Biz teknik yardım için Dr Agnes Viale ve MSKCC Genomik Çekirdek Laboratuvarı teşekkür ederim. Bu protokol Geoffrey Beene Kanser Araştırma Merkezi ve Çiftçi Aile Vakfı desteği ile geliştirilmiştir.

1.. DNA ve Reaktif Hazırlama Not: Bu protokol, 24 numune (örneğin, 12, tümör / normal çifti), eş zamanlı olarak işleme ve analizi tarif etmektedir, ancak daha küçük ve daha büyük kümeler için uyarlanabilir. DNA örnekleri FFPE veya taze dondurulmuş doku, sitolojik örnekler, veya kan kaynaklanıyor olabilir. Tipik olarak, aynı hastadan alınan tümör ve normal doku her iki kalıtsal polimorfizmlerinin somatik mutasyonlar ayırmak için birlikte profilli olacaktır. Protokol hemen DNA ekstraksiyonu takip başlar. <ol><li> Kısım 50-250 ng 1x Tris-EDTA içerisinde seyreltilmiş numune başına edilen DNA, (pH 8.0), ayrı Covaris yuvarlak tabanlı tüp içine, 50 ul&#39;lik nihai bir hacme kadar tampon (250 ng önerilir). </li><li> 10 görev faktörü, 175 PIP, ve patlama başına 200 devirde 360 ​​sn: Aşağıdaki kesme ayarlarında Covaris E220 cihaz üzerinde DNA Kayma. </li><li> Oda sıcaklığına AMPure XP Boncuklar (Tablo 2) çözülme. Tüm met Çözülmeönce uygun aşamasından buz üzerinde ffers ve enzimler. </li></ol> 2. Kütüphane Hazırlık - End Tamir Modülü <ol><li> Örnek başına aşağıdaki miktarlar kullanılarak steril mikrosantrifüj tüpü uç onarım ana karışım hazırlayın: 10x NEBNext End tamir Reaksiyon Tamponu (Tablo 2) 10 ul, 5 ul NEBNext End Enzim Mix (Tablo 2) tamir, 35 ul steril nükleaz free H 2 O. </li><li> 96 oyuklu bir plakanın oyuklarına ayrı ayrı her bir kesilen DNA 50 ul kısım. Her reaksiyona hazırlanan uç onarım ana karışımı 50 ul ekleyin. 20 ° C&#39;de 30 dakika boyunca bir PCR inkübe </li></ol> 3. Mesaj sonu Onarım Temizlik-up <ol><li> Her bir örnek için AMPure XP Boncuk (Tablo 2) 2x hacmi (200 ul) ekleyin ve hafifçe bir çok kanallı pipet kullanarak yukarı ve aşağı 10x tüm hacmi pipetle. 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Manyetik stand (Tablo 2 yerleştirin </numune berrak görünene kadar 15 dakika boyunca oda sıcaklığında)&gt; kuvvetli. </li><li> Hafifçe kaldırın ve boncuk rahatsız etmemek için açık yüzer özen göstererek atın. Bazı sıvı kuyularda kalabilir. </li><li> Standında borular ile, yavaşça, her numune için taze hazırlanmış% 80 etanol içinde 200 ul ekleyin ve 30 saniye boyunca oda sıcaklığında kuluçkalayın. Dikkatle, pipetle etanol çıkarın. </li><li> 2 etanol yıkar, toplam 5. adımı tekrarlayın. Emin, tüm etanol kaldırıldı. Manyetik standından çıkarın ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında kurumaya bırakın. </li><li> 44.5 ul steril H 2 O. ile kurutulmuş boncuk tekrar Yavaşça, pipet tüm hacmi yukarı ve aşağı 10x iyice karıştırma. Emin boncuk artık kuyunun tarafına bağlıdır. </li><li> 2 dakika boyunca oda sıcaklığında süspanse boncuk inkübe edin. Numune berrak görünene kadar 5 dakika boyunca manyetik stand üzerine yerleştirin. </li><li> Yavaşça yeni bir kuyuya örnek içeren berrak süpernatant 42 ul aktarın. Prosedür güvenle bu st durdu olabilirep ve 7 güne kadar -20 ° C&#39;de saklanır örnekleri. , Yeniden başlamadan önce buz üzerinde donmuş örnekleri çözülme. </li></ol> 4. Kütüphane Hazırlık - dA-atık Modülü <ol><li> 10x NEBNext dA-atık Reaksiyon Tamponu (Tablo 2), 3 ul (3&#39;-5 &#39;-ekzo) Klenow Fragment (Tablo 2 5 ul: örnek için, aşağıdaki miktarlar kullanılarak steril mikrosantrifüj tüpü içinde dA-atık ana karışımı hazırlayın .) </li><li> Her iyi son tamir DNA 42 ul içeren için hazırlanan dA-atık ana karışımı 8 ul ekleyin. 37 ° C&#39;de 30 dakika boyunca bir PCR inkübe </li><li> DA-atık bir yayın gerçekleştirmek temizlik: Tekrar 33.75 ul&#39;lik nihai bir hacme kadar steril H2O içinde 2x boncuk hacim (100 ul), fakat tekrar süspansiyon kullanılarak 3,1-3,8 adımları tekrarlayın. Bu işlem güvenli bir şekilde bu aşamada ve 7 güne kadar -20 ° C&#39;de saklanan numunelerde durdurulabilir. , Yeniden devam etmeden önce buz üzerinde donmuş örnekleri çözülme. &lt;/ Li&gt; </ol> 5. Kütüphane Hazırlık - Adaptör ligasyon Modülü <ol><li> 5x NEBNext Quick Ligation Reaksiyon Tamponu (New England Biolabs, Tablo 2), 5 ul T4 DNA ligaz Quick (Tablo 2) 10 ul: örnek için, aşağıdaki miktarlar kullanılarak steril mikrosantrifüj tüpü içinde Ligation ana karışımı hazırlayın. </li><li> Her iyi dA-Kuyruklu DNA içeren için ligasyon ana karışımı 15 ul ekleyin. </li><li> Her bir oyuğa, uygun 25 uM NEXTflex Barkodlanan adaptörü (Tablo 2), 1.25 ul ekleyin. Her örnek ayrı bir barkodlu adaptörü almak gerekir. 20 ° C&#39;de 15 dakika boyunca bir PCR inkübe </li><li> 50 ul bir son hacme kadar steril H2O içinde tekrar boncuk 1x hacmi (50 ul) kullanılarak 3,1-3,8 adımları, ancak tekrar süspansiyon: sonrası bir adaptör ligasyon clean-up yapın. </li><li> Tekrar ikinci bir 1x hacmi (50 ul) temiz-up için 3,1-3,8 adımları, ancak steril H 2 O tekrar süspansiyon23 ul nihai hacim. Bu işlem güvenli bir şekilde bu aşamada ve 7 güne kadar -20 ° C&#39;de saklanan numunelerde durdurulabilir. , Yeniden başlamadan önce buz üzerinde donmuş örnekleri çözülme. </li></ol> 6. Kütüphane Amplifikasyon <ol><li> 25 ul 2x KAPA HiFi HS RM (Tablo 2), 1 ul 100 uM kapsül 1 ve kapsül 2 (Tablo 3) her biri: örnek başına aşağıdaki miktarlar kullanılarak steril mikrosantrifüj tüpü içinde KAPA HiFi ana karışımı hazırlayın. </li><li> Her bir ligasyon ürünü ihtiva etmek için ana karışımı 27 ul ekle. 50 ul pipet seti ve yavaşça yukarı ve aşağı 10x tüm hacmi pipetle. </li><li> Aşağıdaki PCR döngü PCR in yerleştirin: 98 ° C&#39;de 45 saniye ilk denatürasyon, 98 ° C, 60 ° C&#39;de 30 saniye 15 saniye 10 döngü, 30 ° C&#39;de 72 saniye, 1 dakika ve son uzatma 72 ° C&#39;de </li><li> Bir post amplifikasyon temiz-up gerçekleştirin: yineleyin kullanarak 3,1-3,8 adımları1x AMPure XP Boncuk hacmi (50 ul), 30 ul bir son hacme kadar steril su içinde tekrar süspansiyon. </li><li> Üreticinin talimatlarına göre Qubit Broad Range Assay (Life Technologies, Tablo 2) kullanılarak her bir kütüphane konsantrasyonunu ölçmek. </li></ol> 7. Roche NimbleGen SeqCAP EZ Kütüphane Hibridizasyon, Yıkama ve Amplifikasyon <ol><li> Buz üzerinde Çözülme genel ve dizin oligonükleotid blokerleri (Tablo 3), SeqCap EZ Kütüphane ve NimbleGen yakalama parçaları (COT DNA, 2 x hibridizasyon tampon maddesi, ve hibridizasyon bileşen A, Tablo 2). Bütün oligonükleotit bloke 1 mM&#39;lik çalışma stokları saklanır. Bizim SeqCap EZ Kütüphane diğer özel ve katalog tasarımları kullanılabilir olsa, 279 kanser-ilişkili genlerin tümü protein kodlama eksonları kapsayan yakalama probları özel tasarlanmış yüzme havuzu bulunmaktadır. </li><li> Özel barkodlu reklama karşılık endeks oligonükleotid bloker 1 mM havuzu hazırlayınKütüphane hazırlanmasında kullanılan aptor dizileri. 1. Her bloker ul ve vorteks birleştirin. </li><li> Yeni bir steril 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü içinde, 1mg/ml COT DNA 5 ul, 1 mM evrensel bloker 2 ul ve endeks bloker oligonükleotid havuzu 1 mM 2 ul ekle. </li><li> Tek bir reaksiyon içine Pool 24 barkodlu kütüphaneler. Yakalama karışımına (yukarıda hazırlanan) bir araya getirilmiş, barkodlu dizisi kütüphanesi 1-3 ug toplam ekleyin. 24 örnekleri için, örnek başına 100 ng önerilir. Tümör ve karşılık gelen normal örnekleri havuzu, biz bu kapsama daha derin için dizilenmiştir, böylece daha fazla tümör kütüphanesi (tümör ve normal başına 50 ng örneğin 100 ng) eklenmesi tavsiye edilir. </li><li> Tüpün kapağını kapatın ve bir ya da daha küçük 18-20 G iğne ile başlığın üst 15-20 delik açın. Speed ​​Vac yüksek ısıda (60 ° C) üzerinde bir DNA vakum yoğunlaştırıcısında güçlendirilmiş örnek kütüphane / TIK DNA / oligolar. </li><li> Kez tamamen aşağı kurutulmuş, 2x hybridi 7.5 ul rehydratekıymetleştirme tampon ve melezleme bileşen A. 3 ul tüpü şimdi aşağıdaki içermelidir: 5 ug TIK DNA, değişken ug güçlendirilmiş örnek kütüphane, Universal ve Endeks Oligos 1000 pmol, 7.5 ul 2x melezleme tamponu, bir 3 ul melezleme A bileşeni 10.5 ul toplam hacmi. </li><li> Laboratuvar bant küçük bir parça ile kapağı delikleri örtün. Vortex 10 saniye boyunca en yüksek hızda 10 sn için ve santrifüj için örnek. </li><li> Oda sıcaklığında 10 saniye boyunca en yüksek hızda santrifüjleme ve ardından DNA&#39;yı denatüre etmek için 10 dakika boyunca 95 ° C &#39;de örnek inkübe edin. </li><li> Yeni bir 0.2 ml PCR strip tüpünde, SeqCap EZ Kütüphane yakalama prob ve steril nükleaz ücretsiz H 2 O 2.25 ul 2.25 ul kısım hazırlamak ve adım 7.7 içeriğini ekleyin. Yavaşça yukarı ve aşağı 10x tüm hacmi pipetle. </li><li> 48-96 saat boyunca 47 ° C&#39;de bir termal döngüleyici içinde inkübe edin. Ayarlamak ve 57 ° C&#39;ye kadar termal döngü kapağının ısısını korumak </li><li> Folyıkama ve yakalanan DNA kurtarma için NimbleGen SeqCap EX Kütüphanesi SR Kullanım Kılavuzu v3.0 (Tablo 2) Bölüm 6 düşük adımlar. </li><li> Şu değişiklikler ile çekilen DNA&#39;nın amplifikasyonu için Roche NimbleGen protokol Bölüm 7 adımlar takip eder: <ul type="disc"><li> Yerine Phusion Yüksek Sadakat PCR Master Mix 2x KAPA HiFi Polimeraz (Tablo 2) kullanın </li><li> Tablo 3&#39;te listelenen 100 uM kapsül 1 ve kapsül 2 kullanın. </li><li> 30 saniye boyunca 98 ° C de ilk denatürasyon, 10 saniye boyunca 98 ° C 11 döngü, 30 saniye için 60 ° C, 30 saniye için 72 ° C ve 5 dakika boyunca 72 ° C&#39;de son uzatma: Aşağıdaki PCR koşulları çalıştırın . 4 ° C&#39;de tutun </li></ul></li><li> Üreticinin talimatlarına göre Qubit Yüksek Hassasiyet Testi (Tablo 2) kullanılarak amplifiye çekilen DNA&#39;nın konsantrasyonunu ölçmek. </li><li> Agilent Bio kullanarak yakalanan DNA kalitesini analizDNA analiz HS yonga (Tablo 2), üretici talimatlarına göre. <ul type="disc"><li> PCR verimi en az 100 ng (aralık 100-1.000 ng) olmalıdır. </li><li> Ortalama fragman uzunluğu 150-400 baz çifti arasında olmalıdır. </li></ul></li></ol> 8. Illumina Hi-Seq Sıralama <ol><li> 14:00 için büyütülmüş DNA yakalanan seyreltin ve bir Illumina HiSeq 2000 akış hücresinin bir tek şeritli örnek yükleyin. Dizi eşleştirilmiş uç 75 baz çifti, üreticinin talimatlarına uygun olarak okur. Deneyimlerimize göre, tek bir şerit 24 numune üzerinde havuzu için 279 genler arasında, örnek başına 500-700x benzersiz dizi kapsama üretmek için yeterlidir. </li><li> Illumina yazılım (Gerçek Zamanlı Analizi) aramaları ve kalite puanları tabanına küme yoğunlukları yüksek çözünürlüklü görüntüleri dönüştürmek olacaktır. Barkod kimliğe göre veri çoklaması ve her numune için ayrı fastq dosyaları oluşturmak için casava kullanın. </li></ol> 9. Veri AnalYsis <ol><li> Dizisinin 3 &#39;ucundan Trim adaptör dizileri Cutadapt (kullanarak fastq dosyaları okur <a href="http://code.google.com/p/cutadapt/">http://code.google.com/p/cutadapt/</a> ). Minimum örtüşme uzunluğu (= O)% 1 hata oranına (-e) ile 3&#39;tür. Eşleştirilmiş tutulması için asgari taban uzunluğu 25 olan kesme sonra okur. </li><li> Hizalama dizisi Burrows-Wheeler Hizalayıcı aracını (BWA) 12 kullanılarak referans insan genomu hg19 okur. Kendi standart en iyi uygulamalar (göre Genom Analizi Toolkit (GATK) kullanarak işaretleme yinelenen, yerel birden dizisi yeniden düzenlenmesi ve baz kalite puanı kalibrasyon dahil olmak üzere post-processing adımları gerçekleştirin <a href="http://www.broadinstitute.org/gatk/guide/topic?name=best-practices">http://www.broadinstitute.org/gatk/guide/topic? = iyi uygulamaları isim</a> ) 13. , Aynı hastadan alınan çok sayıda örneğin (örn. eşleşen tümör ve normal) profil zaman, lokal çoklu dizi yeniden düzenleme perfor olmalıdırortaklaşa Med. Bu post-processing adımları çıktısı tüm dizisi, kalite ve uyum bilgilerini içerir ve okur ve sıra 14 varyantları görselleştirme için Bütünleştirici Genomics Görüntüleyici (IGV) doğrudan yüklenebilir her numune için ayrı bir BAM dosyadır. </li><li> Picard araçlarını kullanarak dizisi performans ölçümlerini hesaplayın ( <a href="http://picard.sourceforge.net/">http://picard.sourceforge.net/</a> ). Bilgilendirici ölçümleri uyum oranı, fragmanı boyut dağılımı, GC-içerik ilişkili kapsama önyargı, üzerinde hedef yakalama özgünlük, PCR çoğaltmak oranı, kütüphane karmaşıklığı ve hedef kapsama anlamına içerir. Örnek değerleri, Şekil 1 &#39;de gösterilir. GATK ikinci DepthOfCoverage kullanılarak hesaplanmıştır ortak polimorfizm sitelerde alel frekansları olmayan DNA kontaminasyonu izlemek için ve bu eşleştirilmiş numuneler, aynı hastadan gelen sağlamak için kullanılır. Aşağıdaki hesaplama analizler eşleştirilmiş varlığına bağlıdırsomatik genetik değişikliklerin saptanması için, tümör ve normal örnekleri. Eşsiz tümörler, aynı zamanda, ayrı bir normal bir kontrol numunesi kullanılarak analiz edilebilir, ama en çok somatik mutasyonlar kolay kalıtsal sekansı varyantları ayırt edilemez. </li><li> Böyle muTect 15, SomaticSniper 16 veya Strelka 17 gibi bir somatik mutasyon arayan kullanarak her tümör normal çifti için somatik tek nükleotid varyantları (SNVs) diyoruz. Bu düşük (sıfır olmayan) alel normal numunede sayısı sürece allel sıklığı tümörün en az 5x büyük olduğu gibi türevleri ile sağlayan, modifiye edilmiş filtre kriterlere muTect kullanın. Normal tekrarlı DNA&#39;ların bir panel olarak adlandırılan varyantlar sekanslama ya da uyum muhtemel sistematik eşya olarak kaldırılır. Filtreleri geçen her SNV sonra dikkatlice IGV kullanılarak incelenir. </li><li> Böyle SomaticIndelDetector 13, Dindel 18 algoritmalar kullanarak her tümör normal çifti için somatik indels arayın veya SOAPindel 19 </sup&gt;. Biz, aşağıdaki kriterlere göre SomaticIndelDetector kullanın: en az% 10 alel frekansı, en az 3, en az 10 ile destek okur alel frekans okur destek, ya da en az% 2 ile. Bu düşük (sıfır olmayan) alel normal numunede sayısı sürece allel sıklığı tümörün en az 5x büyük olduğu gibi olan indellerin için izin verir. Normal DNA&#39;ların bir panel olarak adlandırılan indellerin yukarıdaki gibi uzaklaştırılır. Filtreleri geçen her indel sonra dikkatlice IGV kullanılarak incelenir. </li><li> Hedef ekzonlarıyla at dizisi kapsama kopya sayısı durumunu tahmin. Her bir örnek için, tüm hedef ekzonlarının, GC yüzdesi üzerinde regresyon için ortalama dizisi kapsama Lös normalleşme gerçekleştirin. Lös uyum çıkarılarak ve örnek çapında medyan kapsama ekleyerek normalleşmemiş kapsama değerlerini ayarlayın. Tümör, normal çiftleri için tüm hedef eksondan genelinde normalize dizisi kapsama oranını hesaplayın. Bir eşleştirilmiş normal numune ve / veya gürültü azaltmak için, diğer cinsiyet eşlemeli diploid yokluğundagerm kopya sayısı varyantlarını eksik normal kontroller kullanılabilir. Kapsama oranı artar veya azalır dayalı somatik kopya sayısı kazanç ve kayıpların belirlenmesi. </li><li> En az bir genomik kesme genomunun bir hedef aralığı içinde veya yakınında düşen kanser genlerin somatik düzenlenmeleri diyoruz. Önerilen algoritmalar GASV 20, Breakdancer 21, CREST 22 ve dRanger 23 içerir. Intrachromosomal inversiyon, silmeler ve tandem duplikasyonlar destek göreli konumu ve oryantasyonu, uyumsuz çift olarak okur göre ayırt edilebilir. Tüm aday düzenlenmeleri elle IGV kullanılarak gözden geçirilmelidir. Biz varsayılan yeniden düzenleme kesme noktaları arasında PCR ve Sanger dizileme tarafından deneysel doğrulama öneririz. </li></ol>

<ol>
	<li>Stratton, M. R., Campbell, P. J., Futreal, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cancer+genome.">The cancer genome.</a> Nature. 458 (7239), 719-724 (2009).</li><li>Meyerson, M., Gabriel, S., Getz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+cancer+genomes+through+second-generation+sequencing.">Advances in understanding cancer genomes through second-generation sequencing.</a> Nat. Rev. Genet. 11 (10), 685-696 (2010).</li><li>Thomas, R. K., Baker, A. C., Debiasi, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+oncogene+mutation+profiling+in+human+cancer.">High-throughput oncogene mutation profiling in human cancer.</a> Nat. Genet. 39 (3), 347-351 (2007).</li><li>Macconaill, L. E., Campbell, C. D., Kehoe, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+critical+cancer+gene+mutations+in+clinical+tumor+samples.">Profiling critical cancer gene mutations in clinical tumor samples.</a> PLoS One. 4 (11), e7887 (2009).</li><li>Dias-Santagata, D., Akhavanfard, S., David, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+targeted+mutational+analysis+of+human+tumours:+a+clinical+platform+to+guide+personalized+cancer+medicine.">Rapid targeted mutational analysis of human tumours: a clinical platform to guide personalized cancer medicine.</a> EMBO Mol. Med. 2 (5), 146-158 (2010).</li><li>Macconaill, L. E., Van Hummelen, P., Meyerson, M., Hahn, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+implementation+of+comprehensive+strategies+to+characterize+cancer+genomes:+opportunities+and+challenges.">Clinical implementation of comprehensive strategies to characterize cancer genomes: opportunities and challenges.</a> Cancer Discov. 1 (4), 297-311 (2011).</li><li>Taylor, B. S., Ladanyi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+cancer+genomics:+how+soon+is+now.">Clinical cancer genomics: how soon is now.</a> J. Pathol. 223 (2), 318-326 (2011).</li><li>Gnirke, A., Melnikov, A., Maguire, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+hybrid+selection+with+ultra-long+oligonucleotides+for+massively+parallel+targeted+sequencing.">Solution hybrid selection with ultra-long oligonucleotides for massively parallel targeted sequencing.</a> Nat. Biotechnol. 27 (2), 182-189 (2009).</li><li>Mamanova, L., Coffey, A. J., Scott, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-enrichment+strategies+for+next-generation+sequencing.">Target-enrichment strategies for next-generation sequencing.</a> Nat. Methods. 7 (2), 111-118 (2010).</li><li>Craig, D. W., Pearson, J. V., Szelinger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genetic+variants+using+bar-coded+multiplexed+sequencing.">Identification of genetic variants using bar-coded multiplexed sequencing.</a> Nat. Methods. 5 (10), 887-893 (2008).</li><li>Wagle, N., Berger, M. F., Davis, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+detection+of+actionable+genomic+alterations+in+clinical+tumor+samples+by+targeted,+massively+parallel+sequencing.">High-throughput detection of actionable genomic alterations in clinical tumor samples by targeted, massively parallel sequencing.</a> Cancer Discov. 2 (1), 82-93 (2012).</li><li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+accurate+short+read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform.">Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).</li><li>Depristo, M. A., Banks, E., Poplin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+framework+for+variation+discovery+and+genotyping+using+next-generation+DNA+sequencing+data.">A framework for variation discovery and genotyping using next-generation DNA sequencing data.</a> Nat. Genet. 43 (5), 491-498 (2011).</li><li>Robinson, J. T., Thorvaldsdottir, H., Winckler, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genomics+viewer.">Integrative genomics viewer.</a> Nat. Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).</li><li>Cibulskis, K., Lawrence, M. S., Carter, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+detection+of+somatic+point+mutations+in+impure+and+heterogeneous+cancer+samples.">Sensitive detection of somatic point mutations in impure and heterogeneous cancer samples.</a> Nat. Biotechnol. 31 (3), 213-219 (2013).</li><li>Larson, D. E., Harris, C. C., Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SomaticSniper:+identification+of+somatic+point+mutations+in+whole+genome+sequencing+data.">SomaticSniper: identification of somatic point mutations in whole genome sequencing data.</a> Bioinformatics. 28 (3), 311-317 (2012).</li><li>Saunders, C. T., Wong, W. S., Swamy, S., Becq, J., Murray, L. J., Cheetham, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strelka:+Accurate+somatic+small-variant+calling+from+sequenced+tumor-normal+sample+pairs.">Strelka: Accurate somatic small-variant calling from sequenced tumor-normal sample pairs.</a> Bioinformatics. 28 (14), 1811-1817 (2012).</li><li>Albers, C. A., Lunter, G., Macarthur, D. G., Mcvean, G., Ouwehand, W. H., Din del Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+indel+calls+from+short-read+data.">Accurate indel calls from short-read data.</a> Genome Res. 21 (6), 961-973 (2011).</li><li>Li, S., Li, R., Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+identification+of+indels+from+short+paired+reads.">Efficient identification of indels from short paired reads.</a> Genome Res. 23 (1), 195-200 (2013).</li><li>Sindi, S., Helman, E., Bashir, A., Raphael, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+geometric+approach+for+classification+and+comparison+of+structural+variants.">A geometric approach for classification and comparison of structural variants.</a> Bioinformatics. 25 (12), 222-230 (2009).</li><li>Chen, K., Wallis, J. W., Mclellan, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BreakDancer:+an+algorithm+for+high-resolution+mapping+of+genomic+structural+variation.">BreakDancer: an algorithm for high-resolution mapping of genomic structural variation.</a> Nat. Methods. 6 (9), 677-681 (2009).</li><li>Wang, J., Mullighan, C. G., Easton, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CREST+maps+somatic+structural+variation+in+cancer+genomes+with+base-pair+resolution.">CREST maps somatic structural variation in cancer genomes with base-pair resolution.</a> Nat. Methods. 8 (8), 652-654 (2011).</li><li>Drier, Y., Lawrence, M. S., Carter, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+rearrangements+across+cancer+reveal+classes+of+samples+with+distinct+patterns+of+DNA+breakage+and+rearrangement-induced+hypermutability.">Somatic rearrangements across cancer reveal classes of samples with distinct patterns of DNA breakage and rearrangement-induced hypermutability.</a> Genome Res. 23 (2), 228-235 (2012).</li><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat. Rev. Genet. 10 (1), 57-63 (2009).</li><li>Roychowdhury, S., Iyer, M. K., Robinson, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+oncology+through+integrative+high-throughput+sequencing:+a+pilot+study.">Personalized oncology through integrative high-throughput sequencing: a pilot study.</a> Sci. Transl. Med. 3 (111), 111ra121 (2011).</li><li>Kerick, M., Isau, M., Timmermann, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+high+throughput+sequencing+in+clinical+cancer+settings:+formaldehyde+fixed-paraffin+embedded+(FFPE)+tumor+tissues,+input+amount+and+tumor+heterogeneity.">Targeted high throughput sequencing in clinical cancer settings: formaldehyde fixed-paraffin embedded (FFPE) tumor tissues, input amount and tumor heterogeneity.</a> BMC Med. Genomics. 4, 68 (2011).</li></ol>

Dr Berger Vakfı Tıp, kanser teşhis şirketten danışmanlık ücretleri ve araştırma fonu aldı.

Bizim ETKİ tahlil yüksek uyum oranı, yüksek on-hedef oranı, yüksek hedef kapsama alanı ve algılama mutasyonlar, indellerin ve numara değişiklikleri kopyalamak için yüksek duyarlılık üretir. Biz taze dondurulmuş hem dizisi DNA&#39;ya bizim ETKİ tahlil yeteneği gösterdi ve düşük DNA girdi FFPE örnekleri arşiv var. Anahtar kanserle ilişkili genlerin hedef sıralama yapılarak ekson, bir böylece alçak frekans mutasyonları tespit etmek için yeteneğini maksimize bu en önemli genin ekson dizisi i...

Anahtar onkogenler ve tümör baskılayıcı genler &quot;sürücü&quot; tümör genetik olayların tanımlanması birçok kanser 1&#39;in tanı ve tedavisinde önemli bir rol oynar. Kitlesel paralel &quot;yeni nesil&quot; sıralamasını kullanan büyük ölçekli araştırma çabaları son yıllarda 2 gibi pek çok kanser ilişkili genlerin belirlenmesini sağlamıştır. Bununla birlikte, bu dizilim, genellikle bu nedenle bu tür platformlar (FFPE) tümör örnekleri gömülü formalinle sabitlenmiş parafin gibi korunmuş dokulardan DNA mutasyonlarının karakterize ve analiz önemli bir sınırlama poz dondurulmuş dokulardan izole DNA büyük miktarlarda gerektirir. Verimli ve güvenilir FFPE tümör örneklerinden &quot;eyleme&quot; genomik bilgilerini karakterize etmek için geliştirilmiş çabalar önceden saklanmış örneklerin retrospektif analizini sağlayacak ve daha fazla kanser yönetimine bireysel yaklaşımları teşvik edecektir. Geleneksel olarak, moleküler diagnostic laboratuarlar, DNA mutasyon profilleme için Sanger dizileme ve gerçek-zamanlı PCR gibi zaman alıcı, düşük hacimli metodolojileri yararlanmıştır. Daha yakın bir zamanda, çok katlı PCR veya kütle spektroskopisi genotipleme kullanan daha verimli yöntemler anahtar kanser genlerinin 3-5 tekrarlayan somatik mutasyonları incelemek için geliştirilmiştir. Bu yaklaşımlar, ancak, sadece önceden belirlenmiş bir &quot;sıcak nokta&quot; mutasyonlar tümör baskılayıcı genlerin in etkisiz mutasyonları tespit etmek için uygun olmayacak hale getirmeyecek, tahlil edilir olması ile sınırlıdır. Devasa paralel dizilim yaygın ve nadir iki mutasyonlar için tüm eksonları sorgulamak için yeteneği, böyle bir kopya sayısı karı ve zararı olarak genomik değişiklikler ek sınıfları ortaya çıkarmak için yetenek ve heterojen örnekleri 6, daha yüksek algılama hassasiyeti dahil olmak üzere bu stratejileri üzerinde çeşitli avantajlar sunuyor 7 . Göreceli olsa tüm genom dizileme, mutasyon keşif için en kapsamlı yaklaşımı temsilly pahalı ve veri analizi ve depolama için büyük hesaplama talepleri doğurur. Genomunun sadece küçük bir kısmı klinik ilgisini çekebilir klinik uygulamalar için, dizileme teknolojisindeki iki özel yenilikler dönüştürücü olmuştur. İlk olarak, hibridizasyon-bazlı exon yakalama ile, bir, hedefli mutasyon profil 8 için önemli kanserle ilişkili genlere karşı gelen DNA izole edebilir. İkincisi, moleküler barkod (yani DNA dizileri uzunluğunda 6-8 nükleotid) ligasyonu ile, bir sıralama çalışma başına örneklerin yüzlerce havuz ve tam kitlesel paralel dizilim araçların 10 artan kapasitesi yararlanmak. Kombine edildiğinde, bu yenilikler küçük hesaplamalı gereksinimleri 11 ile, düşük maliyet için profilli olması tümörleri sağlamak ve daha yüksek debisinde. Bundan başka, özel bir uygulama için en önemli yalnızca genlerle olan sekans kapsama tekrar dağıtarak, tek bir achie olabilirdüşük allel sıklığı olaylar için daha yüksek algılama hassasiyeti için daha fazla sıralama derinliği ettik. İşte biz (tüm protein kodlayan ekzon yakalamak ve 279 anahtar kanserle ilişkili genlerin intronlan seçmek için özel oligonükleotidler kullanarak melezleme ile barkodlu sıra kütüphane havuzları ekson yakalama kullanır bizim ETKİ tahlili (Actionable Kanser Hedefler Entegre Mutasyon profil), tarif Tablo 1 .) Bu strateji mutasyonlar, indellerin, kopya sayısı değişikliklerin belirlenmesini sağlar ve bu 279 geni içeren yapısal yeniden düzenlenmeleri seçin. Bizim yöntem taze, dondurulmuş ve FFPE dokusu yanı sıra ince iğne aspiratları ve diğer sitoloji örneklerinde hem de izole edilen DNA ile uyumludur.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="812">
	<tbody> 
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">NEBNext End Repair Module</td>
			<td style="width:247px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">E6050L</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">NEBNext dA-Tailing Module</td>
			<td style="width:247px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">E6053L</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">NEBNext Quick Ligation Module</td>
			<td style="width:247px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">E6056L</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Agencourt AMPure XP</td>
			<td style="width:247px;">Beckman Coulter Genomics</td>
			<td style="width:137px;"> </td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">NEXTflex PCR-Free Barcodes &#8211; 24</td>
			<td style="width:247px;">Bioo Scientific</td>
			<td style="width:137px;">514103</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">HiFi Library Amplification Kit</td>
			<td style="width:247px;">KAPA Biosystems</td>
			<td style="width:137px;">KK2612</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">COT Human DNA, Fluorometric Grade</td>
			<td style="width:247px;">Roche Diagnostics</td>
			<td style="width:137px;">05 480 647 001</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">NimbleGen SeqCap EZ Hybridization and Wash kit</td>
			<td style="width:247px;">Roche NimbleGen</td>
			<td style="width:137px;">05 634 261 001</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">SeqCap EZ Library Baits</td>
			<td style="width:247px;">Roche NimbleGen</td>
			<td style="width:137px;"> </td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:247px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">28104</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Qubit dsDNA Broad Range (BR) Assay Kit</td>
			<td style="width:247px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:137px;">Q32850</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit</td>
			<td style="width:247px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:137px;">Q32851</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Agilent DNA HS Kit</td>
			<td style="width:247px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:137px;">5067-4626, 4627</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:247px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:137px;"> </td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Covaris E220</td>
			<td style="width:247px;">Covaris</td>
			<td style="width:137px;"> </td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Magnetic Stand-96</td>
			<td style="width:247px;">Ambion</td>
			<td style="width:137px;">AM10027</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Illumina Hi-Seq 2000</td>
			<td style="width:247px;">Illumina</td>
			<td style="width:137px;"> </td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting somatic genetic alterations in tumor specimens by exon capture and massively parallel sequencing

Anahtar onkojenik mutasyonları tespit ve araştırmak için çabalar kanser hastaları için uygun tedaviyi kolaylaştırmak değerli kanıtlanmıştır. Yüksek verimlilik kurulması, kitlesel paralel &quot;yeni nesil&quot; dizileme gibi pek çok mutasyonların keşif destekli vardır. Bu teknolojinin klinik ve yorumsal programını geliştirmek için, platformlar, yüksek verimlilik, maliyet-etkin, ve bozulmuş veya hasar görmüş DNA&#39;nın küçük miktarlarda verim olabilir (FFPE) doku örnekleri gömülü formalin ile fikse parafin ile uyumlu olmalıdır. Burada, büyük ölçüde paralel dizilemesi ile taze, dondurulmuş ve FFPE tümörlerde kanserle ilişkili mutasyonların saptanması için hedeflenen eksondan olan hibridizasyon-bazlı yakalama ardından Barkodlanan ve birden fazla mesaj göndermiş DNA kütüphanelerinin hazırlanmasını tarif etmektedir. Bu yöntem, dizi mutasyonların tanımlanmasını sağlayan numara değişiklikleri kopyalamak ve hedeflenen tüm genleri içeren yapısal yeniden düzenlenmeleri seçin. Hedefli ekson dizileme t sunuyorO nedenle düşük frekanslı mutasyonları tespit etmek için yüksek duyarlılık kazandırmak, yüksek verimlilik, düşük maliyet ve derin dizisi kapsama yararlanır.

24 Barkodlanan sekansı kütüphaneleri (12 tümör normal çifti), bir havuz 279 kanser genlerinin tüm protein kodlayıcı eksonlar için karşılık gelen problar kullanılarak yakalandı ve 2 x 75 bp bir HiSeq 2000 akış hücresi tek bir şerit üzerinde okur olarak dizilenmiştir. Tümör ve normal kütüphaneleri bir 2:1 oranında bir araya toplanmıştır. Dondurulmuş tümör DNA örneklerinin bir havuz için örnek performans ölçümleri hizalama hızı, parça büyüklüğü dağılımı, on-hedef yakalama ?...

Watch this Scientific Journal Video about Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing at JoVE.com

Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing

Biz Barkodlanan DNA kütüphaneleri ve büyük ölçüde paralel &quot;yeni nesil&quot; dizisi ile klinik tümör numunelerinde önemli kanserle ilişkili mutasyonların saptanması için olan hibridizasyon-bazlı sonraki ekson yakalama hazırlanmasını tarif etmektedir. Hedefli ekson dizileme nedenle düşük frekanslı mutasyonları tespit etmek için yüksek duyarlılık verimli, yüksek verimlilik, düşük maliyet ve derin dizisi kapsama avantajlar sunmaktadır.

Ekson yakalama ve Devasa Paralel Dizilimine tarafından Tümör Örneklerinin somatik genetik değişiklikler tespit

Efforts  to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to  facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The ...

detecting-somatic-genetic-alterations-tumor-specimens-exon-capture

Research

JoVE Journal

Biology

19.3K Görüntüleme.  Memorial Sloan-Kettering Cancer Center.  Biz Barkodlanan DNA kütüphaneleri ve büyük ölçüde paralel "yeni nesil" dizisi ile klinik tümör numunelerinde önemli kanserle ilişkili mutasyonların saptanması için olan hibridizasyon-bazlı sonraki ekson yakalama hazırlanmasını tarif etmektedir. Hedefli ekson dizileme nedenle düşük frekanslı mutasyonları tespit etmek için yüksek duyarlılık verimli, yüksek verimlilik, düşük maliyet ve derin dizisi kapsama avantajlar sunmaktadır. 

Video: Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing

CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV

CD4 + T-Lenfosit Yakalama HIV için Disposable mikroakışkan Chip

Biyoloji

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Erken Civciv Embriyolar in situ Hibridizasyon Çift Tüm Dağı

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors are offering new opportunities for regenerative medicine. Such clinical applications of iPS cells have been limited so far, mainly due to the poor efficiency of the existing reprogramming methodologies and the risk of the generated iPS cells to form tumors upon implantation.
We hypothesized that the reprogramming of somatic cells towards pluripotency could be achieved in vivo by gene transfer of reprogramming factors. In order to efficiently reprogram cells in vivo, high levels of the Yamanaka (OKSM) transcription factors need to be expressed at the target tissue. This can be achieved by using different viral or nonviral gene vectors depending on the target tissue. In this particular study, hydrodynamic tail-vein (HTV) injection of plasmid DNA was used to deliver the OKSM factors to mouse hepatocytes. This provided proof-of-evidence of in vivo reprogramming of adult, somatic cells towards a pluripotent state with high efficiency and fast kinetics. Furthermore no tumor or teratoma formation was observed in situ.
It can be concluded that reprogramming somatic cells in vivo may offer a potential approach to induce enhanced pluripotency rapidly, efficiently, and safely compared to in vitro performed protocols and can be applied to different tissue types in the future.

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

This study demonstrates the reprogramming of somatic cells towards pluripotency in vivo without the generation of teratomas. We used hydrodynamic tail vein injection of plasmid DNA encoding the Yamanka factors to induce the in vivo reprogramming of adult hepatocytes into cells of enhanced pluripotency.

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

Sendai-virüs ile İnsan Somatik Verimli Üretimi İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Linear Amplification Mediated PCR &#8211; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA

Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR) has been developed to study hematopoiesis in gene corrected cells of patients treated by gene therapy with integrating vector systems. Due to the stable integration of retroviral vectors, integration sites can be used to study the clonal fate of individual cells and their progeny. LAM- PCR for the first time provided evidence that leukemia in gene therapy treated patients originated from provirus induced overexpression of a neighboring proto-oncogene. The high sensitivity and specificity of LAM-PCR compared to existing methods like inverse PCR and ligation mediated (LM)-PCR is achieved by an initial preamplification step (linear PCR of 100 cycles) using biotinylated vector specific primers which allow subsequent reaction steps to be carried out on solid phase (magnetic beads). LAM-PCR is currently the most sensitive method available to identify&#160;unknown DNA which is located in the proximity of known DNA. Recently, a variant of LAM-PCR has been developed that circumvents restriction digest thus abrogating retrieval bias of integration sites and enables a comprehensive analysis of provirus locations in host genomes. The following protocol explains step-by-step the amplification of both 3&#8217;- and 5&#8217;- sequences adjacent to the integrated lentiviral vector.

Linear Amplification Mediated PCR &amp;#8211; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA

Linear-amplification mediated (LAM)-PCR is a method developed to identify the exact positions of integrating viral vectors in the genome. The technique has evolved to be the superior method to study clonal dynamics in gene therapy patients, biosafety of novel vector technologies, T-cell diversity, cancer stem cell models, etc.

Doğrusal Amplifikasyon Dolayımlı PCR - Bilinmeyen Yollardan DNA Genetik Elemanları ve Karakterizasyonu lokalizasyonu

Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR) has been developed to study hematopoiesis in gene corrected cells of patients treated by gene therapy with ...

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model congenital abnormalities. During the first day of life, the zebrafish embryo progresses through many developmental stages including fertilization, cleavage, gastrulation, segmentation, and the organogenesis of structures such as the kidney, heart, and central nervous system. The anatomy of a young zebrafish embryo presents several challenges for the visualization and analysis of the tissues involved in many of these events because the embryo develops in association with a round yolk mass. Thus, for accurate analysis and imaging of experimental phenotypes in fixed embryonic specimens between the tailbud and 20 somite stage (10 and 19 hours post fertilization (hpf), respectively), such as those stained using whole mount in situ hybridization (WISH), it is often desirable to remove the embryo from the yolk ball and to position it flat on a glass slide. However, performing a flat mount procedure can be tedious. Therefore, successful and efficient flat mount preparation is greatly facilitated through the visual demonstration of the dissection technique, and also helped by using reagents that assist in optimal tissue handling. Here, we provide our WISH protocol for one or two-color detection of gene expression in the zebrafish embryo, and demonstrate how the flat mounting procedure can be performed on this example of a stained fixed specimen. This flat mounting protocol is broadly applicable to the study of many embryonic structures that emerge during early zebrafish development, and can be implemented in conjunction with other staining methods performed on fixed embryo samples.

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is an excellent model for developmental biology research. During embryogenesis, zebrafish develop with a yolk mass, which presents three-dimensional challenges for sample observation and analysis. This protocol describes how to create two-dimensional flat mount preparations of whole mount in situ (WISH) stained zebrafish embryo specimens.

Tüm Dağı ile Zebra balığı Embriyo örnekler Vitray gözlenmesi ve Analiz Daire Dağı Hazırlık<em&gt; In situ</em&gt; Melezleme

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.

Kültürlenmiş memeli hücrelerinde büyük çapta paralel Raportör Tahliller

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Fekal Glukokortikoid Analizi: Tek tırnaklılarda in Non-invaziv Adrenal İzleme

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

RNA Sıralama Deneyi Gen İfade ve Genomik değişiklikleri tanımlamak için hedeflenen

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.