Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 31501099) ve Hubei Eyaleti Eğitim Departmanı Orta Yaşlı ve Genç (No. Q20191104). Wuhan Bilim ve Teknoloji Üniversitesi'nden Profesör Wensheng Deng'e fare embriyonik kök hücre çizgileri A2lox'u sağladığı için teşekkür ederiz.

1. Fare embriyonik kök hücre kültürü
<ol><li>% 0.1 jelatin kaplı hücre kültürü yemekleri veya tabakları hazırlayın.<ol>
<li>60 mm hücre kültürü yemeklerine 2 mL sterilize edilmiş %0,1 jelatin (suda %0,1 w/v) ekleyin. Hücre kültürü yemeklerinin eşit şekilde kaplanmasını sağlamak için hafifçe sallayın.</li>
		<li>Bulaşıkları 37 °C'de % 5 CO2 inkübatöre koyun ve 1 saat boyunca kaplamaya izin verin.</li>
		<li>Hücreleri tohumlamadan önce% 0.1 jelatin çözeltisini çıkarın. NOT: Jelatin çıkarıldıktan sonra, kaplanmış bulaşıkları kurutmaya veya yıkamaya gerek yoktur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fare embriyonik kök hücreleri (A2lox ve 129) kültürü<ol>
<li>%0,1 jelatin kaplı 60 mm hücre kültürü yemeklerindeki mESC hücrelerini sırasıyla %5 CO2 inkübatöründe 37 °C'de 37 °C'de kuluçkaya yatırın. mESC büyüme ortamı% 85 nakavt DMEM / F12, 15% Nakavt serum replasmanı (KSR), 0.1 mM β-mercaptoethanol (2ME), 2 mM GlutaMAX, %1 esansiyel olmayan amino asit (NEAA), %1 penisilin/streptomisiyan (P/S), 1000 U/mL lösemi inhibitör faktörü (LIF), 10 nM CHIR-99021 (GSK-3 inhibitörü) ve 0,33 nM PD0325901 (MEK inhibitörü). DİkKAT: β-mercaptoethanol yanıcıdır ve soluma toksisitesi vardır. Yangın kaynaklarından uzak durun ve kullanırken teneffüsten kaçınmak için maske takın.</li>
		<li>A2lox ve 129'un daha iyi büyümesi için mESC büyüme ortamını günlük olarak değiştirin.</li>
		<li>Hücreler% 80 izdihama ulaştığında, ortamı çıkarın ve yemeğe% 0.1 tripsin 1 mL ekleyin. Tüm hücrelerde tripin kapağını bile sağlamak için 30 sn hafifçe sallayın.</li>
		<li>Trypsinize için hücreleri yaklaşık 1 dakika bekletin ve ardından 1 mL pipet kullanarak tripsin çıkarın.</li>
		<li>Yemeğe 2 mL mL mESC büyüme ortamı ekleyin, tek bir hücre süspansiyonu yapmak için birkaç kez pipet yukarı ve aşağı.</li>
		<li>Hemositometre kullanarak süspansiyondaki hücrelerin yoğunluğunu mümkün olduğunca doğru bir şekilde sayın.</li>
		<li>Hücreleri 7 gruba ayırın ve Tablo 1'degösterilen farklı protokolleri kullanarak farklılaşmaya neden olan.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. MESC'lerden NPC'lere farklılaşma (Aşama I)
<ol><li>% 0.1 jelatin kaplı hücre kültürü plakaları veya kapak örtüleri hazırlayın.<ol>
<li>Kullanmadan önce, adım 1.1'deki gibi% 0.1 jelatin kaplı 6 kuyu plakaları veya kapaklar hazırlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Protokol 1 kullanılarak Aşama I farklılaşması (Tablo 1)<ol>
<li>%0,1 jelatin kaplı 6 kuyulu plakalarda kuyu başına 2 mL bazal farklılaşma ortamında yaklaşık 2 x 104 mESC tohum. Mikroskop altında hücre yoğunluğunu kontrol edin.</li>
		<li>Hücreleri 37 °C'de% 5 CO2 inkübatörde 6 saat boyunca inkübatöre sokun.</li>
		<li>Bağlanmadan sonra, inkübatörden hücreleri çıkar ve hücreleri 2 mL PBS ile iki kez yıkayın.</li>
		<li>Her kuyuya 2 mL bazal farklılaşma ortamı I (Tablo 1) ekleyin ve hücreleri tekrar inkübatöre koyun.</li>
		<li>Hücreleri 8 gün boyunca farklılaşma için bırakın. Bazal farklılaşma ortamı I'yi her 2 günde bir değiştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Protokol 2 kullanılarak Aşama I farklılaşması (Tablo 1)<ol>
<li>%5 CO2 inkübatörde 37 °C'de embriyoid vücut oluşumuna izin vermek için 10 mL bazal farklılaşma ortamı I'de yapışkan olmayan bir bakteri kabına 1,5 x 106 mESC ekleyin.</li>
		<li>2 gün sonra, hücre agregalarını 15 mL santrifüj tüplerine aktarın ve yerçekimi ile yerleşmelerini bırakın.</li>
		<li>Süpernatant çıkarın ve embriyoid vücutları yeniden depolamak için 10 mL taze bazal farklılaşma ortamı I ekleyin. Onları yeni bir nonadhesive bakteri kabına yeniden dikin ve 2 gün daha farklılaşmaya izin verin.</li>
		<li>Mikroskop altında embriyoid cisimlerinin oluşumunu kontrol edin (Şekil 2A).</li>
		<li>Embriyoid cisimleri 2.3.2-2.3.3 adımlarında açıklandığı gibi toplayın. %0,1 jelatin kaplı 6 kuyu plakası üzerine kuyu başına 2 mL bazal farklılaşma ortamında yaklaşık 50 embriyoid cisim tohum.</li>
		<li>1 mM all-trans RA stoğu hazırlayın (DMSO'da) ve alt ambalajdan sonra -80 °C dondurucuda ışıktan uzak saklayın. NOT: RA kararsızdır ve RA stoğunun hazırlanması sırasında ışıktan uzak tutmaya ve hava temasını azaltmaya dikkat edilmelidir.</li>
		<li>RA indüksiyonu için, 1 μM'lik son bir konsantrasyon yapmak için her kuyuya 2 μL RA stoğu ekleyin.</li>
		<li>Plakayı 37 °C'de % 5 CO2 inkübatöre yerleştirin ve 4 gün daha ayırt edin.</li>
		<li>2 mL bazal farklılaşma ortamı I'nin tamamını (1 μM RA ile) her 2 günde bir değiştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Protokol 3 kullanılarak Aşama I farklılaşması (Tablo 1)<ol>
<li>Bitki 1.5 x10 6 mESC'yi 10 mL bazal farklılaşma ortamında yapışkan olmayan bir bakteri kabına yerleştirin I. %5 CO 2 inkübatörde 37 °C'de embriyoid vücut oluşumu için2 gün bekletin.</li>
		<li>Mikroskop altında embriyoid cisimlerinin oluşumunu kontrol edin (Şekil 2B).</li>
		<li>Hücre agregalarını 15 mL santrifüj tüplerine aktarın ve yerçekimi ile yerleşmelerine izin verin.</li>
		<li>Süpernatant'ı dikkatlice çıkarın ve yeniden depolamak için 10 mL taze bazal farklılaşma ortamı I ekleyin.</li>
		<li>Yaklaşık 50 embriyoid cisimini% 0.1 jelatin kaplı 6 kuyu plakalarına kuyu başına 2 mL bazal farklılaşma ortamına tohumlayın.</li>
		<li>RA indüksiyonu için, 1 μM'lik son bir konsantrasyon yapmak için her kuyuya 2 μL RA stoğu ekleyin.</li>
		<li>Plakayı 37 ° C'de% 5 CO2 inkübatöre yerleştirin ve 6 gün daha ayırt edin. Tüm bazal farklılaşma ortamı I'yi (1 μM RA ile) her 2 günde bir değiştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Protokol 4 kullanılarak Aşama I farklılaşması (Tablo 1)<ol>
<li>Tohum yaklaşık 2 x10 4 mESC içinde 2 mL bazal farklılaşma ortamı I kuyu başına% 0.1 jelatin kaplı 6 kuyu plakaları üzerine. Plakayı 6 saat boyunca bağlanmaya izin vermek için 37 °C'de% 5 CO2 inkübatörüne yerleştirin.</li>
		<li>Bağlanmadan sonra, hücreleri 2 mL PBS ile iki kez yıkayın. Her kuyuya 2 mL bazal farklılaşma ortamı I ekleyin ve 37 °C'deki %5 CO 2 inkübatörde4 gün boyunca farklılaşmaya izin verin.</li>
		<li>RA indüksiyonu için, 4 gün daha farklılaşmayı teşvik etmek için her kuyuya 2 μL all-trans RA stoğu ekleyin (çalışma konsantrasyonu 1 μM'dir).</li>
		<li>Tüm süreçte, tüm ortamı her 2 günde bir değiştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Protokol 5 kullanılarak Aşama I farklılaşması (Tablo 1)<ol>
<li>Tohum yaklaşık 2 x10 4 mESC içinde 2 mL bazal farklılaşma ortamı I kuyu başına% 0.1 jelatin kaplı 6 kuyu plakaları üzerine. Plakayı 6 saat boyunca bağlanmaya izin vermek için 37 °C'de% 5 CO2 inkübatörüne yerleştirin.</li>
		<li>Hücreleri 2 mL PBS ile iki kez yıkayın. Her kuyuya 2 mL bazal farklılaşma ortamı I ekleyin ve 37 °C'deki %5 CO 2 inkübatörde2 gün boyunca farklılaşmaya izin verin.</li>
		<li>Sonraki RA indüksiyonu için, 1 μM'lik son bir konsantrasyon yapmak için her kuyuya2 μL RA stoğu ekleyin.</li>
		<li>Tüm süreçte, tüm ortamı her 2 günde bir değiştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Protokol 6 (Tablo 1) kullanılarak Aşama I farklılaşması<ol>
<li>Embriyoid cisimlerin oluşumuna izin vermek için10 mL N2B27 orta II 'de (Tablo 1) yapışkan olmayan bir bakteri kabına1,5 x 10 6mESC yerleştirin.</li>
		<li>2. günde, 2.3.2-2.3.3 adımlarında açıklandığı gibi hücre agregalarını toplayın ve 10 mL taze N2B27 orta II kullanarak embriyoid gövdeleri yeniden uygulayın.</li>
		<li>Onları yeni bir nonadhesive bakteri kabına yeniden dikin ve 37 °C'deki% 5 CO 2 inkübatörde2 gün daha farklılaşmaya izin verin. Mikroskop altında embriyoid cisimlerinin oluşumunu kontrol edin.</li>
		<li>4. günde embriyoid vücutları toplayın. 2 mL N2B27 orta II ile% 0.1 jelatin kaplı 6 kuyu plakaları üzerine kuyu başına yaklaşık 50 embriyoid gövdesi tohumlayın.</li>
		<li>Her kuyuya 2 μL all-trans RA stoğu ekleyin ve 4 gün daha farklılaşmaya neden olan. Her iki günde bir tüm ortamı (N2B27 orta II, 1 μM RA ile) değiştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Protokol 7 kullanılarak Aşama I farklılaşması (Tablo 1)<ol>
<li>Tohum yaklaşık 2 x10 4 mESC içinde 2 mL bazal farklılaşma ortamı I kuyu başına% 0.1 jelatin kaplı 6 kuyu plakaları üzerine. Plakayı 6 saat boyunca bağlanmaya izin vermek için 37 °C'de% 5 CO2 inkübatörüne yerleştirin.</li>
		<li>Hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. Ardından, her kuyuya 2 mL N2B27 orta II ekleyin ve% 5 CO 2 inkübatörde 37 ° C'de8 gün boyunca farklılaşmaya izin verin.</li>
		<li>N2B27 orta II'nin tamamını her 2 günde bir değiştirin.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Hücre morfolojisi gözlemi
<ol><li>Ters faz kontrastı ışık mikroskobu altında yukarıda belirtilen 7 grubun günlük farklılaşma durumunu kontrol edin.</li>
	<li>En az 12 alanı rastgele seçin ve her grubun morfolojik değişikliklerini D8'e kaydetmek için fotoğraf çekin.</li>
</ol>4. İmmünofluoresans boyama
<ol><li>Örnek hazırlama: %0,1 jelatin kaplı kapaklarda tohum mESC'leri ve adım 2'de belirtilen protokolleri kullanarak 8 gün boyunca farklılaşmaya izin verin.</li>
	<li>Durulama:8. günde, örnekleri inkübatörden çıkarın ve ayırma ortamını aspirasyonla çıkarın. Hücreleri 1 mL PBS ile bir kez 5 dakika boyunca hafifçe durulayın.</li>
	<li>Fiksasyon: Her numuneye 1 mL%4 paraformaldehit ekleyin ve hücreleri oda sıcaklığında (RT) 20 dakika sabitleyin.</li>
	<li>Durulama: Sabitlemeden sonra, hücreleri her biri 5 dakika boyunca 3 kez 1 mL PBS ile hafifçe durulayın.</li>
	<li>Permeabilizasyon: Pbs'de %0,2 TritonX-100'ün 1 mL'sini her örneğe ekleyin ve RT'de 8 dakika bekletin.</li>
	<li>Durulama: Permeabilizasyondan sonra, hücreleri her biri 5 dakika boyunca 3 kez 1 mL PBS ile hafifçe durulayın.</li>
	<li>Engelleme: Her örneğe PBS'de %10 keçi serumunun 1 mL'sini ekleyin ve spesifik olmayan etkileşimleri engellemek için RT'de 1 saat kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Primer antikor ile inkübasyon<ol>
<li>PBS'de %5 keçi serumu kullanarak anti-Nestin antikoru 1:100 oranında seyreltin.</li>
		<li>Farklı örneklere 500 μL seyreltilmiş antikor uygulayın ve 4 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Durulama: Antikoru çıkarın ve örnekleri her biri 8 dakika boyunca 3 kez 1 mL PBS ile hafifçe durulayın.</li>
	<li>sekonder antikor ile inkübasyon<ol>
<li>PBS'de %5 keçi serumu kullanarak Alexa Fluor 488 etiketli keçi fare önleyici IgG'yi 1:500 oranında seyreltin.</li>
		<li>Farklı örneklere 500 μL seyreltilmiş antikor uygulayın ve RT'de 2 saat boyunca karanlıkta kuluçkaya yatırın. NOT: Floresan sekonder antikor uyguladıktan sonra, floresan söndürmeyi önlemek için karanlıkta sonraki tüm adımları uygulayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Durulama: İkincil antikoru çıkarın ve örnekleri her biri 8 dakika boyunca 3 kez 1 mL PBS ile hafifçe durulayın.</li>
	<li>Nükleer boyama ve montaj<ol>
<li>Temiz mikroslide üzerine bir damla DAPI montaj ortamı yerleştirin.</li>
		<li>Plakalardan numuneleri dikkatlice alın ve numuneyi hücre yüzü aşağı bakacak şekilde DAPI montaj ortamının üzerine yerleştirin. RT'de 5 dakika karanlıkta bırakın.</li>
		<li>Fazla DAPI montaj ortamını emici kağıtla çıkarın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Floresan mikroskopi gözlemi<ol>
<li>Numuneleri floresan mikroskopinin altına yerleştirin ve uygun filtreler kullanarak DAPI ve Alexa Fluor 488 sinyalini algılayın.</li>
		<li>Her örnek için eşit ve rastgele 10-15 farklı görsel alan seçin ve görüntüleri bir CCD kamera ile kaydedin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. NPC'lerden nöronlara farklılaşma (Faz II)
<ol><li>MESC türevlerini, en yüksek farklılaşma verimliliğine sahip adım 2.4'te ayrıntılı olarak belirtildiği gibi protokol 3 (8 gün, Tablo 1)kullanarak Faz I farklılaşması altında hazırlayın (Bkz. Şekil 3). NOT: Faz I farklılaşmasından sonra, sağlıklı ve yüksek verimli bir NPC sağlamak için yukarıda belirtilen hücre morfolojisi gözlemi ve immünofluoresans tahlil kullanılarak kalite kontrolü yapılmalıdır.</li>
	<li>Tohum yaklaşık 5 x10 5 mESC türevleri 2 mL bazal farklılaşma ortamı I kuyu başına% 0.1 jelatin kaplı 6 kuyu plakaları üzerine. mESC türevlerini sırasıyla Aşama II protokol 1, protokol 2 ve protokol 3 olarak rastgele 3 gruba ayırın.</li>
	<li>Plakayı 6 saat boyunca bağlanmaya izin vermek için 37 °C'de% 5 CO2 inkübatörüne yerleştirin. 2 mL PBS ile iki kez yıkayın.</li>
	<li>Yukarıdaki grupların her kuyusuna sırasıyla 2 mL bazal farklılaşma ortamı I, N2B27 orta I veN2B27orta II ( Tablo 2 ) ekleyin.</li>
	<li>Plakaları inkübatöre yerleştirin ve 10 gün daha ayırt etmeye bırakın. İlgili ortamı her 2 günde bir değiştirin.</li>
	<li>Farklılaşma durumunu denetleyin ve 3.</li>
	<li>18. günde, nöronların neslini değerlendirin (β-Tubulin III pozitif) ve 4.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Vieira, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cell+differentiation+into+mature+neurons:+mechanisms+of+regulation+and+biotechnological+applications.">Neural stem cell differentiation into mature neurons: mechanisms of regulation and biotechnological applications.</a> Biotechnology Advances. 36 (7), 1946-1970 (2018).</li><li>Yang, J. R., Lin, Y. T., Liao, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+embryonic+stem+cells+on+Parkinson's+disease+therapy.">Application of embryonic stem cells on Parkinson's disease therapy.</a> Genomic Medicine, Biomarkers, and Health Sciences. 3 (1), 17-26 (2011).</li><li>Liu, C., Zhong, Y. W., Apostolou, A., Fang, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+as+an+in+vitro+tool+for+the+study+of+the+expression+patterns+of+the+neuronal+cytoskeleton+during+neurogenesis.">Neural differentiation of human embryonic stem cells as an in vitro tool for the study of the expression patterns of the neuronal cytoskeleton during neurogenesis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 439 (1), 154-159 (2013).</li><li>Khramtsova, E. A., Mezhevikina, L. M., Fesenko, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+and+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+modified+by+the+Neural+Growth+Factor+(NGF)+gene.">Proliferation and differentiation of mouse embryonic stem cells modified by the Neural Growth Factor (NGF) gene.</a> Biology Bulletin. 45 (3), 219-225 (2018).</li><li>Yoshimatsu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+efficacy+of+small+molecules+for+neural+differentiation+of+common+marmoset+ESCs+and+iPSCs.">Evaluating the efficacy of small molecules for neural differentiation of common marmoset ESCs and iPSCs.</a> Neuroscience research. , (2019).</li><li>Kothapalli, C. R., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+matrix+microenvironment+for+targeted+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+neural+and+glial+lineages.">3D matrix microenvironment for targeted differentiation of embryonic stem cells into neural and glial lineages.</a> Biomaterials. 34, 5995-6007 (2013).</li><li>Gazina, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+of+derivation+and+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+generating+synchronous+neuronal+networks.">Method of derivation and differentiation of mouse embryonic stem cells generating synchronous neuronal networks.</a> Journal of Neuroscience Methods. 293, 53-58 (2018).</li><li>Ohnuki, Y., Kurosawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+hanging+drop+culture+conditions+on+embryoid+body+formation+and+neuronal+cell+differentiation+using+mouse+embryonic+stem+cells:+Optimization+of+culture+conditions+for+the+formation+of+well-controlled+embryoid+bodies.">Effects of hanging drop culture conditions on embryoid body formation and neuronal cell differentiation using mouse embryonic stem cells: Optimization of culture conditions for the formation of well-controlled embryoid bodies.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 115 (5), 571-574 (2013).</li><li>Wongpaiboonwattana, W., Stavridis, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+in+serum-free+monolayer+culture.">Neural differentiation of mouse embryonic stem cells in serum-free monolayer culture.</a> Journal of Visualized experiments. (99), e52823 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+neuronal+differentiation+of+embryonic+stem+cells+in+vitro.">An optimized method for neuronal differentiation of embryonic stem cells in vitro.</a> Journal of Neuroscience Methods. 330 (15), 108486 (2020).</li><li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+optimal+suspension+culture+time+for+the+osteoblastic+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+using+the+embryoid+body+method.">Investigation of the optimal suspension culture time for the osteoblastic differentiation of human induced pluripotent stem cells using the embryoid body method.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 515 (4), 586-592 (2019).</li><li>Lu, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-trans+retinoic+acid+promotes+neural+lineage+entry+by+pluripotent+embryonic+stem+cells+via+multiple+pathways.">All-trans retinoic acid promotes neural lineage entry by pluripotent embryonic stem cells via multiple pathways.</a> BMC Cell Biology. 10, 57 (2009).</li><li>Kanungo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+signaling+in+P19+stem+cell+differentiation.">Retinoic acid signaling in P19 stem cell differentiation.</a> Anticancer Agents in Medicinal Chemistry. 17 (9), 1184-1198 (2017).</li><li>Rochette-Egly, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+signaling+and+mouse+embryonic+stem+cell+differentiation:+Cross+talk+between+genomic+and+non-genomic+effects+of+RA.">Retinoic acid signaling and mouse embryonic stem cell differentiation: Cross talk between genomic and non-genomic effects of RA.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1851 (1), 66-75 (2015).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+maintains+self-renewal+of+murine+embryonic+stem+cells+via+a+feedback+mechanism.">Retinoic acid maintains self-renewal of murine embryonic stem cells via a feedback mechanism.</a> Differentiation. 76 (9), 931-945 (2008).</li><li>Wu, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid-induced+upregulation+of+miR-219+promotes+the+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+neural+cells.">Retinoic acid-induced upregulation of miR-219 promotes the differentiation of embryonic stem cells into neural cells.</a> Cell Death Disease. 8, 2953 (2017).</li><li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+regulates+germ+cell+differentiation+in+mouse+embryonic+stem+cells+through+a+Smad-dependent+pathway.">Retinoic acid regulates germ cell differentiation in mouse embryonic stem cells through a Smad-dependent pathway.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 418 (3), 571-577 (2012).</li><li>Nakayama, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+efficient+method+for+neuronal+induction+of+the+P19+embryonic+carcinoma+cell+line.">A rapid and efficient method for neuronal induction of the P19 embryonic carcinoma cell line.</a> Journal of Neuroscience Methods. 227, 100-106 (2014).</li><li>Bibel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+into+a+defined+neuronal+lineage.">Differentiation of mouse embryonic stem cells into a defined neuronal lineage.</a> Nature neuroscience. 7 (9), 1003-1009 (2004).</li><li>Coyle, D. E., Li, J., Baccei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+Differentiation+of+Retinoic+Acid-Induced+Human+Pluripotent+Embryonic+Carcinoma+Stem+Cell+Neurons.">Regional Differentiation of Retinoic Acid-Induced Human Pluripotent Embryonic Carcinoma Stem Cell Neurons.</a> PLoS ONE. 6 (1), 16174 (2011).</li><li>Okada, Y., Shimazaki, T., Sobue, G., Okano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic-acid-concentration-dependent+acquisition+of+neural+cell+identity+during+in+vitro+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells.">Retinoic-acid-concentration-dependent acquisition of neural cell identity during in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Developmental Biology. 275, 124-142 (2004).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu çalışmada, düşük maliyetli ve kolayca elde edilen malzemelerle, mESC'lerden nöronal farklılaşma için basit ve etkili bir yöntem oluşturduk. Bu yöntemde, 2 günlük embriyoid vücut oluşumu ve ardından 6 günlük RA indüksiyonu, MESC'lerin NPC'lere farklılaştırılmasını etkili bir şekilde teşvik edebilir (Faz I-protokolü 3). Faz II farklılaşması için, N2B27 orta II (Faz II-protokol 3) NPC'lerden nöronlara farklılaşmayı en etkili şekilde teşvik eder. Başarıyı sağlamak için birkaç kritik adıma daha fazla dikkat edilmelidir.
İlk olarak, embriyoid vücutların sağlıklı durumu tüm farklılaşma sürecinin anahtarıdır. Üç boyutlu embriyoid vücut oluşumu genellikle ESC'lerin farklılaşmasına yön vermek için kullanılır8. Bu çalışmada embriyoid cisimlerin uygun süspansiyon kültürü zamanını araştırdık. Şekil 2'degösterildiği gibi, parlak çekirdekli yuvarlak embriyoid cisimler, bu durumda 2 gün boyunca süspansiyon kültüründen sonra oluşturulmuştur. Bununla birlikte, 4 gün boyunca kültürlendiğinde, birçok embriyoid cisim birbirine yapışır ve çekirdekler karanlık hale gelir ve bu da çekirdeklerdeki hücrelerin apoptozuna işaret eder. Daha sonraki farklılaşma, uzun süreli embriyoid vücut oluşumunun daha kötü etkisini daha da doğruladı. Bildirilen bazı çalışmalarda, embriyoid cisimlerin süspansiyon kültürü, daha düşük FBS konsantrasyonuna sahip veya FBS 11 olmadan orta kullanarak10gün kadar sürebilir. Çalışmada embriyoid vücut oluşumu için azaltılmış süre, daha yüksek FBS konsantrasyonuna (%15) bağlı olabilir. burada kullanılır ve% 15 FBS'nin embriyoid cisimlerin oluşumunu ve farklılaşmasını daha iyi teşvik edebileceği kanıtlanmıştır.
İkincisi, RA'nın uygulandığı zaman noktası ve RA çalışma konsantrasyonu MESC'lerin hücre kaderinin belirlenmesi için kritik öneme sahiptir. A vitamininin bir türevi olan RA, pleiotropik eylemlere sahip en önemli morfojenlerden biridir12. RA birden fazla sinyal yolunu düzenleyebilir ve ESC'lerin hücre kaderinin belirlenmesini etkileyebilir13,14. Raporlar, erken farklılaşma aşamasında MESC'lerin RA ile kısa süreli tedavisinin spontan farklılaşmayı önlediği ve mESC15'inkendini yenileme kapasitesini koruduğu göstermiştir. Diğerleri RA'nın hem mikrop hücre farklılaşması hem de zaman noktasına bağlı 16,17,18olanESC'lerdensinirselfarklılaşmayı düzenleyebileceğini öne sürdü. Burada sunulan durumda, EMBRIYOID vücut oluşumundan sonraki2 nd günde eklenen RA, farklılaşmayı NPC'lere yönlendirmek için uygundur. Bu arada, RA'nın çalışma konsantrasyonu da kritiktir. Düşük RA konsantrasyonları (~10 nM) mESC'lerin endoderm benzeri hücrelere farklılaşmasına neden olabilirken, yüksek RA konsantrasyonlarının (1-5 μM)NPC'lerefarklılaşmaya neden olma olasılığı daha yüksektir 13,14,15,16,17,18,19. RA kullanımı nedeniyle, bir kaudalizasyon etkisi beklenir; ön beyin nöronlarına farklılaşma nadiren görülür ve arka beyin ve omurilik kaderlerinin nöronları meydana gelir20,21. Ayrıca, RA kolayca kullanılabilen ve düşük maliyetli bir ajandır ve bu protokolün kullanımı çoğu laboratuvar için araştırma fonlarından tasarruf sağlayabilir.
Üçüncü olarak, burada sunulan durumda, faz I farklılaşmasından sonra oluşturulan NPC'ler uygun koşullarda saklanabilir ve geçiş yapılabilir. Kök HücreBanker kullanarak yüksek hücre yoğunluğuna sahip kriyoprezervasyon (>2 x10 6),yüksek iyileşme oranı elde etmek için donma nedeniyle oluşan hücre hasarını etkili bir şekilde azaltabilir. Bu arada, çalışmada üretilen NPC'ler, 5 x105 /cm 2'den fazla hücre yoğunluğuna sahip N2B27 ortamı (%49 DMEM/F12+ %1 N2 + %48 Nörobasal orta + %2B27)kullanılarak geçirilebilir. Düşük hücre yoğunluğu altında (0,5 x 105/cm2'denaz), NPC'ler farklılaşma eğilimindedir. Bu tür hücre kriyoprezervasyonu ve iyileşmesi araştırmaya büyük kolaylık getirebilir.
Ayrıca, Nörobakal ortam faz II farklılaşması için gereklidir. Nörobakal ortam özellikle nöronal hücrenin uzun süreli bakımı ve olgunlaşması için tasarlanmıştır. N2B27 medium II 'de(Tablo 2)listelendiği gibi, Nörobakal ortamın eklenmesi NPC'lerden nöronlara farklılaşmayı daha iyi destekleyebilir.
Toplu olarak, kombinatoryal tarama stratejilerini kullanarak mESC in vitro'dan nöronal farklılaşma için verimli ve düşük maliyetli bir yöntem bildirdik. Kurulan yöntemin uygulanması çok kolaydır ve çoğu laboratuvar tarafından kullanıma uygundur. Böyle optimize edilmiş bir yöntem nörobiyoloji ve gelişimsel biyoloji araştırmaları için güçlü bir araç olabilir.

Embriyonik kök hücreler (ESC' ler) pluripotenttir ve nöral öncül hücrelere (NPC' ler) ve daha sonra belirli koşullar altında nöronlara farklılaşabilir1. ESC tabanlı nörogenez, nörogenez taklit etmek için en iyi platformu sağlar, böylece gelişimsel biyoloji çalışmaları için yararlı bir araç olarak hizmet eder ve rejeneratif tıpta potansiyel olarak yardımcıolunur 2,3. Son on yıllarda, transgenik yöntem 4 , küçük moleküller5,3Dmatris mikroçevrimi 6 ve ortak kültür tekniği7gibi embriyoniknörogenez indüklenmesi için birçok strateji bildirilmiştir. Bununla birlikte, bu protokollerin çoğu koşul sınırlı veya kullanımı zordur, bu nedenle çoğu laboratuvarda kullanım için uygun değildir.
MESC'lerden verimli nöral farklılaşma elde etmek için kullanımı kolay ve düşük maliyetli bir yöntem bulmak için burada bir kombinatoryal tarama stratejisi kullanılmıştır. Şekil 1'deaçıklandığı gibi embriyonik nörogenezin tüm süreci 2 faza ayrılmıştır. Aşama I, MESC'lerden NPC'lere farklılaşma sürecini ifade eder ve faz II, NPC'lerden nöronlara sonraki farklılaşma ile ilgilidir. Kolay kullanım, düşük maliyetli, kolay kullanılabilen malzemeler ve yüksek farklılaşma verimliliği ilkelerine dayanarak, Geleneksel yapışık monolayer kültür sistemine veya embriyoid vücut oluşum sistemine göre Faz I'de yedi protokol ve Faz II'de üç protokol seçilmiştir8,9. Her iki fazda da protokollerin farklılaşma verimliliği hücre morfolojisi gözlemi ve immünofluoresans tahlilleri kullanılarak değerlendirildi. Her aşamanın en verimli protokolünü birleştirerek, mESC'lerden nöral farklılaşma için optimize edilmiş yöntemi oluşturduk.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-Nestin antibody [Rat-401]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab11306</td>
			<td>stored at -80 &#176;C, avoid repeated freezing and thawing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;-Tubulin III antibody produced in rabbit</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T2200</td>
			<td>stored at -80 &#176;C, avoid repeated freezing and thawing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>A0428</td>
			<td>stored at -20 &#176;C and protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td>stored at -20 &#176;C, and protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR-99021 (CT99021)</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>S1263</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>NEST</td>
			<td>801007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>A0516</td>
			<td>stored at -20 &#176;C and protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DME/F-12 1:1 (1x)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30023.01B</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30084.03</td>
			<td>stored at -20 &#176;C, avoid repeated freezing and thawing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscopy</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>CM0635B</td>
			<td>stored at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunol Staining Primary Antibody dilution Buffer</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0103</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12660012</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td>stored at -20 &#176;C, avoid repeated freezing and thawing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leukemia Inhibitory Factor human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5283</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab104139</td>
			<td>stored at 4 &#176;C and protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential amino acids solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140076</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>stored at -20 &#176;C and protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonadhesive bacterial dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (1X)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30256.01B</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/ Streptomycin Solution</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD0325901(Mirdametinib)</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>S1036</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td>stored at -80 &#176;C and protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strain 129 Mouse Embryonic Stem Cells</td>
			<td>Cyagen</td>
			<td>MUAES-01001</td>
			<td>Maintained in feeder-free culture system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stem-Cellbanker (DMSO free)</td>
			<td>ZENOAQ</td>
			<td>stem cellbanker DMSO free</td>
			<td>stored at -20 &#176;C, avoid repeated freezing and thawing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25% (1X) Solution</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30042.01</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td>stored at 4 &#176;C and protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0098</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 - well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml centrifuge tube</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neuronal differentiation from mouse embryonic stem cells in vitro

Fare embriyonik kök hücrelerinin (mESC' ler) nöral farklılaşması, nörogenezde yer alan temel mekanizmaların aydınlatıcı ve rejeneratif tıbba potansiyel olarak yardımcı olan potansiyel bir araçtır. Burada, kombinatoryal tarama stratejisinikullanarak mESC in vitro'dan nöronal farklılaşma için verimli ve düşük maliyetli bir yöntem oluşturduk. Burada tanımlanan koşullar altında, 2 günlük embriyoid vücut oluşumu + 6 günlük retinoik asit indüksiyon protokolü, Nestin pozitif olan iyi istiflenmiş ve neurit benzeri A2lox ve 129 türevin oluşumunda görüldüğü gibi, MESC'lerden sinirsel öncül hücrelere (NPC' ler) hızlı ve verimli bir şekilde farklılaşmaya izin sağlar. Embriyoid cisimlerin sağlıklı durumu ve retinoik asidin (RA) uygulandığı zaman noktası ve RA konsantrasyonları bu süreçte kritik öneme sahiptir. Daha sonraki NPC'lerden nöronlara farklılaşmada, N2B27 orta II (Nörobakal ortam tarafından desteklenmiştir) nöronal hücrelerin uzun süreli bakımını ve olgunlaşmasını daha iyi destekleyebilir. Sunulan yöntem yüksek verimlilik, düşük maliyetli ve kullanımı kolaydır ve nörobiyoloji ve gelişimsel biyoloji araştırmaları için güçlü bir araç olabilir.

2 günlük embriyoid vücut oluşumu + 6 günlük RA indüksiyonu, mESC'lerin farklılaştırılmasını NPC'lere (Faz I) yönlendirmede en iyi şekilde çalışır. MESC'lerin NPC'lere (Aşama I) farklılaştırılmasını en iyi şekilde destekleyen en uygun protokolü belirlemek için, hem A2lox hem de 129 mESC 'de(Tablo 1)7 protokol test edildi ve her grubun farklılaşma durumu ışık mikroskobu kullanılarak izlendi. Şekil 3A'dagösterildiği gibi , "2 günlük embriyoid vücut oluşumu + 6 günlük RA indüksiyonu" tedavisi (Faz I-protokolü 3) altında çoğu A2lox ve 129 türevi, NPC'lerin oluşumunu gösteren iyi yığılmış ve neurit benzeri morfolojiler göstermiştir. Bununla birlikte, "4 günlük embriyoid vücut oluşumu + 4 günlük RA indüksiyonu" tedavisi (Faz I-protokolü 2) olan hücreler, embriyoid cisimlerde besin eksikliğinden kaynaklanabilecek zayıf ve apoptotik durum göstermiştir. RA indüksiyonu (Faz I-protokolü 4 ve 5) ile birlikte monolayer kültürü mESC'lerin farklılaşmasına da yön verebilirken, neurit benzeri hücrelerin oranı Faz I-protokolü 3'teki kadar değildi. Bu arada, Faz I-protokolü 6 ve 7'deki çoğu A2lox ve 129 türevi daha küçük hücre cisimleri gösterdi ve apoptoz geçirme eğiliminde olduğunu belirterek, N2B27 medium II'nin embriyonik nörogenezi etkili bir şekilde destekleyemeyeceğini düşündürmektedir.
NPC'lerin oluşumunu daha da doğrulamak için, her gruptaki Nestin+ hücrelerinin yüzdesi (NPC'ler için belirteç) bir immünofluoresans tahlili kullanılarak tespit edildi. Şekil 3B'deNestin+ hücrelerinin Faz I protokolü 3'teki yüzdesi en yüksekti ve sırasıyla %4,33 ± 77,67'ye, A2lox ve 129 türevlerinde ise %2,33'± 69,33'e ulaştı. Toplu olarak, Aşama I-protokolü 3, mESC'lerin farklılaştırılmasını NPC'lere yönlendirmede en iyi şekilde çalışır.
N2B27 orta II, NPC'lerden nöronlara (Faz II) farklılaşmayı en etkili şekilde teşvik edebilir. Faz II farklılaşmasında üç protokol incelendi. Şekil 4A'dagösterildiği gibi, morfolojik gözlem, faz II-protokol 3'teki A2lox ve 129 türevlerinin çoğunun (N2B27 orta II ile farklılaşma) 18. İmmünofluoresans tahlilleri, D18'de sırasıyla β-Tubulin III+ hücrelerinin% 4.01'± ve 58.73'e ±% 7.25'e kadar olan nöronların neslini doğruladı (Şekil 4B).
Daha açık hale getirmek için, embriyonik nörogenez için optimize edilmiş yöntemin şematik diyagramı Şekil 5'te gösterilmiştir. Kısaca, 1.5 x10 6 mESC, 10 mL bazal farklılaşma ortamı I'de yapışkan olmayan bir bakteri kabına tohumlanır ve 2 gün boyunca embriyoid vücut oluşumuna izin verir. Daha sonra embriyoid cisimleri toplanır ve kuyu başına 50 embriyoid cisim konsantrasyonu ile% 0.1 jelatin kaplı 6 kuyu plakalarına ekilir. Bu arada, RA (1 μM) 6 gün daha eklenir. 8. günden 18. güne kadar RA çıkarılır ve sonraki farklılaşmayı NPC'lerden nöronlara yönlendirmek için N2B27 orta II uygulanır. Böyle bir kombine yöntemle, 18. günde sağlam nöronlar oluşturulabilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61190/61190fig01.jpg"> Şekil 1: Embriyonik nörogenez sürecinin şeması. Bu rakam Li ve ark.10'dan değiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61190/61190fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61190/61190fig02.jpg"> Şekil 2: Embriyoid cisimlerinin morfolojisi. (A) Embriyoid cisimler 4 gün boyunca kültürlü. (B) Embriyoid cisimler 2 gün boyunca kültüre edildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61190/61190fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61190/61190fig03.jpg"> Şekil 3: A2lox ve 129 mESC kullanılarak faz I farklılaşmasına ilişkin 7 protokolün verimlilik karşılaştırması. (A) 8. Günde A2lox ve 129 mESC türevlerinin morfolojik analizi. Üst panel: A2lox türevleri; Alt panel: 129 türev. (B) NPC oluşumu için immünoresans tespiti (Nestin+, yeşil). Çekirdekler DAPI ile mavi olarak etiketlenmişti. Üst panel: D8'de A2lox türevleri; Alt panel: D8'de 129 türev. Her grubun Nestin+ hücrelerinin yüzdeleri histogram ile gösterilmiştir. Her sütun üç bağımsız deneyin ortalama±SEM'ini temsil eder. *, s≤0.05; **, s≤0.01. Bu rakam Li ve ark.10'dandeğiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61190/61190fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61190/61190fig04.jpg"> Şekil 4: Faz II farklılaşmasına ilişkin 3 protokolün verimlilik karşılaştırması. (A) 18. Günde A2lox ve 129 mESC türevlerinin morfolojik analizi. Üst panel: A2lox türevleri; Alt panel: 129 türev. (B) Nöron oluşumu için immünoresans tespiti (β-Tubulin III+, kırmızı). Çekirdekler DAPI ile mavi olarak etiketlenmişti. Üst panel: D18'de A2lox türevleri; Alt panel: D18'de 129 türev. Her grubun β-Tubulin III+ hücrelerinin yüzdeleri histogram ile gösterilmiştir. Her sütun, üç bağımsız deneyin ortalama ± SEM'ini temsil eder. *, s≤0.05; **, s≤0.01. Bu rakam Li ve ark.10'dan değiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61190/61190fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61190/61190fig05.jpg"> Şekil 5: MESC in vitro'dan nöronal farklılaşma için optimize edilmiş yöntemin kısa modeli Bu rakam Liet al.10'dan değiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61190/61190fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="3">Farklılaşma Aşaması I (8d)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Protokol</td>
			<td>Medya</td>
		</tr>
<tr>
<td>protokol 1</td>
			<td>Doğal olarak farklılaşma: Bazal farklılaşma ortamı ile sadece ben</td>
			<td rowspan="5">Bazal farklılaşma ortamı I: DMEM/F12 +%15 FBS + %1 NEAA+0,1mM 2ME+ %1 P/S</td>
		</tr>
<tr>
<td>protokol 2</td>
			<td>4 günlük Embriyoid Vücut oluşumu + 4 günlük RA indüksiyonu</td>
		</tr>
<tr>
<td>protokol 3</td>
			<td>2 günlük Embriyoid Vücut oluşumu + 6 günlük RA indüksiyonu</td>
		</tr>
<tr>
<td>protokol 4</td>
			<td>RA indüksiyonu ile birlikte monolayer kültürü: 4d (-RA) 4d (+RA)</td>
		</tr>
<tr>
<td>protokol 5</td>
			<td>RA indüksiyonu ile birlikte monolayer kültürü: 2d (-RA) 6d(+RA)</td>
		</tr>
<tr>
<td>protokol 6</td>
			<td>Embriyoid Cisim oluşumu (4 d) ve N2B27 orta II ile indüklenen farklılaşma</td>
			<td rowspan="2">N2B27 orta II: %49 DMEM/F12+ %1 N2 + %48 Nörobakal orta + %2 B27 +%1 GlutaMAX+ 0,1mM 2ME</td>
		</tr>
<tr>
<td>protokol 7</td>
			<td>N2B27 orta II ile monolayer kültürü</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Aşama I farklılaşmasında kullanılan 7 protokolün ayrıntıları. Bu tablo Li ve ark.10'dan değiştirilmiştir.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="3">Farklılaşma Aşaması II (10d)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Protokol</td>
			<td>Medya</td>
		</tr>
<tr>
<td>protokol 1</td>
			<td>Doğal olarak farklılaşma: Bazal farklılaşma ortamı ile sadece ben</td>
			<td>Bazal farklılaşma ortamı I: DMEM/F12 +%15 FBS +%1 NEAA +0,1mM 2ME+ %1 P/S</td>
		</tr>
<tr>
<td>protokol 2</td>
			<td>N2B27 medium I ile farklılaşma</td>
			<td>N2B27 orta I: DMEM/F12 + 1%N2 + 2%B27 + %1 GlutaMAX +0.1mM 2ME</td>
		</tr>
<tr>
<td>protokol 3</td>
			<td>N2B27 orta II ile farklılaşma</td>
			<td>N2B27 orta II: %49 DMEM/F12+ %1 N2 + %48 Nörobakal orta + %2 B27 +%1 GlutaMAX+ 0,1mM 2ME</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: Faz II farklılaşmasında kullanılan 3 protokolün ayrıntıları. Bu tablo Li ve ark.10'dan değiştirilmiştir.

Watch this Scientific Journal Video about Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro at JoVE.com

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

Burada embriyonik kök hücrelerden nöronlara hızlı ve verimli farklılaşmayı yönlendiren düşük maliyetli ve kullanımı kolay bir yöntem kurduk. Bu yöntem laboratuvarlar arasında popülerleşmeye uygundur ve nörolojik araştırmalar için yararlı bir araç olabilir.

Fare Embriyonik Kök Hücre in vitro nöronal farklılaşma

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

neuronal-differentiation-from-mouse-embryonic-stem-cells-in-vitro

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.7K Görüntüleme.  Wuhan Center for Disease Control and Prevention. Burada embriyonik kök hücrelerden nöronlara hızlı ve verimli farklılaşmayı yönlendiren düşük maliyetli ve kullanımı kolay bir yöntem kurduk. Bu yöntem laboratuvarlar arasında popülerleşmeye uygundur ve nörolojik araştırmalar için yararlı bir araç olabilir.

Video: Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system (CNS) structure and circuitry in today's healthcare industry. Cell-based therapies hold great promise to restore the lost nerve tissue and function for CNS disorders. However, cell therapies based on CNS-derived neural stem cells have encountered supply restriction and difficulty to use in the clinical setting due to their limited expansion ability in culture and failing plasticity after extensive passaging1-3. Despite some beneficial outcomes, the CNS-derived human neural stem cells (hNSCs) appear to exert their therapeutic effects primarily by their non-neuronal progenies through producing trophic and neuroprotective molecules to rescue the endogenous cells1-3. Alternatively, pluripotent human embryonic stem cells (hESCs) proffer cures for a wide range of neurological disorders by supplying the diversity of human neuronal cell types in the developing CNS for regeneration1,4-7. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity7-10. In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic11-13. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules14 (please see a schematic in Fig. 1). Retinoic acid (RA) does not induce neuronal differentiation of undifferentiated hESCs maintained on feeders1, 14. And unlike mouse ESCs, treating hESC-differentiated embryoid bodies (EBs) only slightly increases the low yield of neurons1, 14, 15. However, after screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered retinoic acid (RA) sufficient to induce the specification of neuroectoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to neuroblasts that generated human neuronal progenitors and neurons in the developing CNS with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of neuroblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human neuronal cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of neuroblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human neuronal progenitors and neuronal cell types in the developing CNS for neural repair.

Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Nöronal atalarıdır ve Nöronlar Verimli türetilmesi

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Nörobilim

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

The mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due to the abundance of molecular and genetic data. However, the developing mouse brain is not suitable for easy manipulation and imaging in vivo since the mouse embryo is inaccessible and opaque. Organotypic slice cultures of embryonic brains are therefore widely used to study murine brain development in vitro. Ex-vivo manipulation or the use of transgenic mice allows the modification of gene expression so that subpopulations of neuronal or glial cells can be labeled with fluorescent proteins. The behavior of labeled cells can then be observed using time-lapse imaging. Time-lapse imaging has been particularly successful for studying cell behaviors that underlie the development of the cerebral cortex at late embryonic stages 1-2. Embryonic organotypic slice culture systems in brain regions outside of the forebrain are less well established. Therefore, the wealth of time-lapse imaging data describing neuronal cell migration is restricted to the forebrain 3,4. It is still not known, whether the principles discovered for the dorsal brain hold true for ventral brain areas. In the ventral brain, neurons are organized in neuronal clusters rather than layers and they often have to undergo complicated migratory trajectories to reach their final position. The ventral midbrain is not only a good model system for ventral brain development, but also contains neuronal populations such as dopaminergic neurons that are relevant in disease processes. While the function and degeneration of dopaminergic neurons has been investigated in great detail in the adult and ageing brain, little is known about the behavior of these neurons during their differentiation and migration phase 5. We describe here the generation of slice cultures from the embryonic day (E) 12.5 mouse ventral midbrain. These slice cultures are potentially suitable for monitoring dopaminergic neuron development over several days in vitro. We highlight the critical steps in generating brain slices at these early stages of embryonic development and discuss the conditions necessary for maintaining normal development of dopaminergic neurons in vitro. We also present results from time lapse imaging experiments. In these experiments, ventral midbrain precursors (including dopaminergic precursors) and their descendants were labeled in a mosaic manner using a Cre/loxP based inducible fate mapping system 6.

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

A method to generate organotypic slices from the E12.5 murine embryonic midbrain is described. The organotypic slice cultures can be used to observe the behavior of dopaminergic neurons or other ventral midbrain neurons.

Embriyonik ventral orta beyin Organotipik Dilim Kültürler: dopaminerjik Nöronal Gelişim Eğitim Bir Sistem In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Embriyonik Mürin Nöral Tüp çıkan sinirsel Crest Hücre İzolasyonu ve Kültür

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson&#8217;s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.

We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson&#8217;s disease.

İnsan Pluripotent Kök Hücreleri dopaminerjik Nöron Farklılaşma Yönetmen

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons as well as synchronizing the outputs of pyramidal neuron ensembles. Deficits in interneuron function have been implicated in a variety of neuropsychiatric disorders, including schizophrenia, autism, and epilepsy. The derivation of cortical interneurons from embryonic stem cells not only allows for the study of their development and function, but provides insight into the molecular mechanisms underlying the pathogenesis of cortical interneuron-related disorders. Interneurons also have the remarkable capacity to survive, migrate, and integrate into host cortical circuitry post-transplantation, making them ideal candidates for use in cell-based therapies. Here, we present a scalable, highly efficient, modified embryoid body-to-monolayer method for the derivation of Nkx2.1-expressing interneuron progenitors and their progeny from mouse embryonic stem cells (mESCs). Using a Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual reporter mESC line, Nkx2.1 progenitors or their Lhx6-expressing post-mitotic progeny can be isolated via fluorescence-activated cell sorting (FACS) and subsequently used in a number of downstream applications. We also provide methods to enrich for parvalbumin (PV) or somatostatin (SST) interneuron subgroups, which may be helpful for studying aspects of fate determination or for use in therapeutic applications that would benefit from interneuron subgroup-enriched transplantations.

This protocol describes a method for generating cortical interneuron progenitors and post-mitotic interneuron precursors from mouse embryonic stem cells using a modified embryoid body-to-monolayer method. These progenitors/precursors can be used in vitro or fluorescently sorted and transplanted into neonatal neocortex for studying fate determination, or used in therapeutic applications.

Fare embriyonik kök hücre farklılaşma içine kortikal Interneuron Kara filmin tarih öncesi

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.

Yalıtım ve kültür embriyonik fare nöral kök hücrelerin

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively thin to properly visualize and access neurons for patch-clamping or imaging, and in vitro examination of brain circuitry is limited to only what is physically present in the acute slice. To maintain the benefits of in vitro slice experimentation while preserving a larger portion of presynaptic nuclei, we developed a novel slice preparation. This &#8220;wedge slice&#8221; was designed for patch-clamp electrophysiology recordings to characterize the diverse monaural, sound-driven inputs to medial olivocochlear (MOC) neurons in the brainstem. These neurons receive their primary afferent excitatory and inhibitory inputs from neurons activated by stimuli in the contralateral ear and corresponding cochlear nucleus (CN). An asymmetrical brain slice was designed which is thickest in the rostro-caudal domain at the lateral edge of one hemisphere and then thins towards the lateral edge of the opposite hemisphere. This slice contains, on the thick side, the auditory nerve root conveying information about auditory stimuli to the brain, the intrinsic CN circuitry, and both the disynaptic excitatory and trisynaptic inhibitory afferent pathways that converge on contralateral MOC neurons. Recording is performed from MOC neurons on the thin side of the slice, where they are visualized using DIC optics for typical patch-clamp experiments. Direct stimulation of the auditory nerve is performed as it enters the auditory brainstem, allowing for intrinsic CN circuit activity and synaptic plasticity to occur at synapses upstream of MOC neurons. With this technique, one can mimic in vivo circuit activation as closely as possible within the slice. This wedge slice preparation is applicable to other brain circuits where circuit analyses would benefit from preservation of upstream connectivity and long-range inputs, in combination with the technical advantages of in vitro slice physiology.

Integration of diverse synaptic inputs to neurons is best measured in a preparation that preserves all pre-synaptic nuclei for natural timing and circuit plasticity, but brain slices typically sever many connections. We developed a modified brain slice to mimic in vivo circuit activity while maintaining in vitro experimentation capability.

In Vitro Kama Dilimi In Vivo Nöronal Devre Bağlantısı Nın TaklitI Için Hazırlık

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...

In vitro Modeling for Neurological Diseases using Direct Conversion from Fibroblasts to Neuronal Progenitor Cells and Differentiation into Astrocytes

Research on neurological disorders focuses primarily on the impact of neurons on disease mechanisms. Limited availability of animal models severely impacts the study of cell type specific contributions to disease. Moreover, animal models usually do not reflect variability in mutations and disease courses seen in human patients. Reprogramming methods for generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) have revolutionized patient specific research and created valuable tools for studying disease mechanisms. However, iPSC technology has disadvantages such as time, labor commitment, clonal selectivity and loss of epigenetic markers. Recent modifications of these methods allow more direct generation of cell lineages or specific cell types, bypassing clonal isolation or a pluripotent stem cell state. We have developed a rapid direct conversion method to generate induced Neuronal Progenitor Cells (iNPCs) from skin fibroblasts utilizing retroviral vectors in combination with neuralizing media. The iNPCs can be differentiated into neurons (iNs) oligodendrocytes (iOs) and astrocytes (iAs). iAs production facilitates rapid drug and disease mechanism testing as differentiation from iNPCs only takes 5 days. Moreover, iAs are easy to work with and are generated in pure populations at large numbers. We developed a highly reproducible co-culture assay using mouse GFP+ neurons and patient derived iAs to evaluate potential therapeutic strategies for numerous neurological and neurodegenerative disorders. Importantly, the iA assays are scalable to 384-well format facilitating the evaluation of multiple small molecules in one plate. This approach allows simultaneous therapeutic evaluation of multiple patient cell lines with diverse genetic background. Easy production and storage of iAs and capacity to screen multiple compounds in one assay renders this methodology adaptable for personalized medicine.

We describe a protocol to reprogram human skin-derived fibroblasts into induced Neuronal Progenitor Cells (iNPCs), and their subsequent differentiation into induced Astrocytes (iAs). This method leads to fast and reproducible generation of iNPCs and iAs in large quantities.

Fibroblastlardan Nöronal Progenitör Hücrelere Doğrudan Dönüşüm ve Astrositlere Farklılaşma Kullanarak Nörolojik Hastalıklar için İn vitro Modelleme

Research on neurological disorders focuses primarily on the impact of neurons on disease mechanisms. Limited availability of animal models severely ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

In vivo Fare Kalitesiz Zeytinde Kalsiyum Görüntüleme

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple neurological diseases. Studying human microglia in health and disease represents a challenge due to the extremely limited supply of human cells. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) derived from human individuals can be used to circumvent this barrier. Here, it is demonstrated how to differentiate human iPSCs into microglia-like cells (iMGs) for in vitro experimentation. These iMGs exhibit the expected and physiological properties of microglia, including microglia-like morphology, expression of proper markers, and active phagocytosis. Additionally, documentation for isolating and labeling synaptosome substrates derived from human iPSC-derived lower motor neurons (i3LMNs) is provided. A live-cell, longitudinal imaging assay is used to monitor engulfment of human synaptosomes labeled with a pH-sensitive dye, allowing for investigations of iMG's phagocytic capacity. The protocols described herein are broadly applicable to different fields that are investigating human microglia biology and the contribution of microglia to disease.

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

This protocol describes the differentiation process of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into microglia-like cells for in vitro experimentation. We also include a detailed procedure for generating human synaptosomes from iPSC-derived lower motor neurons that can be used as a substrate for in vitro phagocytosis assays using live-cell imaging systems.

İnsan Mikroglia Benzeri Hücreler: İnsan Sinaptozomları Kullanılarak İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerden ve In Vitro Canlı Hücre Fagositoz Analizinden Farklılaşma

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple ...