Burada sunulan protokol yetişkin ve yaşlanan fare hipokampal dilimlerinin hazırlanması sırasında aşırı hipoksik hasarı azaltarak, olgun ve yaşlanan nöral devrelerin işlevini incelemek için önemli bir engeli ortadan kaldırır. Sodyumiçermeyen çözeltilerde hipoterminin ortaya çıkması, kesimden sonra 10 saate kadar sağlıklı ve hem uzun süreli alan kayıtları hem de yama-kıskaç çalışmaları için uygun olan hipokampal dilimlerle sonuçlanır. Hipokampal dilimler hazırlama Bu yöntem tanımı gereği bir yaşlanma beyin hazırlık gerektiren nörodejeneratif hastalıklarda hayvan modelleri için özellikle ilgili olabilir.
Bu protokoldeki en kritik adım, buz gibi bir çözelti ile transkardiyal profüzyon yoluyla hipotermi getirilmesidir. Bazı uygulamalarla, araştırmacılar bu adımı güvenilir bir şekilde uygulayabilecekler. Kurtarma odası ve sonraki kayıtlar için bir litre aCSF çözümü hazırlayarak başlayın.
Sonra transkardiyal profüzyon ve kesme adımları için NMDG-aCSF 300 mililitre hazırlayın. Titreşimli mikrotom kesme tepsisini ve montaj diskini eksi 20 derecelik bir dondurucuya yerleştirin. Kurtarma odası hazırlamak için, örgü tutan dilim hemen üstüne doldurun ve oda sıcaklığında bankta oda üzerinde oda tutarak kabarcık başlar.
Buz kristalleri yüzey ve şişe duvarları oluşmaya başlayana kadar bir dondurucuda NMDG-aCSF tüm 300 mililitre chill. Sıfır ve iki derece santigrat arasında çözelti tutarak, buz ve kabarcık üzerine soğutulmuş ve NMDG-aCSF ile şişe yerleştirin. Doku montaj diskini dondurucudan alın ve gerekirse kurusilin.
Bir fare beyin boyutu hakkında% 5 agar bir blok kesip ve cyanoakrilat tutkal ince bir tabaka kullanarak diskin ortasında tutkal. Buz üzerine yapıştırılmış agar ile disk yerleştirin ve kullanıma hazır olana kadar kağıt havlu ile kaplayın. Kesme tepsisini dondurucudan çıkarın, mikrotome yerleştirin, sonra buzla çevreleyin ve bıçağı yükleyin.
Beyin diseksiyonu için tüm aletleri önceden hazırlayın. Transkardiyal perfüzyon için peristaltik pompayı ayarlayın. Buzlu NMDG-aCSF ile şişeiçine pompa boru bir tarafı yerleştirin ve 27 gauge iğne ile diğer tarafa uygun.
Pompa hızını dakikada yaklaşık 3,5 mililitreye ayarlayın. Bu hızda, bir NMDG-aCSF çıkışı hızlı bir yolculuk değil, sürekli bir akış. Fareyi sırt üstüne bir bez üzerine yerleştirin.
Devam etmeden önce, fare bir parmak çimdik gerçekleştirerek anestezi cerrahi bir düzlemde olduğunu doğruladı. Fare tepkisiz olmalı, daha sonra göğüs ve karın maruz böylece ön ve arka bacaklar aşağı bantlanmış. Göğüs kafesinin altından boğaza doğru giden derinin büyük bir parçasını kesin.
Sternum'u forsepslerle alın, hafifçe kaldırın ve göğüs boşluğu açığa çıkana kadar her iki taraftaki göğüs kafesini kesmeye başlayın. Diyafram keserek, ince bir kas parçası ile bağlı göğüs kafesi kapağı bırakarak. Bu maruz göğüs boşluğuna geri düşmeden bir kenara koymak mümkün olmalıdır.
Kalbin hala atışını kontrol edin ve karaciğerin çoğunun görünür olduğundan emin olun. İğneyi sağdan daha açık görünen sol ventriküle takın. İğneyi stabilize etmek için, vücudun sol tarafındaki kalan kaburgalardan geçirin.
Koyu kırmızı renkli sağ atriyum bulun ve küçük makas ile kesti. Kan akmaya başlamalı. Pompa başlatın ve kırmızıdan kahverengiye renk değişecek karaciğer, gözlemlemek.
Karaciğer rengini izleyin ve karaciğer soluk kahverengi dönene kadar perfüzyon devam edin. Pompayı birkaç dakika daha çalıştırın. Hayvanın vücut ısısı 28-29 dereceye düşmeli ve burnu dokunmak için soğuk olmalıdır.
Farenin kafasını büyük decapitation makasla deşin, sonra kafatasının üstündeki deriyi açmak için 10 numaralı bıçakla neşter kullanın. Küçük açılı makas ile, orta hatta kafatası kesti. Daha sonra, kafatasının sağ ve sol yarım larını gözetlemek için üç numaralı forceps'u kullanın, durayı onunla birlikte götürmeye dikkat edin.
Bir spatula ile dışarı kepçe ve buz üzerinde NMDG-aCSF çözeltisi içine bırakarak bir off-beyaz renk olmalıdır beyin, çıkarın. Bir dakika kadar orada bırakın. Beyni NMDG-aCSF'den çıkar ve bir filtre kağıdına yerleştirin.
Ön beynin rostral ucundan orta hatta ortalanmış 60 derecelik bir aletle 60 derecelik bir doku dilimini kesip çıkarın. Hipokampal dilimler için uygun açı yı sağladığı için montaj yüzeyinin kesilmiş kenarlarını kullanın. Neşter ile orta hattan yarımküreleri ayırın ve montaj diskine yapıştırın.
Buzdan montaj diskini alın ve gerekirse kuru silin. Sonra agar blok önünde her yarımkürede tutkal, yan aşağı kesti. Her iki yarımkürenin ventral kenarlarının agar bloğuna değdiğinden ve her iki yarımkürenin sırt tarafının bıçakla karşı karşıya olduğundan emin olun.
Kesilen tarafta yapıştırıldığında, her yarımküre yerinde dorsal hipokampus enine dilimleri sağlayan bir şekilde bıçak göreli yönlendirilmelidir. Diski yarımkürelerle birlikte buz gibi karbogenated NMDG-aCSF içeren bir kesme odasına batırın. 400 mikrometrelik bir kesin, sonra dilimi oda sıcaklığında karbogenated NMDG-aCSF içeren bir kurtarma odasına aktarmak için kesme ucu olan tek kullanımlık bir transfer pipeti kullanın.
Geri kalan bölümleri kesmeye ve dorsal hipokampus bölgesinden toplam 8-10 dilim kesmek için en fazla 10 dakika alarak kurtarma odasına aktarmaya devam edin. Kayıt yapmadan önce dilimleri oda sıcaklığında yaklaşık iki saat kuluçkaya yatırın. Bu protokol yetişkin farelerden hipokampal dilimler oluşturmak için kullanıldı.
CA1 alanında ve subiculumda çok sayıda piramidal hücre, kızılötesi diferansiyel kontrast mikroskopisi altında gözlendiğinde, sağlıklı hücrelerin bir özelliği olan düşük kontrastta görünür. Yama-kelepçe kayıtları altı aylıktan eski farelerin CA1 nöronlarından elde edilebilir. Buradaki örnek deneyde, nmda-LTD kontrol koşullarına göre indüklendikten sonra minyatür uyarıcı postsinaptik akımların sıklığı ölçüldü.
Minyatür uyarıcı postsinaptik akımların sıklığı, NMDA-LTD indüksiyonundan sonra nöronlarda daha düşüktü ve CA1'deki sinopsitlerin aktiviteye bağlı budamasını gösteriyordu. Genlik değişiklikleri algılanmadı. mEPSC kayıtları sırasında CA1 hücreleri de biyositin dolduruldu ve bozulmamış dendritik arbor ve piramidal nöronların sağlıklı hücre habitus burada görülebilir.
Floresan boyanın hücre boyunca sağlam bir dağılımı, farklı koşullar altında dendritlerin ve dendritik dikenlerin analizini sağlar. CA3-CA1 sinapslarının yaklaşık %170'lik uzun süreli potentiation veya LTP'si gözlenmiştir ve bu da LTP için gerekli sinyal basamaklarının yetişkin farelerden hazırlanan dilimlerde mevcut olduğunu düşündürmektedir. Sağlam bir alan uyarıcı postsinaptik potansiyel sinyal ağ bağlantısı da korunmuş olduğunu göstermektedir.
Protokolün iki kritik yönü hipotermi ve sitotoksik ödemi önlemek için çözümler de sodyum iyon yerine bir NMDG giriş bir buz gibi çözelti ile transkardiyal profüzyon vardır. Bu önlemler kullanılarak herhangi bir beyin bölgesinden akut dilimler hazırlanabilir. Ayrıca, bu şekilde hazırlanan dilimler iki foton veya geniş alan mikroskobu kullanılarak kalsiyum ve voltaj görüntülemeiçin kullanılabilir.
Bu protokol, yaşlanan hayvanlardan akut hipokampal dilimler için standart bir hazırlık için bir temel olarak hizmet verebilir ve böylece nörodejeneratif hastalık mekanizmaları bağlamında çalışmalar arasında karşılaştırmalar kolaylaştırmak.
