The authors acknowledge Stefan Vogt for his assistance in the fitting of the representative data shown in this paper, and helpful discussions. The authors also acknowledge Chris Jacobsen for his support to Q. J. 
Use of the Advanced Photon Source, beamlines 2-ID-E and 8-BM-B, at Argonne National Laboratory was supported by the U. S. Department of Energy, Office of Science, Office of Basic Energy Sciences, under Contract No. DE-AC02-06CH11357.

Göstergeler, Materyalden, Kültür Medya ve Yemekleri 1. Hazırlık <ol><li> Silikon nitrür (Si 3 N 4) pencere Taşıma. <ol><li> Öte yandan, kapsül diğer ucunu dönerken, hafif, pencerenin kendisinin sıkmak üzere olan bir şekilde bir pencere ihtiva eden bir ucu sıkarak kapsül açın. </li><li> Ters bir çift kontrol, stereomicroscope altında ince uçlu cımbız ucunda hiçbir yapıştırıcı, boşluklar veya virajlı olmadığından emin olmak için. Aksi takdirde, pencere cımbız ile kırık veya sonraki adımları sırasında onları uçtuğunu olabilir. </li><li> Yavaşça pencerenin kenarları çıkıp gereken yere kapsül geniş yapmak amacıyla bir yönde basınç uygulayarak açık uca yakın kapsülü sıkarken, dikkatle cımbız ile pencerenin çerçevesini tutarak kapsülden pencereyi çıkarın. </li></ol></li><li> Pencere ön yıkama (opsiyonel). <ol><li> Hafifçe batırarak, ön yıkama pencere Eğer istenirse% 70 etanol içinde 2 dakika yıkama ve% 100 etanol içinde 2 dakika yıkama ve ardından 5 saniye için damıtılmış su içine. </li></ol></li><li> Iliştirilmesi ve kültür çanak pencereleri sterilize. <ol><li> Pencereleri tutturmak için, kültür çanak altındaki düz tarafı yukarı pencereyi ayarlamak, temiz bir cam slayt bir parça bant koyun. Bandın uzun kenarı aşağı çeyrek inç şerit kapalı yaklaşık kesin. Temiz bir jilet ile (&quot;¾ tarafından&quot; ⅛ at) kısa tarafı kapalı bant bir dilim alın. </li><li> Izgara veya pencerenin kenarına bant dilim uygulamak için cımbız kullanın. Güvenli pencere açıklığı kendisini kapsayan olmadan uymak için yeterli kullanın. Cımbız ile yapıştırılır bant kurgulama, kültür çanak alt üzerine aşağı pencere ayarlayın. Sıkıca kültür çanak alt bandı yapıştırmak için cımbız ucu kullanın. </li><li> Diğer kenarına başka bir teyp şeridi uygulayın ve sıkıca cımbız ucuyla altına bu uygun. </li><li> Bir kez tüm pencereleri vardırbantlanmış, ultraviyole (UV) radyasyon ile kültür yemekleri pencereleri sterilize. Yaklaşık 1 saat boyunca bir laminar akış başlığı içinde UV lambası altında çanak yerleştirerek başarmak. </li><li> Pencere, poli-lisin ile önceden kaplanmış edilecek (İsteğe bağlı), yani pencere Sterilizasyondan sonra yoktur. Kaplama, daha sonra 10 37 ° C kuluçka makinesi içinde, 1 saat boyunca steril% 0.01 Poli-L-lisin çözeltisinin ul ve pencere kültür ortamı ile geri kalan çözelti ile durulama. </li></ol></li><li> XFM önce son yıkama için tamponlar hazırlayın. <ol><li> Tris-glükoz ya da piperazin-N ya da hazırlama N-bis (etansülfonik asit) (BORU), kalsiyum ve magnezyum içermeyen Dulbecco fosfat tampon tuzlu suyla (D-PBS) ile osmolalite ve pH eşdeğer olan herhangi bir eser metallerin serbest tampon -sucrose. Hücreler kimyasal sabit sonra hücrelerin durulama için bu tamponlar birini kullanın. <ol><li> Tris-glükoz çözeltisi (10 mM Tris, 260 mM glukoz, 9 mM asetik asit) yapmak glukoz 1.4 g Tris baz, 36 mg eklemek veUltra-saf su, 20 ml asetik asit ve 16 ul. Daha sonra, aşırı saf su ile 30 ml nihai hacim ayarlayın. Hiçbir pH ayarlaması gereklidir. Bir haftaya kadar oda sıcaklığında saklayın. </li><li> BORULARI sakaroz (20mM PIPES, 200 mM sükroz) BORU 0.18 g ve ultra saf su 20 ml sükroz 2.0 g&#39;ı eklenmekte ve konsantre asetik asit ve küçük miktarlarda pH&#39;ı 7.4&#39;e ayarlayın yapmak. Daha sonra, aşırı saf su ile 30 ml nihai hacim ayarlayın. Bir haftaya kadar oda sıcaklığında saklayın. Not: son durulama PBS kullanarak engellemek için bir neden PBS fosfat, klorür ve potasyum konsantrasyonları tamamen hava ile kurutma işleminden önce çıkarılması değilse bu XFM engelleyebilir kadar yüksek olmasıdır. </li></ol></li></ol></li><li> Hücre kaplama için tampon hazırlayın. <ol><li> Hazırlama veya RPMI ortamı 1640 gibi tüm medya, çıkarma, 1x tripsin-EDTA çözeltisi, D-PBS, ve normal olarak yapışmış olan hücrelerin O pasaj için yapıldığı gibi, özellikle yapışkan hücre hattı için gereken başka herhangi bir reaktiff faiz ve 37 ° C onları sıcak. </li></ol></li></ol> Hücreler 2. Kaplama <ol><li> Laminar akış başlığı içinde pencere ihtiva eden sterilize edilmiş kültür kabı için, hafifçe eğimli bir zeminde onunla kültür çanak tarafındaki, ortam (100 mm kültür çanağı için 10 mi) ilave edin. Gereksiz yüzey gerilimini oluşturma veya silisyum nitrür pencere yüzeyine doğrudan medya bırakarak kaçının. Medya ilave olarak, yavaş yavaş kaplamak eğim açısı medya ile ızgara ve pencere rahatlatmak. </li><li> Trypsinizing veya hücre hattı pasaj için her zamanki gibi plakalar kapalı hücreler kazıma, uygun faiz yapışık hücre hattı hazırlayın. Taze plaka hücreleri uygulamadan önce gerekli herhangi bir hücre sayımı, ya da diğer hazırlık yapın. </li><li> Tipik haliyle, 24-72 saat içinde% 50-% 70 izdiham ulaşmak için gerekli olan bir hücre yoğunluğunda pencereli kültür tabağına hücreleri ekleyin ve% 5 karbon dioksit ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li&gt; <li> Istenilen hücre yoğunluğuna kadar (genellikle 50% -70% izdiham) ulaşıldığında, bir ters ışık mikroskobu kullanılarak, zaman zaman hücrelerin büyümesini dikkate alınmalıdır. </li></ol> Hücreler 3. Sabitleme <ol><li> Satın alınan stok (örneğin,% 25 paraformaldehit) seyreltilmesi ve (numuneye aşırı sodyum ilave önlemek için), asetik asit ile 7.4&#39;e pH değerinin ayarlanması ile D-PBS içinde% 4 paraformaldehid, taze hazırlayın. </li><li> Hücreler istediğiniz gibi yetiştirilen ve (örneğin Hoescht gibi) herhangi bir hayati lekeler uygulanmış ve görüntülü edildiğinde, tek elle bir 45 ° açıyla çanak eğerek, nazik aspirasyon ortamı çıkarın ve diğer el pipet ile aspire . NOT: yerine pipet harcanan medya, alternatif, pencere pick up kez D-PBS ile mikrosantrifüj tüpler içine pencere daldırma ve sonra PBS yıkama 2 kat, ardından 20 dakika boyunca sabitleyici çözümleri ile yeni bir kültür kabına onu yerleştirmektir artık fiksatif kaldırmak için. Bu seçilirse, dir gitmekectly 3.5 adıma. </li><li> D-PBS ile hafifçe çanak durulayın ve yemeğin tarafına doğru, 45 ° açıyla pipetlenmesini çanak tutarak yavaşça taze% 4 PFA / PBS ekleyerek, ve yavaş yavaş izin eğim açısını rahatlatıcı hemen kaldırıldı sıvı yerine sabitleştirici çözüm pencereleri kapatmak için. Oda sıcaklığında 20 dakika için sabitleyici ile kaplı hücreler tutun. </li><li> Biraz çanak eğerek ve elle aspire, yukarıdaki gibi yine, nazik aspirasyonu ile sıvı çıkarın. </li><li> Yavaşça, BORU / sakaroz çözeltisi bazı ekleme Adım 3.3 tarif devirme ve pipetleme yöntemi kullanılarak uzaklaştırıldı sıvıyı değiştirin. </li><li> Tekrar 3.4 ve 3.5 adımları. </li><li> Kurutma için malzeme hazırlayın. <ol><li> Böyle Kimwipes gibi tüy bırakmayan havlu toplayın, ve çok hızlı ve kolay kullanışlı böylece kutunun bir out çekin. </li><li> Pencere kurumaya ayarlamak için bir temiz olmayan düz bir yer hazırlayın. Sırtlar yüzden sahip elektron mikroskobu kullanılan türden, bir lastik ızgara hasır Setkuruduktan ise pencere bir ucunda sütyen olabilir. Bu kurudukça kurutma yüzeyine yapışmış getting pencere tutmak, ve numune kenarına kalan tampon drenaj olacaktır. </li></ol></li><li> Dikkatle sıvı pencereden dışarı tutmak için pencereye bağlı bandı tweeze. Ters cımbız ile onları toplayıp sonra onları yüzer almak için BORULARI / sakaroz küçük bir miktar uygulayarak tarafından bant dökülmek pencereleri alın. </li><li> Dikkatle iyice ve (pencere kendisi dokunmadan) bir Kimwipe ile pencerenin kenarından taşan BORULARI / sakaroz sıvamak. Ayrıca Kimwipe bir yuvarlak kat kullanarak arka girintili alan sıvamak. Not: amacı mümkün olduğunca pencere yüzeyinde tuzları veya tamponlar gibi az kristalleşme sahip olmaktır. </li><li> Izgara hasır üzerine pencereyi yerleştirin. Pencere ızgara mat düz yalan değil emin olun, ama (ızgara mat sırtlar kullanarak) ve ızgara gibi küçük dokunmadan bir kenarında sütyenmümkün mat. Pencere kurumasını bekleyin. </li></ol> 4. Numune Montaj ve Görüntüleme <ol><li> Örnek kuruduktan sonra, bir ışık mikroskobu kullanarak windows hücrelerin varlığını doğrulamak. Bir sinkrotron ulaşım için numune hazırlamadan önce, bu doğrulamayı gerçekleştirin. </li><li> Denemenizi barındırma sinkrotron beamline ulaşım için pencereleri paketleyin. Yavaşça, sonra bir cam slayt iki tarafta bant ile yapıştırın pencereler plastik Petri kabı alt bant ile cam slayt yapıştırın. Petri kabı kapalı Teyp. NOT: Bu noktadan önce, bu aşamalar herhangi bir tipik laboratuarda gerçekleştirilebilir. Aşağıdaki adımlar en iyi şekilde bir sinkrotron beamline yapılabilir olacaktır. </li><li> Cımbız ile hafifçe penceresinden bandı çıkarın. Sinkrotronu de beamline işbirlikçileri tarafından sağlanan bir alüminyum sahibine pencereleri güvenli, pencerenin kenarında ince bir hatta kaplamada, oje kullanın. </li><li> Içine alüminyum tutucu yerleştirinkinematik bir montaj ve X-ışını mikroskop konuma yerleştirin. Beamline de örnek odasının içine, motorlu aşamaları bağlayarak bir destek üzerine monte örnek. </li><li> Örnek X-ışını mikroskobu enstrüman alanı (kurşun dolu duvarlar yapılmış bir baraka), kurulum tarama çıktıktan sonra. Bir video çapraz saç ile donatılmış bir kamera kullanarak örnek üzerinde X-ışını konumunu görüntülerken, tarama numunenin uygun alanı seçmek, beamline özel bir yazılım kullanılarak önceden hizalanmış bir alt scintillator kamera ile. </li><li> Çevrede küçük özelliği büyüklüğü bir tahmine dayalı bir numune için uygun çözünürlük, seçin. Tek memeli hücrelerini görüntüleme için (~ boyutu 20-40 mikron), 0,25-0,5 mikron çözünürlük kullanın. Dokuların alanları görüntülenmesi ve birbirinden hücre tabakaları ayırmak için, 2-20 um çözünürlüğü kullanır. </li><li> Araya miktarının bir tahmine dayalı numune için uygun bekleme süresi, SeçinFaiz mevcut ark. Metallerin yüksek miktarlarda varsa hızlı bir bakış tarama için, ya da, piksel başına 30-300 msn bekleme süreleri ile sinek taramaları kullanın. Az malzeme varsa, ya da, düşük bağıl bolluğu metaller ölçmek piksel başına 1-2 sn bekleme süreleri ile adım taramaları kullanmak için. </li><li> Beamline özel yazılım içine taramaları Program. Bir raster tarama görüntü elde. Her element için karakteristik enerji zirveleri tespit edecek yazılımı ile verileri analiz etmek beamline işbirlikçileri ile birlikte çalışın. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

X-ışını floresans görüntüleme yerbilimleri, malzeme bilimi ve kimya biyoloji 26-34 olmak üzere birçok alanda, yararlıdır. Sinkrotron X-ışınları gelişmeler ve onların odaklanarak, çok yüksek yoğunluklu ışınları üretmişlerdir. Odaklı X-ışını mevcut silikon sürüklenme detektörü teknolojisi ile ölçülebilir sinyalinin oluşturulması, şu anda varolan hücreler endojen metallerin uyarmak için yeterli kirişler. Ve hücrede metallerin kimyasal biyoloji okuyan bu alandaki son g...

Floresan Görüntüleme kimlik ve bir numunede bulunan elementlerin nicelik sağlar X-ışını uzaysal çözülmesi. Olay X-ışınları, ilgi konusu ağır elemanının bağlanma enerjisi elektron daha büyük olacak şekilde seçilir, bir enerji, hücre çekirdeğinin 1 iç kabuk elektronların bağlanma enerjisi üstesinden gelir. Bu elektron kabuğu bir &#39;delik&#39; oluşturur. Yüksek enerjili elektronlar bu deliklerin içine düşmek gibi, floresan X-ışınları dalga boyu bu orbitallerinin enerji ayrımı bağlıdır yayılır. Orbital enerji aralığı, belirli bir elemanın karakteristik olduğu için, X-ışını floresans emisyon da aletin göre karakteristik dalga boylarında, yer alır. Mevcut elemanların belirlenmesini sağlar karakteristik dalga boyunda bu emisyon olduğunu. Floresan yoğunluğunun kalibrasyonu bulunan elementlerin kantitatif sağlar. X-ışını flüoresans mikroskopy (XFM) kısmen böyle Bahar-8 Japonya&#39;da, Avrupa Radyasyon Sinkrotron Tesisi Fransa&#39;da (SDBY), ve İleri Foton Kaynağı (olanların çok parlak X-ışını sinkrotron kaynaklarının gelişimine, giderek kullanılan haline gelmiştir ABD&#39;de 2 APS). Bu kaynaklar çok yüksek yoğunluklu X-ışını kirişler sağlamak. Aynı zamanda, böyle bir bölge plaka teknolojisi gibi X-ışını optik gelişmeler, oldukça verimsiz 3 olsa, alt-mikron noktalar bu kirişlerin odaklanarak izin. Çok yüksek yoğunluklu kirişler, mevcut detektör teknoloji ile ölçülebilir hücrelerde endojen metallerin uyarmak için yeterlidir odaklanabilir ışık bile nispeten küçük bir miktarı, üretim sinyali ile. Böylece, hücrenin içindeki metallerin kimyasal biyoloji okuyan bu teknikle 4-10 son gelişmelerin birçoğu kullanan özellikle bir uygulamadır. App sırasında dikkate alınması gereken birçok kritik faktör vardırXFM yatan kültürlenmiş memeli hücreleri veya diğer biyolojik örneklerin temel dağılımı ve miktarının araştırılması. İlk olarak, numune anlamlı olması için ölçme amacıyla, hem yapısal ve elementel kompozisyon bakımından, sağlam tutulması gerekir. Bu odaklanmış bir X-ışını neden olabilir, radyasyona karşı dayanıklı olacak şekilde İkinci olarak, örnek de bir şekilde korunmalıdır. Bir örnek bir seferde bu iki ölçütü karşılayan bir yolu, hızlı bir şekilde camsı, amorf buz 11,12 içine dondurulacaksa. Hızlı dondurma genellikle dalma dondurma ya da yüksek basınçlı 13-16 dondurma gibi çeşitli dondurarak saklama teknikleri ile elde edilir. Genellikle, dondurarak saklama mümkün yerli halde yakın olarak biyolojik numunelerde toplam hücresel bir yapıya ve kimyasal bileşimleri muhafaza ettiği kabul edilmektedir. Hücrelere ve dokulara fiksatif yavaş ve seçici penetrasyon nedeniyle diğer taraftan Kimyasal sabitleme, well membran geçirgenliği olarak sonradan yapılacak değişiklikler, çeşitli hücresel iyonları özellikle Cl, Ca ve K gibi yayılabilir iyonlar böylece 17-19 suboptimaldir bu unsurların soruşturma render, süzülür kayıp ya da taşındı izin verebilir. Özellikle yapışık memeli hücrelerinde genel olarak kimyasal sabitleme, üzerinde cryo-tespitin net avantajına rağmen, Kriyoprezervasyonun çeşitli sınırlamalar 20-23 sahiptir. En belirgin değil, her araştırma laboratuvarı dondurarak saklama araçlarına kolay erişim olmasıdır. Hatta En güncel yüksek basınç dondurucular veya dondurucular sadece kadar hücreler kuluçkaya yerden olabilir cryo tesisleri bir alt tarafından pahalı ve sahip olduğu vardır dalma. kryoprezervasyon yararı hücreleri üzerinde yerleştirilen seyahat stres dezavantajı işlem olabilir. Dondurulması kesinlikle X-ışını floresans analizi için numune korumak için en titiz şekilde Böylece, bu kesinlikle her koşulda tüm araştırmacılara en erişilebilir değil;ne de her zaman önemlidir - ilgi metaller sıkı düzeltilebilir makromoleküllerin bağlı ve numune yansıması olacak hangi çözünürlük kurutma sırasında meydana gelebilecek ultra mikro hasar büyükse eğer. Uyarılar 24 Dikkatli, kimyasal tespiti ve kurutma uygun bir seçim olabilir. Başarılı bir X-ışını fluoresans görüntüsü elde deneyde diğer faktörler uygun analiz içerir. X-ışını floresans görüntüleme temelde uzaysal çözünürlüğü sağlamak için raster tarama ile birlikte X-ışını floresans emisyon spektroskopisi olduğunu. Toplanan X-ışını floresans emisyon spektrumları emisyon zirveleri, arka plan, ve olay kirişin elastik ve inelastik saçılma doruklarına örtüşen bir kombinasyonunu içerir. Bu katkıların de-büklüm, ve emisyon doruklarına montajını sağlayan yazılım, bu alanda 25 kritik gelişme olmuştur. Ayrıca, geliştirme ve ticari distMalzeme miktar floresan yoğunluğu göreceli kalibre etmek için kullanılır bilinen kompozisyon, ince film standartlarının ribution, aynı zamanda çok önemli olmuştur. Bu protokol, kimyasal sabitleme ve hava kurutma ile yapışan hücrelerin hazırlanması için bir tanımını sağlar. Bu süreçte hayati bir adım genellikle başarı için belirli bir moda anahtarı nazik durulama yaparak, iyi uymayan silisyum nitrür windows hücrelerin büyüme.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="924">
	<tbody>
		<tr height="231">
			<td height="231" style="height:231px;width:216px;">silicon nitride windows</td>
			<td style="width:423px;">Silson Ltd/J B J Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, United Kingdom</td>
			<td style="width:119px;">No part numbers available. Order by size. Membrane size: 1.5 mm x 1.5 mm.&#160; Thickness 500 nm.&#160; Frame size: 5 mm x 5 mm.&#160; Frame thickness: 200 &#181;m</td>
			<td style="width:167px;">Alternate source: SPI Supplies / Structure Probe, Inc.West Chester, PA</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">reverse tweezers</td>
			<td style="width:423px;">Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450</td>
			<td style="width:119px;">78520-5X</td>
			<td style="width:167px;">EMS 5X, NC &#8211; Ultra Fine Tweezers</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">rubber grid mat</td>
			<td style="width:423px;">Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450</td>
			<td style="width:119px;">71170</td>
			<td style="width:167px;">Round Grid Mat</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">acetic acid</td>
			<td style="width:423px;">Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052</td>
			<td style="width:119px;">338826</td>
			<td style="width:167px;">trace metals grade concentrated acetic acid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PIPES buffer</td>
			<td style="width:423px;">Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052</td>
			<td style="width:119px;">P6757</td>
			<td style="width:167px;">solid PIPES buffer</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">formaldehyde stock solution</td>
			<td style="width:423px;">Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450</td>
			<td style="width:119px;">RT 17113</td>
			<td style="width:167px;">10 x 10mL ampules of 20% aqueous paraformaldehyde</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparing adherent cells for x-ray fluorescence imaging by chemical fixation

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over large or small sample areas. It has been applied in many areas of science, including materials science, geoscience, studying works of cultural heritage, and in chemical biology. In the case of chemical biology, for example, visualizing the metal distributions within cells allows us to study both naturally-occurring metal ions in the cells, as well as exogenously-introduced metals such as drugs and nanoparticles. Due to the fully hydrated nature of nearly all biological samples, cryo-fixation followed by imaging under cryogenic temperature represents the ideal imaging modality currently available. However, under the circumstances that such a combination is not easily accessible or practical, aldehyde based chemical fixation remains useful and sometimes inevitable. This article describes in as much detail as possible in the preparation of adherent mammalian cells by chemical fixation for X-ray fluorescent imaging.

Biyolojik örnekler hakkında bilgi temin etmek üzere X-ışını floresans görüntüleme yeteneği, bu örnekler, deney süresi ölçeğinde radyasyona karşı sağlam bir şekilde hazırlanmaktadır edilmesine bağlıdır ve yine kimyasal ve yapısal özellikleri iyi olan korunmuş. Tespit hücrenin bu yönleri, (Şekil 1) korunmuş olduğunu gösteren - yukarıda tarif edildiği gibi hazırlanmış ve görüntülenmiştir olan bir numune sonucu görüntüleme olarak, bu elemanlar varyasyon olduğun...

Watch this Scientific Journal Video about Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation at JoVE.com

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays.

Kimyasal Fiksasyon X-ışını Floresans Görüntüleme Değme Hücreleri hazırlanması

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

preparing-adherent-cells-for-x-ray-fluorescence-imaging-chemical

Research

JoVE Journal

Chemistry

9.3K Görüntüleme.  Argonne National Laboratory. Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays. 

Video: Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

A Simple and Rapid Protocol for Measuring Neutral Lipids in Algal Cells Using Fluorescence

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal fermentation processes and screening for new oil-rich strains requires a fast and reliable protocol for determination of intracellular lipid content. Current practices rely largely on gravimetric methods to determine oil content, techniques developed decades ago that are time consuming and require large sample volumes. In this paper, Nile Red, a fluorescent dye that has been used to identify the presence of lipid bodies in numerous types of organisms, is incorporated into a simple, fast, and reliable protocol for measuring the neutral lipid content of Auxenochlorella protothecoides, a green alga. The method uses ethanol, a relatively mild solvent, to permeabilize the cell membrane before staining and a 96 well micro-plate to increase sample capacity during fluorescence intensity measurements. It has been designed with the specific application of monitoring bioprocess performance. Previously dried samples or live samples from a growing culture can be used in the assay.

A simple protocol to determine the neutral lipid content of algal cells using a Nile Red staining procedure is described. This time-saving technique offers an alternative to traditional gravimetric-based lipid quantification protocols. It has been designed for the specific application of monitoring bioprocess performance.

Floresan kullanma Alg hücrelerinde nötral Lipidler Ölçüm Basit ve Hızlı Protokolü

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal ...

Kimya

X-ray Powder Diffraction in Conservation Science: Towards Routine Crystal Structure Determination of Corrosion Products on Heritage Art Objects

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder diffraction (XRPD) is presented in detail via two case studies.
The first material under investigation was sodium copper formate hydroxide oxide hydrate, Cu4Na4O(HCOO)8(OH)2&#8729;4H2O (sample 1) which forms on soda glass/copper alloy composite historic objects (e.g., enamels) in museum collections, exposed to formaldehyde and formic acid emitted from wooden storage cabinets, adhesives, etc. This degradation phenomenon has recently been characterized as &#34;glass induced metal corrosion&#34;.
For the second case study, thecotrichite, Ca3(CH3COO)3Cl(NO3)2&#8729;6H2O (sample 2), was chosen, which is an efflorescent salt forming needlelike crystallites on tiles and limestone objects which are stored in wooden cabinets and display cases. In this case, the wood acts as source for acetic acid which reacts with soluble chloride and nitrate salts from the artifact or its environment.
The knowledge of the geometrical structure helps conservation science to better understand production and decay reactions and to allow for full quantitative analysis in the frequent case of mixtures.

Modern high resolution X-ray powder diffraction (XRPD) in the laboratory is used as an efficient tool to determine crystal structures of long-known corrosion products on historic objects.

Koruma Bilimi X-ışını Toz Kırınım: Miras Sanat Objects Korozyon Ürünleri Rutin Kristal Yapı Tayini Doğru

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder ...

Quantifying X-Ray Fluorescence Data Using MAPS

The quantification of X-ray fluorescence (XRF) microscopy maps by fitting the raw spectra to a known standard is crucial for evaluating chemical composition and elemental distribution within a material. Synchrotron-based XRF has become an integral characterization technique for a variety of research topics, particularly due to its non-destructive nature and its high sensitivity. Today, synchrotrons can acquire fluorescence data at spatial resolutions well below a micron, allowing for the evaluation of compositional variations at the nanoscale. Through proper quantification, it is then possible to obtain an in-depth, high-resolution understanding of elemental segregation, stoichiometric relationships, and clustering behavior.
This article explains how to use the MAPS fitting software developed by Argonne National Laboratory for the quantification of full 2-D XRF maps. We use as an example results from a Cu(In,Ga)Se2 solar cell, taken at the Advanced Photon Source beamline 2-ID-D at Argonne National Laboratory. We show the standard procedure for fitting raw data, demonstrate how to evaluate the quality of a fit and present the typical outputs generated by the program. In addition, we discuss in this manuscript certain software limitations and offer suggestions for how to further correct the data to be numerically accurate and representative of spatially resolved, elemental concentrations.

Here, we demonstrate the use of the X-ray fluorescence fitting software, MAPS, created by Argonne National Laboratory for the quantification of fluorescence microscopy data. The quantified data that results is useful for understanding the elemental distribution and stoichiometric ratios within a sample of interest.

HARİTALAR kullanarak x-ışını Floresans veri miktarının

The quantification of X-ray fluorescence (XRF) microscopy maps by fitting the raw spectra to a known standard is crucial for evaluating chemical ...

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The devices are patterned from epoxy glue using soft lithography and are suitable for in situ X-ray diffraction experiments at room temperature. The sample wells are lidded on both sides with polymeric polyimide foil windows that allow diffraction data collection with low X-ray background. This fabrication method is undemanding and inexpensive. After the sourcing of a SU-8 master wafer, all fabrication can be completed outside of a cleanroom in a typical research lab environment. The chip design and fabrication protocol utilize capillary valving to microfluidically split an aqueous reaction into defined nanoliter sized droplets. This loading mechanism avoids the sample loss from channel dead-volume and can easily be performed manually without using pumps or other equipment for fluid actuation. We describe how isolated nanoliter sized drops of protein solution can be monitored in situ by dynamic light scattering to control protein crystal nucleation and growth. After suitable crystals are grown, complete X-ray diffraction datasets can be collected using goniometer based in situ fixed target serial X-ray crystallography at room temperature. The protocol provides custom scripts to process diffraction datasets using a suite of software tools to solve and refine the protein crystal structure. This approach avoids the artefacts possibly induced during cryo-preservation or manual crystal handling in conventional crystallography experiments. We present and compare three protein structures that were solved using small crystals with dimensions of approximately 10-20 &#181;m grown in chip. By crystallizing and diffracting in situ, handling and hence mechanical disturbances of fragile crystals is minimized. The protocol details how to fabricate a custom X-ray transparent microfluidic chip suitable for in situ serial crystallography. As almost every crystal can be used for diffraction data collection, these microfluidic chips are a very efficient crystal delivery method.

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

This protocol describes in detail how to fabricate and operate microfluidic devices for X-ray diffraction data collection at room temperature. Additionally, it describes how to monitor protein crystallization by dynamic light scattering and how to process and analyze obtained diffraction data.

Mikrosıvısal çip Situ Crystal x-ışını kırınım ve in Situ dinamik ışık saçılma seri kristalografisi için için

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

Essential Metal Uptake in Gram-negative Bacteria: X-ray Fluorescence, Radioisotopes, and Cell Fractionation

We demonstrate a scalable method for the separation of the bacterial periplasm from the cytoplasm. This method is used to purify periplasmic protein for the purpose of biophysical characterization, and measure substrate transfer between periplasmic and cytoplasmic compartments. By carefully limiting the time that the periplasm is separated from the cytoplasm, the experimenter can extract the protein of interest and assay each compartment individually for substrate without carry-over contamination between compartments. The extracted protein from fractionation can then be further analyzed for three-dimensional structure determination or substrate-binding profiles. Alternatively, this method can be performed after incubation with a radiotracer to determine total percent uptake, as well as distribution of the tracer (and hence metal transport) across different bacterial compartments. Experimentation with a radiotracer can help differentiate between a physiological substrate and artefactual substrate, such as those caused by mismetallation.
X-ray fluorescence can be used to discover the presence or absence of metal incorporation in a sample, as well as measure changes that may occur in metal incorporation as a product of growth conditions, purification conditions, and/or crystallization conditions. X-ray fluorescence also provides a relative measure of abundance for each metal, which can be used to determine the best metal energy absorption peak to use for anomalous X-ray scattering data collection. Radiometal uptake can be used as a method to validate the physiological nature of a substrate detected by X-ray fluorescence, as well as support the discovery of novel substrates.

A protocol for the extraction of a periplasmic transition metal chaperone in the context of its native binding partners, and biophysical characterization of its substrate contents by X-ray fluorescence and radiometal uptake is presented.

Ayagin Gram-negatif bakterilerde temel Metal alımı: x-ışını Floresans, Radioisotopes ve hücre ayırma

We demonstrate a scalable method for the separation of the bacterial periplasm from the cytoplasm. This method is used to purify periplasmic protein for ...

Elemental-sensitive Detection of the Chemistry in Batteries through Soft X-ray Absorption Spectroscopy and Resonant Inelastic X-ray Scattering

Energy storage has become more and more a limiting factor of today's sustainable energy applications, including electric vehicles and green electric grid based on volatile solar and wind sources. The pressing demand of developing high-performance electrochemical energy storage solutions, i.e., batteries, relies on both fundamental understanding and practical developments from both the academy and industry. The formidable challenge of developing successful battery technology stems from the different requirements for different energy-storage applications. Energy density, power, stability, safety, and cost parameters all have to be balanced in batteries to meet the requirements of different applications. Therefore, multiple battery technologies based on different materials and mechanisms need to be developed and optimized. Incisive tools that could directly probe the chemical reactions in various battery materials are becoming critical to advance the field beyond its conventional trial-and-error approach. Here, we present detailed protocols for soft X-ray absorption spectroscopy (sXAS), soft X-ray emission spectroscopy (sXES), and resonant inelastic X-ray scattering (RIXS) experiments, which are inherently elemental-sensitive probes of the transition-metal 3d and anion 2p states in battery compounds. We provide the details on the experimental techniques and demonstrations revealing the key chemical states in battery materials through these soft X-ray spectroscopy techniques.

Here, we present a protocol for typical experiments of soft X-ray absorption spectroscopy (sXAS) and resonant inelastic X-ray scattering (RIXS) with applications in battery material studies.

Pil ile yumuşak x-ışını soğurma spektroskopisi ve rezonans esnek olmayan x-ışını saçılması kimyada Elemental duyarlı tespiti

Energy storage has become more and more a limiting factor of today's sustainable energy applications, including electric vehicles and green electric grid ...

Analysis of Minerals Produced by hFOB 1.19 and Saos-2 Cells Using Transmission Electron Microscopy with Energy Dispersive X-ray Microanalysis

This video presents the use of transmission electron microscopy with energy dispersive X-ray microanalysis (TEM-EDX) to compare the state of minerals in vesicles released by two human bone cell lines: hFOB 1.19 and Saos-2. These cell lines, after treatment with ascorbic acid (AA) and &#946;-glycerophosphate (&#946;-GP), undergo complete osteogenic transdifferentiation from proliferation to mineralization and produce matrix vesicles (MVs) that trigger apatite nucleation in the extracellular matrix (ECM).
Based on Alizarin Red-S (AR-S) staining and analysis of the composition of minerals in cell lysates using ultraviolet (UV) light or in vesicles using TEM imaging followed by EDX quantitation and ion mapping, we can infer that osteosarcoma Saos-2 and osteoblastic hFOB 1.19 cells reveal distinct mineralization profiles. Saos-2 cells mineralize more efficiently than hFOB 1.19 cells and produce larger mineral deposits that are not visible under UV light but are similar to hydroxyapatite (HA) in that they have more Ca and F substitutions.
The results obtained using these techniques allow us to conclude that the process of mineralization differs depending on the cell type. We propose that, at the cellular level, the origin and properties of vesicles predetermine the type of minerals.

We present a protocol to compare the state of minerals in vesicles released by two human bone cell lines: hFOB 1.19 and Saos-2. Their mineralization profiles were analyzed by Alizarin Red-S (AR-S) staining, ultraviolet (UV) light visualization, transmission electron microscopy (TEM) imaging and energy dispersive X-ray microanalysis (EDX).

Mineraller hFOB 1.19 tarafından üretilen ve SAO'lar-2 hücreleri kullanarak transmisyon elektron mikroskobu ile enerji dağıtıcı x-ışını Microanalysis Analizi

This video presents the use of transmission electron microscopy with energy dispersive X-ray microanalysis (TEM-EDX) to compare the state of minerals in ...

Ligand-Mediated Nucleation and Growth of Palladium Metal Nanoparticles

The size, size distribution and stability of colloidal nanoparticles are greatly affected by the presence of capping ligands. Despite the key contribution of capping ligands during the synthesis reaction, their role in regulating the nucleation and growth rates of colloidal nanoparticles is not well understood. In this work, we demonstrate a mechanistic investigation of the role of trioctylphosphine (TOP) in Pd nanoparticles in different solvents (toluene and pyridine) using in situ SAXS and ligand-based kinetic modeling. Our results under different synthetic conditions reveal the overlap of nucleation and growth of Pd nanoparticles during the reaction, which contradicts the LaMer-type nucleation and growth model. The model accounts for the kinetics of Pd-TOP binding for both, the precursor and the particle surface, which is essential to capture the size evolution as well as the concentration of particles in situ. In addition, we illustrate the predictive power of our ligand-based model through designing the synthetic conditions to obtain nanoparticles with desired sizes. The proposed methodology can be applied to other synthesis systems and therefore serves as an effective strategy for predictive synthesis of colloidal nanoparticles.

The main goal of this work is to elucidate the role of capping agents in regulating the size of palladium nanoparticles by combining in situ small angle x-ray scattering (SAXS) and ligand-based kinetic modeling.

Çekirdekleşme ligand-aracılı ve Paladyum Metal nano tanecikleri gelişmesi

The size, size distribution and stability of colloidal nanoparticles are greatly affected by the presence of capping ligands. Despite the key contribution ...

Improving High Viscosity Extrusion of Microcrystals for Time-resolved Serial Femtosecond Crystallography at X-ray Lasers

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray free electron lasers (XFELs). A series of experiments using the light-driven proton pump bacteriorhodopsin have further established these injectors as a preferred option to deliver crystals for time-resolved serial femtosecond crystallography (TR-SFX) to resolve structural changes of proteins after photoactivation. To obtain multiple structural snapshots of high quality, it is essential to collect large amounts of data and ensure clearance of crystals between every pump laser pulse. Here, we describe in detail how we optimized the extrusion of bacteriorhodopsin microcrystals for our recent TR-SFX experiments at the Linac Coherent Light Source (LCLS). The goal of the method is to optimize extrusion for a stable and continuous flow while maintaining a high density of crystals to increase the rate at which data can be collected in a TR-SFX experiment. We achieve this goal by preparing lipidic cubic phase with a homogenous distribution of crystals using a novel three-way syringe coupling device followed by adjusting the sample composition based on measurements of the extrusion stability taken with a high-speed camera setup. The methodology can be adapted to optimize the flow of other microcrystals. The setup will be available for users of the new Swiss Free Electron Laser facility.

The success of a time-resolved serial femtosecond crystallography experiment is dependent on efficient sample delivery. Here, we describe protocols to optimize the extrusion of bacteriorhodopsin microcrystals from a high viscosity micro-extrusion injector. The methodology relies on sample homogenization with a novel three-way coupler and visualization with a high-speed camera.

Microcrystals yüksek viskozite ekstrüzyon için zaman karar vermek seri halinde Femtosecond kristalografisi x-ışını lazerleri iyileştirilmesi

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray ...

Biological Samples Preparation for Speciation at Cryogenic Temperature using High-Resolution  X-Ray Absorption Spectroscopy

The study of elements with X-ray absorption spectroscopy (XAS) is of particular interest when studying the role of metals in biological systems. Sample preparation is a key and often complex procedure, particularly for biological samples. Although X-ray speciation techniques are widely used, no detailed protocol has been yet disseminated for users of the technique. Further, chemical state modification is of concern, and cryo-based techniques are recommended to analyze the biological samples in their near-native hydrated state to provide the maximum preservation of chemical integrity of the cells or tissues. Here, we propose a cellular preparation protocol based on cryo-preserved samples. It is demonstrated in a high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy study of selenium in cancer cells and a study of iron in phytoplankton. This protocol can be used with other biological samples and other X-ray techniques that can be damaged by irradiation.

This protocol presents a detailed procedure to prepare biological cryosamples for synchrotron-based X-ray absorption spectroscopy experiments. We describe all the steps required to optimize sample preparation and cryopreservation with examples of the protocol with cancer and phytoplankton cells. This method provides a universal standard of sample cryo-preparation.

Yüksek Çözünürlüklü X-Işını Absorpsiyon Spektroskopisi Kullanılarak Kriyojenik Sıcaklıkta Türleşme için Biyolojik Numunelerin Hazırlanması

The study of elements with X-ray absorption spectroscopy (XAS) is of particular interest when studying the role of metals in biological systems. Sample ...