Bu çalışma aynı zamanda JSB için R01GM103655 hibe Welch Vakfı Hibe F1155 ve NIH tarafından desteklenen Sağlık (NIH) National Institutes Bağış AI064184 ve AI76322 tarafından ve MST Araştırma Ordu Araştırma Bürosu Grant 61789-MA-MUR tarafından desteklenen

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu protokolde, bakterilerin bütün hücrelerden lipid A türlerin izole ayrıntılı ve kimyasal olarak, bu izole edilmiş malzemenin karakterize etmek için TLC ya da MS-analitik yöntemler tarif etmişlerdir. Tandem kütle spektrometresi biyolojik bileşiklerin de novo yapısal karakterizasyonu için güçlü bir stratejidir, ve doğada gözlenen lipid A molekülleri yelpazesine kimyasal karakterizasyonu için paha biçilemez. CID ve UVPD lipid A molekülleri için anahtar parmak izi sağlayan ürün iyonlar...

Lipopolisakarid (LPS) neredeyse tüm gram-negatif bakterilerin en büyük dış yüzey molekülü olan ve üç molekül etki oluşmaktadır: merkezden uzak bir O-antijen polisakarit, çekirdek oligosakkarit ve zara bağlı lipid dış yaprakçıkta biriken bir etki dış zar iki tabakalı 1,2. Lipid A alanı, lipid A yumuşak asit hidrolizi 1 üzerine LPS&#39;nin kloroform çözünür bölümü olarak tanımlanabilir 3-deoksi-D-manno-okt-2-ulosonic (Kdo) artıkları ve bir lipit A moleküler türün oluşmaktadır 2. Model organizma Escherichia coli (E. coli), 1,2 gözlenen büyük lipid A türleri ile tutarlıdır; standart lipid A molekül kimyasal heksa-asilatlanmış ve bis-fosforile edilmiş olan bir omurga diglucosamine olarak tanımlanabilir. Gram-negatif bakteriler boyunca muhafaza edilmiş dokuz kurucu olarak ifade edilen genler, lipid üretiminde bir alanı (Şekil 1), 1,2 sorumludur. Bir çok bakteri lipid A 3 daha başka kimyasal modifikasyonu katılma filogenetik koruma derecesi değişebilir genlerin ek dizi vardır. Defosforilasyon, asil zincirleri çıkarılması ve amino şekerler (örneğin amino-arabinoz) ve / veya fosfoetanolamin gibi kimyasal kısımların ve buna ek olarak en sık gözlemlenen etkinlikleri ve (Şekil 1) bulunmaktadır. Lipid A modifikasyonu sorumlu enzimlerin çoğu doğrudan bu iki değerli katyonları gibi tabiata ait sinyallerle aktive edilir, ya da sentezleme, iki bileşenli tepki düzenleyici sistemler 3 düzenlenir. Host doğuştan gelen bağışıklık sistemi tarafından lipid A türlerin tanınması Toll-benzeri reseptör 4/myeloid farklılaşma faktörü 2 (TLR4/MD2) co-reseptör 4 aracılık eder. MD2 ve lipid A asil zincirleri, aynı zamanda, TLR4 ve lipid A 1 ve 4 &#39;, fosfat grupları dudağın güçlü bir ilişki teşvik arasında var olan hidrofobik kuvvetlerTLR4/MD2, 4,5 ile kimliği bir. Asilasyon durum ya da lipid A negatif yük etki TLR4/MD2 göre lipid değiştirmek modifikasyonlar A tanıma ve doğal bağışıklık yanıtının uyarılması alt NF-KB ve örneğin TNFa ve IL1-β, 6,7 enflamasyon medyatörleri harekete geçiriciler kullanılmaktadır. Lipid A&#39;nın negatif şarjının maskelenmesini modifikasyonları da hücre yüzeyleri 3,8 gram-negatif bakteri bağlanmasını katyonik antimikrobiyal peptitler engeller. Birçok lipid A modifikasyon örneğin, insan ev sahibi içinde veya ekolojik bir niş gibi özel çevre koşulları altında, bakteri sağlığını arttırmak için öne sürülmüştür. Bu nedenle birçok modifikasyon enzimleri antimikrobiyal bileşiklerin rasyonel gelişme çekici hedeflerdir. Lipid A yapılarının kimyasal çeşitliliği, organizma ve / veya çevreye ve bu çeşitli yapıların biyolojik etkileri ile ilgili olarak lipid A&#39;nın yapısal karakterizasyonu t önemli bir çaba yapmakO gram-negatif bakterilerin çalışma. Bütün bakterilerden lipid A molekülleri izolasyonu nihai saflaştırma prosedürü 9-11 ardından bakteriyel hücre yüzeyinden LPS&#39;nin çıkarma, lipit A serbest bırakmak için bir hidrolitik aşamasını içerir. En sık atıf LPS ekstraksiyon prosedürü ilk Westphal ve Jann 10 tarafından tanıtılan, sıcak-fenol su çıkarma işlemdir. Bütün kimyasal olarak ekstre LPS lipid A&#39;nın uzak glukozamin şeker (Şekil 1) 6&#39;-hidroksil KDO ayıran hafif asit hidrolize tabi sonra. Çok sayıda tuzaklar yüksek bir tehlike reaktifin kullanılması da dahil olmak üzere, sıcak-fenol su prosedürü için mevcut ko-ekstre edilmiş nükleik asitler ve proteinler, ve birkaç gün indirgeme için ihtiyaç protokolü 10 tamamlamak için gereklidir. İlk Caroff ve Raetz 12,13 tarafından geliştirilen Bizim laboratuvar ayrıca lipid A&#39;nın çıkarma ve izole geliştirdi. Sıcak-fenol su işlemleri ile karşılaştırıldığında, burada sunulan yöntem daha hızlı ve daha verimli ve 5 ml birden litre kültür hacimleri geniş bir aralıkta. Ayrıca, sıcak fenol su ekstresini aksine, bizim yöntem lipit A türlerin optimal iyileşme sağlayan, LPS kaba veya pürüzsüz türleri için seçmez. Protokolde, bütün bir bakteri hücrelerinin kimyasal liziz LPS, santrifüjle topaklar haline edilebilir bir kloroform, metanol ve sudan oluşan bir karışımı kullanılarak gerçekleştirilir. Hafif asit hidrolize ve solvent ekstraksiyon (Bligh-Dyer) içinde bir arada kovalent bağlı polisakarit lipit A serbest bırakmak için kullanılır. Bligh ve Dyer bir yöntem ilk olarak 14, dokular, hayvan ve bitki çeşitli lipid türlerin çıkarılması için uygulanan bu son adımda ayırma lipid A&#39;dan hidrolize polisakarit ayırmak için burada modifiye edilmiş, kloroform çözünür lipidler seçici bir alt organik bir şekilde bölünmezler aşaması. Bundan başka, lipid A saflaştırılması için ters fazlı ya daAnyonik değiştirme kolon kromatografisi 12 kullanılabilir. Tüm hücrelerden lipid A türlerinin izole edildikten sonra, analitik bir dizi yöntem bu NMR ve TLC ve MS-esaslı analizi gibi izole edilmiş malzemenin kimyasal yapısını karakterize etmek için kullanılabilir. NMR tahribatsız yapısal açıklama için izin verir, ve glikosidik bağlantıları, asil zinciri pozisyonların kesin atama ve amino-arabinozun veya fosfoetanolamin 15-17 gibi lipit A değişiklikler için ek siteler ödevle ilgili yapısal ayrıntı sağlar. Lipid A&#39;nın NMR analizi eden protokol içinde ele değildir, fakat başka 15,16 yeterince tarif edilmiştir. Hızlı analiz için TLC yöntemler sıkça kullanılır dayalı, ama ince kimyasal yapısına ilişkin doğrudan bilgi sağlamak için başarısız. MS temel protokoller lipid A yapıları 18,19 karakterize etmek için en çok kullanılan bir yöntemdir. Matrix ilişkili lazer desorpsiyon iyonizasyon (MALDI)-MS genellikle başlangıçta sağlam lipit A türlerini araştırmak için kullanılır. Tek yüklü iyonların daha analit eden ekstraksiyon prosedürlere göre hazırlanmıştır oluşturulur. Daha ince yapısal analiz gerekli olduğu gibi, MS / MS tabanlı yöntemler MALDI-MS&#39;den daha bilgilendirici kanıtlamak. Yapısal bilgi ürün iyonları 18,20,21 oluşturmak için, (ESI) bir ön-madde iyonları Çarpışmanın neden olduğu ayırma (CID) ya da mor ötesi Fotodissosiasyon (UVPD) ile daha da parçalanmış olan, tek başına veya çok yüklü lipid iyonizasyon elektrosprey Akuple. Bir ön-madde iyonları lipid Nötr kaybı ürünler ayrıca sık sık yapısal bilgileri ve ek bir tabaka sağlayan ESI-MS sırasında oluşturulur. Tandem kütle spektrometrisi (MS / MS) lipid A yapıların açıklanması için vazgeçilmez ve çok yönlü bir yöntem olduğu kanıtlanmıştır. MS / MS sırasında, ön-madde iyonları iyon yapısını aydınlatmak için kullanılabilecek bir tanı parçalanma desen vermek üzere aktive olur. En yaygın olarak available MS / MS metodu olup CID. Bu yöntem, ayrışma yol açar enerji birikimi ile sonuçlanır, bir atıl gaz ile, hedef seçilen haberci iyon çarpışmaları yolu ile parçası iyonlar üretir. CID bakteri türlerinin 22-33 geniş bir yelpazesi için bir lipid yapının atama önemli bir araç olduğunu kanıtlamıştır. CID en evrensel olarak uygulanan MS / MS metodu da, bu ürün, iyonların sınırlı dizisi oluşturur. 193 nm UVPD alternatif ve tamamlayıcı bir MS / MS yöntemi. Bu yöntem iyon ışın tedavisi için bir lazer kullanmaktadır ve fotonların emme iyonları ve sonraki ayrışma enerjilendirilmesi ile sonuçlanır. Bu yüksek enerji, MS / MS tekniği CID daha ürün iyonların daha çeşitli bir dizi üretir ve böylece daha bilgilendirici parçalanma desen sağlar. Özellikle, UVPD glukan, amin, asil ve CC bağlantılı tahviller 18,21,34 de bölünmelere dayalı lipid A türlerde ince değişiklikler hakkında bilgi verir.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C607</td>
			<td>HPLC Grade</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A452</td>
			<td>HPLC Grade</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Teflon FEP Centrifuge Bottles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-562-21</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Silica Gel 60 TLC Plates</td>
			<td>EMD Biosciences</td>
			<td>5626-6</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Grade No. 3MM Chromatography Paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>3030700</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Orbitrap Elite</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mass Spectrometer</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ExciStar XS Excimer Lasrer</td>
			<td>Coherent Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PicoTip Nanospray ESI emitters</td>
			<td>New Obectives</td>
			<td></td>
			<td>&ge; 30 &mu;m to reduce clogging</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Model 505 Pulse/Delay Generator</td>
			<td>Berkeley Nucleonics Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Hot Plate Thermoylne 2200</td>
			<td>Barnstead/Thermolyne</td>
			<td>HPA2235MQ</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>16x125 mm GPI 15-415 Threaded Disposable Borosilicate Culture Tubes</td>
			<td>Corning Pyrex</td>
			<td>99449-16X</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Reusable Threaded PTFE screw caps GPI 45-415</td>
			<td>Corning </td>
			<td>9999-152</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Personal Molecular Imager System (phosphorimager)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>170-9400</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Autoradiography Cassette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FBCS810</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Phosphorscreen SO230</td>
			<td>Kodak</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Peptide Mass Standards Kit</td>
			<td>Sequazyme</td>
			<td>P2-3143-00</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sonifier S250-A</td>
			<td>Branson</td>
			<td>101063196</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1.5 ml 12x32 mm Tapered Base Screw Thread Vial</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C4000-V1</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

isolation and chemical characterization of lipid a from gram-negative bacteria

Lipopolisakarid (LPS) dış zar iki tabakalı dış yaprakçıkta biriken gram-negatif bakterilerin en büyük hücre yüzey molekülüdür. LPS üç sahaya bölünebilir: distal O-polisakarit, çekirdek oligosakkarit ve lipid, bir lipit içeren bir etki moleküler türleri ve 3-deoksi-D-manno-okt-2-ulosonic asit kalıntıları (Kdo). Lipid A etki bakteriyel hücre hayatta kalması için gerekli olan tek bileşendir. Sentezi takiben lipid A kimyasal olarak antibiyotik bileşiklere karşı direncini arttırma ve ana doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin aracılar tarafından tanınması kaçınmak için, bu tür pH ve sıcaklık gibi çevresel strese cevap olarak modifiye edilir. Aşağıdaki protokol, gram-negatif bakterilerin lipid A&#39;nın küçük ve büyük ölçekli izolasyon detayı. İzole edilen malzeme, daha sonra, kimyasal, ince tabaka kromatografisi (TLC) veya kütle spektrometrisi (MS) ile karakterize edilir. Buna ek olarak, F lazer desorpsiyon / iyonizasyon süresi matris destekliışığı (MALDI-TOF) MS, aynı zamanda Çarpışmanın neden olduğu ayırma (CID) bağlanmış elektrosprey iyonizasyon (ESI) ve yeni kullanılan ultraviyole Fotodissosiasyon (UVPD) yöntemleri kullanılarak lipid A moleküler türler analiz etmek için tandem MS protokolleri açıklanmıştır. Bizim MS protokolleri benzersiz veya yeni kimyasal modifikasyon içeren lipid A molekülleri karakterizasyonu için çok önemlidir, kimyasal yapının, şüphe götürmez belirlenmesi için izin verir. Ayrıca, TLC ile analiz için bakteriyel hücrelerden lipid A&#39;nın radyoizotopik etiketleme, ve daha sonra izolasyon, tarif etmektedir. MS tabanlı protokol ile karşılaştırıldığında, TLC bir daha ekonomik ve hızlı bir karakterizasyonu yöntem sağlar, ancak açık bir şekilde bilinen bir kimyasal yapıya standartlarının kullanımı olmayan bir kimyasal yapıları lipid atamak için kullanılamaz. Son yirmi yılda lipid A izolasyonu ve karakterizasyonu gram-negatif bakteriler, antibiyotik direnci mekanizmalarının fizyolojisinin anlayışımızı geliştirdik ki çok heyecan verici keşiflere yol açmıştırmesafe, insan doğuştan gelen bağışıklık tepkisi ve antibakteriyel bileşiklerin geliştirilmesinde bir çok yeni hedefler sağlamıştır.

E. kanonik lipid A ve 4 &#39;-pozisyonları - coli ve Salmonella enterica serovar Typhimurium bir heksa-asilatlanmış 1 de fosfat grupları ile glukozamin disakkarittir. Zengin ortam (örneğin, Luria Broth) büyüme sırasında lipid A kısmı, tris-fosforile türlerin 36 (Şekil 1) elde 1-pozisyonunda bir pirofosfat grubu içerir. Kdo (3-deoksi-D-manno-oktuiosonik asit), bağlı olup 6&#39;-hidroksil ve LPS kalan karbonhidrat etki (...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria at JoVE.com

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Gram-negatif bakterilerin lipopolisakarit (LPS) lipid A alanı izolasyonu ve karakterize edilmesi, hücre yüzeyi antibiyotik direnç mekanizmaları göre, bakterinin yaşamda kalması ve spor ve nasıl kimyasal olarak çeşitli lipit A moleküler türün farklı olarak ana doğal immün yanıtları modüle fikir verir.

Gram-negatif bakterilerin izolasyonu ve Lipid A kimyasal karakterizasyonu

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

isolation-chemical-characterization-lipid-from-gram-negative

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Chemistry

Biochemistry

SCIENTISTS IN ACTION

31.5K Görüntüleme.  The University of Texas at Austin.  Gram-negatif bakterilerin lipopolisakarit (LPS) lipid A alanı izolasyonu ve karakterize edilmesi, hücre yüzeyi antibiyotik direnç mekanizmaları göre, bakterinin yaşamda kalması ve spor ve nasıl kimyasal olarak çeşitli lipit A moleküler türün farklı olarak ana doğal immün yanıtları modüle fikir verir. 

Video: Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Free Radicals in Chemical Biology: from Chemical Behavior to Biomarker Development

The involvement of free radicals in life sciences has constantly increased with time and has been connected to several physiological and pathological processes. This subject embraces diverse scientific areas, spanning from physical, biological and bioorganic chemistry to biology and medicine, with applications to the amelioration of quality of life, health and aging. Multidisciplinary skills are required for the full investigation of the many facets of radical processes in the biological environment and chemical knowledge plays a crucial role in unveiling basic processes and mechanisms. We developed a chemical biology approach able to connect free radical chemical reactivity with biological processes, providing information on the mechanistic pathways and products. The core of this approach is the design of biomimetic models to study biomolecule behavior (lipids, nucleic acids and proteins) in aqueous systems, obtaining insights of the reaction pathways as well as building up molecular libraries of the free radical reaction products. This context can be successfully used for biomarker discovery and examples are provided with two classes of compounds: mono-trans isomers of cholesteryl esters, which are synthesized and used as references for detection in human plasma, and purine 5',8-cyclo-2'-deoxyribonucleosides, prepared and used as reference in the protocol for detection of such lesions in DNA samples, after ionizing radiations or obtained from different health conditions.

Radical-based biomimetic chemistry has been applied to building-up libraries necessary for biomarker development.

Kimyasal Biyoloji Serbest Radikaller: Kimyasal Davranış den Biyomarker Kalkınma

The involvement of free radicals in life sciences has constantly increased with time and has been connected to several physiological and pathological ...

Kimya

Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both stimuli and cargo can be tailored according to specific needs. Here we describe the DNA nanorobot fabrication protocol, with the use of the DNA origami technique. The procedure initiates by mixing short single-strand DNA staples into a stock mixture which is then added to a long, circular, single-strand DNA scaffold in presence of a folding buffer. A standard thermo cycler is programmed to gradually lower the mixing reaction temperature to facilitate the staples-to-scaffold annealing, which is the guiding force behind the folding of the nanorobot. Once the 60 hr folding reaction is complete, excess staples are discarded using a centrifugal filter, followed by visualization via agarose-gel electrophoresis (AGE). Finally, successful fabrication of the nanorobot is verified by transmission electron microscopy (TEM), with the use of uranyl-formate as negative stain.

DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM).

DNA Origami bir Bio-duyarlı Robot katlanması ve Karakterizasyonu

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both ...

Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization

The traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the use of solid-phase synthesis by appending suitably modified phosphoramidite precursors to the nascent chain. However, the conditions used during the synthesis and the restriction to rather short sequences hamper the applicability of this methodology. On the other hand, modified nucleoside triphosphates are activated building blocks that have been employed for the mild introduction of numerous functional groups into nucleic acids, a strategy that paves the way for the use of modified nucleic acids in a wide-ranging palette of practical applications such as functional tagging and generation of ribozymes and DNAzymes. One of the major challenges resides in the intricacy of the methodology leading to the isolation and characterization of these nucleoside analogues.
	
	In this video article, we present a detailed protocol for the synthesis of these modified analogues using phosphorous(III)-based reagents. In addition, the procedure for their biochemical characterization is divulged, with a special emphasis on primer extension reactions and TdT tailing polymerization. This detailed protocol will be of use for the crafting of modified dNTPs and their further use in chemical biology.

The protocol described herein aims to explain and abridge the numerous obstacles in the way of the intricate route leading to modified nucleoside triphosphates. Consequently, this protocol facilitates both the synthesis of these activated building-blocks and their availability for practical applications.

Nükleosid trifosfatlar - sentezinden Biyokimyasal Karakterizasyonu için

The  traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the  use of solid-phase synthesis by appending suitably modified ...

An Inverse Analysis Approach to the Characterization of Chemical Transport in Paints

The ability to directly characterize chemical transport and interactions that occur within a material (i.e., subsurface dynamics) is a vital component in understanding contaminant mass transport and the ability to decontaminate materials. If a material is contaminated, over time, the transport of highly toxic chemicals (such as chemical warfare agent species) out of the material can result in vapor exposure or transfer to the skin, which can result in percutaneous exposure to personnel who interact with the material. Due to the high toxicity of chemical warfare agents, the release of trace chemical quantities is of significant concern. Mapping subsurface concentration distribution and transport characteristics of absorbed agents enables exposure hazards to be assessed in untested conditions. Furthermore, these tools can be used to characterize subsurface reaction dynamics to ultimately design improved decontaminants or decontamination procedures. To achieve this goal, an inverse analysis mass transport modeling approach was developed that utilizes time-resolved mass spectroscopy measurements of vapor emission from contaminated paint coatings as the input parameter for calculation of subsurface concentration profiles. Details are provided on sample preparation, including contaminant and material handling, the application of mass spectrometry for the measurement of emitted contaminant vapor, and the implementation of inverse analysis using a physics-based diffusion model to determine transport properties of live chemical warfare agents including distilled mustard (HD) and the nerve agent VX.

In this paper, a procedure for quantifying the mass transport parameters of chemicals in various materials is presented. This process involves employing an inverse-analysis based diffusion model to vapor emission profiles recorded by real-time, mass spectrometry in high vacuum.

Boyalar Kimyasal Ulaştırma Karakterizasyonu bir Ters Analizi Yaklaşımı

The ability to directly characterize chemical transport and interactions that occur within a material (i.e., subsurface dynamics) is a vital component in ...

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and technological applications. Their signature property is their ultrahigh porosity, which however imparts a series of challenges when it comes to both constructing them and working with them. Securing desired MOF chemical and physical functionality by linker/node assembly into a highly porous framework of choice can pose difficulties, as less porous and more thermodynamically stable congeners (e.g., other crystalline polymorphs, catenated analogues) are often preferentially obtained by conventional synthesis methods. Once the desired product is obtained, its characterization often requires specialized techniques that address complications potentially arising from, for example, guest-molecule loss or preferential orientation of microcrystallites. Finally, accessing the large voids inside the MOFs for use in applications that involve gases can be problematic, as frameworks may be subject to collapse during removal of solvent molecules (remnants of solvothermal synthesis). In this paper, we describe synthesis and characterization methods routinely utilized in our lab either to solve or circumvent these issues. The methods include solvent-assisted linker exchange, powder X-ray diffraction in capillaries, and materials activation (cavity evacuation) by supercritical CO2 drying. Finally, we provide a protocol for determining a suitable pressure region for applying the Brunauer-Emmett-Teller analysis to nitrogen isotherms, so as to estimate surface area of MOFs with good accuracy.

Synthesis, activation, and characterization of intentionally designed metal-organic framework materials is challenging, especially when building blocks are incompatible or unwanted polymorphs are thermodynamically favored over desired forms. We describe how applications of solvent-assisted linker exchange, powder X-ray diffraction in capillaries and activation via supercritical CO2 drying, can address some of these challenges.

Fonksiyonlu Sentezi ve Karakterizasyonu Metal-organik Altyapıları

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over large or small sample areas. It has been applied in many areas of science, including materials science, geoscience, studying works of cultural heritage, and in chemical biology. In the case of chemical biology, for example, visualizing the metal distributions within cells allows us to study both naturally-occurring metal ions in the cells, as well as exogenously-introduced metals such as drugs and nanoparticles. Due to the fully hydrated nature of nearly all biological samples, cryo-fixation followed by imaging under cryogenic temperature represents the ideal imaging modality currently available. However, under the circumstances that such a combination is not easily accessible or practical, aldehyde based chemical fixation remains useful and sometimes inevitable. This article describes in as much detail as possible in the preparation of adherent mammalian cells by chemical fixation for X-ray fluorescent imaging.

Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays.

Kimyasal Fiksasyon X-ışını Floresans Görüntüleme Değme Hücreleri hazırlanması

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical properties for applications in photonics, drug delivery and coating technology. Here we present a new family of colloidal building blocks, coined supramolecular colloids, whose self-assembly is controlled through surface-functionalization with a benzene-1,3,5-tricarboxamide (BTA) derived supramolecular moiety. Such BTAs interact via directional, strong, yet reversible hydrogen-bonds with other identical BTAs. Herein, a protocol is presented that describes how to couple these BTAs to colloids and how to quantify the number of coupling sites, which determines the multivalency of the supramolecular colloids. Light scattering measurements show that the refractive index of the colloids is almost matched with that of the solvent, which strongly reduces the van der Waals forces between the colloids. Before photo-activation, the colloids remain well dispersed, as the BTAs are equipped with a photo-labile group that blocks the formation of hydrogen-bonds. Controlled deprotection with UV-light activates the short-range hydrogen-bonds between the BTAs, which triggers the colloidal self-assembly. The evolution from the dispersed state to the clustered state is monitored by confocal microscopy. These results are further quantified by image analysis with simple routines using ImageJ and Matlab. This merger of supramolecular chemistry and colloidal science offers a direct route towards light- and thermo-responsive colloidal assembly encoded in the surface-grafted monolayer.

A protocol for the synthesis and characterization of colloids coated with supramolecular moieties is described. These supramolecular colloids undergo self-assembly upon the activation of the hydrogen-bonds between the surface-anchored molecules by UV-light.

Supramoleküler Kolloidlerin Sentezi ve Karakterizasyonu

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

Microfluidic Dry-spinning and Characterization of Regenerated Silk Fibroin Fibers

The protocol demonstrates a method for mimicking the spinning process of silkworm. In the native spinning process, the contracting spinning duct enables the silk proteins to be compact and ordered by shearing and elongation forces. Here, a biomimetic microfluidic channel was designed to mimic the specific geometry of the spinning duct of the silkworm. Regenerated silk fibroin (RSF) spinning doped with high concentration, was extruded through the microchannel to dry-spin fibers at ambient temperature and pressure. In the post-treated process, the as-spun fibers were drawn and stored in ethanol aqueous solution. Synchrotron radiation wide-angle X-ray diffraction (SR-WAXD) technology was used to investigate the microstructure of single RSF fibers, which were fixed to a sample holder with the RSF fiber axis normal to the microbeam of the X-ray. The crystallinity, crystallite size, and crystalline orientation of the fiber were calculated from the WAXD data. The diffraction arcs near the equator of the two-dimensional WAXD pattern indicate that the post-treated RSF fiber has a high orientation degree.

A protocol for the microfluidic spinning and microstructure characterization of regenerated silk fibroin monofilament is presented.

Mikrosıvısal kuru-iplik ve rejenere ipek Fibroin lifleri karakterizasyonu

The protocol demonstrates a method for mimicking the spinning process of silkworm. In the native spinning process, the contracting spinning duct enables ...

Synthesis and Evaluation of a Ruthenium-based Mitochondrial Calcium Uptake Inhibitor

We detail the synthesis and purification of a mitochondrial calcium uptake inhibitor, [(OH2)(NH3)4Ru(&#181;-O)Ru(NH3)4(OH2)]5+. The optimized synthesis of this compound commences from [Ru(NH3)5Cl]Cl2 in 1 M NH4OH in a closed container, yielding a green solution. Purification is accomplished with cation-exchange chromatography. This compound is characterized and verified to be pure by UV-vis and IR spectroscopy. The mitochondrial calcium uptake inhibitory properties are assessed in permeabilized HeLa cells by fluorescence spectroscopy.

A protocol for the synthesis, purification, and characterization of a ruthenium-based inhibitor of mitochondrial calcium uptake is presented. A procedure to evaluate its efficacy in permeabilized mammalian cells is demonstrated.

Sentez ve rutenyum tabanlı mitokondrial kalsiyum alımını inhibitörü değerlendirilmesi

We detail the synthesis and purification of a mitochondrial calcium uptake inhibitor, [(OH2)(NH3)4Ru(&#181;-O)Ru(NH3)4(OH2)]5+. The optimized synthesis of ...

An Engineered Split-TET2 Enzyme for Chemical-inducible DNA Hydroxymethylation and Epigenetic Remodeling

DNA methylation is a stable and heritable epigenetic modification in the mammalian genome and is involved in regulating gene expression to control cellular functions. The reversal of DNA methylation, or DNA demethylation, is mediated by the ten-eleven translocation (TET) protein family of dioxygenases. Although it has been widely reported that aberrant DNA methylation and demethylation are associated with developmental defects and cancer, how these epigenetic changes directly contribute to the subsequent alteration in gene expression or disease progression remains unclear, largely owing to the lack of reliable tools to accurately add or remove DNA modifications in the genome at defined temporal and spatial resolution. To overcome this hurdle, we designed a split-TET2 enzyme to enable temporal control of 5-methylcytosine (5mC) oxidation and subsequent remodeling of epigenetic states in mammalian cells by simply adding chemicals. Here, we describe methods for introducing a chemical-inducible epigenome remodeling tool (CiDER), based on an engineered split-TET2 enzyme, into mammalian cells and quantifying the chemical inducible production of 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) with immunostaining, flow cytometry or a dot-blot assay. This chemical-inducible epigenome remodeling tool will find broad use in interrogating cellular systems without altering the genetic code, as well as in probing the epigenotype&#8722;phenotype relations in various biological systems.

Detailed protocols for introducing an engineered split-TET2 enzyme (CiDER) into mammalian cells for chemical inducible DNA hydroxymethylation and epigenetic remodeling are presented.