Teknik yardım için Bernard Foucart teşekkür ederim. Bu çalışma Bilimsel Araştırma Belçika Fonu (FRS-FNRS) tarafından ve Tıbbi Araştırma Kraliçe Elisabeth Fonu tarafından desteklenmiştir. Agnès Villers Bilimsel Araştırma için Belçika Fonu Araştırma üyesidir.

Tüm hayvan prosedürleri araştırma hayvanların bakım ve kullanımı için Sağlık düzenlemeler Ulusal Sağlık Enstitüleri uygun olarak ve yerel etik kurul onayı ile yapılmıştır. 1. Yapay Cerebro-spinal Sıvı hazırlanması Aynı medya, incelemek kesme ve dinlenme süresi ve elektrofizyolojik sırasında dilimleri (1 ml / dak) serpmek için kullanılır. Bu ortam, 124 mM NaCI, 4.4 mM KCI, 26 mM NaHCO 3, 1 mM NaH 2 PO 4, 2.5 mM CaCl2, 1.3 mM MgSO 4 ve 10 mM D-glukoz oluşmaktadır. <ol><li> (1 M) ile çözelti içinde zaten MgSO 4 hariç ACSF 2 L farklı bileşenler tartılır. Toz MgSO 4 derece higroskopik + için bir standart solüsyon kullanılarak Mg 2 tam konsantrasyonu emin olmasını sağlar. Ca 2 +: Mg 2 + oranı büyük ölçüde LTP indüksiyon ve bakım etkiler14 ve böylece oranları her zaman saygı gösterilmelidir. </li><li> Bir bardak CaCl 2 hariç tüm bileşenleri koymak dereceli silindir ve distile H 2 O ile 2 L getirmek </li><li> Şiddetle karıştırın. Her çözülür, tank (% 95 O2,% 5 CO2) bağlanmış bir akvaryum fıskiyeden ve borunun içinden karbojen ekleyin. Birkaç dakika bekleyin ve pH bikarbonat tampon etkisi ile 7.4 &#39;de sabit kalsiyum klorür ekleyin. </li><li> Bir soğuk dikdörtgen cam tabak içinde 600 ml tutmak ve ° C çanak çevresinde buz ile 4 için soğumasını. Bu ortam, hipokampus diseksiyon için kullanılacaktır. </li><li> Kalan 1.400 ml filtre ve bir Erlenmeyer şişesi bulundurun. </li></ol> 2. Elektrofizyolojik Rig ve Beyin Dilim Kayıt Odası hazırlanması Perfüzyon devresi 2 peristaltik pompa, bir rezerv tankı taze sıvı pompalama bir ve t diğer pompalama kullanılan sıvı yapılmıştıro bir bölmeye odası kayıt. Taze sıvı yeniden oksijenli ve ağırlık (Şekil 1A) tarafından arayüzü kayıt odasına ulaşmadan önce ısıtılır bir ev yapımı perfüzyon sistemi eklenir. Arayüzü kayıt odasına FST (Güzel Bilim Araçları, Vancouver, Kanada, Şekil 1B) tarafından tasarlanmıştır. Doku dilimleri çıkarılabilir iyi halka bağlı ve sürekli iyi iğne emme yüksekliğini ayarlayarak arayüzü koşullar altında korunabilir dokuma net filtre yerleştirilir. Sonuna ve (0.5 mm) yanal delikli bloke bir ev yapımı plastik tüp odasında istikrarı artırmak için emme iğne sabitlenir. Kayıt kafası da kayıt kafasının (su damlacığı oluşumu azaltmak için) olarak sapma bağlantı noktaları üzerinden nemli hava geçirerek nemli ortam sağlamak yardımcı olan bir gaz dağılım taş içeren bir su banyosu üzerinde monte edilir. Küvet ve orta sıcaklıkta sürekli DC akım inci seviyesini değiştirmek sureti ile kontrol edilirkaba bir silikon kauçuk-gömülü su banyosunda ısıtıcı. Su banyosu ve kayıt kuyularda termistör oda sıcaklığında bu sitelerde kurmak ve tam izlenecek sağlar. Odasının ısıtma sistemi, tüm teçhizat sıcaklığını kontrol küresel bir ısıtma sistemi ile tamamlanmıştır. Edinburgh Üniversitesi&#39;nde (araştırmacılar tarafından geliştirilen yazılım <a href="http://www.etcsystem.com" target="_blank">www.etcsystem.com</a> ) oksijenli havanın sıcaklığı, beyin dilim, elektrotlar ve uzun vadeli kayıtları (Şekil 1C) için istikrarlı bir ortam sağlayarak kalan teçhizat izler ve eşitler . Fare hipokampal dilimler için kullanılan sıcaklık 28 ° C &#39;dir <ol><li> 20 dakika arasında, en az damıtılmış H2O ile tüm perfüzyon devre durulayın ve ısıtma sistemleri başlar. </li><li> Devredeki karbojen köpüren başlatın. Carbogen f ile ev yapımı perfüze tüpler geldiilter mumlar ve kayıt odasının altındaki su banyosu içinde soğutulmuştur. Su banyosu içinde akış hızı, bir akış ölçer tarafından kontrol edilir. Akış hızı çok yavaş ise, doku hipoksik haline gelebilir. Debisi çok yüksek ise tersine, gaz yeterince ısıtılmış ve doku kurutma neden nemli olmayabilir. Yüksek gaz akış oranı da ozmotik şok yol açan aşağıdaki su banyosundan doku üzerinde püskürtme su şansını artırabilir. Bu sapma portların çıkışında naylon örgü bit (100 mikron) eklenerek önlenebilir. </li><li> Devre boşaltın ve filtre ACSF ile doldurun. </li><li> Tutma odasında dilim destekleyecek halka koyun. 500 ila 750 mikron arasında değişen örgü delikleri olan bir dokuma ağ filtre iki parçalı epoksi yapıştırıcı reçine ile gerilmiş ve halka takılır. Dokuma net filtre% 87 polyamid ve% 13 elastan (külot 15 den) yapılmıştır. Tutkal rin yüzeyinde kabartmalar oluşumunu önlemek için dikkatli bir şekilde uygulanmalıdırg. </li><li> Devre tüm hava kabarcıkları dikkatlice çıkarın. </li><li> Emme iğne vida ile kayıt odasında ACSF seviyesini ayarlayın. Peristaltik pompa hızı giriş pompa boyunca 1 ml / dak ve 5 ml / dak çıkış pompası için ayarlanır. </li></ol> Perfüzyon sistemi katı bir titreşime dayanıklı masa üzerine yerleştirilir ve bir Faraday kafesi ile çevrilidir. 3. Diseksiyon Alanı hazırlanması Cerrahi aletler: Bir # 11 bıçak, küçük standart diseksiyon makas, yaylı makas, kavisli bir forseps, iki Heidemann spatulae ve bir kaşıkla bir neşter. Yardımcı madde: bir giyotin, bir selüloz, bir tıraş bıçağı ile bir Mcllwain doku kesici, filtre kağıdı, bir plastik emzik olan bir cam Pasteur pipeti, 2 plastik pastör geniş bir ağız, bir Petri kabı, bir metal silindir ile bir pipetler 7 mm çaplı (Şekil 2A). <ol><li&gt; soğuk ACSF (Adım 1 hazırlanan) ile dolu diseksiyon çanak olarak, filtre kağıdı sarılmış bir boyama çanak bir soğuk cam kapak, bırakın. Dikkatli bir akvaryum bubbler (Şekil 2A) ile hava kabarcıkları ve oksijen ACSF çıkarın. </li><li> Kullanım sırasına göre aletleri yatıyordu. Doku kesici plaka ve distile su ve eter (Şekil 2B) ile temizlenir, yeni bir tıraş bıçağı filtre kağıdı üç tabaka ekleyin. Bu kağıt dokunduğunda tıraş bıçağı yatay konumda olmalıdır. Bıçak gücü maksimal değerin üçte biri maksimum değeri ve hızının yarısı ayarlanır. </li><li> Daha sonra zamanımız yok, çünkü her şey (aletleri, sıcaklık ...) hazır olup olmadığını dikkatle kontrol edin. </li><li> Soğuk ACSF dolu bir Pasteur pipeti ile diseksiyon sprey birine sormak. </li><li> Dekapitasyon önce Nembutal IP (100 mg / kg) ile fare anestezisi. Halotan anestezisi de kullanılabilir. Bu yöntemler ve hem de obta karşılaştırıldığındaaynı sonuçları ined. Dekapitasyon anestezi altında gereken ancak servikal dislokasyon de kullanılabilir. Ancak servikal dislokasyon hayvan acı önlemek için çok iyi bir uygulama ihtiyacı var. </li><li> Soğuk ACSF sürekli duş altında kısa sürede selüloz üzerinde parçalara ayır. </li></ol> 4. Beyin Kaldırma <ol><li> Namlu üzerinde bir elin işaret parmağı ve başparmak ile hala kafa tutarken, giyotin kesme kenarında başlayan ve frontal kemik rostrally çalışan başın üst ortasında boyunca diseksiyon makas ile bir kesi yapmak . </li><li> Tam kafatası tabakaları ortaya çıkarmak ve başın kaudal kenarındaki kas çıkarmak için başın her iki tarafındaki deri kas kesti. </li><li> Diseksiyon makas ile, her iki tarafta temporal kas kesmek temporal plaka boyunca, daha sonra enine, ortada ön plakalar kesti. Daha sonra, iki pl arasında, oksipital kemik küçük bir kesim yapmakates. </li><li> Her bir tarafı için, oksipital plakaların kuyruk dibinde kesilir. </li><li> Yaylı makas ile sagital sütür boyunca kesin. </li><li> Forseps ile, birbirinden onları yayarak kafatası yarısı çıkarın. </li><li> Neşter ile, sadece koku ampul sonra enine kesilmiş ve beyincik sonra soğuk ACSF ile diseksiyon çanak içine ayıklanan beyin dalma hemen önce. </li></ol> 5. Hipokampal Diseksiyon <ol><li> Beyin diseksiyon çanak immerged sonra, orta takılı bir neşter ile birbirinden iki hemisfer sever. </li><li> Hipokampus diseksiyonu bir binoküler cerrahi mikroskop (X25, Şekil 2A) ile görsel kontrol altında spatulae ile yapılır. Beynin bir yarısı üzerinde, dikkatli bir şekilde lateral ventrikül görmek için yapılar yayıldı. Beyin sapı ve diencephalon çıkarın. Bu bir tarafta frontal korteks üzerinde spatulae uygulayarak ve ilgili diensefalon yapılırdiğer tarafta. Spatulae ile hipokampus dokunmayın ve doku kesit sırasında germek değil dikkat edin. </li><li> Forniks yavaşça ventrikül bir spatula ekleyerek korteks (uzak rulo), en hipokampus dışarı itmek sever. </li><li> Hipokampus ayıklanır, aşırı korteks dokusu ve geri kalan kan damarları çıkarın. </li></ol> 6. Dilimleri kesimi <ol><li> Geniş bir ağız plastik Pasteur pipet ile, onun alvear yüzey üst (dışbükey tarafı) ile bir kaşık hipokampus aktarın. </li><li> Bir standart plastik Pasteur pipeti ile aşırı sıvı çıkarın. </li><li> Dikey neredeyse helikopter filtre kağıdı (Şekil 2B) dokunmadan kaşık İpucu ve hızlı bir şekilde filtre kağıdı dokunarak, kaşık hipokampus düşüyorlar sonra kaşık geri hareket ettirin. </li><li> Hipokampus yönlendirmek ve (hipokampal yönünü Şekil 2C gördüğünüz helikopteri ile 400 mikron enine dilimtıraş bıçağı göre irin). Mümkün olduğunca çabuk hareket. </li><li> Dilimlenmiş hipokampus ile filtre kağıdı çıkarın ve dilim biraz yaymak için metal silindir etrafında sarın. Daha sonra, ücretsiz standart plastik Pasteur pipeti ve soğuk ACSF ile dolu bir Petri kabındaki bunları toplamak kullanarak ACSF spreyler ile dilimleri. </li></ol> 7. Arayüz Dilimleri Kuluçka <ol><li> Bir standart plastik Pasteur pipeti ile dilim seçin ve hızlı bir şekilde kayıt odasına koyun. Dilimler 28 de arayüzü, doğrudan kayıt odasında diseksiyonu travma kurtarmak ° C </li><li> Dilim büyük olasılıkla lavabo olacaktır. Dilim seviyeye ulaşmak için sıvı seviyesi indirin ve sonra yüzer yapmak için yükseltmek. </li><li> Seviyesinin düşürülmesi sırasında doğru pozisyonda kesit getirin. Dilimler CA1 bölgesinde elektrot yerleştirme (2 uyarıcı ve bir kayıt elektrotları) kolaylaştırmak için her zaman aynı şekilde konumlandırılmıştır. </li><li> Durdurmaksıvı arayüzü bulunmaktadır. Dilim etrafında bir ortam &quot;menisküs&quot; medya yeterli düzeyde göstergesidir. Net filtre ortamı ile doymuş ama tamamen sular altında değil olmalıdır. </li><li> Delikli kapağı üzerine yerleştirilen filtre kağıtları ile kaplı odası tutun. </li><li> 28, en az 1.5 saat için dilim dinlenmesine izin ° C </li></ol> 8. Synaptic Yanıtları kaydedilmesi <ol><li> Elektrot Kayıt: ACSF dolu zaman cam kılcal MQ 2-5 bir ucu direnci elde etmek için çekilir. Filtre kağıdı küçük bir parça, elektrot ucu etrafında yerleştirilir ve kemik mumu yoğunlaşma azaltmak için ucunda uygulanmaktadır. Uyarıcı elektrotlar: 12.5 mikron çaplı platin-iridyum bipolar küme elektrotlar FHC (ABD) satın alınır. Doğru bakım ile, her elektrot en az 30 kez (Şekil 1B) kullanılabilir. </li><li> CA1 bölgenin stratum radiatum elektrotlar yerleştirin, tüm elektrotları kaplıkadar (Şekil 3A). Elektrotlar Narishige mikromanipülatörler ile dilim yüzeyinin altında 75 ile 150 mikron indirilir. İki uyarıcı elektrot Schaffer teminat iki ayrı demetleri uyarmak için yerleştirilir. Elektrotlar dilim üzerine indirilir zaman, filtre kağıtları, dikkatli bir şekilde kapatılması için odasına etrafına yerleştirilir. </li><li> Iki fazlı uyarım (yarım dalga 0.08 milisaniye darbe süresi) SIU V tecrit birimleri bağlı bir Grass uyarıcısı sabit voltaj gerçekleştirilir. Maksimum cevap 12 V. Alan EPSPS bir TEFE ISO-80 amplifikatör ile 1000 kez yükseltilir ve 10 Hz ve 10 kHz süzülür en fazla 2 V uyaran yoğunluğunu artırarak kontrol edilir. Daha sonra sinyal bir Ulusal Enstrüman A / D dönüştürücü ile bir PC&#39;ye gönderilir. Uyarım, veri toplama ve analiz WinLTP programı (kullanılarak gerçekleştirilir <a href="http://www.winltp.com">www.winltp.com</a> ). Alan EPSPS bir giriş-çıkış elde edilen maksimum genlik% 40 kaydedilireğri koydu. Her dilim için, fEPSP yamaçlarında LTP indüksiyon önceki 30 dakika boyunca ortalama eğim karşı normalize edilmiştir. </li><li> LTP ikinci yolu bir kontrol olarak sunarken, bir yol üzerinde testi güçte stimülasyon tek bir tren (100 Hz) uygulayarak tetiklenir. </li></ol> 9. Kurulum temizliği <ol><li> En az 10 dakika boyunca, hidrojen peroksit (H2O 2)% 3&#39;lük bir çözeltisi ile tüm devre durulayın, sonra süzün. Devre dikkatle herhangi bir deney başlamadan önce distile su ile durulanır olacak. Diğer laboratuvarlar temizlenmesi için sadece saf su kullanmak ancak sadece su kullanılarak biz boru sistemindeki koyu kalıntı çökelmesi fark olarak H 2&#39;nin kullanımı O 2 kesinlikle gerekli değildir. </li><li> Kayıt odasına altında su banyosunda su değiştirin. </li><li> 5 dakika boyunca alkol banyo uyarıcı elektrotlar ipuçları. </li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Biz laboratuvarda geliştirilen ve LTP kayıtları 11,17 büyük bir uzmanlığa sahip diğer laboratuvarlar tarafından kullanılan yöntemlerin kombinasyonu kaynaklanan bir protokol geliştirdik. Bu protokol, yetişkin fare hipokampus adapte edilir ve her yaşta ve arka plan genotip hayvanlarda kullanılabilir. Ayrıca, Alzheimer hastalığı gibi nörodejeneratif hastalıkların 18,19 gelişmekte olan transgenik farenin LTP analizine izin verir. Sıçan hipokampal di...

Günümüzde, karmaşık anıları saklanır ve nöronal devre düzeyinde hatırlattı nasıl sınırlı anlayış vardır. Ancak, bellek depolama birleştirici bir hipotez mevcut ve genel olarak kabul edilir: hafızası merkezi sinir sistemindeki nöronlar arasındaki sinaptik bağlantıların gücü değişiklikleri olarak depolanır. Kendi başına, sinaptik plastisite araştırma büyük ölçüde iki atılım keşifler yararlanmıştır. (1) olarak sağlam anestezi tavşan kullanarak yeni ufuklar açan bir deney, Bliss ve Lomo 1,, kısa bir yüksek frekanslı (1 sn, 100 Hz) hipokampus olan delici yoluna stimülasyon teslim uzun süreli (birkaç neden olduğu bulundu saat) ilgili sinaptik bağlantıları artış. Bu büyüleyici fenomen 1.975 2 Douglas ve Goddard tarafından &quot;Uzun Vadeli potansiyelize&quot; veya LTP denirdi. (2) Daha sonra, benzer bir olay (0.4 mm) beyin dilimleri içinde devreye girebilir bulunmuştur yapay in vitro canlı tutulur </em&gt;. En yaygın olarak incelenmiştir LTP sözde CA1 bölgesinde piramidal nöronlarda uyarılmış çıkan alan uyarıcı sinaptik potansiyel kayıt sırasında aksonlar (sözde Schaffer kollateral) bir paket için bir veya birkaç tetani sunarak, in vitro tespit edildi. LTP indüksiyon mekanizmaları büyük ölçüde ortaya konmuştur. AMPA alıcılarının fosforilasyonuyla (verimlilik artar) ve post-sinaptik zar 3 ilave AMPA alıcılarının bir birleşme: Temel olarak, NMDA reseptörleri ile Ca2 + akışı, iki sonuçları olan enzimleri aktive. Deneysel olarak çok daha zor 30-60 dakika boyunca daha uzun saatler boyunca sağlıklı bir dilim sağlamaktır, özellikle, çünkü aksine, LTP bakım fazı mekanizmaları tam olarak bilinmemektedir. Birçok çalışma, LTP mekanizmaları ve ilginç teorileri anlayışı ithaf edilmiş yıllar 4-11 üzerinde ayrıntılı edilmiştir. Ama until şimdi, sinaptik gücü istikrarlı bir artış altında yatan kesin moleküler mekanizmaları ortaya konamamıştır. Bu hazırlanması için farklı teknikler kullanarak farklı laboratuvarlarda önceki sonuçları yeniden zorluk ve hipokampal dilim bakım kısmen olabilir. Onların metodoloji yazıda, Sajikumar ve ark. 12 sıçan hipokampal dilimleri ve istikrarlı LTP kayıt hazırlanması için deneysel koşullar önemini vurguladı. Bu videoda fare hipokampal dilim çok istikrarlı LTP kayıt edebilmek için yıllar boyunca laboratuarımızda geliştirilen tüm optimizasyon adımları sunuyoruz. Bu optimizasyon farenin 13 ve 11 sıçan LTP mekanizmaları incelemek diğer laboratuarlar tarafından geliştirilmiştir ve başarılı bir şekilde kullanılan protokoller yapılmıştır. Bu deneyimli araştırmacılar neden ve başarı oranı yüksek olan yetişkin farelerde çok uzun ömürlü LTP kaydetmenize olanak verir. Pbağlı LTP hysiological olarak dikkatli bir şekilde kontrol ve 14 gösterilmiştir. Bu metodoloji yazıda, diseksiyon işlemi derin dilimleri heyecanlanma değiştirebilirsiniz ise sıcaklık veya oksijen gibi deneysel koşullardan herhangi bir değişiklik, LTP bakım üzerinde derin bir etkiye sahip olduğunu göstermektedir. Ayrıca tüm bu parametrelerin hassas kontrol acemi öğrenciler için birkaç aylık bir eğitim gerektirdiğini vurgulamak gerekir.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagent/Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>S8875</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 1M</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>63126</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen</td>
			<td>Air Liquide (Belgium)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillaries</td>
			<td>WPI, Inc. (UK)</td>
			<td>TW150-4</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulating Electrodes</td>
			<td>FHC (USA)</td>
			<td>CE2B30</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tools</td>
			<td>FST (Germany)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper 84 g/m2</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>FT-3-105-110</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh</td>
			<td>Lycra</td>
			<td>15 den</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue</td>
			<td>UHU</td>
			<td>plus endfest300</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>WPI, Inc. (UK)</td>
			<td>ISO-80</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interface recording chamber</td>
			<td>FST (Germany)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pumps</td>
			<td>Gilson (USA)</td>
			<td>Minipuls 3</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>University of Edinburgh</td>
			<td><a href="http://www.etcsystem.com" target="_blank">www.etcsystem.com</a></td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Chopper</td>
			<td>Mcllwain</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulators</td>
			<td>Grass (USA)</td>
			<td>S88X + SIU-V</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Program analysis</td>
			<td>WinLTP</td>
			<td><a href="http://www.winltp.com" target="_blank">www.winltp.com</a></td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulators</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MM-3 and MMO-220A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope</td>
			<td>Leica Microsystem</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A/D converter</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NIPCI-6229 M-series</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved preparation and preservation of hippocampal mouse slices for a very stable and reproducible recording of long-term potentiation

Uzun vadeli potensiyalizasyon (LTP) sinaptik gücü bir artış ile karakterize sinaptik plastisite türüdür ve bellek kodlama dahil olmak inanıyordu. LTP yoğun çalışılmıştır akut hipokampal dilim CA1 bölgesinde ortaya çıkardı. Ancak bu olayın bakım aşamasında altında yatan moleküler mekanizmalar hala tam olarak anlaşılamamıştır. Bu farklı laboratuarlar tarafından kullanılan çeşitli deneysel koşullar, kısmen bağlı olabilir. Gerçekten de, LTP bakım aşamasında oksijen, sıcaklık ve nem gibi dış parametrelere sıkı bir şekilde bağlıdır. Ayrıca diseksiyonu sonra dilimleme uçak ve dilim canlılığı yönelim gibi iç parametreleri bağlıdır. Tüm bu parametrelerin optimizasyonu çok tekrarlanabilir ve çok istikrarlı uzun vadeli potensiyasyonun indüksiyon sağlar. Bu metodoloji daha da istikrarlı bir artış yer alan moleküler mekanizmaları keşfetmek için imkan sunuyorhipokampal dilim sinaptik gücü. Ayrıca nörofizyolojik olayların in vitro soruşturma deneysel koşullarının önemini vurgulamaktadır.

Bu metodoloji, erişkin farenin C57Bl/6J (JANVIER SAS, Fransa) 14 akut hipokampal dilimler indüklenir uzun süreli uzun süreli potansiyasyon özelliklerini analiz etmek için kullanılmıştır. Şaşırtıcı bir şekilde, deneysel koşullarının iyileştirilmesi LTP bakarak yeni bir yol yol açmıştır. Biz sinaptik gücü uzun süreli artış yeni protein sentezi gerektirmeyen gösterdi. Burada, LTP indüksiyon dilim canlılığı ve heyecan bağlı olduğunu göstermektedi...

Watch this Scientific Journal Video about Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation at JoVE.com

Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation

Bu makale hazırlamak ve korumak için tam bir metodoloji sunar<em&gt; In vitro</emYetişkin farelerin&gt; akut hipokampal dilim. Bu protokol% 95 başarı oranı ile fazla 8 saat boyunca çok sağlam uzun ömürlü uzun vadeli potansiyasyonu (LTP) ve kayıt sağlar.

Uzun vadeli potansiyelize bir çok Kararlı ve tekrarlanabilir Kayıt için geliştirilmiş Hazırlık ve Hipokampal Fare Dilimleri korunması

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory ...

improved-preparation-preservation-hippocampal-mouse-slices-for-very

Research

JoVE Journal

Neuroscience

26.6K Görüntüleme.  University of Mons. Bu makale hazırlamak ve korumak için tam bir metodoloji sunar In vitro akut hipokampal dilim. Bu protokol% 95 başarı oranı ile fazla 8 saat boyunca çok sağlam uzun ömürlü uzun vadeli potansiyasyonu (LTP) ve kayıt sağlar.

Video: Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). &beta;-amyloid (A&beta;), a peptide produced in high amounts in AD, is known to reduce Long-Term Potentiation (LTP), a cellular correlate of learning and memory. Indeed, LTP impairment caused by A&beta; is a useful experimental paradigm for studying synaptic dysfunctions in AD models and for screening drugs capable of mitigating or reverting such synaptic impairments. Studies have shown that A&beta; produces the LTP disruption preferentially via its oligomeric form. Here we provide a detailed protocol for impairing LTP by perfusion of oligomerized synthetic A&beta;1-42 peptide onto acute hippocampal slices. In this video, we outline a step-by-step procedure for the preparation of oligomeric A&beta;1-42. Then, we follow an individual experiment in which LTP is reduced in hippocampal slices exposed to oligomerized A&beta;1-42 compared to slices in a control experiment where no A&beta;1-42 exposure had occurred.

Preparation of Oligomeric &amp;#946;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

One feature of Alzheimer's Disease is the elevation of A&beta;1-42 peptide. Here we provide a protocol for preparing synthetic A&beta;1-42 oligomers, which impairs hippocampal Long-Term Potentiation, a cellular correlate of memory. This procedure is useful for investigating mechanisms of A&beta;-induced pathology and drug screening.

Β-amiloid Oligomerik hazırlanması 1-42</subHipokampal Dilimleri Sinaptik Plastisite değer düşüklüğü> İndüksiyon

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Nörobilim

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The hippocampus can be extracted quickly and easily from rats and mice and slices remain viable for hours in oxygenated artificial cerebrospinal fluid. Moreover, basic electrophysisologic techniques are easily applied to the investigation of synaptic function in hippocampal slices and have provided some of the best biomarkers for cognitive impairments. The hippocampal slice is especially popular for the study of synaptic plasticity mechanisms involved in learning and memory. Changes in the induction of long-term potentiation and depression (LTP and LTD) of synaptic efficacy in hippocampal slices (or lack thereof) are frequently used to describe the neurologic phenotype of cognitively-impaired animals and/or to evaluate the mechanism of action of nootropic compounds. This article outlines the procedures we use for preparing hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations associated with brain aging and Alzheimer's disease (AD)1-3. Use of aged rats and AD model mice can present a unique set of challenges to researchers accustomed to using younger rats and/or mice in their research. Aged rats have thicker skulls and tougher connective tissue than younger rats and mice, which can delay brain extraction and/or dissection and consequently negate or exaggerate real age-differences in synaptic function and plasticity. Aging and amyloid pathology may also exacerbate hippocampal damage sustained during the dissection procedure, again complicating any inferences drawn from physiologic assessment. Here, we discuss the steps taken during the dissection procedure to minimize these problems. Examples of synaptic responses acquired in "healthy" and "unhealthy" slices from rats and mice are provided, as well as representative synaptic plasticity experiments. The possible impact of other methodological factors on synaptic function in these animal models (e.g. recording solution components, stimulation parameters) are also discussed. While the focus of this article is on the use of aged rats and transgenic mice, novices to slice physiology should find enough detail here to get started on their own studies, using a variety of rodent models.

This article outlines procedures for preparing hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations associated with brain aging and age-related neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease.

Yaşlanma ve Amiloid Patoloji sırasında sinaptik değişiklikler Çalışması Sıçanlar ve Transgenik Farelerde akut Hipokampal Dilimleri hazırlanması

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

Tüm Dağı Muscle Analizi ile tekrarlanabilir Fare Siyatik Sinir Ezilme ve Rejenerasyon daha sonraki Değerlendirme

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

Fare Beyin Uzun vadeli Görüntüleme için Parlak ve Takviyeli inceltilmiş-kafatası Pencere

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

Preparation of an Awake Mouse for Recording Neural Responses and Injecting Tracers

It is well known that anesthesia alters neural response properties in various regions of the brain.13. In the auditory system, fundamental response properties of brainstem neurons including threshold, frequency specificity, and inhibitory sidebands are altered in significant ways under anesthesia1-2. These observations prompted physiologists to seek ways to record from single neurons without the contaminating effects of anesthesia. One result was a decerebrate preparation, where the brainstem was completely transected at the level of the midbrain4. The drawbacks of this preparation are a formidable surgery, the elimination of descending projections from the forebrain, and an inability to use sensory stimulation to examine structures above the midbrain. A different strategy has been to implant electrode arrays chronically to record from single neurons and multiunit clusters while the animal is awake and/or behaving5,6. These techniques however are not compatible with injecting tracer dyes after first electrophysiologically characterizing a brain structure. To avoid altering neural response properties with anesthetics while recording electrophysiological response properties from single neurons, we have adapted a head restraint technique long used in bats7-9 to mouse10-12. Using this method, we are able to conduct electrophysiological recordings over several days in the unanesthetized mouse. At the end of the recording sessions, we can then inject a dye to reconstruct electrode positions and recording sites or inject a tracer so that pathways to and from the recording loci can be determined. This method allows for well isolated single neuron recordings over multiple days without the use anesthetics.

Electrophysiological characterization of neuronal responses is important for understanding brain function and for guiding the placement of dyes for pathway tracing. However, many studies are performed in anesthetized animals. To understand brain function without anesthetics, we developed a method to record neuronal response properties and inject dyes in awake mouse.

Sinir Yanıtları Kayıt ve Tarayıcıları enjekte için bir Awake Fare hazırlanması

It is well known that anesthesia alters neural response properties in various regions of the brain.13.  In the auditory system, fundamental response ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

Uzun vadeli Olfaktör İntibak A Moleküler Saati<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Organotipik Hipokampal Dilimleri eşleştirilmiş Tüm Hücre Kayıtlar

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

Fare Koklear Eksplantlarından uzun vadeli Time Lapse Görüntüleme

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic hippocampal neurons can often grow successfully on glass coverslips at high density under serum-free conditions, but low density cultures typically require a supply of trophic factors by co-culturing them with a glia feeder layer, preparation of which can be time-consuming and laborious. In addition, the presence of glia may confound interpretation of results and preclude studies on neuron-specific mechanisms. Here, a simplified method is presented for ultra-low density (~2,000 neurons/cm2), long-term (&#62;3 months) primary hippocampal neuron culture that is under serum free conditions and without glia cell support. Low density neurons are grown on poly-D-lysine coated coverslips, and flipped on high density neurons grown in a 24-well plate. Instead of using paraffin dots to create a space between the two neuronal layers, the experimenters can simply etch the plastic bottom of the well, on which the high density neurons reside, to create a microspace conducive to low density neuron growth. The co-culture can be easily maintained for &#62;3 months without significant loss of low density neurons, thus facilitating the morphological and physiological study of these neurons. To illustrate this successful culture condition, data are provided to show profuse synapse formation in low density cells after prolonged culture. This co-culture system also facilitates the survival of sparse individual neurons grown in islands of poly-D-lysine substrates and thus the formation of autaptic connections.

Low density cultures of primary hippocampal neurons usually require glia feeder layer to supply neurotrophic factors and sustain longevity. We describe here a simplified method to culture ultra-low density neurons on glass coverslips in the presence of a high density neuronal feeder layer, which facilitates investigation of specific neuronal-autonomous mechanisms.

Ultra Düşük Yoğunluk için Basitleştirilmiş Bir Yöntem, Uzun Vadeli İlköğretim Hipokampal Nöron Kültürü

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Sinaptik plastisite akut Hipokampal dilimleri bir küçük hacimli geri dönüşüm-, perfüzyon- ve batma-tipi oda sistemi içinde tutulan kayıt

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...