Bu çalışma BBSRC (BB/1006478/1) tarafından kısmen finanse edildi. PRR Royal Society Üniversitesi Araştırma Bursu almıştır.

1.. Stratejik Düşünceler <ol><li> Mikro-deney için kullanılan tohum kristallerinin seçimi deney nesnesine bağlı olarak değişecektir. Bir projenin başında o kristal optimizasyonu için alternatif başlangıç ​​noktaları sağlayabilir çeşitli kristalleşme hit bulmak için yararlı olur. iyi kalitede kristaller rahatsızlık ya da aşağıdaki sistem denge döner nükleasyon burada bölgede yani faz şeması, metastabl bölgede büyümeye daha muhtemel olduğu için RMMler büyük ölçüde kristal optimizasyonu için olan ihtiyacı azaltır. Bu nedenle ilk kristalleri kısa sürede (ilk kristaller büyüyen durdurmak gibi, daha doğru, ya da) elde edilir gibi rutin kısa sürede RMMler kullanmanızı öneririz. </li><li> RMMler ilk tur için, tohum stok mümkün olduğu kadar çok kristalli bir malzeme ile yapılmalıdır. Sadece bir iyi varsa o kristalleri içeren veya kristaller küçük, eğer birden fazla tekrarlar kurmak yararlı olabilirkristallerin arzını artırmak için (tohumlama olmadan) orijinal hit. Bununla birlikte, pek çok farklı isabet elde edilir ise, tohum kristalleri çeşitli koşullarda hasat edilir ve bir arada karıştırılabilir. </li><li> Faz ayrılmasını önlemek için, yüksek tuz koşullarında yetiştirilen kristalleri yüksek PEG koşullarında yetiştirilen kristallerinden ayrı hasat edilmelidir. Birkaç kuyulardan kristaller karıştırılır ise, tuz kristalleri vermek üzere daha az olasıdır bir çözelti, tohum süspansiyonu için seçilmelidir. Örneğin, fosfat, sülfat, kalsiyum ve magnezyum, yüksek dozlarda kaçınılmalıdır. </li><li> Daha sonra bir projede bu kırınım geliştirmek çiftli kristaller önlemek ve ligandları bağlamak için uygun olan kristaller elde etmek için farklı bir birim hücre kristaller aramak için önemli olabilir. Bu aşamada (örneğin, en iyi kırılmaktadırlar olanlar) sadece en uygun tohum kristalleri stok yapmak için kullanılmalıdır. Mikro-Bazen tekrarlanan mermi nerede sadece &quot;iyi, gerekli&quot;Kristalleri, bir sonraki tur için ekim stok yapmak için kullanılır. Mümkünse,&quot; PEG 3000 gibi nötr &quot;yeni bir kristal çökelti temas teşvik etmek ve yüksek olarak kararsız olabilir kompleksleri kristalize için tohum kristalleri askıya almak için kullanılmalıdır -tuz çözeltileri 12. </li><li> Tek bir kristalleşme durumdur kullanılan klasik mikro-deneyleri, umut verici bir durum ve sonraki optimizasyonu sırasında kimlik aşağıdaki sıklıkla faydalıdır. Bu damla başına kristallerinin istenen sayısını elde etmek için tohum stok sulandırmak için genellikle gereklidir. (Artan seyreltme tohum stoklarının bir dizi bir kristalizasyon eklenir) bir &quot;birleştirici&quot; mikro-deney tohum stoku optimum seyreltme oranını bulmak için hızlı bir yöntemdir. Bu yaklaşım, aşağıda tarif edilmektedir. </li></ol> 2. Tohum Stok hazırlanması <ol><li> Bir Bunsen alev kullanarak cam Pasteur pipeti bir yuvarlak cam soruşturma yapmak. <ol><li> Yumuşak hale gelinceye kadar ortasına yakın pipet ısıtın, sonra hızla alev çıkarın ve uçlarını ayrı çekerek dışarı çizin. Aşağı 0.25 mm altında bir çapa cam çekmek için hedefliyoruz. </li><li> Bu yaklaşık 0.25 mm olan ve kısa bir süre alev içine kırık ucu dalma noktasında cam kırın. ~ 0.75 mm&#39;lik bir çapa ucunda oluşturulur ile cam bir hemisfer kadar bu işlemi tekrar edin. Uygun şekilde 0.01-1.0 mm ölçekte katı nesnelerin çarpıcı için boyutlandırılır ve bir kristalizasyon tepsi alt oyuk ya da lamel plastik yüzeyine zarar vermez gibi bu prob, kristal halinde malzemeyi kırmak için yararlıdır. Kristalleri, cam ve plastik arasında sıkışıp çünkü büyük sondalar (~ 1.0 mm) daha etkili küçük kristaller ezmek olabilir. </li></ol></li><li> Buz üzerinde tohum Boncuk ihtiva eden bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü yerleştirin. </li><li> Binoküler mikroskop veya kristal görüntüleme sistemi kullanılarak önceden belirlenmiş kristalleşme tepsisini kontrol edin ve bir veya daha fazla ap seçintohum stok üretimi için kristal malzeme hasat için hangi tepsiden kuyuları propriate. Herhangi bir malzeme ince iğneler, kürecikler, mikro kristalleri ve düzensiz, kötü biçimli kristallerden de dahil olmak üzere kullanılabilir. Büyük malzeme, kısmen çapraz bağlanmış olması daha muhtemel olduğu gibi tohum stoku, böylece tohum deneylerde kullanım için uygunluğu azaltarak, en kısa sürede mümkün olan en kristaller artan durdurduktan sonra yapılmalıdır. Herhangi bir şüphe hasat edilecek olan kristal malzeme iyi bir UV floresan mikroskop ya da görüntüleme sistemi, açılmadan önceki kullanılarak görüntülenebilir, veya, kristalin malzemenin bir in-situ X-ışını kırınım analizi için tabi tutulabilir bir tuzu ya da protein olup olmadığı konusunda varsa Tepsiye. UV ışınlaması altında floresan olacak eski yaklaşım protein kristalleri kullanırken, tuz kristalleri renksiz görünür. </li><li> Iyi seçilmiş kristalleşme tepsisini açın. 96-çevresinde de üst plastik sızdırmazlık levha kesti damla tepsilerini oturan için usi iyi seçilmişBir neşter bıçak ng. 24-iyi asılı damla tepsiler için bir cımbız kullanarak lamel kaldırmak. Lamel ters çevirin ve istikrarlı temiz bir yüzey üzerine koyun. Rezervuar çözeltisi 50 ul çıkarın ve boru boyunca buz üzerinde kalmasını sağlamak tohum boncuk içeren mikrosantrifüj tüpüne bu sıvıyı transfer. </li><li> İyice mikroskop altında sonuçlarını görüntüleme, bölüm 2.1 &#39;de hazırlanan cam sonda kullanılarak, subwell (96 oyuklu tepsi), lamel (24-çukurlu tabla) damla olarak kristaller ezmek. Küçük kristaller iyice ezmek için birkaç dakika sürebilir. Bu adım, deneyci kristaller tuz kristalleri olduğu da ezmek için kolaydır ve bu yüzden, çapraz bağlantılı değildir, ve bu kontrol sağlar. Tuz kristalleri duydum ve onlar ezilmiş zaman hissedilebilir bir ayırt edici tıklayın üretirler. Kristaller taze malzeme elde edilir ve kullanılır denemek ezmek için sert ve zor ise. </li><li> Tohum Boncuk tüp ve t rezervuar çözeltisi 5 ul kaldırransfer eşdeğer alt oyuk (damla deneyi oturma) ya da lamel (asılı damla deneyi) hasat edilecek olan, kristal halinde malzemeyi ihtiva eden için. Mümkün olan en alt iyi ya da lamel içindekiler kadar yeniden askıya almak için, bu sıvı yukarı ve aşağı 5-6 kez Pipet. Tohum Boncuk tüp süspansiyon dönmek ve çok kristalli malzeme mümkün olduğunca hasat sağlayarak, iki kez daha bu adımı tekrarlayın. </li><li> Buz üzerinde tüp soğutmak için her 30 saniye durma, iki dakika için tohum boncuk vorteksleyin. </li><li> 4, her bir aşamada 10 kadar bir faktör ile çözeltide tohum stok seyreltilmesi, bir seyreltme serisi yapın. Tipik olarak, çok fazla kristal seyreltilmemiş tohum stokları kullanılıyorsa elde edilen, yani oyuk başına kristallerinin sayısını kontrol etmek için seyreltilmiş tohum stokları kullanmak olacaktır. Tohumların konsantrasyonu daha fazla kristalleşme vurur elde edilecek beri RMMler ilk turda, o tohum stok solüsyonu sulandırmak için önemli değildir. </li><li> Bu derhal kullanılmak üzere değilserilmesi, bir -20 ° C tohum stok süspansiyonu ile sulandırılmış tohum stokları transferi, ya da depolama için -80 ° C sıcaklıkta dondurucuya. Küçük hacimli alikotları örneğin, 10-20 ul, bu malzemeyi depolamak, tohum stoku etkinliğini azaltabilir ki, tekrarlanan donma-erime döngülerinden önlemek. Dondurulmuş kez ihtiyaç kadar, tohum stoklarının süresiz muhafaza edilebilir. </li></ol> 3. Kristalizasyon Tepsi kurulması <ol><li> Kristalleşme tesisleri ve deneyci tercihleri ​​mevcudiyetine bağlı olarak, RMMler kristalleşme tarama oturan damla buhar difüzyon yöntemi kullanılarak asılı damla buhar difüzyon yöntemi kullanılarak 24-kuyu tepsileri, veya 96-kuyu tepsileri kullanarak yapılabilir. RMMler için kristalizasyon tepsiler robotik işleme bir sıvı dağıtıcı ya da ikisinin bir kombinasyonu kullanılarak, elle ya da kurulabilir. </li><li> Elle kurulmuş tipik bir RMMler deney, 1.0 ul protein çözeltisi, 1.0 ul kristalleşme durumu ihtiva edecek ve0.5 ul tohum stok. Bir kristalleşme robot kullanarak kurmak tipik bir deney, 0.3 ul protein çözeltisi, 0.2 ul kristalleşme durumu ve 0.1 ul tohum stok içerecektir. </li><li> 24-çukurlu damla tepsiler askıdaki RMMler tarama gerçekleştirmek için, ilk olarak, bir el pipet kullanılarak, 4 x 24 oyuklu pregreased kristalleştirme her kuyuya, 10 ml bir tüp biçiminde bir 96 oyuklu durum kristalleşme ekranından her bir durum içinde 300 ul transfer tepsiler. <ol><li> Her ikisi de ön ve arka koruyucu alt şeritler çıkarılınca edilmiş olan karşılık gelen bir plastik lamel yüzeyi üzerine her bir 300 ul her bir hazneden kristalizasyon transferi 1 ul. </li><li> Her bir kristalizasyon durumunun 1 ul için kristal tohum stoklar 0.5 ul ve ardından protein çözeltisi 1 ul ekle. Sıvı damla aşağı doğru bakan ve de uygun yukarıdaki pozisyonu olduğu gibi her lamel ters çevirin. </li><li> Aşağıya lamel basın, seali sıkıştırılmasıyağ ng güvenli bir yalıtım oluşturur. Bir kere 96 damla kurulmuş, tepsi genellikle depolama için yaş aralığı 4-18 ° C, bir inkübatör veya sabit sıcaklık odasında transfer edilmelidir. </li></ol></li><li> 96 oyuklu damla tepsisi ilk olarak her bir kristalleşme tepsinin de karşılık gelen derin kuyu blok biçiminde, 96 oyuklu bir durum kristalleşme ekranından her bir durum 20-50 ul transfer oturma RMMler tarama yapmak için. Bu transfer adımı, 8 kanallı pipet kullanarak, bir kristalizasyon robot ya da manuel transferi kullanılarak gerçekleştirilebilir. <ol><li> Elle veya 3.1 ayrıntılı hacimleri kullanarak bir robot ile damla transfer rezervuar, protein ve tohum stok çözümleri. Bazı ticari kristalleşme robotlar kesiciyi temas etmezler ve böyle bir sistemi kullanarak bir performans tohum hisse devir ipuçlarını veya ilgili boruları dağıtım tıkanmasına neden olabilir. Dağıtma sırası değişkendir: Bazı robotlar aynı anda tüm çözümleri dağıtmak. Eğersonra stok tohum, rezervuar sonra, ilk protein dağıtmak, bu, mümkün değildir. </li><li> Robot tevzi bir temas, kör bir iğne ile donatılmış bir düşük hacimli bir cam şırınga kullanılarak tohum mevcut transfer değilse. Daha sonra her bir damla halinde, tohum dağıtım stok rezervuar çözelti içinden geçirilerek iğne durulayın. </li><li> Şeffaf sızdırmazlık sayfasını kullanarak tepsiyi Seal ve bir inkübatör veya depolama için sabit sıcaklık odasında transfer. </li></ol></li></ol> 4. Kristalizasyon Tepsi Muayene <ol><li> Binoküler mikroskop ya da bir kristal görüntüleme sistemi kullanılarak tüm kristalizasyon deneyleri gözünüzde canlandırın. İlk madde genel görünüşüdür derinliği boyunca, kullanıcı daha fazla kontrol ve ikinci daha büyütme derecesini elde edilir, ancak daha fazla zaman alır. </li><li> Sırayla her sub-well/coverslip incelemek ve kristal oluşumu herhangi bir kanıt kaydedin. Deneyler her 24 kurulmasını takiben 5 gün boyunca saat ve kontrol edilmelidirn daha sonra bir kez kadar 4 hafta boyunca her 7 gün. </li><li> Optimum kırılma kaliteli kristaller üretilmektedir önce RMMler birden döngüleri genellikle gereklidir. </li></ol>

<ol>
	<li>Bergfors, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Crystallization.">Protein Crystallization.</a> IUL Biotechnology Series. , (2009).</li><li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomolecular Crystallography: Priciples, Practice and Application to Structural Biology. , (2010).</li><li>Babnigg, G., Joachimiak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+protein+crystallization+propensity+from+protein+sequence.">Predicting protein crystallization propensity from protein sequence.</a> J. Struct. Funct. Genomics. 11 (1), 71-80 (2010).</li><li>Bergfors, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeds+to+crystals.">Seeds to crystals.</a> J. Struct. Biol. 142 (1), 66-76 (2003).</li><li>Ireton, G. C., Stoddard, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microseed+matrix+screening+to+improve+crystals+of+yeast+cytosine+deaminase.">Microseed matrix screening to improve crystals of yeast cytosine deaminase.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 60, 601-605 (2004).</li><li>Zhu, D. Y., Zhu, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+protein+crystal+growth+through+dynamic+seeding.">Optimizing protein crystal growth through dynamic seeding.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 61 (Pt 6), 772-775 (2005).</li><li>Bergfors, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+optimization+methods+for+nonautomated+crystallization+laboratories.">Screening and optimization methods for nonautomated crystallization laboratories.</a> Methods Mol. Biol. 363, 131-151 (2007).</li><li>Xu, L., Butcher, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+receptor-binding+protein+P2+of+bacteriophage+PRD1.">Crystallization and preliminary X-ray analysis of receptor-binding protein P2 of bacteriophage PRD1.</a> J. Struct. Biol. 131 (2), 159-1563 (2000).</li><li>Rangarajan, E. S., Izard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+diffraction+of+full-length+human+selenomethionyl+metavinculin+crystals+by+streak-seeding.">Improving the diffraction of full-length human selenomethionyl metavinculin crystals by streak-seeding.</a> Acta. Crystallogr. Sect. F. Struct. Biol. Cryst. Commun. 66 (Pt 12), 1617-1620 (2010).</li><li>Kadirvelraj, R., Harris, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stepwise+optimization+of+crystals+of+rhamnogalacturonan+lyase+from+Aspergillus+aculeatus.">A stepwise optimization of crystals of rhamnogalacturonan lyase from Aspergillus aculeatus.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol . Crystallogr. 58 (Pt 8), 1346-1349 (2002).</li><li>D'Arcy, A., Villard, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+microseed+matrix-screening+method+for+protein+crystallization.">An automated microseed matrix-screening method for protein crystallization.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 63 (Pt 4), 550-554 (2007).</li><li>Shaw Stewart, P. D., Kolek, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+Microseeding:+A+Theoretical+and+Practical+Exploration+of+Seed+Stability+and+Seeding+Techniques+for+Successful+Protein+Crystallization.">Random Microseeding: A Theoretical and Practical Exploration of Seed Stability and Seeding Techniques for Successful Protein Crystallization.</a> Crystal Growth &amp; Design. 11 (8), 3432-3441 (2011).</li><li>Obmolova, G., Malia, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+crystallization+of+antibody-antigen+complexes+via+microseed+matrix+screening.">Promoting crystallization of antibody-antigen complexes via microseed matrix screening.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 66, 927-933 (2010).</li><li>Villasenor, A. G., Wong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+matrix+microseeding:+improving+protein+crystal+growth+with+minimal+chemical+bias.">Acoustic matrix microseeding: improving protein crystal growth with minimal chemical bias.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 5), 568-5676 (2010).</li><li>Strynadka, N. C., James, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysozyme:+a+model+enzyme+in+protein+crystallography.">Lysozyme: a model enzyme in protein crystallography.</a> EXS. 75, 185-222 (1996).</li><li>Diaz, A., Loewen, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thirty+years+of+heme+catalases+structural+biology.">Thirty years of heme catalases structural biology.</a> Arch. Biochem. 525 (2), 102-110 (2012).</li></ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Bu yazıda RMMler protein kristalleşme taraması için genel bir yöntem tanımlanmıştır. Bu yöntemi kullanarak, iki test proteinleri kristalleşme başarı oranında önemli bir artış ile göstermiştir. RMMler olmayan RMMler yöntemlerle üretilen kristaller bir alt kümesi senkrotron radyasyonu kullanılarak kırınım analizi, önceki yazarlar iyi kalitede kristaller RMMler deneylerde 11 büyümeye daha fazla olduğunu rapor olmasına rağmen, her iki yöntemi kullanılarak yetiştirilir...

Perutz, Kendrew ve yapısal genomik konsorsiyumların, modern yüksek kapasiteli otomatik boru hatları, hemoglobin ve miyoglobin yapılarını belirlemede işçiler ile ilk uygulamadan, makromoleküler X-ışını kristalografisi bize protein dünyasına görülmemiş bir yapısal bir bakış tanınan vardır . Bu teknik, atom at protein yapısının doğrudan görselleştirme izin en yaygın uygulanan deneysel yöntem kalır, ya da (yani 1-3 Å aralığında) atomik çözünürlükte yakın. Bir proteine ​​uygulanacak X-ışını difraksiyonu için bir ön gereklilik, ilk kristalize olması gerektiğini, ve bu kırınım yöntem 1, 2 ile yapı belirlenmesinde büyük tek oran-sınırlayıcı aşama kaldığı işlemin bu aşamasıdır. Bizim protein kristalleştirme sürecinin anlaşılması ve kristalizasyon ekranlarının kalitesi ve kullanılabilirliği önemli gelişmeler önemli gelişmelere rağmen,tepsiler ve ilgili teknolojiler, güvenilir kristalleşme başarının 3 olasılığını tahmin etmek imkansız kalır. Biyokimyasal ve Biyofiziksel yöntemler ilgi görüntüler bir kristal protein çekirdeklenme ve büyüme için elverişli özellikleri, yani iyi katlanmış, homojen, tek dağılımlı, vs olup olmadığını değerlendirmek için uygulanabilir, ancak, hiçbir şekilde bu anlayış kristalleşme kesin bir belirleyici sağlamak eğilimi. Tohum uzun mevcut kristal veya kristal malzemenin 4-7 sayısı, boyutu ve kaliteyi artırmak için uygun bir yöntem olduğu iddia edilmiştir. Bu yaklaşım kristal çekirdeklenmesini destekleyen bir durumdur sonraki kristal büyümesi ve tersi için optimal olmayabilir önermesine dayanır. Başka bir durum nucleatedi malzemeyi aktararak, kimse, bu süreçlerin etkin ayrılabilmesi için yeni, henüz keşfedilmemiş kristalleşme alanı böylece veren erişimi deneyebilirve bunun sonucu olarak bir tarama deneyinin genel başarı oranı artmaktadır. Kurulan yöntemleri, genellikle, örneğin kullanılarak yönlü basınç uygulaması ile elde edilen (i) macroseeding, bir 8 bir durum bütünüyle tek bir kristalin transferi, (ii) bir çizgi ekim, çekirdekli malzeme transferi için belgelenmiştir Yeni bir kristalizasyon damla 9, ve (iii) &quot;klasik&quot; mikro-ile bıyık sonraki geçişi ve ardından var olan bir kristal, yüzeyine bir kedi bıyık, hasat tarafından üretilen kristal &quot;tohum&quot;, transfer kristaller (ya da kristal halinde ezilmiş Tohumlar 10 vermiştir benzer koşullar malzemesi). Özellikle bu yöntemlerin her üç örneği, modern sıvı kullanım kristalleştirme ile elde robotik ne göre, zaman alıcı ve kötü ölçeklenebilir. Bu faktörler algı, en azından belli bir düzeyde, katkıda bu tohuming diğer yaklaşımlar meyvelerini başarısız olduğunda, yalnızca ziyaret edilecek bir yöntemdir. Rasgele matris mikro-(RMMler) yüksek verimli tarama ve ölçeklenebilirlik 11-13 olanlar ile geleneksel mikro-avantajlarını birleştiren yeni bir metodolojik bir yeniliktir. Bu yaklaşım, bir standart 96-durum kristalleşme ekran içinde her sub-well/coverslip üzerine / içine örnek edilebilir çekirdekli kristal bir malzemeden üretilen bir tohum stoku nesil dayanır. Bu yöntem, her iki el ile ya da 24-kuyu veya 96-çukurlu tabla formatında, sıvı kullanım robotları ile ya da kurulmuş damla buharı difüzyon deneyleri, oturma ya da asılı için de geçerlidir. RMMler önemli ölçüde kristalleşme başarı oranını artırmak ve daha fazla kırınım kalite ve miktar 11, 13, 14 kristallerini üretmek için deneysel olarak gösterdi, ve o de yaklaşımların crystallographers &#39;cephanelik yeni bir araç temsil edilmiştirkristalleşme başarı yolunda çaba ngoing. Burada RMMler için genel bir yöntem açıklanmaktadır ve bu tekniğin etkinliğini gösteren örnek veriler sağlar.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC 96 well crystallization trays</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD11-00-100</td>
			<td>Non-UV compatible, for screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClearView sealing sheets</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD6-01S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hen egg white lyzozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td>~95% purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine liver catylase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td>&gt;95% purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylanase</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR7-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thaumatin from Thaumatococcus daniellii</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JCSG-plus HT-96 screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-40</td>
			<td>For screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PACT premier HT-96 screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-36</td>
			<td>For screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morpheus HT-96 screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-47</td>
			<td>For screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Phoenix liquid handling system</td>
			<td>Art Robbins Instruments</td>
			<td>602-0001-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seed bead kit</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2646-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ErgoOne 0.1-2.5 &mu;l pipette</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-0125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ErgoOne 2-20 &mu;l pipette</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-0221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ErgoOne 100-1000 &mu;l pipette</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JCSG-plus screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-37</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PACT premier screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-29</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morpheus screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-46</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5415-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CrystalClene coverslips 18 mm</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD4-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml glass Pasteur pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z722669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-215-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well XRL crystallization tray</td>
			<td>Molecular Dimensions Limited</td>
			<td>MD3-11</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% (w/v) PEG 8000, 0.2 M ammonium sulfate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% (w/v) PEG 8000, 0.2 M magnesium acetate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% (w/v) PEG 6000, 100 mM citric acid pH 5.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving the success rate of protein crystallization by random microseed matrix screening

Rasgele microseed matris taraması (RMMler) tohum kristalleri rasgele ekranlar ilave edildiği bir protein kristalleştirme tekniktir. Kristaller, bir protein faz diyagramının metastabl bölgede büyüyecek olasılığını artırarak, ilave kristalizasyon yol genellikle üretilen kristallerin kalitesi artırılabilir, elde edilir ve veri toplama ve ıslatma deneyler için kristallerinin iyi bir besleme sağlanır. Burada el ile ya da 96-kuyu veya 24-çukurlu tabla formatında, sıvı kullanım robotları ile ya da kurulmuş damla oturma veya asılı damla buharı difüzyon deneyleri, ya da uygulanabilir RMMler için genel bir yöntem açıklanmaktadır.

Bir RMMler deney (A) Örnek RMMler tarama etkinliğini göstermek için, biz tavuk yumurtası beyaz lisozim (HEWL) ve sığır karaciğer katalaz (BLC) kristalizasyonuna için bu yöntemi uygulanır. Bu enzimler fazlasıyla kristalize olan ve yapısal olarak iyi hedefleri 15, 16 karakterize edilir hem de. Böyle iki RMMler ile elde geliştirilmiş kristalleşme başarı oranını göstermek için mükemmel denekler sağlamak gibi. Kristalizasyon deneyleri 96-sıra sıvı taşıma rob...

Watch this Scientific Journal Video about Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening at JoVE.com

Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

Burada, rasgele microseed matris taraması için genel bir yöntem açıklanmaktadır. Bu tekniğin önemli, protein kristalleşme tarama deneylerin başarı oranını artırmak için optimizasyon ihtiyacını azaltır ve veri toplama ve ligand-ıslatma deneyler için kristaller güvenilir bir kaynağı sağlamak için gösterilmiştir.

Rastgele Microseed Matrix ELEME Protein Belirginleşmesine Başarı Oranı artırma

Random microseed matrix screening  (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added  to random screens. By increasing the ...

improving-success-rate-protein-crystallization-random-microseed

Research

JoVE Journal

Biology

17.7K Görüntüleme.  University of Bristol.  Burada, rasgele microseed matris taraması için genel bir yöntem açıklanmaktadır. Bu tekniğin önemli, protein kristalleşme tarama deneylerin başarı oranını artırmak için optimizasyon ihtiyacını azaltır ve veri toplama ve ligand-ıslatma deneyler için kristaller güvenilir bir kaynağı sağlamak için gösterilmiştir. 

Video: Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Sıvı Faz Kurtarma Moleküler Ağırlık Tabanlı Fraksiyonu GELFREE 8100 Fraksiyonu Sisteminin Kullanılması

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Biyoloji

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray crystallography to study structure-function questions of membrane proteins, as well as soluble proteins. Screening for two-dimensional (2D) crystals by transmission electron microscopy (EM) is the critical step in finding, optimizing, and selecting samples for high-resolution data collection by cryo-EM. Here we describe the fundamental steps in identifying both large and ordered, as well as small 2D arrays, that can potentially supply critical information for optimization of crystallization conditions.
By working with different magnifications at the EM, data on a range of critical parameters is obtained. Lower magnification supplies valuable data on the morphology and membrane size. At higher magnifications, possible order and 2D crystal dimensions are determined. In this context, it is described how CCD cameras and online-Fourier Transforms are used at higher magnifications to assess proteoliposomes for order and size.
While 2D crystals of membrane proteins are most commonly grown by reconstitution by dialysis, the screening technique is equally applicable for crystals produced with the help of monolayers, native 2D crystals, and ordered arrays of soluble proteins. In addition, the methods described here are applicable to the screening for 2D crystals of even smaller as well as larger membrane proteins, where smaller proteins require the same amount of care in identification as our examples and the lattice of larger proteins might be more easily identifiable at earlier stages of the screening.

Evaluating two-dimensional (2D) crystallization trials for the formation of ordered membrane protein arrays is a highly critical and difficult task in electron crystallography. Here we describe our approach in screening for and identifying 2D crystals of predominantly small membrane proteins in the range of 15 &#x2013; 90kDa.

Elektron Kristalografi Yapısal Biyoloji Araştırmaları Küçük Membran Proteinleri İki boyutlu Kristalizasyon Denemeler değerlendirilmesi

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The availability of atomic resolution structures provides a deep and unique understanding of protein function, and helps to unravel the inner workings of the living cell. To date, 86% of the Protein Data Bank (rcsb-PDB) entries are macromolecular structures that were determined using X-ray crystallography.
To obtain crystals suitable for crystallographic studies, the macromolecule (e.g. protein, nucleic acid, protein-protein complex or protein-nucleic acid complex) must be purified to homogeneity, or as close as possible to homogeneity. The homogeneity of the preparation is a key factor in obtaining crystals that diffract to high resolution (Bergfors, 1999; McPherson, 1999).
Crystallization requires bringing the macromolecule to supersaturation. The sample should therefore be concentrated to the highest possible concentration without causing aggregation or precipitation of the macromolecule (usually 2-50 mg/ mL). Introducing the sample to precipitating agent can promote the nucleation of protein crystals in the solution, which can result in large three-dimensional crystals growing from the solution. There are two main techniques to obtain crystals: vapor diffusion and batch crystallization. In vapor diffusion, a drop containing a mixture of precipitant and protein solutions is sealed in a chamber with pure precipitant. Water vapor then diffuses out of the drop until the osmolarity of the drop and the precipitant are equal (Figure 1A). The dehydration of the drop causes a slow concentration of both protein and precipitant until equilibrium is achieved, ideally in the crystal nucleation zone of the phase diagram. The batch method relies on bringing the protein directly into the nucleation zone by mixing protein with the appropriate amount of precipitant (Figure 1B). This method is usually performed under a paraffin/mineral oil mixture to prevent the diffusion of water out of the drop.
Here we will demonstrate two kinds of experimental setup for vapor diffusion, hanging drop and sitting drop, in addition to batch crystallization under oil.

The 3-D structure of a molecule provides a unique understanding of how the molecule functions. The principal method for structure determination at near-atomic resolution is X-ray crystallography. Here, we demonstrate the current methods for obtaining three-dimensional crystals of any given macromolecule that are suitable for structure determination by X-ray crystallography.

X-ray Kristalografi Protein Kristalizasyon

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been identified and are separated into six groups based on their structure and substrate specificity (collagenases, gelatinases, membrane type [MT-MMP], stromelysins, matrilysins, and others). MMPs play a critical role in cell invasion, cartilage degradation, tissue remodeling, wound healing, and embryogenesis. They therefore participate in both normal processes and in the pathogenesis of many diseases, such as rheumatoid arthritis, cancer, or chronic obstructive pulmonary disease1-6. Here, we will focus on MMP-2 (gelatinase A, type IV collagenase), a widely expressed MMP. We will demonstrate how to detect MMP-2 in cell culture supernatants by zymography, a commonly used, simple, and yet very sensitive technique first described in 1980 by C. Heussen and E.B. Dowdle7-10. This technique is semi-quantitative, it can therefore be used to determine MMP levels in test samples when known concentrations of recombinant MMP are loaded on the same gel11.
Solutions containing MMPs (e.g. cell culture supernatants, urine, or serum) are loaded onto a polyacrylamide gel containing sodium dodecyl sulfate (SDS; to linearize the proteins) and gelatin (substrate for MMP-2). The sample buffer is designed to increase sample viscosity (to facilitate gel loading), provide a tracking dye (bromophenol blue; to monitor sample migration), provide denaturing molecules (to linearize proteins), and control the pH of the sample. Proteins are then allowed to migrate under an electric current in a running buffer designed to provide a constant migration rate. The distance of migration is inversely correlated with the molecular weight of the protein (small proteins move faster through the gel than large proteins do and therefore migrate further down the gel). After migration, the gel is placed in a renaturing buffer to allow proteins to regain their tertiary structure, necessary for enzymatic activity. The gel is then placed in a developing buffer designed to allow the protease to digest its substrate. The developing buffer also contains p-aminophenylmercuric acetate (APMA) to activate the non-proteolytic pro-MMPs into active MMPs. The next step consists of staining the substrate (gelatin in our example). After washing the excess dye off the gel, areas of protease digestion appear as clear bands. The clearer the band, the more concentrated the protease it contains. Band staining intensity can then be determined by densitometry, using a software such as ImageJ, allowing for sample comparison.

This protocol describes an activity-based assay for detecting matrix metalloproteinases in culture supernatants or body fluids.

Zymography Fonksiyonel Matrix Metalloproteinazlar Tespiti

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

Lipidik Mesophases Membran Proteinleri Kristallendirilmesi

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large macromolecular complexes. Compared to X-ray crystallography, it has some unique advantages. First, single particle EM reconstruction does not need to crystallize the protein sample, which is the bottleneck in X-ray crystallography, especially for large macromolecular complexes. Secondly, it does not need large amounts of protein samples. Compared with milligrams of proteins necessary for crystallization, single particle EM reconstruction only needs several micro-liters of protein solution at nano-molar concentrations, using the negative staining EM method. However, despite a few macromolecular assemblies with high symmetry, single particle EM is limited at relatively low resolution (lower than 1 nm resolution) for many specimens especially those without symmetry. This technique is also limited by the size of the molecules under study, i.e. 100 kDa for negatively stained specimens and 300 kDa for frozen-hydrated specimens in general.
For a new sample of unknown structure, we generally use a heavy metal solution to embed the molecules by negative staining. The specimen is then examined in a transmission electron microscope to take two-dimensional (2D) micrographs of the molecules. Ideally, the protein molecules have a homogeneous 3D structure but exhibit different orientations in the micrographs. These micrographs are digitized and processed in computers as "single particles". Using two-dimensional alignment and classification techniques, homogenous molecules in the same views are clustered into classes. Their averages enhance the signal of the molecule's 2D shapes. After we assign the particles with the proper relative orientation (Euler angles), we will be able to reconstruct the 2D particle images into a 3D virtual volume.
In single particle 3D reconstruction, an essential step is to correctly assign the proper orientation of each single particle. There are several methods to assign the view for each particle, including the angular reconstitution1 and random conical tilt (RCT) method2. In this protocol, we describe our practice in getting the 3D reconstruction of yeast exosome complex using negative staining EM and RCT. It should be noted that our protocol of electron microscopy and image processing follows the basic principle of RCT but is not the only way to perform the method. We first describe how to embed the protein sample into a layer of Uranyl-Formate with a thickness comparable to the protein size, using a holey carbon grid covered with a layer of continuous thin carbon film. Then the specimen is inserted into a transmission electron microscope to collect untilted (0-degree) and tilted (55-degree) pairs of micrographs that will be used later for processing and obtaining an initial 3D model of the yeast exosome. To this end, we perform RCT and then refine the initial 3D model by using the projection matching refinement method3.

This article describes a standard method to get a three-dimensional (3D) reconstruction of biological macromolecules using negative staining electron microscopy (EM). In this protocol, we explain how to get the 3D structure of the Saccharomyces cerevisiae exosome complex at medium resolution using the random conical tilt reconstruction method (RCT).

Rastgele Konik Tilt Yöntemiyle Exosome Kompleksi Tek Parçacık Elektron Mikroskobu İmar

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

Yüksek verim Kristalizasyon lipidik Bicelle Yöntemiyle Membran Proteinleri

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy

The MGM101 gene was identified 20 years ago for its role in the maintenance of mitochondrial DNA. Studies from several groups have suggested that the Mgm101 protein is involved in the recombinational repair of mitochondrial DNA. Recent investigations have indicated that Mgm101 is related to the Rad52-type recombination protein family. These proteins form large oligomeric rings and promote the annealing of homologous single stranded DNA molecules. However, the characterization of Mgm101 has been hindered by the difficulty in producing the recombinant protein. Here, a reliable procedure for the preparation of recombinant Mgm101 is described. Maltose Binding Protein (MBP)-tagged Mgm101 is first expressed in Escherichia coli. The fusion protein is initially purified by amylose affinity chromatography. After being released by proteolytic cleavage, Mgm101 is separated from MBP by cationic exchange chromatography. Monodispersed Mgm101 is then obtained by size exclusion chromatography. A yield of ~0.87 mg of Mgm101 per liter of bacterial culture can be routinely obtained. The recombinant Mgm101 has minimal contamination of DNA. The prepared samples are successfully used for biochemical, structural and single particle image analyses of Mgm101. This protocol may also be used for the preparation of other large oligomeric DNA-binding proteins that may be misfolded and toxic to bacterial cells.

The yeast mitochondrial nucleoid protein, Mgm101, is a Rad52-type recombination protein that forms large oligomeric rings. A protocol is described to prepare soluble recombinant Mgm101 using the Maltose Binding Protein (MBP)-tagging strategy coupled with cation exchange and size exclusion chromatography.

MBP tabanlı Etiketleme Stratejisi Mgm101 Rekombinasyon Protein hazırlanması

The MGM101 gene was identified 20 years ago for its role in the maintenance of mitochondrial DNA. Studies from several groups have suggested that the ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

Kültür Memeli Hücrelerde Biyolojik tanımında ubikitin ve Ubiquitin benzeri Sistemi Regülatörleri tanımak siRNA Eleme

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).

Yaşayan Hücrelerde Protein-fragmanı tamamlama Assay (PCA) ile genom Protein-protein etkileşimi Eleme

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...