PWD Batı Üniversitesi&#39;nde Gerald M. Kidder için Sağlık Araştırma Bursu (CIHR) ve CIHR hibe Kanadalı bir Enstitüleri tarafından desteklenmektedir. Yazar ayrıca Burada sunulan protokol gelişimi ile yardım için Guelph Üniversitesi&#39;nde Julang Li kabul etmek istiyorum.

1. Medya Hazırlık <ol><li> Deney yer alacak hücre kültürü inkübatör bir gevşetti kapağı ile kullanım ve yer önceden medya 2-3 saat hazırlayın. Bu protokolde kullanılan Medya: <ol><li> 1 x B27, 40 ng / ml bFGF ve 20 ng / ml EGF ile desteklenmiş DMEM/F12 oluşan hücre orta kök hazırlayın. </li><li> 0.05 IU FSH, 0.03 IU LH, 3 mg / ml BSA, 5 ul / mL, 0.23 mM sodyum piruvat, 1 mg / ml fetuin, ve 1 ng / ml EGF ile takviye edilmiş M199 oluşan germ hücre farklılaşması orta hazırlayın. Tüm katkı maddelerinden oluşan ama FSH kullanılmadan bir baz vasatı, LH ve EGF ° C ila bir hafta için hazırlanmış ve 4 &#39;de saklanabilir. </li></ol></li></ol> 2. Hücre Kültürü Hazırlanması Kök <ol><li> Daha önce 12 açıklandığı gibi yeni doğan fare yavrular kök hücre izole edin. In vitro germ hücreli farklılaşmasında için geçiş 2-4 kök hücre yararlanın. VerimiOLC oluşumunu doğrudan ana kök hücrelerinin kalitesi ile ilgilidir. Bu en kısa sürede nüfusun geçit yaklaşık 2 genel olarak olan temiz ve sağlıklı göründüğü gibi farklılaşma başlamak en iyisidir. Ayrıca kültür kök hücreler son geçit 2 olumsuz OLC oluşumu verimliliği (yayınlanmamış) etkiler. </li><li> Önce alt-kültürü kök hücreler farklılaşma başlamadan 48 saat. Tüm askıya küresel hücre agrega ve harcanan medya kültür çanak, bir serolojik pipet kullanarak, ve bir 15 ml tüp içinde yer çıkarın. Sadece askıya küresel hücrelerin agrega değil, kendiliğinden ayırıyoruz çanak alt bağlı hücreleri toplamak için önemlidir. </li><li> 5 dakika boyunca 500 xg&#39;de Pelet hücreleri., Supernatant ve taze kök hücre, 500 ul ortam içinde tekrar süspansiyon 37 ° C ye ısıtıldı Yavaşça kısmen hücreleri ayırmak için agrega pipetle. Agresif hücre PipetiBu kadar s hücre canlılığı azaltacaktır. Düşük bir bağlanma 10 cm hücre kültürü kabı, taze, önceden ısıtılmış kök hücre orta 9.5 mi içine kısmen ayrışmış hücreleri yıkayın. </li><li> Farklılaşmanın başlamasından önce, 48 saat boyunca 37 ° C,% 5 CO2 inkübatör hücre kültürü hücreleri dönün. </li></ol> 3. OLC Farklılaşma <ol><li> Serolojik bir pipet kullanarak 15 ml tüp içinde kültür çanak ve yerden kök hücreleri çıkarmak, takılı olan hücreler geride bırakmak. 500 ul steril PBS içinde 500 xg ve tekrar süspansiyon de Pelet hücreleri. Güçlü pipet geniş kullanarak hücrelerin 10-20 hücreleri daha büyük değil kümeleri içine 1.000 ul ucu delik. Periyodik ayrışma sırasında, hücre küçük bir miktar kaldırmak ve toplu hücreler 10-20 tek tek hücrelerin kümeleri olan onaylamak için beyaz bir ışık mikroskobu altında kontrol edin. Ayrışma boyunca düşük hücre canlılığı ile sonuçlanacaktır. </li><li> Ayrışmış hücreleri için 9.5 ml PBS ekleyin ve 1 ekleyinHücre sayımı için bir hemasitometre bu hücre süspansiyonu 5 ul. 5 dakika boyunca 500 xg&#39;de Pelet hücreleri. </li><li> 1.32X10 6 hücre / farklılaşma ortamda ml &#39;lik bir konsantrasyonda, hücre yeniden askıya. </li><li> Düz dipli içine de ortalama 24 iyi süspansiyon çanak 500 ul ekleyerek plaka hücreleri. </li><li> 48 saat boyunca% 5 CO2 içinde 37 ° C&#39;de hücre kültürü inkübatöründe içine 24 ° C de çanak yerleştirin. Bir buna etiketli 1.5 ml tüp her iyi ve yerden 250 ul orta çıkarın. Her bir kuyunun 250 ul taze farklılaşma orta ekleyin. 5 dakika boyunca 500 x g&#39;de santrifüj harcanan aracı. ve supernatant atın. 50 ul taze farklılaşma ortamda herhangi bir pelet hücreleri tekrar süspansiyon ve farklılaşma plaka üzerinde de ilgili kültür dönmek. </li><li> Her 48 saat farklılaşma gün 12 yarım orta değişiklere. </li></ol>

<ol>
	<li>van den Hurk, R., Zhao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+mammalian+oocytes+and+their+growth,+differentiation+and+maturation+within+ovarian+follicles.">Formation of mammalian oocytes and their growth, differentiation and maturation within ovarian follicles.</a> Theriogenology. 63, 1717-1751 (2005).</li><li>Molyneaux, K. A., Stallock, J., Schaible, K., Wylie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+analysis+of+living+mouse+germ+cell+migration.">Time-lapse analysis of living mouse germ cell migration.</a> Dev. Biol. 240, 488-498 (2001).</li><li>Lawson, K. A., Hage, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+analysis+of+the+origin+of+primordial+germ+cells+in+the+mouse.">Clonal analysis of the origin of primordial germ cells in the mouse.</a> Ciba Found Symp. 182, 68-91 (1994).</li><li>Ginsburg, M., Snow, M. H., McLaren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primordial+germ+cells+in+the+mouse+embryo+during+gastrulation.">Primordial germ cells in the mouse embryo during gastrulation.</a> Development. 110, 521-528 (1990).</li><li>Hubner, K., Fuhrmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+oocytes+from+mouse+embryonic+stem+cells.">Derivation of oocytes from mouse embryonic stem cells.</a> Science. 300, 1251-1256 (2003).</li><li>Toyooka, Y., Tsunekawa, N., Akasu, R., Noce, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cells+can+form+germ+cells+in+vitro.">Embryonic stem cells can form germ cells in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 11457-11462 (2003).</li><li>Wang, L., Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte-like+Cells+Induced+from+Mouse+Spermatogonial+Stem+Cells.">Oocyte-like Cells Induced from Mouse Spermatogonial Stem Cells.</a> Cell Biosci. 2, 27 (2012).</li><li>Dyce, P. W., Wen, L., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+germline+potential+of+stem+cells+derived+from+fetal+porcine+skin.">In vitro germline potential of stem cells derived from fetal porcine skin.</a> Nat. Cell Biol. 8, 384-390 (2006).</li><li>Danner, S., Kajahn, J., Geismann, C., Klink, E., Kruse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+oocyte-like+cells+from+a+clonal+pancreatic+stem+cell+line.">Derivation of oocyte-like cells from a clonal pancreatic stem cell line.</a> Mol. Hum. Reprod. 13, 11-20 (2007).</li><li>Cheng, X., Chen, S., Yu, X., Zheng, P., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP15+gene+is+activated+during+human+amniotic+fluid+stem+cell+differentiation+into+oocyte-like+cells.">BMP15 gene is activated during human amniotic fluid stem cell differentiation into oocyte-like cells.</a> DNA Cell Biol. 31, 1198-1204 (2012).</li><li>Song, S. H., Kumar, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+porcine+multipotent+stem/stromal+cells+derived+from+skin,+adipose,+and+ovarian+tissues+and+their+differentiation+in+vitro+into+putative+oocyte-like+cells.">Characterization of porcine multipotent stem/stromal cells derived from skin, adipose, and ovarian tissues and their differentiation in vitro into putative oocyte-like cells.</a> Stem Cells Dev. 20, 1359-1370 (2011).</li><li>Dyce, P. W., Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+germ+line+potential+of+stem+cells+derived+from+newborn+mouse+skin.">In vitro and in vivo germ line potential of stem cells derived from newborn mouse skin.</a> PLoS One. 6, e20339 (2011).</li><li>Linher, K., Dyce, P., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primordial+germ+cell-like+cells+differentiated+in+vitro+from+skin-derived+stem+cells.">Primordial germ cell-like cells differentiated in vitro from skin-derived stem cells.</a> PLoS One. 4, e8263 (2009).</li><li>Hayashi, K., Ogushi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Offspring+from+Oocytes+Derived+from+in+Vitro+Primordial+Germ+Cell-Like+Cells+in+Mice.">Offspring from Oocytes Derived from in Vitro Primordial Germ Cell-Like Cells in Mice.</a> Science. , (2012).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Fonksiyonel OLCS Bugüne kadar in vitro tamamen kullanılarak geliştirilmiştir edilmemiştir. Son Hayashi ve arkadaşları tarafından yapılan bir çalışmada. In vitro oluşan ve daha da geliştirilmesi 14 in vivo transfer hücreleri İKK-gibi gelen yavrular üretmek mümkün oldu. Onlar in vivo nakli sonrasında kurtarıldı, hücreleri gibi PGC oluşturmak başardık ES hücreleri veya uyarılmış pluripotent hücreler ile başlayan, olgunlaşmış döllenm...

Erken embriyo sırasında, gametogenez primordial germ hücreli (PGC) oluşumu, göç ve gonadal sırtlar sonunda kolonizasyon dahil olmak üzere aşamalarında bir dizi oluşur. Bu süre zarfında PGCs giderek daha olgun gamet 1 içine çoğalması ve farklılaşması tabi. PGCs embriyo hindgut içine allantoisi en tabanından ve son olarak sonunda gonadal sırtlar kolonize dorsal duvar boyunca göç gerçeğini 2 çalışma onları son derece zor hale getirir. Alanında ilerlemelere rağmen, PGC oluşumu ve farklılaşma anlamaya çalışırken çalışmalar sınırlı sayısı, yeri ve göçmen doğa 3,4 engellemektedir edilmiştir. Son yıllarda, embriyonik kök hücrelerinin in vitro 5,6 germ hücreleri oluşturmak için potansiyele sahip olduğu gösterilmiştir. Benzer şekilde, birçok somatik kök hücreleri de germ hücreleri FOLL oluşturmak için potansiyele sahip olduğu gösterilmiştirin vitro kültür 7-11 nedeniyle. Son zamanlarda yeni doğan fare deri izole kök hücre germ-benzeri hücreler ve erken evre oosit 12 in vitro ayırt edildi. Farklılaşma sırasında Oct4 ifade eden kök hücrelerin alt artmış ve yapılar benzeyen kümülüs-oosit kompleksleri oluşturulmuştur. Oosit-benzeri hücreler (OLCS) kültürlerden aldı ve doğal oosit ile karşılaştırılabilir. 40-45 mikron ölçüm Bu kültür yöntemi OLCS kullanılarak elde edilir böyle Gdf9b, VASA ve DAZL olarak oosit için ifade benzer işaretleri. Bugüne kadar ortaya çıkan OLCS 12 olgun veya döllenmiş olması mümkün kalır. OLCS bu OLCS oluşturmak için kullanılan protokol hala içinde daha erken bir aşamada germ hücrelerinin oluşumu ve gelişimini incelemek için bir test olarak yardımcı olabilir çalışması için mümkün kalmasına rağmen bir in vitro sistemde kapalı. Kadar gelen OLCS oluşumunu tartışırken orijinal yayınmatic kök hücreler bir kök hücre kaynağı 8 olarak fetal domuz deri kullanılmaktadır. Bağlı farklılaşma sırasında erken oluşan İKK-benzeri hücreler, Oct4 olarak OLCS ve ekspres bu İKK işaretleri için VASA, STELLA, C-KIT ve DAZL 13 öncüleri olduğu gösterilmiştir olduğunu çalışmaya genişletilmesi. Bu, in vitro olarak germ hücre oluşumu ve farklılaşma incelemek için bu sistemi kullanan potansiyel destekler. Yeni doğan fare deriden OLCS oluşturmak için kullanılan protokol Bu video makalede gösterilecektir. Bu protokol kendi çoğalması ve farklılaşması için faktörlerin önemli aydınlatmak için bir araç sağlayabilir germ hücre gelişimi incelemek için bir in vitro model sunuyor.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>12500</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0266</td><td></td></tr><tr><td>ITS</td><td>Invitrogen</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A-6003</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Invitrogen</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Fetuin</td><td>Sigma</td><td>F3385</td><td></td></tr><tr><td>FSH</td><td>Sioux Biochemicals</td><td>915</td><td></td></tr><tr><td>LH</td><td>Sioux Biochemicals</td><td>925</td><td></td></tr><tr><td>M199</td><td>Invitrogen</td><td>31100-035</td><td></td></tr><tr><td>24 well plates</td><td>Nunc</td><td>144530</td><td></td></tr><tr><td>10 cm dishes</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>15 ml tubes</td><td>BD</td><td>352095</td><td></td></tr></tbody></table>

differentiation of newborn mouse skin derived stem cells into germ-like cells in vitro

Germ hücre oluşumu ve farklılaşması incelenmesi geleneksel olarak düşük hücre sayıları ve gelişmekte olan embriyoların içinde derin kendi konumu nedeniyle çok zor olmuştur. In vitro tabanlı sistem bir &quot;kapalı&quot; durumu gametogenez anlayışımız için çok değerli olabilecek. Yeni doğan fare deri izole somatik kök hücreler, gelen oosit-benzeri hücreler (OLCS) oluşumu gösterilmiştir ve bu video protokolde görüntülenebilir. Elde edilen OLCS gibi Oct4 Vasa, Bmp15 ve SCP3 gibi oosit ile tutarlı çeşitli işaretleri ifade eder. Ancak, olgunlaşma ya da mayoz tamamlamak için bir hatası nedeniyle gübreleme geçmesi mümkün kalır. Bu protokol daha olgun gamet içine germ hücrelerinin erken oluşumu ve farklılaşma eğitim için yararlı bir sistem sağlayacaktır. Erken farklılaşması sırasında Oct4 eksprese eden hücrelerin sayısına (potansiyel germ hücreleri gibi), ancak şu anda, F ~% 5 ulaşırOLCS bir ormation nispeten verimsiz kalır. Özel bakım başlangıç ​​hücre popülasyonu sağlıklı ve erken bir geçit olduğundan emin olmak için alınması gereken rağmen protokol oldukça yalındır.

Başlangıçta hücrelerin kültür çanak altına eklemek ve yaymak. Farklılaşma içine 42-72 saatte küçük askıya Oct4 pozitif hücreler oluşturmak ve (Şekil 1A) çoğalırlar. Kısa bir süre bu hücrelerin görselleştirme sonra çoğunluğu kaybolur ve bağlı hücrelerin kültür altındaki yoğun koloni agrega oluşturacaktır. Birkaç gün sonra bu agrega kültür yüzeyinden ayırır. Bu agrega bazılarında bir büyük hücreli (Şekil 1b ve 1c) görül...

Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro at JoVE.com

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Son yıllarda, in vitro kültür yöntemler kullanılarak germ hücre oluşumunu somatik kök hücrelerin birkaç farklı türde kullanılarak gösterilmiştir. Bu makale, görsel erken oosit benzeri hücrelere yeni doğan fare edilen kök hücrelerin farklılaşma sunacak.

Germ benzeri hücreler içine Yenidoğan Fare Cilt Türetilmiş Kök Hücre Farklılaşma<em&gt; In vitro</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

differentiation-newborn-mouse-skin-derived-stem-cells-into-germ-like

Research

JoVE Journal

Biology

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

9.2K Görüntüleme.  The University of Western Ontario. Son yıllarda, in vitro kültür yöntemler kullanılarak germ hücre oluşumunu somatik kök hücrelerin birkaç farklı türde kullanılarak gösterilmiştir. Bu makale, görsel erken oosit benzeri hücrelere yeni doğan fare edilen kök hücrelerin farklılaşma sunacak.

Video: Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as well as the generation of mature neural cell types for further study. In this protocol we describe a method for the differentiation of ESC to neural progenitors using serum-free, monolayer culture. The method is scalable, efficient and results in production of ~70% neural progenitor cells within 4 - 6 days. It can be applied to ESC from various strains grown under a variety of conditions. Neural progenitors can be allowed to differentiate further into functional neurons and glia or analyzed by microscopy, flow cytometry or molecular techniques. The differentiation process is amenable to time-lapse microscopy and can be combined with the use of reporter lines to monitor the neural specification process. We provide detailed instructions on media preparation and cell density optimization to allow the process to be applied to most ESC lines and a variety of cell culture vessels.

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

Serum serbest Tek tabakalı Kültüründe Fare Embriyonik Kök Hücre Sinir Farklılaşma

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Gelişim Biyolojisi

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines retain the ability to either self-renew or differentiate under specific conditions. Due to these properties, mESC are a useful tool in regenerative medicine, disease modeling, and tissue engineering studies. This article describes a simple protocol to obtain mESC lines with high derivation efficiencies (60-80%) by culturing blastocysts from permissive mouse strains on feeder cells in defined medium supplemented with leukemia inhibitory factor. The protocol can also be applied to efficiently derive mESC lines from non-permissive mouse strains, by the simple addition of a cocktail of two small-molecule inhibitors to the derivation medium (2i medium). Detailed procedures on the preparation and culture of feeder cells, collection and culture of mouse embryos, and derivation and culture of mESC lines are provided. This protocol does not require specialized equipment and can be carried out in any laboratory with basic mammalian cell culture expertise.

This article describes a protocol to efficiently derive and culture pluripotent stem cell lines from mouse embryos at the blastocyst stage.

Fare Preimplantasyon embriyo kök hücre satırlarından türetme

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

Fare Embriyonik Germinal Hücreleri İzolasyon ve türetilmesi

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Biyoloji

Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays to characterize the differentiated cells. The E14 mouse embryonic stem cells were used to form embryoid bodies through the hanging drop method, and then induced to differentiate into neural progenitor cells by retinoic acid, and finally differentiated into neurons. Quantitative&#160;reverse transcription&#160;polymerase chain reaction (RT-qPCR) and immunofluorescence experiments revealed that the neural progenitors and neurons exhibit corresponding markers (nestin for neural progenitors and neurofilament for neurons) at day 8 and 12 post-differentiation, respectively. Flow cytometry experiments on an E14 line expressing a Sox1 promoter-driven GFP reporter showed that about 60% of cells at day 8 are GFP positive, indicating the successful differentiation of neural progenitor cells at this stage. Finally, RNA-seq analysis was used to profile the global transcriptomic changes. These methods are useful for analyzing the involvement of specific genes and pathways in regulating the cell identity transition during neuronal differentiation.

We describe the procedure for the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into neuronal cells using the hanging drop method. Furthermore, we perform a comprehensive phenotypic analysis through RT-qPCR, immunofluorescence, RNA-seq, and flow cytometry.

Nöral Progenitörlerin ve Nöronların Fare Embriyonik Kök Hücrelerinden Farklılaşması ve Karakterizasyonu

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...

Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons as well as synchronizing the outputs of pyramidal neuron ensembles. Deficits in interneuron function have been implicated in a variety of neuropsychiatric disorders, including schizophrenia, autism, and epilepsy. The derivation of cortical interneurons from embryonic stem cells not only allows for the study of their development and function, but provides insight into the molecular mechanisms underlying the pathogenesis of cortical interneuron-related disorders. Interneurons also have the remarkable capacity to survive, migrate, and integrate into host cortical circuitry post-transplantation, making them ideal candidates for use in cell-based therapies. Here, we present a scalable, highly efficient, modified embryoid body-to-monolayer method for the derivation of Nkx2.1-expressing interneuron progenitors and their progeny from mouse embryonic stem cells (mESCs). Using a Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual reporter mESC line, Nkx2.1 progenitors or their Lhx6-expressing post-mitotic progeny can be isolated via fluorescence-activated cell sorting (FACS) and subsequently used in a number of downstream applications. We also provide methods to enrich for parvalbumin (PV) or somatostatin (SST) interneuron subgroups, which may be helpful for studying aspects of fate determination or for use in therapeutic applications that would benefit from interneuron subgroup-enriched transplantations.

This protocol describes a method for generating cortical interneuron progenitors and post-mitotic interneuron precursors from mouse embryonic stem cells using a modified embryoid body-to-monolayer method. These progenitors/precursors can be used in vitro or fluorescently sorted and transplanted into neonatal neocortex for studying fate determination, or used in therapeutic applications.

Fare embriyonik kök hücre farklılaşma içine kortikal Interneuron Kara filmin tarih öncesi

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons ...

Nörobilim

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and potentially aid in regenerative medicine. Here, we established an efficient and low cost method for neuronal differentiation from mESCs in vitro, using the strategy of combinatorial screening. Under the conditions defined here, the 2-day embryoid body formation + 6-day retinoic acid induction protocol permits fast and efficient differentiation from mESCs into neural precursor cells (NPCs), as seen by the formation of well-stacked and neurite-like A2lox and 129 derivatives that are Nestin positive. The healthy state of embryoid bodies and the timepoint at which retinoic acid (RA) is applied, as well as the RA concentrations, are critical in the process. In the subsequent differentiation from NPCs into neurons, N2B27 medium II (supplemented by Neurobasal medium) could better support the long term maintenance and maturation of neuronal cells. The presented method is highly efficiency, low cost and easy to operate, and can be a powerful tool for neurobiology and developmental biology research.

Here, we established a low cost and easy to operate method that directs fast and efficient differentiation from embryonic stem cells into neurons. This method is suitable for popularization among laboratories and can be a useful tool for neurological research.

Fare Embriyonik Kök Hücre in vitro nöronal farklılaşma

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

Isolation of Mouse Epidermal Keratinocytes and Their In Vitro Clonogenic Culture

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately 30 x 106 viable cells per mouse. Primary adult mouse keratinocytes are harvested from the dorsal skin of female mice. Male mice (~6 weeks old) can be used for keratinocyte harvesting depending on the requirements of the experiment. Euthanized mice are shaved and sterilized with serial washes in povidone iodine and ethanol solutions (70% alcohol). After disinfecting the mice, the dorsal skin is removed and the subcutaneous fat and muscle are removed with a scalpel and discarded. The skins are cut into small pieces and treated with a mild, low temperature trypsinization to detach the lower dermis from the epidermis. The scraped epidermises are stirred at low speed, filtered to remove the hairs, counted, and re-suspended in culture medium. This method provides an excellent single cell suspension of highly culturable cells for many downstream applications.

The goal of this protocol is to isolate epidermal keratinocytes from the dorsal skin of adult mice for a variety of downstream applications such as molecular biology, biochemistry, fluorescence activated cell sorting, and primary in vitro uses (e.g., clonogenic keratinocytes).

Fare Epidermal Keratinositlerin İzolasyon ve In Vitro Klojenik Kültür

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately ...

Isolation and Differentiation of Primary White and Brown Preadipocytes from Newborn Mice

The understanding of the mechanisms underlying adipocyte differentiation and function has greatly benefited from the use of immortalized white preadipocyte cell lines. These cultured cell lines, however, have limitations. They do not fully capture the diverse functional spectrum of the heterogenous adipocyte populations that are now known to exist within white adipose depots. To provide a more physiologically relevant model to study the complexity of white adipose tissue, a protocol has been developed and optimized to enable simultaneous isolation of primary white and brown adipocyte progenitors from newborn mice, their rapid expansion in culture, and their differentiation in vitro into mature, fully functional adipocytes. The primary advantage of isolating primary cells from newborn, rather than adult mice, is that the adipose depots are actively developing and are, therefore, a rich source of proliferating preadipocytes. Primary preadipocytes isolated using this protocol differentiate rapidly upon reaching confluence and become fully mature in 4-5 days, a temporal window that accurately reflects the appearance of developed fat pads in newborn mice. Primary cultures prepared using this strategy can be expanded and studied with high reproducibility, making them suitable for genetic and phenotypic screens and enabling the study of the cell-autonomous adipocyte phenotypes of genetic mouse models. This protocol offers a simple, rapid, and inexpensive approach to study the complexity of adipose tissue in vitro.

This report describes a protocol for the simultaneous isolation of primary brown and white preadipocytes from newborn mice. Isolated cells can be grown in culture and induced to differentiate into fully mature white and brown adipocytes. The method enables genetic, molecular, and functional characterization of primary fat cells in culture.

Primer Beyaz ve Kahverengi Preadipositlerin Yenidoğan Farelerden İzolasyonu ve Farklılaşması

The understanding of the mechanisms underlying adipocyte differentiation and function has greatly benefited from the use of immortalized white ...

Isolation of Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum and Differentiation into Neural Cells

Source: Edamakanti, C. R., et al. <a href="https://app.jove.com/v/60554">Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video demonstrates a method for isolating stem cells from the postnatal mouse cerebellum and differentiating them into neural cells. Stem cells from the isolated cell suspension are purified using antibody-coated magnetic beads and are cultured to form neurospheres. The neurospheres are then maintained in a differentiation medium to generate neural cells.

Doğum Sonrası Fare Beyinciğinden Kök Hücrelerin İzolasyonu ve Nöral Hücrelere Farklılaşması

1. Preparation of Solutions

	Prepare tissue dissociation solution made from sterile phenol red-containing Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS) ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Nöronal Kültür Teknikleri

Gelişmiş Nöron Modelleri

A Technique for Generating Neural Progenitor Cells from Mouse Embryonic Stem Cells

Add 1.5 million mouse embryonic stem cells into a non-adhesive bacterial dish in 10 milliliters of basal differentiation medium, and incubate the plate at 37 degrees Celsius and 5% carbon dioxide to allow for embryoid body formation.
After two days, transfer the cell aggregates into 15-milliliter centrifuge tubes, and let them settle by gravity. Remove the supernatant and add 10 milliliters of fresh basal differentiation medium to resuspend the embryoid bodies. Then, replant them into a new non-adhesive dish and incubate them for another two days.
Collect and seed about 50 embryoid bodies in 2 milliliters of basal differentiation medium per well onto a gelatin-coated six-well plate. For retinoic acid induction, add 2 microliters of RHA stock into each well to a final concentration of 1 micromolar. Return the plate to the incubator and differentiate the cells for another four days.

Germ benzeri hücreler içine Yenidoğan Fare Cilt Türetilmiş Kök Hücre Farklılaşma

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler