Name: preparing adherent cells for x-ray fluorescence imaging by chemical fixation
Uploaded: 2015-03-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation at JoVE.com

The authors acknowledge Stefan Vogt for his assistance in the fitting of the representative data shown in this paper, and helpful discussions. The authors also acknowledge Chris Jacobsen for his support to Q. J. 
Use of the Advanced Photon Source, beamlines 2-ID-E and 8-BM-B, at Argonne National Laboratory was supported by the U. S. Department of Energy, Office of Science, Office of Basic Energy Sciences, under Contract No. DE-AC02-06CH11357.

Göstergeler, Materyalden, Kültür Medya ve Yemekleri 1. Hazırlık <ol><li> Silikon nitrür (Si 3 N 4) pencere Taşıma. <ol><li> Öte yandan, kapsül diğer ucunu dönerken, hafif, pencerenin kendisinin sıkmak üzere olan bir şekilde bir pencere ihtiva eden bir ucu sıkarak kapsül açın. </li><li> Ters bir çift kontrol, stereomicroscope altında ince uçlu cımbız ucunda hiçbir yapıştırıcı, boşluklar veya virajlı olmadığından emin olmak için. Aksi takdirde, pencere cımbız ile kırık veya sonraki adımları sırasında onları uçtuğunu olabilir. </li><li> Yavaşça pencerenin kenarları çıkıp gereken yere kapsül geniş yapmak amacıyla bir yönde basınç uygulayarak açık uca yakın kapsülü sıkarken, dikkatle cımbız ile pencerenin çerçevesini tutarak kapsülden pencereyi çıkarın. </li></ol></li><li> Pencere ön yıkama (opsiyonel). <ol><li> Hafifçe batırarak, ön yıkama pencere Eğer istenirse% 70 etanol içinde 2 dakika yıkama ve% 100 etanol içinde 2 dakika yıkama ve ardından 5 saniye için damıtılmış su içine. </li></ol></li><li> Iliştirilmesi ve kültür çanak pencereleri sterilize. <ol><li> Pencereleri tutturmak için, kültür çanak altındaki düz tarafı yukarı pencereyi ayarlamak, temiz bir cam slayt bir parça bant koyun. Bandın uzun kenarı aşağı çeyrek inç şerit kapalı yaklaşık kesin. Temiz bir jilet ile (&quot;¾ tarafından&quot; ⅛ at) kısa tarafı kapalı bant bir dilim alın. </li><li> Izgara veya pencerenin kenarına bant dilim uygulamak için cımbız kullanın. Güvenli pencere açıklığı kendisini kapsayan olmadan uymak için yeterli kullanın. Cımbız ile yapıştırılır bant kurgulama, kültür çanak alt üzerine aşağı pencere ayarlayın. Sıkıca kültür çanak alt bandı yapıştırmak için cımbız ucu kullanın. </li><li> Diğer kenarına başka bir teyp şeridi uygulayın ve sıkıca cımbız ucuyla altına bu uygun. </li><li> Bir kez tüm pencereleri vardırbantlanmış, ultraviyole (UV) radyasyon ile kültür yemekleri pencereleri sterilize. Yaklaşık 1 saat boyunca bir laminar akış başlığı içinde UV lambası altında çanak yerleştirerek başarmak. </li><li> Pencere, poli-lisin ile önceden kaplanmış edilecek (İsteğe bağlı), yani pencere Sterilizasyondan sonra yoktur. Kaplama, daha sonra 10 37 ° C kuluçka makinesi içinde, 1 saat boyunca steril% 0.01 Poli-L-lisin çözeltisinin ul ve pencere kültür ortamı ile geri kalan çözelti ile durulama. </li></ol></li><li> XFM önce son yıkama için tamponlar hazırlayın. <ol><li> Tris-glükoz ya da piperazin-N ya da hazırlama N-bis (etansülfonik asit) (BORU), kalsiyum ve magnezyum içermeyen Dulbecco fosfat tampon tuzlu suyla (D-PBS) ile osmolalite ve pH eşdeğer olan herhangi bir eser metallerin serbest tampon -sucrose. Hücreler kimyasal sabit sonra hücrelerin durulama için bu tamponlar birini kullanın. <ol><li> Tris-glükoz çözeltisi (10 mM Tris, 260 mM glukoz, 9 mM asetik asit) yapmak glukoz 1.4 g Tris baz, 36 mg eklemek veUltra-saf su, 20 ml asetik asit ve 16 ul. Daha sonra, aşırı saf su ile 30 ml nihai hacim ayarlayın. Hiçbir pH ayarlaması gereklidir. Bir haftaya kadar oda sıcaklığında saklayın. </li><li> BORULARI sakaroz (20mM PIPES, 200 mM sükroz) BORU 0.18 g ve ultra saf su 20 ml sükroz 2.0 g&#39;ı eklenmekte ve konsantre asetik asit ve küçük miktarlarda pH&#39;ı 7.4&#39;e ayarlayın yapmak. Daha sonra, aşırı saf su ile 30 ml nihai hacim ayarlayın. Bir haftaya kadar oda sıcaklığında saklayın. Not: son durulama PBS kullanarak engellemek için bir neden PBS fosfat, klorür ve potasyum konsantrasyonları tamamen hava ile kurutma işleminden önce çıkarılması değilse bu XFM engelleyebilir kadar yüksek olmasıdır. </li></ol></li></ol></li><li> Hücre kaplama için tampon hazırlayın. <ol><li> Hazırlama veya RPMI ortamı 1640 gibi tüm medya, çıkarma, 1x tripsin-EDTA çözeltisi, D-PBS, ve normal olarak yapışmış olan hücrelerin O pasaj için yapıldığı gibi, özellikle yapışkan hücre hattı için gereken başka herhangi bir reaktiff faiz ve 37 ° C onları sıcak. </li></ol></li></ol> Hücreler 2. Kaplama <ol><li> Laminar akış başlığı içinde pencere ihtiva eden sterilize edilmiş kültür kabı için, hafifçe eğimli bir zeminde onunla kültür çanak tarafındaki, ortam (100 mm kültür çanağı için 10 mi) ilave edin. Gereksiz yüzey gerilimini oluşturma veya silisyum nitrür pencere yüzeyine doğrudan medya bırakarak kaçının. Medya ilave olarak, yavaş yavaş kaplamak eğim açısı medya ile ızgara ve pencere rahatlatmak. </li><li> Trypsinizing veya hücre hattı pasaj için her zamanki gibi plakalar kapalı hücreler kazıma, uygun faiz yapışık hücre hattı hazırlayın. Taze plaka hücreleri uygulamadan önce gerekli herhangi bir hücre sayımı, ya da diğer hazırlık yapın. </li><li> Tipik haliyle, 24-72 saat içinde% 50-% 70 izdiham ulaşmak için gerekli olan bir hücre yoğunluğunda pencereli kültür tabağına hücreleri ekleyin ve% 5 karbon dioksit ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li&gt; <li> Istenilen hücre yoğunluğuna kadar (genellikle 50% -70% izdiham) ulaşıldığında, bir ters ışık mikroskobu kullanılarak, zaman zaman hücrelerin büyümesini dikkate alınmalıdır. </li></ol> Hücreler 3. Sabitleme <ol><li> Satın alınan stok (örneğin,% 25 paraformaldehit) seyreltilmesi ve (numuneye aşırı sodyum ilave önlemek için), asetik asit ile 7.4&#39;e pH değerinin ayarlanması ile D-PBS içinde% 4 paraformaldehid, taze hazırlayın. </li><li> Hücreler istediğiniz gibi yetiştirilen ve (örneğin Hoescht gibi) herhangi bir hayati lekeler uygulanmış ve görüntülü edildiğinde, tek elle bir 45 ° açıyla çanak eğerek, nazik aspirasyon ortamı çıkarın ve diğer el pipet ile aspire . NOT: yerine pipet harcanan medya, alternatif, pencere pick up kez D-PBS ile mikrosantrifüj tüpler içine pencere daldırma ve sonra PBS yıkama 2 kat, ardından 20 dakika boyunca sabitleyici çözümleri ile yeni bir kültür kabına onu yerleştirmektir artık fiksatif kaldırmak için. Bu seçilirse, dir gitmekectly 3.5 adıma. </li><li> D-PBS ile hafifçe çanak durulayın ve yemeğin tarafına doğru, 45 ° açıyla pipetlenmesini çanak tutarak yavaşça taze% 4 PFA / PBS ekleyerek, ve yavaş yavaş izin eğim açısını rahatlatıcı hemen kaldırıldı sıvı yerine sabitleştirici çözüm pencereleri kapatmak için. Oda sıcaklığında 20 dakika için sabitleyici ile kaplı hücreler tutun. </li><li> Biraz çanak eğerek ve elle aspire, yukarıdaki gibi yine, nazik aspirasyonu ile sıvı çıkarın. </li><li> Yavaşça, BORU / sakaroz çözeltisi bazı ekleme Adım 3.3 tarif devirme ve pipetleme yöntemi kullanılarak uzaklaştırıldı sıvıyı değiştirin. </li><li> Tekrar 3.4 ve 3.5 adımları. </li><li> Kurutma için malzeme hazırlayın. <ol><li> Böyle Kimwipes gibi tüy bırakmayan havlu toplayın, ve çok hızlı ve kolay kullanışlı böylece kutunun bir out çekin. </li><li> Pencere kurumaya ayarlamak için bir temiz olmayan düz bir yer hazırlayın. Sırtlar yüzden sahip elektron mikroskobu kullanılan türden, bir lastik ızgara hasır Setkuruduktan ise pencere bir ucunda sütyen olabilir. Bu kurudukça kurutma yüzeyine yapışmış getting pencere tutmak, ve numune kenarına kalan tampon drenaj olacaktır. </li></ol></li><li> Dikkatle sıvı pencereden dışarı tutmak için pencereye bağlı bandı tweeze. Ters cımbız ile onları toplayıp sonra onları yüzer almak için BORULARI / sakaroz küçük bir miktar uygulayarak tarafından bant dökülmek pencereleri alın. </li><li> Dikkatle iyice ve (pencere kendisi dokunmadan) bir Kimwipe ile pencerenin kenarından taşan BORULARI / sakaroz sıvamak. Ayrıca Kimwipe bir yuvarlak kat kullanarak arka girintili alan sıvamak. Not: amacı mümkün olduğunca pencere yüzeyinde tuzları veya tamponlar gibi az kristalleşme sahip olmaktır. </li><li> Izgara hasır üzerine pencereyi yerleştirin. Pencere ızgara mat düz yalan değil emin olun, ama (ızgara mat sırtlar kullanarak) ve ızgara gibi küçük dokunmadan bir kenarında sütyenmümkün mat. Pencere kurumasını bekleyin. </li></ol> 4. Numune Montaj ve Görüntüleme <ol><li> Örnek kuruduktan sonra, bir ışık mikroskobu kullanarak windows hücrelerin varlığını doğrulamak. Bir sinkrotron ulaşım için numune hazırlamadan önce, bu doğrulamayı gerçekleştirin. </li><li> Denemenizi barındırma sinkrotron beamline ulaşım için pencereleri paketleyin. Yavaşça, sonra bir cam slayt iki tarafta bant ile yapıştırın pencereler plastik Petri kabı alt bant ile cam slayt yapıştırın. Petri kabı kapalı Teyp. NOT: Bu noktadan önce, bu aşamalar herhangi bir tipik laboratuarda gerçekleştirilebilir. Aşağıdaki adımlar en iyi şekilde bir sinkrotron beamline yapılabilir olacaktır. </li><li> Cımbız ile hafifçe penceresinden bandı çıkarın. Sinkrotronu de beamline işbirlikçileri tarafından sağlanan bir alüminyum sahibine pencereleri güvenli, pencerenin kenarında ince bir hatta kaplamada, oje kullanın. </li><li> Içine alüminyum tutucu yerleştirinkinematik bir montaj ve X-ışını mikroskop konuma yerleştirin. Beamline de örnek odasının içine, motorlu aşamaları bağlayarak bir destek üzerine monte örnek. </li><li> Örnek X-ışını mikroskobu enstrüman alanı (kurşun dolu duvarlar yapılmış bir baraka), kurulum tarama çıktıktan sonra. Bir video çapraz saç ile donatılmış bir kamera kullanarak örnek üzerinde X-ışını konumunu görüntülerken, tarama numunenin uygun alanı seçmek, beamline özel bir yazılım kullanılarak önceden hizalanmış bir alt scintillator kamera ile. </li><li> Çevrede küçük özelliği büyüklüğü bir tahmine dayalı bir numune için uygun çözünürlük, seçin. Tek memeli hücrelerini görüntüleme için (~ boyutu 20-40 mikron), 0,25-0,5 mikron çözünürlük kullanın. Dokuların alanları görüntülenmesi ve birbirinden hücre tabakaları ayırmak için, 2-20 um çözünürlüğü kullanır. </li><li> Araya miktarının bir tahmine dayalı numune için uygun bekleme süresi, SeçinFaiz mevcut ark. Metallerin yüksek miktarlarda varsa hızlı bir bakış tarama için, ya da, piksel başına 30-300 msn bekleme süreleri ile sinek taramaları kullanın. Az malzeme varsa, ya da, düşük bağıl bolluğu metaller ölçmek piksel başına 1-2 sn bekleme süreleri ile adım taramaları kullanmak için. </li><li> Beamline özel yazılım içine taramaları Program. Bir raster tarama görüntü elde. Her element için karakteristik enerji zirveleri tespit edecek yazılımı ile verileri analiz etmek beamline işbirlikçileri ile birlikte çalışın. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

X-ışını floresans görüntüleme yerbilimleri, malzeme bilimi ve kimya biyoloji 26-34 olmak üzere birçok alanda, yararlıdır. Sinkrotron X-ışınları gelişmeler ve onların odaklanarak, çok yüksek yoğunluklu ışınları üretmişlerdir. Odaklı X-ışını mevcut silikon sürüklenme detektörü teknolojisi ile ölçülebilir sinyalinin oluşturulması, şu anda varolan hücreler endojen metallerin uyarmak için yeterli kirişler. Ve hücrede metallerin kimyasal biyoloji okuyan bu alandaki son g...

Floresan Görüntüleme kimlik ve bir numunede bulunan elementlerin nicelik sağlar X-ışını uzaysal çözülmesi. Olay X-ışınları, ilgi konusu ağır elemanının bağlanma enerjisi elektron daha büyük olacak şekilde seçilir, bir enerji, hücre çekirdeğinin 1 iç kabuk elektronların bağlanma enerjisi üstesinden gelir. Bu elektron kabuğu bir &#39;delik&#39; oluşturur. Yüksek enerjili elektronlar bu deliklerin içine düşmek gibi, floresan X-ışınları dalga boyu bu orbitallerinin enerji ayrımı bağlıdır yayılır. Orbital enerji aralığı, belirli bir elemanın karakteristik olduğu için, X-ışını floresans emisyon da aletin göre karakteristik dalga boylarında, yer alır. Mevcut elemanların belirlenmesini sağlar karakteristik dalga boyunda bu emisyon olduğunu. Floresan yoğunluğunun kalibrasyonu bulunan elementlerin kantitatif sağlar. X-ışını flüoresans mikroskopy (XFM) kısmen böyle Bahar-8 Japonya&#39;da, Avrupa Radyasyon Sinkrotron Tesisi Fransa&#39;da (SDBY), ve İleri Foton Kaynağı (olanların çok parlak X-ışını sinkrotron kaynaklarının gelişimine, giderek kullanılan haline gelmiştir ABD&#39;de 2 APS). Bu kaynaklar çok yüksek yoğunluklu X-ışını kirişler sağlamak. Aynı zamanda, böyle bir bölge plaka teknolojisi gibi X-ışını optik gelişmeler, oldukça verimsiz 3 olsa, alt-mikron noktalar bu kirişlerin odaklanarak izin. Çok yüksek yoğunluklu kirişler, mevcut detektör teknoloji ile ölçülebilir hücrelerde endojen metallerin uyarmak için yeterlidir odaklanabilir ışık bile nispeten küçük bir miktarı, üretim sinyali ile. Böylece, hücrenin içindeki metallerin kimyasal biyoloji okuyan bu teknikle 4-10 son gelişmelerin birçoğu kullanan özellikle bir uygulamadır. App sırasında dikkate alınması gereken birçok kritik faktör vardırXFM yatan kültürlenmiş memeli hücreleri veya diğer biyolojik örneklerin temel dağılımı ve miktarının araştırılması. İlk olarak, numune anlamlı olması için ölçme amacıyla, hem yapısal ve elementel kompozisyon bakımından, sağlam tutulması gerekir. Bu odaklanmış bir X-ışını neden olabilir, radyasyona karşı dayanıklı olacak şekilde İkinci olarak, örnek de bir şekilde korunmalıdır. Bir örnek bir seferde bu iki ölçütü karşılayan bir yolu, hızlı bir şekilde camsı, amorf buz 11,12 içine dondurulacaksa. Hızlı dondurma genellikle dalma dondurma ya da yüksek basınçlı 13-16 dondurma gibi çeşitli dondurarak saklama teknikleri ile elde edilir. Genellikle, dondurarak saklama mümkün yerli halde yakın olarak biyolojik numunelerde toplam hücresel bir yapıya ve kimyasal bileşimleri muhafaza ettiği kabul edilmektedir. Hücrelere ve dokulara fiksatif yavaş ve seçici penetrasyon nedeniyle diğer taraftan Kimyasal sabitleme, well membran geçirgenliği olarak sonradan yapılacak değişiklikler, çeşitli hücresel iyonları özellikle Cl, Ca ve K gibi yayılabilir iyonlar böylece 17-19 suboptimaldir bu unsurların soruşturma render, süzülür kayıp ya da taşındı izin verebilir. Özellikle yapışık memeli hücrelerinde genel olarak kimyasal sabitleme, üzerinde cryo-tespitin net avantajına rağmen, Kriyoprezervasyonun çeşitli sınırlamalar 20-23 sahiptir. En belirgin değil, her araştırma laboratuvarı dondurarak saklama araçlarına kolay erişim olmasıdır. Hatta En güncel yüksek basınç dondurucular veya dondurucular sadece kadar hücreler kuluçkaya yerden olabilir cryo tesisleri bir alt tarafından pahalı ve sahip olduğu vardır dalma. kryoprezervasyon yararı hücreleri üzerinde yerleştirilen seyahat stres dezavantajı işlem olabilir. Dondurulması kesinlikle X-ışını floresans analizi için numune korumak için en titiz şekilde Böylece, bu kesinlikle her koşulda tüm araştırmacılara en erişilebilir değil;ne de her zaman önemlidir - ilgi metaller sıkı düzeltilebilir makromoleküllerin bağlı ve numune yansıması olacak hangi çözünürlük kurutma sırasında meydana gelebilecek ultra mikro hasar büyükse eğer. Uyarılar 24 Dikkatli, kimyasal tespiti ve kurutma uygun bir seçim olabilir. Başarılı bir X-ışını fluoresans görüntüsü elde deneyde diğer faktörler uygun analiz içerir. X-ışını floresans görüntüleme temelde uzaysal çözünürlüğü sağlamak için raster tarama ile birlikte X-ışını floresans emisyon spektroskopisi olduğunu. Toplanan X-ışını floresans emisyon spektrumları emisyon zirveleri, arka plan, ve olay kirişin elastik ve inelastik saçılma doruklarına örtüşen bir kombinasyonunu içerir. Bu katkıların de-büklüm, ve emisyon doruklarına montajını sağlayan yazılım, bu alanda 25 kritik gelişme olmuştur. Ayrıca, geliştirme ve ticari distMalzeme miktar floresan yoğunluğu göreceli kalibre etmek için kullanılır bilinen kompozisyon, ince film standartlarının ribution, aynı zamanda çok önemli olmuştur. Bu protokol, kimyasal sabitleme ve hava kurutma ile yapışan hücrelerin hazırlanması için bir tanımını sağlar. Bu süreçte hayati bir adım genellikle başarı için belirli bir moda anahtarı nazik durulama yaparak, iyi uymayan silisyum nitrür windows hücrelerin büyüme.

<table><tbody><tr><td>Silicon nitride windows</td><td>Silson Ltd/J B J Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, United Kingdom</td><td>SiRN-5.0-200-2.0-200. Order by size. Membrane size: 1.5 mm x 1.5 mm. Thickness: 200&amp;nbsp;nm. Frame size: 5&amp;nbsp;mm x 5 mm. Frame thickness: 200 &amp;micro;m.</td><td>Alternate source: SPI Supplies / Structure Probe, Inc. West Chester, PA.</td></tr><tr><td>Reverse tweezers</td><td>Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450</td><td>78520-5X</td><td>EMS 5X, NC &amp;ndash; Ultra Fine Tweezers</td></tr><tr><td>Rubber grid mat</td><td>Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450</td><td>71170</td><td>Round Grid Mat</td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052</td><td>338826</td><td>trace metals grade concentrated acetic acid</td></tr><tr><td>PIPES buffer</td><td>Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052</td><td>P6757</td><td>solid PIPES buffer</td></tr><tr><td>Formaldehyde stock solution</td><td>Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450</td><td>RT 17113</td><td>10 x 10 ml ampules of 20% aqueous paraformaldehyde</td></tr></tbody></table>

preparing adherent cells for x-ray fluorescence imaging by chemical fixation

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over large or small sample areas. It has been applied in many areas of science, including materials science, geoscience, studying works of cultural heritage, and in chemical biology. In the case of chemical biology, for example, visualizing the metal distributions within cells allows us to study both naturally-occurring metal ions in the cells, as well as exogenously-introduced metals such as drugs and nanoparticles. Due to the fully hydrated nature of nearly all biological samples, cryo-fixation followed by imaging under cryogenic temperature represents the ideal imaging modality currently available. However, under the circumstances that such a combination is not easily accessible or practical, aldehyde based chemical fixation remains useful and sometimes inevitable. This article describes in as much detail as possible in the preparation of adherent mammalian cells by chemical fixation for X-ray fluorescent imaging.

Biyolojik örnekler hakkında bilgi temin etmek üzere X-ışını floresans görüntüleme yeteneği, bu örnekler, deney süresi ölçeğinde radyasyona karşı sağlam bir şekilde hazırlanmaktadır edilmesine bağlıdır ve yine kimyasal ve yapısal özellikleri iyi olan korunmuş. Tespit hücrenin bu yönleri, (Şekil 1) korunmuş olduğunu gösteren - yukarıda tarif edildiği gibi hazırlanmış ve görüntülenmiştir olan bir numune sonucu görüntüleme olarak, bu elemanlar varyasyon olduğun...

Watch this Scientific Journal Video about Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation at JoVE.com

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays.

Kimyasal Fiksasyon X-ışını Floresans Görüntüleme Değme Hücreleri hazırlanması

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

preparing-adherent-cells-for-x-ray-fluorescence-imaging-chemical

Research

JoVE Journal

Chemistry

9.3K Görüntüleme.  Argonne National Laboratory. Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays. 

Video: Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

Micro-analytical techniques based on chemical element imaging enable the localization and quantification of chemical composition at the cellular level. They offer new possibilities for the characterization of living systems and are particularly appropriate for detecting, localizing and quantifying the presence of metal oxide nanoparticles both in biological specimens and the environment. Indeed, these techniques all meet relevant requirements in terms of (i) sensitivity (from 1 up to 10 &#181;g.g-1 of dry mass), (ii) micrometer range spatial resolution, and (iii) multi-element detection. Given these characteristics, microbeam chemical element imaging can powerfully complement routine imaging techniques such as optical and fluorescence microscopy. This protocol describes how to perform a nuclear microprobe analysis on cultured cells (U2OS) exposed to titanium dioxide nanoparticles. Cells must grow on and be exposed directly in a specially designed sample holder used on the optical microscope and in the nuclear microprobe analysis stages. Plunge-freeze cryogenic fixation of the samples preserves both the cellular organization and the chemical element distribution. Simultaneous nuclear microprobe analysis (scanning transmission ion microscopy, Rutherford backscattering spectrometry and particle induced X-ray emission) performed on the sample provides information about the cellular density, the local distribution of the chemical elements, as well as the cellular content of nanoparticles. There is a growing need for such analytical tools within biology, especially in the emerging context of Nanotoxicology and Nanomedicine for which our comprehension of the interactions between nanoparticles and biological samples must be deepened. In particular, as nuclear microprobe analysis does not require nanoparticles to be labelled, nanoparticle abundances are quantifiable down to the individual cell level in a cell population, independently of their surface state.

In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

We describe a procedure for the detection of chemical elements present in situ in human cells as well as their in vitro quantification. The method is well-suited to any cell type and is particularly useful for quantitative chemical analyses in single cells following in vitro metal oxide nanoparticles exposure.

Situ Algılama ve Metal Oksit nano tanecikleri nükleer Microprobe analizi ile tek hücre miktar

Micro-analytical techniques based on chemical element imaging enable the localization and quantification of chemical composition at the cellular level. ...

Kimya

Processing Embryo, Eggshell, and Fungal Culture for Scanning Electron Microscopy

Although scanning electron microscopy (SEM) is being widely used for the ultra-structural analysis of various biological and non-biological samples, methods involved in processing different biological samples involve unique practices. All conventional practices described in the literature for processing samples still find useful applications, but subtle changes in the sample preparation can alter image quality, as well as, introduce artifacts. Hence, using a unique sample preparation technique specific to the type of tissue analyzed is required to obtain a good quality image with ultrastructural resolution. The focus of this study is to provide the optimal sample preparation protocols for imaging embryos, rigid eggshells, and fungal cultures using SEM. The following optimizations were recommended to yield good results for the three different delicate biological samples studied. Use of milder fixatives like 4% paraformaldehyde or 3% glutaraldehyde followed by dehydration with ethanol series is mandatory. Fungal mycelium on agar blocks obtained by slide cultures yields a better ultrastructural integrity compared to cultures taken directly from agar plates. Chemical drying of embryos with HMDS provides drying without introducing surface tension artifacts compared to critical point drying. HMDS prevents cracking caused by shrinkage as samples are less brittle during drying. However, for fungal culture, critical point drying provides acceptable image quality compared to chemical drying. Eggshells can be imaged with no special preparation steps except for thorough washing and air drying prior to mounting. Preparation methodologies were standardized based on acceptable image quality obtained with each trial.&#160;

Here, we present detailed processing protocols for imaging delicate tissue samples using scanning electron microscopy (SEM). Three different processing methods, namely, hexamethyl disilazana (HMDS) chemical drying, simple air drying, and critical point drying are described for preparing rigid eggshells, embryos at early developmental stages, and fungal cultures respectively.

Taramalı Elektron Mikroskobu için Embriyo, Yumurta Kabuğu ve Mantar Kültürünün İşlenmesi

Although scanning electron microscopy (SEM) is being widely used for the ultra-structural analysis of various biological and non-biological samples, ...

Çevre

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions and their disturbed homeostasis is involved in various diseases. State-of-the-art synchrotron X-ray fluorescence nanoprobes provide the required sensitivity and spatial resolution to elucidate the two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) distribution and concentration of metals inside entire cells at the organelle level. This opens new exciting scientific fields of investigation on the role of metals in the physiopathology of the cell. The cellular preparation is a key and often complex procedure, particularly for basic analysis. Although X-ray fluorescence techniques are now widespread and various preparation methods have been used, very few studies have investigated the preservation of the elemental content of cells at best, and no stepwise detailed protocol for the cryopreparation of adherent cells for X-ray fluorescence nanoprobes has been released so far. This is a description of a protocol that provides the stepwise cellular preparation for fast cryofixation to enable synchrotron X-ray fluorescence nano-analysis of cells in a frozen hydrated state when a cryogenic environment and transfer is available. In case nano-analysis has to be performed at room temperature, an additional procedure for freeze-drying the cryofixed adherent cellular preparation is provided. The proposed protocols have been successfully used in previous works, most recently in studying the 2D and 3D intracellular distribution of an organometallic compound in breast cancer cells.

Presented here is a protocol for cell culture on silicon nitride membranes and plunge-freezing prior to X-ray fluorescence imaging with a synchrotron cryogenic X-ray nanoprobe. When only room temperature nano-analysis is provided, the frozen samples can be further freeze-dried. These are critical steps to obtain information on the intracellular elemental composition.

Silikon Nitrür Membranları ve Synchrotron X-ışını Floresan Nano-Analizi için Kriyopreyeüzerine Hücre Kültürü

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

Biyokimya

Simple Polyacrylamide-based Multiwell Stiffness Assay for the Study of Stiffness-dependent Cell Responses

Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a matrix that is elastic and much softer (0.1 &#8211; 100 kPa). Since such stiffness mismatch greatly affects cell responses, there is a strong interest in developing hydrogel materials that span a wide range of stiffness to serve as cell substrates. Polyacrylamide gels, which are inexpensive and cover the stiffness range of all soft tissues in the body, are the hydrogel of choice for many research groups. However, polyacrylamide gel preparation is lengthy, tedious, and only suitable for small batches. Here, we describe an assay which by utilizing a permanent flexible plastic film as a structural support for the gels, enables the preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format. The technique is faster, more efficient, and less costly than current methods and permits the preparation of gels of custom sizes not otherwise available. As it doesn&#8217;t require any specialized equipment, the method could be easily adopted by any research laboratory and would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.

Here, a method that enables quick, efficient, and inexpensive preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format is described. The method does not require any specialized equipment and could be easily adopted by any research laboratory. It would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.

Basit Poliakrilamid-tabanlı Sertlik bağımlı Hücre Yanıtların Çalışmaları multiwell Sertlik Deneyi

Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a ...

Biyomühendislik

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

Hücreleri tarafından seçilmiş adezyon oluşumunda görselleştirme gelişmiş Disk-toplam iç yansıma floresans mikroskobu iplik

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Bioorthogonal Chemical Imaging of Cell Metabolism Regulated by Aromatic Amino Acids

Essential aromatic amino acids (AAAs) are building blocks for synthesizing new biomasses in cells and sustaining normal biological functions. For example, an abundant supply of AAAs is important for cancer cells to maintain their rapid growth and division. With this, there is a rising demand for a highly specific, noninvasive imaging approach with minimal sample preparation to directly visualize how cells harness AAAs for their metabolism in situ. Here, we develop an optical imaging platform that combines deuterium oxide (D2O) probing with stimulated Raman scattering (DO-SRS) and integrates DO-SRS with two-photon excitation fluorescence (2PEF) into a single microscope to directly visualize the metabolic activities of HeLa cells under AAA regulation. Collectively, the DO-SRS platform provides high spatial resolution and specificity of newly synthesized proteins and lipids in single HeLa cell units. In addition, the 2PEF modality can detect autofluorescence signals of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and Flavin in a label-free manner. The imaging system described here is compatible with both in vitro and in vivo models, which is flexible for various experiments. The general workflow of this protocol includes cell culture, culture media preparation, cell synchronization, cell fixation, and sample imaging with DO-SRS and 2PEF modalities.

We present a protocol to directly visualize metabolic activities in cells regulated by amino acids using deuterium-oxide (heavy water D2O) probed stimulated Raman scattering (DO-SRS) microscopy, which is integrated with two-photon excitation fluorescence microscopy (2PEF).

Aromatik Amino Asitler Tarafından Düzenlenen Hücre Metabolizmasının Biyoortogonal Kimyasal Görüntülenmesi

Essential aromatic amino acids (AAAs) are building blocks for synthesizing new biomasses in cells and sustaining normal biological functions. For example, ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

Kültür Hücrelerinin retikulum Subdomain&#39;ler Görselleştirme

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Biyoloji

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, offering an unprecedented three-dimensional view of tissue microanatomy. While SBF-SEM has seen an exponential increase in use in recent years, technical aspects such as proper tissue preparation and imaging parameters are paramount for the success of this imaging modality. This imaging system benefits from the automated nature of the device, allowing one to leave the microscope unattended during the imaging process, with the automated collection of hundreds of images possible in a single day. However, without appropriate tissue preparation cellular ultrastructure can be altered in such a way that incorrect or misleading conclusions might be drawn. Additionally, images are generated by scanning the block-face of a resin-embedded biological sample and this often presents challenges and considerations that must be addressed. The accumulation of electrons within the block during imaging, known as "tissue charging," can lead to a loss of contrast and an inability to appreciate cellular structure. Moreover, while increasing electron beam intensity/voltage or decreasing beam-scanning speed can increase image resolution, this can also have the unfortunate side effect of damaging the resin block and distorting subsequent images in the imaging series. Here we present a routine protocol for the preparation of biological tissue samples that preserves cellular ultrastructure and diminishes tissue charging. We also provide imaging considerations for the rapid acquisition of high-quality serial-images with minimal damage to the tissue block.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

This protocol outlines a routine method for using serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM), a powerful 3D imaging technique. Successful application of SBF-SEM hinges on proper fixation and tissue staining techniques, as well as careful consideration of imaging settings. This protocol contains practical considerations for the entirety of this process.

Biyolojik Doku Örneklerinin Seri Blok-Yüz Tarama Elektron Mikroskopisi (SBF-SEM)

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...

A 3D Cartographic Description of the Cell by Cryo Soft X-ray Tomography

Imaging techniques are fundamental in order to understand cell organization and machinery in biological research and the related fields. Among these techniques, cryo soft X-ray tomography (SXT) allows imaging whole cryo-preserved cells in the water window X-ray energy range (284-543 eV), in which carbon structures have intrinsically higher absorption than water, allowing the 3D reconstruction of the linear absorption coefficient of the material contained in each voxel. Quantitative structural information at the level of whole cells up to 10 &#181;m thick is then achievable this way, with high throughput and spatial resolution down to 25-30 nm half-pitch. Cryo-SXT has proven itself relevant to current biomedical research, providing 3D information on cellular infection processes (virus, bacteria, or parasites), morphological changes due to diseases (such as recessive genetic diseases) and helping us understand drug action at the cellular level, or locating specific structures in the 3D cellular environment. In addition, by taking advantage of the tunable wavelength at synchrotron facilities, spectro-microscopy or its 3D counterpart, spectro-tomography, can also be used to image and quantify specific elements in the cell, such as calcium in biomineralization processes. Cryo-SXT provides complementary information to other biological imaging techniques such as electron microscopy, X-ray fluorescence or visible light fluorescence, and is generally used as a partner method for 2D or 3D correlative imaging at cryogenic conditions in order to link function, location, and morphology.

Here, a protocol describing the sample preparation and data collection steps required in cryo soft X-ray tomography (SXT) to image the ultrastructure of whole cryo-preserved cells at a resolution of 25 nm half pitch, is presented.

Cryo Soft X-ray Tomografisi ile Hücrenin 3D Kartografik Açıklaması

Imaging techniques are fundamental in order to understand cell organization and machinery in biological research and the related fields. Among these ...

Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, frozen-hydrated state. However, cryo-ET requires that samples are thin enough to not scatter or block the incident electron beam. For thick cellular samples, this can be achieved by cryo-focused ion beam (FIB) milling. This protocol describes how to target specific cellular sites during FIB milling using a 3D-correlative approach, which combines three-dimensional fluorescence microscopy data with information from the FIB-scanning electron microscope. Using this technique, rare cellular events and structures can be targeted with high accuracy and visualized at molecular resolution using cryo-transmission electron microscopy (cryo-TEM).

Here, we present a pipeline for 3D-correlative focused ion beam milling on guiding the preparation of cellular samples for cryo-electron tomography. The 3D position of fluorescently tagged proteins of interest is first determined by cryo-fluorescence microscopy, and then targeted for milling. The protocol is suitable for mammalian, yeast, and bacterial cells.

Yüksek Çözünürlüklü Kriyo-Elektron Tomografisi için 3D Korbağıntılı Odaklanmış İyon Işını Frezeleme ile Numune Hazırlama

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, ...