Elektrofizyolojik Kayıtlar için Akut İnsan Hipokampal Dilimlerinin Hazırlanması

Tekniğimizi kullanarak, temporal lob epilepsisi için ilaç gelişimine yardımcı olmak için insan beyin örnekleri içinde potansiyel anti-epileptik maddeleri test edebilirsiniz. İnsan beyin dokusu temel araştırma ve klinik uygulamalar arasında çeviri kap ihlal avantajı vardır. İşlem günü veya bir gün önce mümkün olduğunca geç, 37 derece santigrat su banyosu nda 10x kolin aCSF çözeltisi 50 mililitre çözülme ve çözülmüş çözelti ve 10x çözeltisi 50 mililitre iki ila yaklaşık 300 mililitre çift distile su ekleyin.

Karışıma son glikoz ve kalsiyum klorür konsantrasyonlarını ekleyin ve eriyene kadar karıştırın. Daha sonra, 500 mililitrelik son bir hacim için çift distile su ekleyin. Ozmularitesini ölçün.

Ve 1x kolin aCSF yaklaşık 100 mililitre ile bir şişe doldurun. İşlem günü, buz üzerinde 1x kolin aCSF chill ve en az 10 ila 15 dakika boyunca çözüm karbogenate karbogen gazıbağlı bir cam gaz dispenseri kullanın. İşlemden en az 10 ila 15 dakika önce, depolama aCSF,yüksek potasyum artı 4-aminopyridine aCSF ve karbogenasyon ile 35 santigrat dereceye düşük magnezyum artı bikülin önceden ısıtın.

Arayüz odasını hazırlamak için, her dilim tutma bölmesi için iki adet dört şer iki santimetrelik filtre kağıdı kesin ve parçaları üst üste yığın. Daha sonra, çözeltinin gerilimini kırmak ve eşit bir akış sağlamak için bölmelerin içine filtre kağıdı parçalarının etrafına ince pamuk lu teller yerleştirin. Ve her bölmedeki daha büyük filtre kağıdının üzerine üç ila dört adet 1,5 ila bir santimetrelik filtre kağıdı yerleştirin.

Doku dilimleri edinmeden önce, hazırlık alanı silmek ve alan üzerinde bir kapak yerleştirmek için% 70 etanol kullanın. Süper tutkal, iki keskin cımbız, bir spatula, bıçaklı bir neşter ve vibratome yakın beyin dokusunun kaba kesim için bir bıçak yerleştirin. Vibratomun tampon tepsisini ve numune plakasını %70 etanol ile silin.

Tampon tepsi tamamen kuru olduğunda, alüminyum folyo ile kaplayın ve buz banyosu tepsi yerleştirin. Ezilmiş buz ile buz banyosu doldurun ve hazırlık kadar eksi 20 santigrat derece banyo korumak. Daha sonra, vibratom ve jileti %70 etanol ile silin ve dilimleme işlemi sırasında dikey titreşimleri ve doku hasarlarını en aza indirmek için vibratomu kalibre edin.

Doku örneğini aldıktan hemen sonra, taşıma kolin aCSF doku kaldırmak ve doku herhangi bir yanmış kısımları kesip. Doku parçasının numune plakasına yapıştırılmasını kolaylaştırmak için eşit bir yüzey kesin ve beyin dokusunu 400 mikrometre kalınlığında dilimler halinde dilimlemek için vibratomu kullanın, kesme sırasında vibratomun genliğini ve hızını gerektiği gibi ayarlayın. İnsan hipokampusbazı bölümleri diğerlerinden daha kesme daha dayanıklı olabilir.

Ekstra özen ve zaman almak numune kalitesini büyük ölçüde artırabilir. Kayıt odasına sığacak şekilde beyin dilimlerini kesmek için neşter kullanın ve dilimleri en az bir saat boyunca arayüz odasındaki küçük filtre kağıdı parçalarına dikkatlice yerleştirmek için bir spatula ve küçük forseps kullanın. Epileptiform aktivite kaydı için, plastik bir halkaya yapıştırılmış yarı geçirimli bir membranı hazneye yerleştirin ve odanın giriş ve çıkış tüplerini peristaltik bir pompaya bağlayın.

Tüpleri ve odayı önceden ısıtılmış karbogenated aCSF ile doldurun. Kayıt elektrotlarını hazırlamak için, dolgu 154 milimolar sodyum klorür çözeltisi ile bir ila iki megaohm cam pipetler çekti. Pipetleri bir elektrot tutucuya yerleştirin ve arayüz odasından bir hipokampal dilimi karbogenated aCSF ile dolu bir Petri kabına aktarmak için cımbız ve spatula kullanın.

Dilimi çevirmeden filtre kağıdını çıkarın ve dilimi kayıt odasına yerleştirin. Dilim örgü ile yerinde dilim tutun ve ilgi bölgesinde elektrotlar yerleştirin. Kaydı başlatın.

Yüksek potasyum artı 4-aminopiridin tarafından indüklenen patlama aktivitesi yıkandıktan sonra 2-5 dakika görünür olmalıdır, düşük magnezyum artı bikülliline nöbet benzeri olayların indüksiyon uyup ise 30 dakika kadar sürebilir. Yüksek potasyum artı 4-aminopyridine uygulanması birkaç dakika içinde patlama olayları şeklinde epileptiform aktiviteneden olur. 10 saniyeden fazla bir süre ile Nöbet benzeri olaylar düşük magnezyum artı bikülin uygulanması ile indüklenebilir.

Genlikler çoğunlukla etkilenmemiş olmasına rağmen patlama olaylarının sayısı hem lacosamide uygulaması sırasında hem de dimethylethanolamine uygulaması sırasında azalır. Beyin dokusunun kalitesi de hazırlık sırasında kontaminasyon ve hasarı azaltarak geliştirilebilir. Yöntemlerimiz ile hazırlanan insan beyin dilimleri de yama kelepçesi kullanarak nöronların temel fizyolojik fonksiyonlarını araştırmak veya çeşitli teknikler kullanarak gen ekspresyonunu araştırmak için kullanılabilir.

Tüm dünyada laboratuvarlar insan beyni içinde temel mekanizmaları çalışmaya başladı, ve bu anlayışlar ilaç gelişimine yardımcı olmak için kullanılabilir ve bizim önerilen yöntemler kullanılarak test edilebilir.