilebilir. Bu nedenle, HL-1 hücreleri miyosit fizyolojisi farklı yönlerini yanı sıra pili kaynaklı anormal elektriksel faaliyetleri incelemek için yaygın olarak kullanılan hücresel model haline gelmiş. Harici cevap 13-16 Ancak, özel işlem ve bakım kültürü için gerekli sağlıklı hücre tek tabakaları Optik haritalama çalışmaları için elektrik pili. Buna ek olarak, ikili floresan boya boyama işlemi kolayca kültüre karışan hücre monokatmanlarından bütünlüğünü zarar verebilir. Böylece, kültürlü HL-1 mono tabakaları performans V m / CA çift kanallı optik haritalama büyük bir mücadele olmuştur. Bu yöntemin amacı, başarılı bir şekilde kültür HL-1 tek katmanlarda çift kanal optik eşleme gerçekleştirmek için temel aşamalarının temin edilmesidir. Burada HL-1 hücre tek tabaka hazırlanması, bir kültür hücre tek tabaka çift kanal optik haritalama ve haritalama veri işleme için optimize edilmiş protokol kapsamlı detaylar sağladı.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="756">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:103px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rhod2 dry powder</td>
			<td style="width:103px;">&#160;AAT Bioquest</td>
			<td style="width:119px;">21062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pluronic</td>
			<td style="width:103px;">AAT Bioquest</td>
			<td style="width:119px;">20050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">DMSO</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rh237</td>
			<td style="width:103px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">&#160;S-1109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KH2PO4&#160;</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgSO4&#160;</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CaCl2</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPEs</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

voltage and calcium dual channel optical mapping of cultured hl-1 atrial myocyte monolayer

Optik haritalama kalpleri ex vivo hem sağlam ve kültürlü miyosit mono tabakaları kardiyak elektriksel aktiviteyi tespit etmek için değerli bir teknik olduğu kanıtlanmıştır. HL-1 hücreleri, yaygın olarak kalp fizyolojisi çeşitli yönlerini incelemek için bir 2-boyutlu hücresel bir model olarak kullanılmıştır. Ancak, bir kültür HL-1 atriyal hücre tek tabaka içinde aynı görüş alanında aynı anda optik haritası kalsiyum (Ca) geçici ve aksiyon potansiyelleri büyük bir sorun olmuştur. Özel kullanım ve bakım elektriksel yakalanan ve optik eşlenebilir sağlıklı hücreleri hazırlamak için gerekli olmasıdır. Bu nedenle, biz çift kanallı optik haritalama için optimal çalışma protokolü geliştirdik. Bu yazıda, çift kanallı optik haritalama deneyi gerçekleştirmek için nasıl ayrıntılı olarak tarif var. Bu protokol aritmi gelişiminde aksiyon potansiyeli yayılması ve Ca kinetik anlayışı geliştirmek için bir araçtır.

Film 1 gösterildiği gibi bir kültür birleşik tek tabaka düzenli bir içsel ritmi sergiler. Biz o zaman tam konfluent HL-1 tek tabaka V m / Ca çift kanallı optik haritalama gerçekleştirdi. Şekil 1A kaydedilmiş bir tek V m ve Ca sinyallerinin örnek izlerini göstermektedir yendi. Eşit yayılır V m ve çift kanallı optik haritalama sistemi kullanılarak, Ca sinyallerinin Örnek eş zaman haritaları Şekil 1B ve 1C&#...

Watch this Scientific Journal Video about Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer at JoVE.com

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.

Kültürlü HL-1 Atriyal miyositlerdeki Monolayer Gerilim ve Kalsiyum Çift Kanal Optik Haritalama

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

voltage-calcium-dual-channel-optical-mapping-cultured-hl-1-atrial

Research

JoVE Journal

Biology

10.1K Görüntüleme.  Loyola University Chicago. This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.

Video: Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Mikroskop Uygun Bakım ve Temizlik

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Biyoloji

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

This protocol highlights the principles and practical applications of Phase and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Faz Kontrast ve Diferansiyel Girişim Kontrast (DIC) Mikroskopi

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in experimental models that range in scale from cell cultures to whole-organs[1, 2]. Using state-of-the-art optical imaging systems, generation and propagation of action potentials during normal cardiac rhythm or throughout initiation and maintenance of arrhythmias can be visualized almost instantly[1]. The latest commercially-available systems can provide information at exceedingly high spatiotemporal resolutions and were based on custom-built equipment initially developed to overcome the obstacles imposed by more conventional electrophysiological methods[1]. Advancements in high-resolution and high-speed complementary metal-oxide-semiconductor (CMOS) cameras and intensely-bright, light-emitting diodes (LEDs) as well as voltage-sensitive dyes, optics, and filters have begun to make electrical signal acquisition practical for cardiovascular cell biologists who are more accustomed to working with microscopes. Although the newest generation of CMOS cameras can acquire 10,000 frames per second on a 16,384 pixel array, depending on the type of sample preparation, long-established fluorescence acquisition technologies such as photodiode arrays, laser scanning systems, and cooled charged-coupled device (CCD) cameras still have some distinct advantages with respect to dynamic range, signal-to-noise ratio, and quantum efficiency[1, 3]. In the present study, Lewis rat hearts were perfused ex vivo with a crystalloid perfusate (Krebs-Henseleit solution) at 37&deg;C on a modified Langendorff apparatus. After a 20 minute stabilization period, the hearts were intermittently perfused with 11 mMol/L 2,3-butanedione monoxime to eliminate contraction-associated motion during image acquisition. For optical mapping, we loaded hearts with the fast-response potentiometric probe di-8-ANEPPS[4] (5 &mu;Mol/L) and briefly illuminated the preparation with 475&plusmn;15 nm excitation light. During a typical 2 second period of illumination, &gt;605 nm light emitted from the cardiac preparation was imaged with a high-speed CMOS camera connected to a horizontal macroscope. For this demonstration, hearts were paced at 300 beats per minute with a coaxial electrode connected to an isolated electrical stimulation unit. Simultaneous bipolar electrographic recordings were acquired and analyzed along with the voltage signals using readily-available software. In this manner, action potentials on the surface of Langendorff-perfused rat hearts can be visualized and registered with electrographic signals.

This article describes a high temporal and spatial resolution technique to optically image action potential movement on the surface of Langendorff-perfused rat hearts using a potentiometric dye (di-8-ANEPPS).

Langendorff perfüze sıçan Kalpler Optik Haritalama

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

Optical Recording of Electrical Activity in Guinea-pig Enteric Networks using Voltage-sensitive Dyes

The enteric nervous system (ENS) is a self-contained network with identified functions, capable of performing complex behaviors in isolation. Its neurons (10 to 25 &mu;m in diameter) are arranged in plexuses that are confined to distinct planes of the gut wall 1; the myenteric plexus can be found between the longitudinal and circular muscle layers, and the submucous plexus between the circular muscle layer and the mucosa. Since the effector systems for these plexuses (transporting epithelium, endocrine cells, immune elements, blood vessels and smooth muscle) are also contained within the gut wall, semi-intact preparations can be dissected that preserve individual components of different reflex pathways. The behavior of the effector systems is controlled by the submucous and myenteric plexuses acting in concert. Therefore, detailed knowledge of synaptic interactions within and between ganglia, and of communication between the plexuses, is essential for understanding normal gastrointestinal function. The ENS, as an intact nervous system, is a unique experimental model in which one can correlate molecular and cellular events with the electrical behavior of the neuronal network and its physiological outputs. Because of the quasi-two-dimensional organization of its plexuses, the ENS is particularly well suited for the study of neural networks using multiple site optical recording techniques that employ voltage-sensitive dyes 2,7,8,9. We will illustrate here the use of a relatively new naphthylstyryl-pyridinium dye (di-4-ANEPPDHQ) 3 that offers multiple advantages over its predecessors, including very low phototoxicity, slow rate of internalization, and remarkable chemical stability. When used in conjunction with a camera that permits sub-millisecond time resolution, this dye allows us to monitor the electrical activity of all the neurons in the field of view with a maximal spatial resolution of ~ 2.5 &mu;m at 100X magnification. At lower magnification (10X or 20X), the sacrifice of single-cell resolution is compensated by a gain in perspective, revealing the intricacies of the inter-ganglionic circuitry.

This protocol illustrates how voltage-sensitive dyes enable optical recording of electrical activity from intact neural networks such as the plexuses of the guinea-pig enteric nervous system, with an adjustable resolution that ranges from single-cells to multi-ganglionic circuitry.

Gerilim duyarlı Boyalar kullanarak Gine domuzu Enterik Ağları Elektrik Faaliyet Optik Kayıt

The enteric nervous system (ENS) is a self-contained network with identified functions, capable of performing complex behaviors in isolation. Its neurons ...

Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of fluorescence can be changed by exposure to light of a specific wavelength. Optical highlighting allows noninvasive marking of a subpopulation of fluorescent molecules, and is therefore ideal for tracking single cells or organelles.
Critical parameters for efficient photoconversion are the intensity and the exposure time of the photoconversion light. If the intensity is too low, photoconversion will be slow or not occur at all. On the other hand, too much intensity or too long exposure can photobleach the protein and thereby reduce the efficiency of photoconversion.
This protocol describes a general approach how to set up a confocal laser scanning microscope for pc-FP photoconversion applications. First, we describe a procedure for preparing purified protein droplet samples. This sample format is very convenient for studying the photophysical behavior of fluorescent proteins under the microscope. Second, we will use the protein droplet sample to show how to configure the microscope for photoconversion. And finally, we will show how to perform optical highlighting in live cells, including dual-probe optical highlighting with mOrange2 and Dronpa.

This protocol describes a general approach to perform photoconversion of fluorescent proteins on a confocal laser scanning microscope. We describe procedures for the photoconversion of puried protein samples, as well as for dual-probe optical highlighting in live cells with mOrange2 and Dronpa.

Canlı Hücrelerde Floresan Proteinleri ve Çift prob Optik Vurgulama Saf, Fotoçevrim

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Canlı hücreler Mağaza çalışan Kalsiyum Giriş Floresans tabanlı Ölçümü: Kültür Kanseri Hücre gelen İskelet Kası Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their functional properties. Mutations in KCNE genes have been found in patients with cardiac arrhythmias such as the long QT syndrome and/or atrial fibrillation. However, the precise molecular pathophysiology that leads to these diseases remains elusive. In previous studies the electrophysiological properties of the disease causing mutations in these genes have mostly been studied in heterologous expression systems and we cannot be sure if the reported effects can directly be translated into native cardiomyocytes. In our laboratory we therefore use a different approach. We directly study the effects of KCNE gene deletion in isolated cardiomyocytes from knockout mice by cellular electrophysiology - a unique technique that we describe in this issue of the Journal of Visualized Experiments. The hearts from genetically engineered KCNE mice are rapidly excised and mounted onto a Langendorff apparatus by aortic cannulation. Free Ca2+ in the myocardium is bound by EGTA, and dissociation of cardiac myocytes is then achieved by retrograde perfusion of the coronary arteries with a specialized low Ca2+ buffer containing collagenase. Atria, free right ventricular wall and the left ventricle can then be separated by microsurgical techniques. Calcium is then slowly added back to isolated cardiomyocytes in a multiple step comprising washing procedure. Atrial and ventricular cardiomyocytes of healthy appearance with no spontaneous contractions are then immediately subjected to electrophysiological analyses by patch clamp technique or other biochemical analyses within the first 6 hours following isolation.

Kv channel dysfunction is associated with cardiac arrhythmias. In order to study the molecular mechanisms that lead to such arrhythmias we utilize a systematic protocol for isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes from Kv channel ancillary subunit knockout mice. Isolated cardiomyocytes can then immediately be used for cellular electrophysiological studies, biochemical or immunofluorescence (IF) assays.

Mürin Atriyal ve Ventriküler kardiyomiyositlerde izolasyonu ve Kv Kanal Kayıtları

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow GUVs must be modified in order to form GUVs containing functional transmembrane proteins. This article describes two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation and gel-assisted swelling &#8212; to form GUVs containing the voltage-gated potassium channel, KvAP. In both methods, a solution of protein-containing small unilamellar vesicles is partially dehydrated to form a stack of membranes, which is then allowed to swell in a rehydration buffer. For the electroformation method, the film is deposited on platinum electrodes so that an AC field can be applied during film rehydration. In contrast, the gel-assisted swelling method uses an agarose gel substrate to enhance film rehydration. Both methods can produce GUVs in low (e.g., 5 mM) and physiological (e.g., 100 mM) salt concentrations. The resulting GUVs are characterized via fluorescence microscopy, and the function of reconstituted channels measured using the inside-out patch-clamp configuration. While swelling in the presence of an alternating electric field (electroformation) gives a high yield of defect-free GUVs, the gel-assisted swelling method produces a more homogeneous protein distribution and requires no special equipment.

The reconstitution of the transmembrane protein, KvAP, into giant unilamellar vesicles (GUVs) is demonstrated for two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation, and gel-assisted swelling. In both methods, small unilamellar vesicles containing the protein are fused together to form GUVs that can then be studied by fluorescence microscopy and patch-clamp electrophysiology.

Bir transmembran proteinin yeniden oluşturulması, Mikroskop ve yama kelepçe Çalışmaları Dev tek-katmanlı keseler içine Voltaj kapılı iyon kanalı, KvAP,

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells in the pathogenesis of various renal diseases has been established since podocyte injury leads to proteinuria and foot process effacement. It was previously reported that various endogenous agents may cause a dramatic overload in intracellular Ca2+ concentration in podocytes, presumably leading to albuminuria, and this likely occurs via calcium-conducting ion channels. Therefore, it appeared important to study calcium handling in the podocytes both under normal conditions and in various pathological states. However, available experimental approaches have remained somewhat limited to cultured and transfected cells. Although they represent a good basic model for such studies, they are essentially extracted from the native environment of the glomerulus. Here we describe the methodology of studying podocytes as a part of the freshly isolated whole glomerulus. This preparation retains the functional potential of the podocytes, which are still attached to the capillaries; therefore, podocytes remain in the environment that conserves the major parts of the glomeruli filtration apparatus. The present manuscript elaborates on two experimental approaches that allow 1) real-time detection of calcium concentration changes with the help of ratiometric confocal fluorescence microscopy, and 2) the recording of the single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli. These methodologies utilize the advantages of the native environment of the glomerulus that enable researchers to resolve acute changes in the intracellular calcium handling in response to applications of various agents, measure basal concentration of calcium within the cells (for instance, to evaluate disease progression), and assess and manipulate calcium conductance at the level of single ion channels.

Changes in the intracellular calcium levels in the podocytes are one of the most important means to control the filtration function of glomeruli. Here we explain a high-throughput approach that allows detection of real-time calcium handling and single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli.

Taze İzole glomerulusların Podositler Tek kanallı Analizi ve Kalsiyum Görüntüleme

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a significant role in certain types of arrhythmia. Because arrhythmias are spatially distinct, emergent phenomena, they must be investigated at the tissue level. However, methods for directly probing SR Ca2+ in the intact heart remain limited. This article describes the protocol for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) in the Langendorff-perfused rabbit heart. This approach takes advantage of the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N, which has minimal fluorescence in the cytosol where intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) is relatively low but exhibits significant fluorescence in the SR lumen where [Ca2+]SR is in the millimolar range. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the distinct advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+ and the role of SR Ca2+ in arrhythmogenic phenomena.

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

This article describes the detailed protocol and equipment necessary for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ in the Langendorff-perfused rabbit heart. This method allows for direct observation and quantification of Vm and SR Ca2+ dynamics in the intact heart.

Intra-Sarkoplazmik Retikulum Ca Optik Haritalama<sup&gt; 2+</sup&gt; Ve Langendorff-perfüze Tavşan Heart Transmembran Potansiyeli

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...