Bu protokol, in vivo sahip olduğumuz yağ dokusunun fizyolojisi olan in vitro'yu sadık bir şekilde yeniden oluşturan beyaz ve kahverengi adipositlerin hücre kültürel modellerini oluşturmak için basit bir strateji sağlar. Bu protokol, yenidoğan farelerden hem beyaz hem de kahverengi preadipositlerin eşzamanlı olarak izolasyonunu sağlar ve bu yöntemi kullanarak izole ettiğimiz hücreler yüksek proliferatif kapasiteyi ve farklılaşma potansiyelini değerlendirir. Bu yaklaşım kullanılarak izole edilen hücreler yağ dokusunun karmaşıklığını diğer kültür modellerinden daha iyi yansıtır.
Ve obezite ve diyabette adiposit fonksiyonunu daha doğru incelemek için kullanılabilir. Öncelikle obezitede yağ dokusu disfonksiyonu anlamaya odaklanıyoruz. Bununla birlikte, bu yöntemle hazırlanan hücreler, gelişim biyolojisinde hücre ile ilgili temel soruları incelemek için de kullanılabilir.
Başarılı bir deneyin anahtarı, beyaz yağ depolarının küçük, ancak çok zengin ve çoğalan preadipositlerin yavrularda ayırt edilmesi zor olabilen bu depolar olarak nasıl tanımlanacağını belirlemektir. Görsel gösterim, bu protokolün ne kadar basit olduğunu gösterir ve beyaz ve kahverengi yağ depolarını bulmak ve parçalamak için ipuçları sağlanmasına izin verir. Depo izolasyonu görmek çok yararlıdır.
Deri altı beyaz yağ dokusunu toplamak için, ötanazi bir yenidoğan yavrunun karnının etrafındaki cildi kesin ve cildi bacakların altına hafifçe çekin. Herhangi bir cilt dokusu toplamadan, cildin içine veya kuadriseps'in üstüne bağlı açık veya beyaz, ince uzun bir doku olarak görünecek olan yağ deposunu dikkatlice hasat edin. Hasat edilen depoyu PBS'de durulayın ve yağ dokusunu 250 mikrolitre PBS ve 200 mikrolitre 2X izolasyon tamponu içeren 1,5 mililitrelik bir tüpe yerleştirin.
Kesitler arası kahverengi yağ dokusunu toplamak için, cildi omuz bıçaklarından başın üzerine çekin ve omuz bıçakları arasında bulunan koyu kırmızı kahverengi yağ dokusunu kaldırın. Vücuttan ayırmak ve dokuyu kıvam ve renk için kontrol etmek için yağlığın her yerinde dikkatlice kesiler yapın. Durulamadan sonra, dokuyu 250 mikrolitre PBS ve 200 mikrolitre 2X izolasyon tamponu içeren ikinci bir 1,5 mililitrelik tüpe yerleştirin.
Tüm depolar toplandığında, her depoyu doğrudan tüplerin içine dört ila altı kez nazikçe kıymak için makas kullanın ve her tüpe 2X izolasyon tamponunda 50 mikrolitre 10X kollajenaz ekleyin. Daha sonra dokuları karıştırmak ve sıcaklık kontrollü bir karıştırıcıya 37 santigrat derecede 30 dakika ve dakikada 1400 devir yerleştirmek için tüpleri hızlı bir şekilde ters çevirin. Sindirimin sonunda, tüpleri tekrar buza yerleştirin ve sindirim dokularını 100 mikron hücre süzgeçlerinden yeni 50 mililitrelik tüplere filtreleyin.
Hücre verimini en üst düzeye çıkarmak için, her tüpü bir mililitre izolasyon ortamı ile durulayın ve bu yıkamayı süzgeçten filtreleyin. Kahverengi ve beyaz yağ dokusu çözeltilerini taze izolasyon ortamında depo başına kuyu başına iki mililitre doku süspansiyonu ile seyreltin. Daha sonra dört ila altı kuyunun her birine iki mililitre beyaz yağ dokusu süspansiyonu ve altı kuyu plakasının iki ila üç kuyusunun her birine iki mililitre kahverengi yağ dokusu süspansiyonu, kuyu başına bir 100 mikron filtre ile plakaleyin.
Tüm hücreler kaplandığında, plakayı 60 ila 90 dakika boyunca hücre kültürü inkübatöre yerleştirin. Kuluçkanın sonunda, her bir kuyuyu iki mililitre serumsuz ortamla yıkayın ve kuyuların dibinden herhangi bir kan hücresini ayırmak için plakayı hafifçe çalkalayın. Üç yıkamadan sonra, kuyulara iki mililitre taze izolasyon ortamı ekleyin ve plakayı hücre kültürü inkübatörüne geri verin.
Hücreler% 80 ila 90 izdiah ulaştığında, yeni hedef plakaları 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede damıtılmış suda steril% 0.1 jelatin ile kaplayın. Plakalar inkübasyon yaparken, hücre kültürü inkübatöründe üç dakika tripin ile tedavi etmeden önce hücreleri PBS ile yıkayın. Hücreler ayrıldığında, hücre iyileşmesini en üst düzeye çıkarmak ve hücreleri yeni bir tüpe aktarmak için hücre süspansiyonunu birkaç kez pipetlayın.
Tüm hücreler toplandığında, her bir kuyuyu bir mililitre izolasyon ortamıyla yıkayın ve yıkamaları hücre süspansiyonu ile çekin. Hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve saymak için peleti üç ila beş mililitre izolasyon ortamına yeniden koyun. Hücreleri taze izolasyon ortamında kaplamak için uygun konsantrasyona seyreltin ve fazla jelatinleri çıkarmak için jelatin kaplı plakaları PBS ile yıkayın.
Daha sonra hücreleri jelatin kaplı plakalara tohumlayın ve hücreleri hücre kültürü inkübatörüne geri döndürün. Hücreler konfluense ulaştığında, yalıtım ortamını farklılaşma ortamıyla değiştirin. Kahverengi yağ dokusu preadipositlerini ayırt ediyorsanız, bir nanomoler triiyodotironin de ekleyin.
48 saat sonra, ortamı kültür başına uygun bakım ortamı hacmiyle yenileyin. Şu anda, hücreler içindeki küçük sıvı damlacıklarının birikmesi parlak alan mikroskopisi altında görünür hale gelmelidir. Filtrelemeden sonra bile, bazı hücresel döküntüler ve kan hücreleri hücre süspansiyonu içinde kalır.
Kaplamadan bir saat sonra nazik yıkamalar, preadipositler kuyunun dibine hızla yapıştıkça ilgili olmayan hücreleri uzaklaştırır. Yenidoğan yavrulardan izole edilen hem beyaz hem de kahverengi preadipositler yüksek proliferatif kapasiteye sahip olsa da, beyaz preadipositlerin verimi genellikle depo bazında kahverengi preadipositlerin iki katıdır. Bu nedenle, senkronize kültürler isteniyorsa, beyaz preadipositlerin bu başlangıç yoğunluğu buna göre hesaplanmalıdır.
Farklılaşmanın sonunda, hücreler lipit damlacıkları ile yüklenmiş gibi görünecek ve sırasıyla beyaz ve kahverengi adipositlerin klasik belirteçlerini ifade edecektir. Bazal koşullar altında primer beyaz ve kahverengi adipositlerin mitokondriyal stres testinde oksijen tüketiminin bu karşılaştırmalı analizinde ve mitokondriyal fonksiyonun bilinen uyarıcılarına yanıt olarak, her hücre tipinin bu spesifik biyoenergetik yetenekleri gözlemlenebilir. Canlı hücreleri izole ettiğimizi ve onları birkaç gün boyunca kültüre etmek istediğimizi unutmayın.
Bu nedenle, sonraki kültürü tehlikeye atabilecek kirlenmeyi önlemek için izolasyon sırasında steril koşulları koruduğunuzdan emin olun. Bu yöntem, adiposit işlevini etkileyen hücre otonom mekanizmalarını incelemek için fonksiyonel tahliller, genetik veya kimyasal ekranlar veya omik profilleme dahil olmak üzere farklı uygulamalar için kullanılabilecek tamamen olgun adipositler üretir.
